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抗-MIF抗体和化学 治疗剂的联合治疗

阅读：122发布：2020-05-13

专利汇可以提供抗-MIF抗体和化学治疗剂的联合治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种抗-MIF 抗体，特别是它们联合治疗剂即化学治疗剂用于癌症的治疗。，下面是抗-MIF抗体和化学治疗剂的联合治疗专利的具体信息内容。

权利要求

1.抗-MIF抗体联合化学治疗剂用于癌症的治疗，其中，所述化学治疗剂优选为吉西他滨、顺铂、和/或阿霉素。
2.根据权利要求1所述的抗-MIF抗体联合化学治疗剂用于癌症的治疗，其中，所述癌症选自下组：胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌，更优选胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌。
3.根据权利要求1或2所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗-MIF抗体RAM9、RAM0和/或RAM4。
4.根据权利要求1-3任一项所述的联合治疗，其中，所述化学治疗剂是吉西他滨。
5.根据权利要求1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM9，所述化学治疗剂是阿霉素并可选地联合顺铂，所述癌症为卵巢癌。
6.根据权利要求1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM9，所述化学治疗剂是吉西他滨，所述癌症是胰腺癌。
7.根据权利要求1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM0，所述化学治疗剂是阿霉素并可选地联合顺铂，所述癌症为卵巢癌。
8.根据权利要求1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM0，所述化学治疗剂是吉西他滨，所述癌症是胰腺癌。
9.根据权利要求1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM4，所述化学治疗剂是阿霉素并可选地联合顺铂，所述癌症为卵巢癌。
10.根据权利要求1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAB4，所述化学治疗剂是吉西他滨，所述癌症是胰腺癌。
11.根据权利要求1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM0，所述化学治疗剂是米托蒽醌，所述癌症是前列腺癌。
12.一种试剂盒，包含权利要求1-11任一项定义的联合，以及使用说明。
13.根据权利要求1-11任一项定义的联合或如权利要求12所述的试剂盒应用于癌症治疗。

说明书全文

抗-MIF抗体和化学 治疗剂的联合治疗

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗-MIF抗体，特别是它们联合癌症治疗剂即化学治疗剂用于癌症的治疗。

背景技术

[0002] 巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种细胞因子，起初是基于它能够抑制腹膜渗出液细胞从对结核菌素高度敏感的豚鼠(包含巨噬细胞)中体外随机迁移的能力而被分离的(Bloom et al.Science 1966,153,80-2；David et al.PNAS 1966,56,72-7)。今天，已经知道MIF作为先天性和获得性免疫反应的一个关键的上游调控子，上述免疫反应具有广谱活性。

[0003] 人类MIF cDNA在1989年得到克隆(Weiser et al.,PNAS 1989,86,7522-6)，其基因定位于22号染色体。人类MIF基因产品为具有114个氨基酸的蛋白质(N端蛋氨酸裂解后)，其表观分子量大约为12.5kDa。MIF没有与其他蛋白存在显著的序列同源性。该蛋白结晶成同一亚单位的三聚体。每个单体包含两个反向平行的α螺旋，所述α螺旋包裹(pack against)四链β片。该单体还有其他两个β链，该β链和相邻亚单位的β片相互作用以在单体之间形成界面。三个亚单位排布成一个包含亲溶剂通道的管道，该管道可以沿着分子三重轴向穿过蛋白质中心(Sun et al.PNAS 1996,93,5191-5196)。

[0004] 据报道，低浓度糖皮质激素可以诱导巨噬细胞分泌MIF(Calandra et al.Nature1995,377,68-71)。然而，MIF也会方向调节糖皮质激素的作用，并刺激其他细胞因子的分泌，例如肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-1β(Baugh et al.,Crit Care Med
2002,30,S27-35)。MIF同样表现出例如展示促血管生成、促增殖和抗凋亡的性质，因此能促进肿瘤细胞的生长(Mitchell,R.A.,Cellular Signalling,2004.16(1):p.13-19；Lue,H.et al.,Oncogene 2007.26(35):p.5046-59)。此外，例如它和淋巴瘤、黑素瘤和结肠癌的生长也有直接联系(Nishihira et al.J Interferon Cytokine Res.2000,20:751-62)。

[0005] MIF是多种病理情况的中介物，因此，与各种疾病都有关联，其包括但不限于炎症性肠病(IBD)、风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、血管球性肾炎、IgA肾病、心肌梗死(MI)、败血症和癌症。

[0006] 多克隆和单克隆抗-MIF抗体已经用于抵抗重组人类MIF(Shimizu et al.,FEBS Lett.1996；381,199-202；Kawaguchi et al,Leukoc.Biol.1986,39,223-232,和Weiser et al.,Cell.Immunol.1985,90,167-78)。

[0007] 已经表明抗-MIF抗体具有治疗用途。Calandra et al.,(J.Inflamm.(1995)；47,39-51)报道了使用抗-MIF抗体保护动物免于实验上诱发的革兰氏阴性和革兰氏阳性感染性休克。表明抗-MIF抗体可作为一种治疗手段来调控感染性休克和其他炎症疾病状态中的细胞因子产生。

[0008] US 6,645,493公开了一种源自杂交瘤细胞的单克隆抗-MIF抗体，其能够中和MIF的生物学活性。在动物模型中表明这些源自鼠的抗-MIF抗体在治疗内毒素诱发的休克中具有有益效果。

[0009] US 200310235584公开了一种在动物中制备对MIF具有高亲和性的抗体，所述动物中的MIF基因已经被纯合(homozygously)敲除。

[0010] 糖基化抑制因子(GIF)是一种蛋白质，具体描述见Galat et al.(Eur.J.Biochem,1994,224,417-21)。MIF和GIF被认为是相同的。Watarai et al.(PNAS2000,97,13251-6)描述了一种能够结合到不同的GIF表位的多克隆抗体以识别Ts细胞中的GIF翻译后修饰的生物化学特性。Watarai et al,supra报道称GIF在体外出现在不同的构象异构体中。该异构体的一个类型通过化学修饰单个半胱氨酸残基而产生。该化学修饰导致GIF蛋白内部的构象改变。

[0011] 在过去几十年，和MIF有关的那些疾病和紊乱中的一个即为上述所指出的癌症。一般通过各种途径治疗癌症，其中一种正在使用的即是所谓的化学治疗剂(其是抗癌化疗的基础)。一般意义而言，化疗的潜在概念是假定一种疾病或紊乱(其由细菌、病毒、寄生虫和癌细胞引起)可以通过化合物有效地治疗。化疗的一个特定指征就是癌症。化学治疗剂可以起到如杀死比其他细胞分裂更快的细胞的作用，因而可以靶向通常比非-癌细胞分裂更快的癌细胞。大多数化学治疗剂药物通过破坏细胞分裂起作用，即它们在细胞周期的一个或若干个阶段起作用，因此能够靶向分裂更快的细胞。化学治疗剂也可以抑制细胞生长，即它们可以减慢或废除细胞生长或分裂；其他化学治疗剂会导致细胞受损并杀死它们；
在那种情况下，它们被称作细胞毒性。大多数细胞毒性药物造成的损害不足以杀死细胞，但是能够产生引起程序性细胞死亡(凋亡)的刺激物。

[0012] 一般而言，化学治疗药物的主要种类为烷基化剂、抗代谢物、蒽环类化合物、植物生物碱、拓扑异构酶和其他抗肿瘤剂。最常见的，如上所述，这些药物能影响细胞分裂；它们也能够影响DNA合成或其功能。其他化学治疗剂不直接干扰DNA。这些是化学治疗剂的新种类，其被称为信号拦截子，包括单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂例如甲磺酸伊马替尼。烷基化亲核官能团的烷基化剂的例子，可为二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法伦(苯丙氨酸氮芥)(melphalane)、三芥环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀、环己亚硝脲、达卡巴嗪、替莫唑胺、丝裂霉素C和其他。顺铂、卡铂、奥沙利铂和其他含铂化合物能与DNA形成稳定的复合物。

[0013] 细胞毒性抗代谢物为叶酸类似物(例如，氨甲蝶呤/氨喋呤、雷替曲塞、培美曲塞)、嘌呤(例如，6-巯基嘌呤、咪唑硫嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨)或嘧啶(阿糖孢苷、吉西他滨、5-氟尿嘧啶和它的前体、去氮杂胞苷(deazacytidine))。抗代谢物通过干扰嘌呤和嘧啶核苷酸从头合成中的关键步骤而抑制DNA合成，或它们在细胞周期S期中被整合到DNA，在这里它们干扰DNA折叠、DNA修复或甲基化。或者，一些化合物也被整合入RNA。

[0014] 源自植物和通过妨碍微管功能而阻止细胞分裂的生物碱和萜类的例子是长春花生物碱和紫杉烷。特别出名的长春花生物碱是长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛。足叶草毒素是植物来源化合物的另一个例子。紫杉烷的一个例子是多烯紫杉醇或紫杉醇。
雌莫司汀是靶向微管蛋白的合成化合物的一个例子。

[0015] 拓扑异构酶抑制剂是酶的抑制剂，其可以维持DNA的拓扑结构，举例包括喜树碱例如伊立替康和拓扑替康(类型1拓扑异构酶抑制剂)或安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷(拓扑异构酶类型2抑制剂)。

[0016] 最后，抗肿瘤药螯合剂的例子包括更生霉素、阿霉素、表阿霉素、博来霉素和其他。

[0017] 综述见如下所示的Goodman和Gilman的治疗药理学基础第12版：“癌症化疗的一般原则，简介部分”。几种肿瘤容易受到激素疗法的影响：糖皮质激素(例如氢化波尼松、地塞米松和其他)能够促进淋巴瘤细胞的凋亡。因此，它们属于典型的化疗方法。类似地，几种类型的癌症易受激素干扰。这包括，例如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。激素消融可以通过促性腺激素释放激素受体激动剂(例如乙基酰胺、戈舍瑞林、亮丙瑞林、hisrelin等)抑制垂体释放促性腺激素实现，其引起受体脱敏，因此抑制激素产生，或通过促性腺激素释放激素受体拮抗剂(例如地加瑞克)来实现。或者，雌性激素和雄性激素的作用可能被激素受体拮抗剂阻断：作为雌激素受体的部分激动剂作用的化合物(也被称为选择性雌激素受体调控子，SERM’s)包括它莫西芬、雷洛昔芬和托瑞米芬。氟维司群是纯粹的雌激素受体拮抗剂的一个例子。雄激素受体能被拮抗剂例如氟他米特、bicalitamide和环丙孕酮阻断。最后，激素消融可以通过阻断负责它们合成的相关酶来实现。以雌激素为例，芳香酶(CYP19)可以被下述化合物阻断：例如氨鲁米特、福美司坦、依西美坦、阿那曲唑和来曲唑。雄性激素的产生可以通过阿比特龙抑制酶17α-羟化酶/C17,20裂解酶(CYP17A1)而被抑制。不论采用何种阻断激素输入的方法，都可以抑制易受影响的癌细胞的生长并且促进它们的凋亡。

[0018] 虽然已经表明化学治疗剂在治疗几种不同癌症类型方面是有用和成功的，但取决于所用药物的类型，化学治疗法有着一系列的副作用。最常见的副作用包括免疫系统的退化并可导致潜在的致命的感染、疲劳、贫血、容易出血的倾向、肠胃病例如恶心和呕吐、腹泻或便秘和脱发。进一步地，也可能发生对特定器官的损害而导致例如心脏损伤、肝损伤、肾损伤、内耳损伤、外周神经系统的损伤和脑功能障碍。

[0019] 如果给予的化学治疗药物的剂量增加，所有这些副作用也会更加严重。通过降低给药剂量通常可以使得副作用发生几率降低和/或减轻。

[0020] 在其他例子中，如果需要高剂量治疗，化学治疗剂的作用如果可以强化或增加，则将会是有利的。因此，本领域依然迫切需求提供一种癌症治疗方法，其允许给定化学治疗剂的剂量降低和/或加强给定化学治疗剂的作用。

发明内容

[0021] 通过本发明能解决上述目标。

[0022] 特别地，这可以通过抗-MIF抗体和给定化学治疗剂的联合治疗表明，其中可以检测到协同效应，与单独使用化学治疗剂治疗这种癌症相比，其使得可以采用较低剂量的化学治疗剂治疗癌症和/或采用类似的剂量却能达到更高的效果。特别地，如上所述以及本发明实施例，使用抗-oxMIF抗体和给定化学治疗剂的联合治疗表明和协同效应有关。

[0023] 升高的MIF水平，即MIF水平，通常在各种疾病开始之后，尤其是癌症开始之后，其可被检测到。然而，MIF同样在健康个体内循环，这使得难以清楚地区分。相反地，oxMIF不存在于健康个体中。

[0024] 在彻底研究MIF和其抗体之后，已经发现抗体RAB9、RAB4和RAB0以及RAM9、RAM4和RAM0特异性结合oxMIF(不能结合redMIF)。

[0025] 本发明人进行的早期试验中，表明氧化过程例如胱氨酸介导的氧化、GSSG(ox.谷胱甘肽)-介导的氧化或MIF和Proclin300或蛋白质交联剂(例如BMOE)的共同孵育引起MIF可以结合到上述抗体。

[0026] 本申请发明人得到的以下令人惊异地的结论：

[0027] ·重组MIF(人、小鼠、大鼠、CHO、猴子)的氧化还原调节(Cys/Glu介导的轻度氧化)或用Proclin300或蛋白质交联剂对重组MIF的处理都会导致巴克斯特的抗-MIF抗体RAB9、RAB4和RAB0的结合；

[0028] ·oxMIF的降低导致Ab结合的减少；

[0029] ·oxMIF-异构体的特异性与生物学Ab功效相关(尤其是体内)；

[0030] ·oxMIF水平与疾病状态有关。

[0031] 关于(ox)MIF的这些额外知识作为本申请发明人进一步研究的基础。因此，本申请优选的体现如下：

[0032] 1.抗-MIF抗体联合化学治疗剂用于癌症的治疗，其中，所述化学治疗剂优选为吉西他滨、顺铂、和/或阿霉素。

[0033] 2.根据1所述的抗-MIF抗体联合化学治疗剂用于癌症的治疗，其中，所述癌症选自下组：胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌，更优选胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌。

[0034] 3.根据1或2所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗-MIF抗体RAM9、RAM0和/或RAM4。

[0035] 4.根据1-3任一项所述的联合治疗，其中，所述化学治疗剂是吉西他滨。

[0036] 5.根据1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM9，所述化学治疗剂是阿霉素并可选地联合顺铂，所述癌症为卵巢癌。

[0037] 6.根据1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM9，所述化学治疗剂是吉西他滨，所述癌症是胰腺癌。

[0038] 7.根据1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM0，所述化学治疗剂是阿霉素并可选地联合顺铂，所述癌症为卵巢癌。

[0039] 8.根据1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM0，所述化学治疗剂是吉西他滨，所述癌症是胰腺癌。

[0040] 9.根据1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM4，所述化学治疗剂是阿霉素并可选地联合顺铂，所述癌症为卵巢癌。

[0041] 10.根据1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM4，所述化学治疗剂是吉西他滨，所述癌症是胰腺癌。

[0042] 11.根据1-4任一项所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是RAM0，所述化学治疗剂是米托蒽醌，所述癌症是前列腺癌。

[0043] 12.一种试剂盒，包含1-11任一项定义的联合，以及使用说明。

[0044] 13.根据1-11任一项定义的联合或如12所述的试剂盒应用于癌症治疗。

[0045] 上述抗体已经用它们的序列以及保存在大肠杆菌(E.coli)中的质粒进行表征和支持，所述质粒分别包含上述抗体RAB0、RAB4和RAB9，以及RAM0、RAM4和RAM9的轻链或重链中的一种。

[0046] 上述质粒用它们的DSM编号表征，DSM是根据布达佩斯条约在德国的微生物收藏和细胞培养(DSMZ)(位于德国，布伦瑞克，Mascheroder Weg 1b)保存时得到的官方号码。这些质粒分别保存在大肠杆菌(E.coli)菌株中。编号为DSM25110的质粒包含抗-MIF抗体RAB4的轻链序列。编号为DSM25112的质粒包含抗-MIF抗体RAB4的重链(IgG4)序列。

[0047] 质粒DSM25110和DSM25112在适宜宿主细胞中的共同表达可引起优选的抗-MIF抗体RAB4的生成。

[0048] 编号为DSM25111的质粒包含抗-MIF抗体RAB9的轻链序列。

[0049] 编号为DSM25113的质粒包含抗-MIF抗体RAB9的重链(IgG4)序列。

[0050] 质粒DSM25111和DSM25113在适宜宿主细胞中的共同表达可引起优选的抗-MIF抗体RAB9的生成。

[0051] 编号为DSM25114的质粒包含抗-MIF抗体RAB0的轻链序列。

[0052] 编号为DSM25115的质粒包含抗-MIF抗体RAB0的重链(IgG4)序列。

[0053] 质粒DSM25114和DSM25115在适宜宿主细胞中的共同表达可引起优选的抗-MIF抗体RAB0的生成。

[0054] 同样地，RAM0、RAM9和RAM4的轻链和重链已经根据布达佩斯条约于2012年4月12日保存在DSMZ(德国，布伦瑞克)。使用以下命名：

[0055] RAM9–重链:E.coli GA.662-01.pRAM9hc–DSM 25860。

[0056] RAM4–轻链:E.coli GA.906-04.pRAM4lc–DSM 25861。

[0057] RAM9–轻链:E.coli GA.661-01.pRAM9lc–DSM 25859。

[0058] RAM4–重链:E.coli GA.657-02-pRAM4hc–DSM 25862。

[0059] RAM0–轻链:E.coli GA.906-01.pRAM0lc–DSM 25863。

[0060] RAM0–重链:E.coli GA.784-01.pRAM0hc–DSM 25864。

[0061] 术语“预防性”或“治疗性”治疗在本领域是熟知的，其是指进行个体给药。如果是在有不需要的状态的临床表现(例如疾病或其他个体不希望的状态)之前给药，那么该治疗就是预防性的，即它保护个体免于形成不希望的状态，而如果是在不希望的情况表现之后给药，那么该治疗就是治疗性的(即其是为了从中减小、减轻或维持现存的不希望的状态或副作用)。

[0062] 此处，抗-(ox)MIF化合物是指能够减弱、抑制、对抗、抵消或降低(ox)MIF生物学活性的任意试剂。抗-(ox)MIF的化合物可为能够抑制或中和(ox)MIF活性的试剂，例如抗体、特别优选此处所述的抗体，更优选抗体RAB9、RAB4和/或RAB0。特别优选的抗体是RAM9、RAM4和/或RAM0。

[0063] 根据本发明，优选的MIF拮抗剂是抗-MIF抗体。更优选的抗-MIF抗体是针对oxMIF的抗体。在其他实施例中，所述抗-oxMIF抗体，例如上述抗体或结合oxMIF的抗原结合部分，其KD小于100nM，优选KD小于50nM，更优选KD小于10nM。特别优选，结合oxMIF的抗体的KD小于5nM。

[0064] 本发明进一步涉及一种试剂盒，包含抗-MIF抗体或其抗原结合部分以及本发明所述的化学治疗剂。除了抗体和化学治疗剂，该试剂盒还进一步包含治疗剂及其用途。该试剂盒也可包含在治疗方法中的使用说明。

[0065] 早期结果表明，在动物模型中，抗-MIF抗体只能结合oxMIF而不能结合redMIF，并能够抑制GCO和/或细胞增殖，带来有益效果。

[0066] 发明详述

[0067] 本发明内容通过所附附图进行进一步描述。

附图说明

[0068] 图1：全人类抗-MIF抗体RAM9和吉西他滨联合用于移植瘤模型治疗胰腺癌。BxPC3人类胰腺癌细胞原位移植到裸小鼠；一周之后，小鼠单独采用60mg/kg的RAM9治疗(抗-MIF，右侧，灰色实线)或联合100mg/kg的吉西他滨共同治疗(抗-MIF+吉西他滨，右侧，黑色实线)。对照组不做处理(左侧和右侧，黑色虚线)或用对照人类单克隆抗体处理(对照IgG，左侧，灰色实线)或单独用吉西他滨处理(吉西他滨，左侧，黑色实线)。存活曲线代表的时间点表明根据UK内政部指导，动物处死的时间。

[0069] 图2：人类抗-MIF抗体RAM0和吉西他滨的联合。Colo 357人类胰腺癌细胞株原位移植到裸小鼠；一周之后，小鼠单独采用60mg/kg的RAM0治疗(抗-MIF)或联合100mg/kg的吉西他滨共同治疗(抗-MIF+Gem)。对照组不做处理或单独用吉西他滨处理(Gem)或用对照人类单克隆抗体处理(对照)或用对照人类单克隆抗体联合吉西他滨处理(对照+Gem)。(A)存活曲线代表的时间点表明根据UK内政部指导，动物处死的时间。(B)在细胞移植第20天处死动物之后，作为动物的附属，测量肿瘤体积。(C)治疗之后第12天，用带有Colo457异种移植的小鼠静脉注射FITC结合的番茄凝集素以使得血管可见。使用ImagePro Plus 软件(Image-Pro Plus，Media Cybernetics公司)量化微血管密度，并以总表面积的平均百分比表示血管密度。

[0070] 图3：当A2780adr卵巢癌细胞用阿霉素联合RAM0(A)和RAM9(B)一起治疗时，半胱天冬酶3的水平升高。相比于未处理的细胞，半胱天冬酶3活性升高的百分比如图所示。使用人类同型对照IgG(对照IgG)、单独使用抗-MIF抗体RAM0或RAM9、联合使用对照IgG和阿霉素(对照IgG+Dox)、单独使用阿霉素(Dox)或联合使用抗-MIF抗体和阿霉素(RAMO+Dox或RAM9+Dox)处理细胞。

[0071] 图4：在人类卵巢癌细胞系A2780中进行体外RAM0和顺铂联合的顺铂依赖性细胞杀死实验。在没有抗体(w/o抗体)或人类同型对照IgG或抗-MIF抗体RAM0存在时，记录顺铂的EC50。数据为9个独立实验的平均值±标准偏差。

[0072] 图5：在小鼠异种移植模型中使用人类卵巢癌细胞系A2780进行体内RAM0和顺铂联合。对接种了人类对照IgG或RAM0的小鼠进行处理后的肿瘤重量如图所示。单独施用抗体或联合顺铂共同施用。

[0073] 图6：在人类前列腺癌细胞系LnCAP中进行体外RAM0和米托蒽醌联合的米托蒽醌依赖性细胞杀死实验。在没有抗体(w/o抗体)或人类同型对照IgG或抗-MIF抗体RAM0存在时，记录米托蒽醌的EC50s。图中所示的单个值以及平均值±标准偏差来自10个独立实验的结果。

[0074] 定义和基本技术

[0075] 除非此处另有定义，本发明所使用科学和技术术语的含义为本领域普通技术人员通常所理解的。一般而言，与此处所述细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因和蛋白质以及核苷酸化学相关的所用术语和技术是本领域所众所周知的且通用的。除非特别指出，本发明的方法和技术一般按照本领域已知的传统方法以及本说明书中所引用和讨论的各种综述和更多特定文献所描述的进行。见例如，Sambrook等，分子克隆：实验手册第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)和Ausubel等；分子生物学当代操作手册，格林出版联合社(1992)以及Harlow和Lane抗体:实验手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1990)，通过引用其被包括在此处。

[0076] “MIF”或“巨噬细胞移动抑制因子”是指一种蛋白质，已知其在免疫和炎症反应中是一种关键的调节子，并且其是糖皮质激素的抗调控子。MIF包括哺乳动物MIF，特别是人MIF(Swiss-Prat原始登记号：P14174)，其中单体形式是由115个氨基酸所编码的蛋白质，但因为在起始蛋氨酸处裂解，最终形成114个氨基酸的蛋白质。“MIF”也包括“GIF”(糖基化抑制因子)和其他形式的MIF，例如MIF的融合蛋白。MIF的氨基酸编号起始于N端的蛋氨酸(氨基酸1号)，结束于C端的丙氨酸(氨基酸115号)。根据本发明的目的，“氧化的MIF”或oxMIF定义为MIF的异构体，其通过采用轻度氧化剂例如胱氨酸处理MIF得到。如之前本申请发明人所示，用该方式处理的重组oxMIF包括MIF的异构体，该异构体和oxMIF分享结构的重排，oxMIF(例如)在动物感染细菌之后在体内产生。

[0077] 根据本发明的目的，redMIF被定义为还原的MIF，其为不和RAB0、RAB9和/或RAB4结合的MIF。

[0078] 本发明所述的抗-oxMIF抗体能够区分oxMIF和redMIF，所述oxMIF和redMIF分别通过轻度氧化或还原得到。抗-oxMIF抗体对于特异性地检测oxMIF是有用的。这些构象异构体之间的区别通过ELISA或表面等离子体共振进行评估。这两种技术的操作对于本领域技术人员是已知的，并可以采用下述方法进行操作。

[0079] 用Biacore评估抗体的差异结合

[0080] 使用Biacore 3000系统，并通过表面等离子体共振分析检测oxMIF和redMIF与RAB9和RAB0的结合动力学。所述抗体涂覆于CM5(＝甲基葡聚糖)芯片，并且注射预先和0.2％的Proclin300孵育的重组MIF蛋白。(Proclin300由稳定oxMIF结构的氧化异噻唑构成)。在不添加Proclin300的天然HBS-EP缓冲液中，将重组MIF蛋白未结合到RAB9、RAB0或相关抗体(不相关的同型对照抗体)的用作阴性(背景)结合对照。在一个优选的实施例，oxMIF是和抗体RAB9、RAB4和/或RAB0结合力不同的MIF，或者是其抗原-结合片段，意味着这些抗体结合oxMIF，而redMIF不结合这些抗体中的任何一个。

[0081] 在其他实施例中，所述抗-oxMIF抗体，例如，上述抗体或其结合oxMIF的抗原结合部分，其KD值低于100nM，优选KD值低于50nM，更优选KD值低于10nM。特别优选的是，本发明所述的结合oxMIF的抗体的KD值低于5nM。

[0082] 本发明中的如上定义和如下定义的抗体有同样的特异性。因此在本申请发明人进行的实验中，它们也显示类似的结果。

[0083] 抗体例如RAB9、RAB4或RAB0或RAB9、RAM4或RAM0能否结合(例如oxMIF或redMIF)可以根据本领域技术人员已知的方法确定，举例而言可以是下述方法中的任何一个：使用还原态或氧化态的重组MIF的ELISA，或使用还原态或氧化态的重组MIF的表面等离子体共振，例如上述已知的Biacore实验。

[0084] 用于确定结合的一个优选的方法是抗体结合例如rec.(ox)MIF的表面等离子体共振，其中“结合”意味着以KD值表示低于100nM，优选低于50nM，甚至更优选低于10nM，其中未结合到redMIF的抗体用KD值高于400nM表征。“结合”和“特异性结合”在本文可交换使用，定义如上所述。“差异结合”在本申请上下文中是指一种化合物，特别是本文所述的能够结合oxMIF的抗体(例如，KD值如上所述的抗体)，而且不和redMIF(如上所述非结合)结合的抗体。

[0085] “抗体”是指完整的抗体或能够和用于(特异性)结合的完整的抗体相竞争的抗原结合部分。一般参见免疫基础，第7章(Paul,W.,ed.,第2章.Raven Press,纽约(1989))(通过引用包含在本文)。术语抗体包括但不限于人类抗体、哺乳动物抗体、分离的抗体和基因工程形式例如嵌合体、骆驼/骆驼化或人源化抗体。

[0086] 术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体的一个或一个以上保留特异性结合抗原(例如(ox)MIF)能力的片段。抗原结合部分可以通过重组DNA技术制备，也可以通过酶或化学裂解完整抗体而制备。抗原结合部分包括但不限于下述：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和互补性决定区域(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、抗体和包含至少抗体的一部分的多肽，其中，所述抗体足以使得特异性抗原结合到多肽，即ox或redMIF。从N端到C端，成熟轻链和重链可变区包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4区。每个区域中氨基酸的排布与下述文献的定义保持一致：Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(国家卫生研究院，贝塞斯达，Md.(1987和1991))；Chothia et al.J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，或Chothia et al.,Nature 342:878-883(1989)。抗体或其抗原结合部分可以衍生或连接到另一个功能分子(例如另一个肽或蛋白质)。例如，抗体或其抗原结合部分能够连接到一个或一个以上其他分子实体，例如另一个抗体(例如双特异性抗体或双链抗体(diabody))、可检测试剂、细胞毒性试剂、药物试剂、和/或连接分子。

[0087] 根据本领域技术人员的通常知识，术语“KD”此处是指特定抗体相对于各自抗原的平衡解离常数。该平衡解离常数可以测量亲和力。亲和力决定着在平衡态(结合和解离保持平衡的稳定状态)形成了多少复合物(此处：ox或redMIF和抗体)。

[0088] ka＝结合速度常数[M-1s-1]

[0089] kd＝解离速度常数[s-1]

[0090] KD＝平衡解离常数＝kd/ka[M]

[0091] 术语“人类抗体”是指可变区和恒定区是人类序列的任何抗体。该术语包括带有源自人类基因但却被改变过的序列的抗体，所述改变例如为降低可能的免疫原性、增加亲和性、去除可能引起不良折叠的半胱氨酸等。该术语包含了在非人类细胞重组制备的抗体，其能够如给予人类细胞无特有的糖基化。

[0092] 术语“人源化抗体”是指包含人类序列并包含非人类序列的抗体；特别地，“人源化抗体”是指非人类抗体，其中添加了人类序列和/或人类序列替换非人类序列。术语“骆驼化抗体”是指一种抗体，其中所述抗体结构或序列已经发生改变，其和源自骆驼的抗体更加相似，也被命名为骆驼抗体。设计和制造骆驼化抗体的方法是本领域技术人员所熟知的一般知识的一部分。

[0093] 术语“嵌合抗体”是指包含来自两种或两种以上不同物种的区域的抗体。

[0094] 术语“分离的抗体”或“其分离的抗原结合部分”是指从抗体源例如噬菌体展示库或B细胞谱中挑选和鉴定的一种抗体或其抗原结合部分。

[0095] 根据本发明所述的抗-(ox)MIF抗体的制备包含采用基因工程生成重组DNA的任何方法，例如通过反向转录RNA和/或扩增DNA和将其克隆到表达载体。在一些实施例中，所述载体是病毒载体，其中额外的DNA部分可连接到病毒基因组。在一些实施例中，所述载体能够在被引入的宿主细胞中自我复制(例如带有细菌复制起点的细菌载体和附加体型哺乳动物载体)。在其他实施例中，所述载体(例如非-附加体型哺乳动物载体)在引入宿主细胞时可以整合到宿主细胞的基因组中，因此和宿主基因组一起复制。然而，特定的载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体此处是指“重组表达载体”(或简单的称为“表达载体”)。

[0096] 抗-(ox)MIF抗体尤其可以通过传统表达载体制造，例如细菌载体(例如pBR322和它的衍生物)、或真核载体。编码抗体的那些序列能与调控复制、表达和/或从宿主细胞分泌的调控序列一起提供。这些调控序列包括例如启动子(例如CMV或SV40)和单个序列。表达载体也包含选择和扩增标志物，例如二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶和胸苷激酶。所用载体的成分例如选择标记物、复制子、增强子可以通过商业化获得或通过传统方法制备。

[0097] 该载体可以被构建以用于在各种细胞培养物中表达，例如在哺乳动物细胞例如CHO、COS、HEK293、NSO、纤维组织母细胞、昆虫细胞、酵母或细菌例如大肠杆菌。在一些例子中，所用的细胞可以获得表达蛋白的最佳糖基化。所述抗-(ox)MIF抗体的轻链基因和抗-(ox)MIF抗体的重链基因可以插入到不同的载体或插入到同一个表达载体中。所述抗体基因通过标准方法插入到表达载体中，例如通过抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接、或如果没有限制性位点则通过平末端连接。

[0098] 抗-(ox)MIF或其抗原结合片段的制备包括本领域已知的将重组DNA转染到真核细胞的任何方法，例如通过电穿孔或微注射。例如，抗-(ox)MIF的重组表达可以通过下述方法完成：将包含抗-(ox)MIF抗体编码DNA序列的表达质粒通过适当的转染方法转入适当的宿主细胞株，所述序列受一种或多种调控序列例如强启动子的控制，从而得到所转入的序列已经稳定整合到基因组的细胞。该脂质转染方法只是本发明可能使用的方法举例。

[0099] 抗-(ox)MIF抗体的制备也可包含本领域已知的用于培养所述转化细胞的任何方法，例如在连续或分批培养中，以及抗-(ox)MIF抗体的表达，例如组成型或诱导型表达。特别是在WO 2009/086920中提及的抗-(ox)MIF抗体的制备作为进一步参考。在一个优选的实施例中，根据本发明制备的抗-(ox)MIF抗体可以结合oxMIF或其表位。根据本发明，特别优选的抗体是抗体RAB9、RAB4和/或RAB0，以及RAM9、RAM4和/或RAM0。

[0100] 这些抗体的序列群体也已在WO 2009/086820中公开，本申请的其他序列如下所示：

[0101] RAB9轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:1：

[0102] DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQRIM TYLNWYQQKP GKAPKLLIFVASHSQSGVPS RFRGSGSETD FTLTISGLQP EDSATYYCQQ SFWTPLTFGGGTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC；

[0103] RAB4轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:2：

[0104] DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIYGTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；

[0105] RAB0轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:3：

[0106] DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIYGTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；

[0107] RAB2轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:4：

[0108] DIQMTQSPVT LSLSPGERAT LSCRASQSVR SSYLAWYQQK PGQTPRLLIYGASNRATGIP RTVDRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGNSLTFGGGTKVEIK AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC；

[0109] RAB9重链的氨基酸序列SEQ ID NO:5：

[0110] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMNWVRQA PGKGLEWVSSIGSSGGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGSQWLYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK；

[0111] RAB4重链的氨基酸序列SEQ ID NO:6：

[0112] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSGIVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVNVIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK；

[0113] RAB0重链的氨基酸序列SEQ ID NO:7：

[0114] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMDWVRQA PGKGLEWVSGIYPSGGRTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVNVIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK；

[0115] RAB2重链的氨基酸序列SEQ ID NO:8：

[0116] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSGIVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVNVIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK；

[0117] RAM0hc的氨基酸序列SEQ ID NO:9：

[0118] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMDWVRQA PGKGLEWVSGIYPSGGRTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVNVIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK；

[0119] RAM0lc的氨基酸序列SEQ ID NO:10：

[0120] DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIYGTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；

[0121] RAM9hc的氨基酸序列SEQ ID NO:11：

[0122] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMNWVRQA PGKGLEWVSSIGSSGGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGSQWLYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK；

[0123] RAM91c的氨基酸序列SEQ ID NO：12：

[0124] DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQRIM TYLNWYQQKP GKAPKLLIFVASHSQSGVPS RFRGSGSETD FTLTISGLQP EDSATYYCQQ SFWTPLTFGGGTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLS STLT LSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC；

[0125] RAM4hc的氨基酸序列SEQ ID NO：13：

[0126] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSGIVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVNVIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK，RAM41c的氨基酸序列SEQ ID NO：14：

[0127] DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIYGTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC。

[0128] 本发明的抗-MIF抗体优选是分离的单克隆抗体。该抗-MIF抗体可以使IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在其他实施例中，该抗-MIF抗体是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类。在其他实施例中，该抗体是IgG1或IgG4亚类。在其他实施例中，该抗体是IgG4亚类。在一些实施例中，该IgG4抗体带有一个单独突变，而将丝氨酸(丝氨酸228，根据Kabat编号方案)改变成脯氨酸。相应地，IgG4的Fc区域中的子序列CPSC变为CPPC，CPPC是IgG1的子序列(Angal et al.Mol Immunol.1993，30，105-108)。

[0129] 此外，抗-(ox)MIF抗体的制备可包含本领域用于纯化抗体的任何方法，例如通过阴离子交换色谱或亲和色谱。在一个实施例中，抗-(ox)MIF抗体可以通过体积排阻色谱从细胞培养基上清液中纯化得到。

[0130] 术语MIF的“中心区域”和“C端区域”分别是指包含人类MIF氨基酸35-68和氨基酸86-115的区域，优选分别包含人类MIF氨基酸50-68和氨基酸86-102的区域。本发明的抗体特别优选能够结合人类MIF的氨基酸50-68或86-102的区域。这同样反应在本发明优选的抗体上，例如RAB0、RAB4、RAB2和RAB9，以及RAM4、RAM9和RAM0，它们的结合如下所示：

[0131] RAB4和RAM4：aa 86-102

[0132] RAB9和RAM9：aa 50-68

[0133] RAB0和RAM0：aa 86-102

[0134] RAB2：aa 86-102

[0135] 术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或抗体片段的任何蛋白决定簇。抗原决定簇一般由化学性质活性的表面基团分子例如暴露的氨基酸、氨基糖或其他碳水化合物侧链构成，一般具有特异的三维结构特点以及特异的电荷特征。

[0136] 术语“载体”是指一个核苷酸分子，其能够将其他的核苷酸运输至与其被连接处。在一些实施例中，所述载体是质粒，即连接有额外DNA片段的圆形双链DNA环。

[0137] 术语“宿主细胞”是指细胞系，其在引入表达载体后可以制备重组蛋白。术语“重组细胞系”是指已经引入重组表达载体的细胞系。应该理解的是，“重组细胞系”不仅指特定个体细胞系，也指该细胞系的后代。由于突变或者环境影响，特定修饰可能发生在后代中，其后代虽然事实上可能和母细胞不一致，但是仍然属于此处所述的术语“重组细胞系”的范围之内。

[0138] 根据本发明的宿主细胞类型是例如COS细胞、CHO细胞或例如HEK293细胞或其他任何本领域技术人员已知的宿主细胞，也包括例如细菌细胞例如大肠杆菌细胞。在一个实施例中，该抗-MIF抗体在DHFR-缺乏CHO细胞系即DXB11中表达，其中添加G418作为选择标志物。当编码抗体基因的重组表达载体引入到CHO宿主细胞时，通过培养宿主细胞至足够的时间使得抗体在宿主细胞表达或者抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中，从而制备抗体。

[0139] 抗-(ox)MIF抗体可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收。

[0140] 本发明提供的联合治疗的第二个活性成分是化学治疗剂。

[0141] 一般意义而言，化学治疗剂是化合物，其可以用于治疗因细菌、病毒或寄生虫感染或正常细胞的转变(癌)而导致的疾病或紊乱。化学治疗的一个特别指示是癌症。化学治疗剂可以起到例如杀死比其他细胞分裂快的细胞的作用，因此可以靶向通常比非癌细胞分裂更快的癌细胞。

[0142] 大多数化学治疗剂通过损害细胞周期几个阶段中的一个阶段的细胞分裂而起作用。因此，它们能够靶向分裂更快的那些细胞。化学治疗剂可以是细胞抑制剂，即它们减慢或废除细胞的生长或分裂；其他化学治疗剂能够引起细胞损害并杀死它们；在那种情况下，它们被称为细胞毒性。大多学细胞毒性药物造成的损害不足以杀死细胞却能够产生启动程序性细胞死亡(凋亡)的刺激物。

[0143] 一般而言，化学治疗药物的主要种类是烷基化剂、抗代谢物、蒽环类化合物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和其他抗肿瘤剂。最常见地，如上所述，这些药物影响细胞周期的一个或若干个阶段；它们也影响DNA合成或DNA的完整性。其他化学治疗剂不直接干扰DNA。这些是化学治疗剂的新种类，其包括单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂例如甲磺酸伊马替尼。其他例子是化学治疗类激素和激素拮抗剂，例如糖皮质激素。

[0144] 烷基化亲核官能团的烷基化剂的例子，可以为二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法伦(苯丙氨酸氮芥)(melphalane)、三芥环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀、环己亚硝脲、达卡巴嗪、替莫唑胺、丝裂霉素C和其他。顺铂、卡铂、奥沙利铂和其他含铂化合物与DNA形成稳定的复合物。

[0145] 细胞毒性抗代谢物为叶酸类似物(例如氨甲蝶呤/氨喋呤、雷替曲塞、培美曲塞)、嘌呤(例如6-巯基嘌呤、咪唑硫嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨)或嘧啶(阿糖孢苷、吉西他滨、5-氟尿嘧啶和它的前体、去氮杂胞苷(deazacytidine))。抗代谢物通过干扰嘌呤和嘧啶核苷酸从头合成中的关键步骤而抑制DNA合成，或它们在细胞周期S期被整合到DNA，在这里它们干扰DNA折叠、DNA修复或甲基化。或者，一些化合物被整合入RNA。

[0146] 源自植物的并通过妨碍微管功能而阻止细胞分裂的生物碱和萜类的例子是长春花生物碱和紫杉烷。特别出名的长春花生物碱是长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛。足叶草毒素是植物来源的另一个例子。紫杉烷的一个例子是多烯紫杉醇或紫杉醇。雌莫司汀是靶向微管蛋白的合成化合物的一个例子。

[0147] 拓扑异构酶抑制剂是酶的抑制剂，其可以维持DNA的拓扑结构，举例包括喜树碱例如伊立替康和拓扑替康(类型1拓扑异构酶抑制剂)或安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷(拓扑异构酶类型2抑制剂)。最后，抗肿瘤药螯合剂的例子包括更生霉素、阿霉素、表阿霉素、博来霉素和其他。

[0148] 综述见如下所示的Goodman和Gilman，治疗药理学基础，第12版：“癌症化疗的一般原则”。

[0149] 以下是烷基化剂的举例：

[0150] 二氯甲基二乙胺

[0151] 环磷酰胺异环磷酰胺

[0152] 美法仑

[0153] 苯丁酸氮芥

[0154] 甲基苄肼(N-甲基肼，MIH)

[0155] 二甲磺酸丁酯

[0156] 卡莫司汀(BCNU)

[0157] 链脲菌素(等于streptozotocin)

[0158] 苯达莫司汀

[0159] 达卡巴嗪(DTIC；dimethyltriazenol midazole carboxamide)

[0160] 替莫唑胺

[0161] 顺铂、卡铂、奥沙利铂

[0162] 以下是抗代谢物举例：

[0163] 氨甲蝶呤(Amethopterin)

[0164] 培美曲塞

[0165] 氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)，卡培他滨

[0166] 阿糖孢苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)

[0167] 吉西他滨

[0168] 5-氮杂胞苷

[0169] 脱氧-5-氮杂胞苷

[0170] 巯嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)

[0171] 喷司他丁(2’-脱氧助间型霉素)

[0172] 氟达拉滨

[0173] 氯法拉滨

[0174] 奈拉滨

[0175] 也可以选择下述天然产品：

[0176] 长春花碱

[0177] 长春瑞滨

[0178] 长春新碱

[0179] 紫杉醇、多烯紫杉醇

[0180] 依托泊苷

[0181] 替尼泊苷

[0182] 拓扑替康

[0183] 伊立替康

[0184] 更生霉素(放线菌素D)

[0185] 道诺霉素(道诺霉素、红比霉素)

[0186] 阿霉素

[0187] 曲贝替定

[0188] 米托蒽醌

[0189] 博来霉素

[0190] 丝裂霉素C

[0191] L-天冬酰胺酶

[0192] 激素和拮抗剂举例如下：

[0193] 米托坦(o.p'DDD)

[0194] 强的松

[0195] 己酸羟孕酮

[0196] 醋酸甲羟孕酮、甲地孕酮

[0197] 己烯雌酚、炔雌醇

[0198] 三苯氧胺、托瑞米芬

[0199] 阿那曲唑、来曲唑、依西美坦

[0200] 丙酸睾酮、氟羟甲睾酮

[0201] 氟他米特、康士得

[0202] 亮丙瑞林

[0203] 进一步试剂的例子如下：

[0204] 羟基脲

[0205] 维甲酸、三氧化二砷

[0206] 组蛋白脱乙酰酶抑制剂(伏立诺他)

[0207] 伊马替尼

[0208] 达沙替尼、尼罗替尼

[0209] 吉非替尼、埃罗替尼

[0210] 索拉非尼

[0211] 舒尼替尼

[0212] 拉帕替尼

[0213] 硼替佐米

[0214] 干扰素-α

[0215] 白介素-2

[0216] 萨力多胺

[0217] 来那度胺

[0218] 西罗莫司脂化物

[0219] 依维莫司。

[0220] 已经表明，化学治疗剂在减轻和治疗癌症中是成功的。然而，大多数化学治疗剂都和一系列副作用相关，在一些极端例子中，需要停止该治疗。在任何例子中，都应该尽可能避免对患者身心健康产生的进一步负担的副作用。

[0221] 根据本发明，通过将化学治疗剂和抗-MIF抗体结合，与化学治疗剂作为单独活性成分相比，其可以降低治疗必须的化学治疗剂的用量，其中，该用量对于给定治疗是必需的。与单独使用化学治疗剂相比，本发明的另一个可能是维持化学治疗剂的用量，但却对病人具有更高治疗效应。

[0222] 病人治疗效应的增加也表明可以联合抗-MIF抗体和低剂量的化学治疗剂，来达到单独使用化学治疗取得的治疗效应的可能性，例如在化学治疗的副作用导致不能够继续用更高剂量治疗的情况下使用。本申请的发明人已经表明联合使用化学治疗和抗-MIF抗体的作用相比于单独使用抗-MIF抗体或化学治疗剂更高的治疗效应。

[0223] 本领域的技术人员可以容易地确定治疗效应，其涉及缩小或改进或减轻给定症状。确定如治疗效应的方法是已知的，例如可以通过测定患者在用MIF拮抗剂和化学治疗剂治疗后的存活可能性或存活时间，或者对带有相同疾病的其他个体单独用上述试剂中的一种治疗后的存活可能性或存活时间，或测定同一个病人随着时间症状的改变。本领域技术人员熟知的一个例子是Kaplan-Meier-Plot。

[0224] 其他方法/实验是已知的，并且能从一般教科书中得到，例如治疗学的药理学基础，第12版，“癌症化疗的一般原则，前言”。该文献以全文引用的方式包含在此处；其他方法/实验为本申请实施例所记载的方法/实验。根据本发明，优选的化学治疗剂是阿霉素和吉西他滨。在优选的实施例中，阿霉素可以和顺铂联合使用。

[0225] 同样优选的是例如紫杉醇(abraxane)。

[0226] 特别优选的联合是：

[0227] -阿霉素，特别优选和顺铂以及抗-MIF抗体联合用于治疗卵巢癌，或[0228] -吉西他滨和/或紫杉醇，特别优选和抗-MIF抗体联合用于治疗胰腺癌。

[0229] 在一个优选实施例中，上述联合中抗-MIF抗体选自RAB9、RAB4和RAB0。

[0230] 在上下文中的“癌症”包含细胞或一组细胞表现出不受控制的增长、入侵(侵入或破坏相邻组织)和有时候的代谢的所有失调或疾病。进一步地，在优选的实施例中，所述癌症是MIF相关的。MIF-相关的癌症是例如淋巴瘤、肉瘤、前列腺癌和结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝细胞癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌以及子宫内膜异位。

[0231] 本申请可能的剂型设想成片剂、胶囊、袋剂或丸剂。颗粒剂作为优选的剂型，可以装入胶囊或袋剂或者可以压缩成片剂或丸剂。

[0232] 本发明还包括的剂型是饮品或糖浆、酏剂(elixirs)、药酒、悬浮液、溶液、水凝胶、膜剂、锭剂、口香糖、口腔速崩片、漱口水、牙膏、润唇膏、含药洗发水、纳米球悬浮液和微球体片剂和气雾剂、吸入剂、喷雾、烟或加热用粉末形式和典型应用的剂型例如膏、凝胶、搽剂或软膏、药膏、滴耳液、滴眼液和皮肤贴布。

[0233] 进一步包含栓剂，其可被用于例如直肠给药或阴道给药。所有这些剂型对于本领域技术人员都是已知的。

[0234] 根据本发明优选的剂型是口服药例如颗粒剂、包膜颗粒、片剂、肠溶片剂、药丸、栓剂和乳剂。更优选的是颗粒剂和片剂。其他优选的剂型是肠胃或局部用药剂型。抗MIF抗体特别优选的给药途径是皮下或静脉给药。化学治疗剂优选的给药方式是口服给药(例如颗粒剂、液体、袋剂或片剂)。化学治疗剂进一步优选的给药方式是局部用药，其中所述局部用药包含涂覆到皮肤和/或喷雾，例如鼻腔喷雾或吸入剂。化学治疗剂进一步优选的给药方式是静脉注射或通过皮下注射(包括缓释配方)。

[0235] 然而大部分可以通过任何已知的方式给药。

[0236] 术语“联合”或“联合治疗”在此处交换使用。它们是指一种给药方案，其中抗-MIF抗体和化学治疗剂同时或先后给药或顺序相反。所述给药方案一般为每日给药化学治疗剂，每两周给药抗-MIF抗体。优选的给药方案为：

[0237] 如上所述，抗-MIF抗体可以和化学治疗剂同时或先后给药。“同时”在上下文中是指给药抗-MIF抗体和给药化学治疗剂的时间间隔不超过10分钟。“先后”是指给药抗-MIF抗体和给药化学治疗剂的时间间隔在10分钟以上。因此时间间隔可以是10分钟以上、30分钟以上、1小时以上、3小时以上、6小时以上或12小时以上。

[0238] 抗-MIF抗体和化学治疗剂的剂型主要需要能够确保两种化合物在体内存在的时间相同(特定时间段)。抗-MIF抗体的半衰期一般为2-4周，化学治疗剂的半衰期为2-48小时。

[0239] 因此，上述联合治疗也明确地包含了连续给药方案，其中在该方案中本领域技术人员会考虑各自的化学治疗剂和抗体的已知半衰期问题。鉴于此，抗体的半衰期一般为2-4周，考虑所用抗体的给药时间可以是2周一次、3周一次或一个月一次。在一个典型实施例中，本发明所述的用于和抗体联合给药的化学治疗剂的半衰期是2-48小时；因此，化学治疗剂的给药时间间隔是每隔5小时、每隔6小时、一天三次、一天两次、一天一次、一周一次或在一个典型实施例中每三周一次。

[0240] 然而根据本发明，化学治疗剂的剂量以及抗体的联合剂量需要执业医生基于需要治疗的特定紊乱的个例以及患者的详情来决定。本领域技术人员可以知晓对给定化学治疗剂各自的指导方案。

[0241] 基于疗效性化学治疗的一般理解，人们会期望能够施用最大耐受剂量以取得最期望的剂量密度。只有当存在毒性时(即嗜中性粒细胞<4000(但>2500)＝给药一半的剂量，2
见顺铂或环磷酰胺)，才会降低剂量。大多数化学治疗剂的给药都是基于(m)g/m身体表面积。在小鼠、大鼠和人类之间耐受性和功效的区别一般是基于身体表面积计算剂量的。

[0242] 在一个特别优选的实施例中，所述活性成分的递送应当是可控的，例如延迟释放。也就是说，本发明所述的包含这样的活性成分的口服给药剂型能通过包衣进行提供。因此，在本发明一个优选的实施例中，涉及含有包衣的颗粒剂，特别地，所述颗粒包含活性成分，且所述活性成分以可控的方式释放，其中这些颗粒都有包衣。

[0243] 更优选的，这些包衣是药学可接受的包衣，特别优选的是肠溶衣、延长释放包衣或延迟释放包衣；所有这些包衣对于本领域技术人员都是已知的。

[0244] 体内保护性抗-MIF的单克隆抗体(mAbs)(例如RAB9、RAB4、RAB0)的亚类，在还原态时不和未修饰过的MIF结合，所述保护性抗-MIF的单克隆抗体针对促炎性细胞因子MIF(巨噬细胞移动抑制因子)。相比之下，显示这些mAbs对氧化还原依赖性MIF异构体具有高度选择性。

[0245] 一种特别优选的抗体是抗体RAB9。

[0246] 另一种特别优选的抗体是抗体RAB4。

[0247] 再一种特别优选的抗体是抗体RAB0。

[0248] 非常优选的抗体是抗体RAB9。

[0249] 如本发明所示，此处提到的联合治疗是有利的，它使得两种成分具有协同效应。

[0250] 通过实施例对本发明进行以下描述，但这些实施例不应该被认为是对本发明的限制。

[0251] 参考实施例

[0252] A)用于抗体筛选的GCO实验

[0253] THP1悬浮培养基离心，细胞用新鲜的全培养基重悬至细胞密度为每毫升含106个细胞。该培养基转移到96微孔板中(90μl/孔)，添加潜在的抗-MIF抗体，其终浓度为75μg/ml。一式三份测试每个抗体。在37℃o/n孵育之后，添加地塞米松并且浓度为2nM，在37℃孵育一小时之后，添加LPS(终浓度为3ng/ml)。在37℃孵育六小时之后，收获上清液，使用商购的ELISA测定IL-6浓度。一式三份的所有结果取平均值，测定相比对照抗体的IL-6分泌的百分比。导致IL-6分泌率低于75％的抗体被认为是阳性。

[0254] B)测定IC50值的实验

[0255] 除了增加所用抗体的含量(一般为1-125nM)，其他依照筛选实验中所述的方法进行本实验。相比于阴性对照抗体，得到的剂量反应曲线表示为％抑制。该曲线用于计算抗体的最大抑制效应(％Inh max)和具有50％最大抑制效应(IC50)的抗体浓度。

[0256] C)细胞增殖抑制

[0257] 血清可以刺激静止的NIH/3T3分泌MIF，并且MIF反过来可以刺激细胞增殖。因此，抑制内源性MIF的抗体会降低静止的NIH/3T3细胞的增殖。增殖的降低可以通过添加3
H-胸苷测定。

[0258] 包含10％血清的96孔板中，每孔含1000个NIH/3T3细胞在37℃培养整个周末。然后，细胞再含有0.5％血清的培养基中在37℃饥饿培养过夜。去除0.5％的培养基，用新鲜的包含10％血清、75μg/ml抗体和5μCi/ml的3H-胸苷培养基替换。在和CO2培养箱中
37℃下培养16小时之后，每孔中的细胞用150μl的冷PBS冲洗。使用多通道吸管在每孔中添加150μl 5％(w/v)TCA溶液，然后在4℃下孵育30分钟。用150μl PBS冲洗平板。每孔添加75μl的0.5M NaOH溶液和0.5％SDS，混合后，储存在室温下。通过将5ml Ultima Gold(Packard)和75μl的样品溶液混合后，在β-计数器测量样品。每个测量都是一式三份，其值通过t-检验和对照抗体相比较。能够显著降低增殖的抗体(P<0.05)被认为是阳性的。

[0259] D)结合研究：抗-MIF抗体的表位决定簇

[0260] 用连接缓冲液(coupling buffer)稀释每种肽后，得到一般为1μg/ml浓度的肽，TM并添加到微板中(NUNC Immobilizer Amino Plate F96Clear)，然后在4℃下孵育过夜(100μl/孔)。使用重组的全长MIF和PBS作为对照。平板用200μl PBST冲洗三次，添加抗体(PBS中2-4μg/ml)(100μl/孔)，在室温下孵育2小时并轻轻摇晃。平板用200μl PBST冲洗三次，并添加检测抗体(例如标记的Fc特异性抗-人类IgG/HRP，Sigma)(100μl/孔)。在室温下孵育并轻轻摇晃1小时，所述平板用200μl PBST冲洗三次。每孔用100μl TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液(T-0440,Sigma)在暗处孵育30分钟。通过每孔添加
100μl1.8M H2SO4终止染色反应。在450nm下测量样品。

[0261] E)通过Biacore测定抗-MIF抗体的Fab片段的亲和性

[0262] 典型地，将40RU单位的人类重组MIF和CM5(＝甲基葡聚糖)基质(Biacore)固定在感应芯片上。稀释于HBS-EP中的Fab片段注射的浓度范围一般为6-100nM。每次循环之后，该芯片都用50mM NaOH+1M NaCl重新生成。根据1:1Langmuir模型计算亲和性。

具体实施方式

[0263] 简介

[0264] 使用化学治疗药物治疗癌症和增生过多失调时，经常因严重的副作用或需要增加剂量而受阻。此外，已经证实很多肿瘤对化学治疗剂的干扰有抵抗。在本发明中，我们介绍了化学治疗化合物(例如吉西他滨、阿霉素或顺铂)的功效可以通过与MIF拮抗剂(例如抗-oxMIF抗体)的联合而增加。与各自的单独治疗相比，该联合具有改善癌症和增生过多失调的治疗的潜能，并能够显著延长病人的预期寿命。

[0265] 综述

[0266]

[0267] 抗-MIF联合抗代谢物

[0268] (通过抗-MIF抗体联合吉西他滨示例)

[0269] 实施例1：使用BxPC3细胞系，全人类抗-MIF抗体RAM9和吉西他滨在异种移植模型中联合治疗胰腺癌

[0270] BxPC3细胞源自人类胰腺癌，一旦原位注射到裸小鼠中它们就开始在胰腺中生长并形成实体瘤。CD1-Foxn1/nv裸小鼠原位注射1×105BxPC3的细胞(注射30μl的基质胶：肿瘤细胞悬浮液注入胰腺)，允许7天形成肿瘤。用100mg/kg的吉西他滨(每三天给药一次，总共注射四次)联合60mg/kg的RAM9(在整个实验期间每隔一天给药一次)处理小鼠。
对照组的小鼠单独用100mg/kg的吉西他滨或60mg/kg的RAM9处理，作为单药治疗。其他对照组不处理，或者接受对照人类IgG1单克隆抗体处理。通过外部信号(例如：腹部膨大导致体重相比正常体重增加20％，或相比正常体重减少了20％)或临床信号(例如呼吸困难、黄疸、神经病学体征、消化障碍)判断内部肿瘤的生长。处死达到根据UK内政部指导规定的限值的动物(出于动物保护的原因)。得到的存活曲线作为本研究的主要结果。

[0271] 吉西他滨作为单药治疗仅仅少量地延长了异种移植小鼠的存活，并且实际上和RAM9的单药治疗的效应类似。然而，与以这两种试剂中的一种进行单独给药相比，抗-MIF抗体RAM9和吉西他滨的联合赋予了显著的存活优势，并且导致小鼠的总体存活增加20％，这表明两种试剂之间具有协同效应(图1)。

[0272] 实施例2：使用COLO357细胞系，全人类抗-MIF抗体RAM0和吉西他滨在异种移植模型中联合治疗胰腺癌

[0273] CD1-Foxn1/nu裸小鼠原位接种1×105Colo357细胞(注射30μl的基底胶：肿瘤细胞悬浮于胰腺)，允许7天形成肿瘤。用100mg/kg的吉西他滨(每三天给药一次，总共注射四次)联合60mg/kg的RAM0(在整个实验期间每隔一天给药一次)以腹腔注射来处理小鼠。对照组的小鼠单独用100mg/kg的吉西他滨或60mg/kg的RAM0处理，作为单药治疗。其他对照组不处理，或者接受对照人类IgG1单克隆抗体处理。通过外部信号(例如：腹部膨大导致体重相比正常体重增加20％，或相比正常体重减少了20％)或临床信号(例如呼吸困难、黄疸、神经病学体征、消化障碍)判断内部肿瘤的生长。处死达到根据UK内政部指导规定的限值的动物(出于动物保护的原因)。得到的存活曲线作为本研究的主要结果。

[0274] 吉西他滨作为单药治疗仅仅少量地延长了异种移植小鼠的存活而且统计学上没有显著意义。而RAM0作为单药治疗已经对存活具有显著效应。然而，“吉西他滨加抗-MIF抗体”的联合的有利效果显著高于单独使用这两种试剂的效果，因此表明吉西他滨和抗-MIF抗体之间具有协同效应(图2A)。存活时间的延长和肿瘤体积的下降相关，而且联合治疗导致肿瘤体积大大减少(图2B)。

[0275] 我们进一步分析了一小群动物中的血管密度。所有小鼠原位注射Colo357细胞，一周后确定肿瘤，不同的组用上述方法处理。在第12天，麻醉小鼠，并注射FITC-共轭的番茄凝集素，使得肿瘤中的血管密度显像。在动物用4％的多聚甲醛灌注之前，该凝集素能够循环3分钟。肿瘤切成50μm的部分。使用碘化丙啶对细胞核染色，使用共聚焦显微镜可以看到血管(Zeiss LSM 510META)，并使用ImagePro Plus软件(Image-Pro plus,Media Cybernetics)对微管密度进行量化。血管密度用占总表面积的平均百分比表示。我们的结果表明RAM0和吉西他滨的协同效应使得肿瘤微环境中的血管密度正常化。吉西他滨和RAM0作为单药治疗都没有显著效应(图2C)。

[0276] 抗-MIF联合螯合剂

[0277] (通过抗-MIF抗体和阿霉素的联合示例)

[0278] 实施例3：通过联合施用阿霉素和抗-MIF抗体诱导抗阿霉素人类卵巢癌细胞的凋亡

[0279] 在体外试验中，抗阿霉素A2780adr卵巢癌细胞单独用抗-MIF抗体RAM9或RAM0或和阿霉素联合处理。在处理72小时后，通过检测半胱天冬酶3的活性评估凋亡的引发。和同型对照抗体处理或未处理的细胞相比，未处理的细胞或用抗体单独处理的细胞中的半胱天冬酶3的活性没有增加。阿霉素引发了显著的但较小的半胱天冬酶3活性的增加。抗-MIF抗体和阿霉素的联合进一步加强了半胱天冬酶3的活性，因此诱导了凋亡。该结果表明，通过联合MIF中和抗体给药，原本抗阿霉素的细胞系开始对该化学治疗药物敏感。阿霉素和RAM0(图3A)或RAM9(图3B)的联合产生了可比较的结果。这些结果证实了，当抗-MIF和抗代谢物联合时，在体内观察到了协同增强的半胱天冬酶活性。

[0280] 抗-MIF联合烷基化剂

[0281] (用抗-MIF抗体联合顺铂示例)

[0282] 实施例4：抗-MIF抗体体外使A2780卵巢癌细胞对顺铂的作用敏感化[0283] 已经在顺铂依赖性细胞杀死实验中证实顺铂和抗-MIF抗体的协同效应。在没有或添加50nM RAM0或人类同型对照抗体下，A2780细胞和浓度提高的顺铂共同孵育。孵育TM48小时后的细胞用Accutase 分离，并用钙黄绿素-AM标记，用流式细胞仪测定钙黄绿素荧光水平。不使用任何药物或抗体时的平均荧光强度设定为1，以使实验间变化标准化。标记相对于顺铂浓度的平均荧光强度和计算顺铂最大活性浓度的半数值(EC50-值)。当顺铂和RAM0联合时，该EC-50值显著降低(p<0.01)(图4)。相比于同型对照抗体(数据没有显示)，抗-MIF抗体作为单药治疗(没有顺铂)对于细胞杀死没有作用。

[0284] 实施例5：抗-MIF抗体体内使A2780卵巢癌细胞对顺铂的作用敏感化[0285] 总结上述数据表明，在细胞培养中，RAM0使得卵巢癌细胞更容易被顺铂杀死。该效应有高度相关性，特别是如果也能在体内观察到。在雌性Mf1裸小鼠中进行研究，该裸小鼠6
接种A2780异种移植(图5)。小鼠(n＝10/组)接种重悬于基质胶的1*10A2780细胞。
在接种异种移植物一天后，开始每隔一天注射RAM0(15mg/kg)或人类同型对照抗体(15mg/kg)。在接种异种移植物第2天后，开始每隔一周给予顺铂。顺铂作为单药治疗对于肿瘤生长没有任何作用。RAM0有微小但不显著的影响。然而，RAM0使得肿瘤对顺铂治疗敏感化，顺铂和RAM0的联合治疗也表明肿瘤生长显著降低(p＝0.04)。

[0286] 抗-MIF联合螯合剂/天然制剂

[0287] (用抗-MIF抗体联合米托蒽醌示例)

[0288] 实施例6：抗-MIF抗体RAM0使得LnCAP前列腺癌细胞对米托蒽醌的细胞毒性作用敏感化

[0289] 米托蒽醌和抗-MIF抗体的协同效应已经在米托蒽醌依赖性细胞杀死试验中证实。

[0290] 在没有或添加100nM RAM0或人类异型对照抗体下，LnCAP细胞和浓度提高的米托TM蒽醌共同孵育。孵育48小时后的细胞用Accutase 分离，并用钙黄绿素-AM标记，用流式细胞仪测定钙黄绿素荧光水平。不使用任何药物或抗体时的平均荧光强度设定为1，以使实验间变化标准化。标记相对于米托蒽醌浓度的平均荧光强度和计算米托蒽醌最大活性浓度的半数值(EC50-值)。测定米托蒽醌/抗体联合(n＝10)的10组独立的EC50值，该结果如图6所示。米托蒽醌单独的EC50值测定为1.6nM。米托蒽醌和对照抗体的联合显示了相同的平均EC50值。然而，当米托蒽醌和RAM0联合时，平均EC50值显著地降低到0.97nM。相比于同型对照抗体(数据没有显示)，抗-MIF抗体作为单药治疗(没有米托蒽醌)对于细胞杀死没有作用。

[0291] 结论

[0292] 上述不同实验中，已经表明MIF抗体和标准的化学治疗药物的联合引起功效显著增强。在一个自发形成的胰腺模型中，测试抗-MIF抗体和抗代谢物(吉西他滨)的联合。相比于抗-MIF抗体和化学治疗药物附加的结果，该联合使得小鼠的存活时间显著延长。其次，在体外实验中，抗阿霉素细胞系通过和抗-MIF抗体共同孵育，使得抗阿霉素细胞系对阿霉素敏感化，这通过半胱天冬酶活性的增加证明。此外，抗-MIF抗体在体内模型中使得抗顺铂癌细胞对顺铂敏感化。进一步地，在体外试验中，米托蒽醌和抗-MIF抗体的联合使得E50平均值的显著降低。这是首次描述化学治疗药物和MIF-抑制子的协同效应。化学治疗剂和MIF抗体的联合治疗可以克服当前化学治疗剂干预的局限性，并改善患有增生过多失调的病人的治疗效果。

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抗-MIF抗体和化学治疗剂的联合治疗