化学治疗应答者的确定
阅读：786发布：2020-05-12
专利汇可以提供化学治疗应答者的确定专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种测定包含人 肺 癌细胞的 生物 样品是否对表皮生长因子受体 抑制剂 和 化学 治疗 剂的组合敏感的方法，所述方法通过测定磷 酸化 的AKT蛋白和/或 磷酸 化的MAPK蛋白在生物样品中的过量表达而进行。本发明还涉及用于获得候选药剂或者用于选择抑制患者肺癌发展的组合物的方法，其中应用磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白。，下面是化学治疗应答者的确定专利的具体信息内容。
1.一种确定包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因子受体抑制剂 和化学治疗剂的组合敏感的方法，所述方法包括：
测定磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白在所述生物样品中的过量 表达，
由此所述磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的过量表达是所述包 含人肺癌细胞的生物样品对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组 合敏感的指示。
2.按照权利要求1的方法，其中所述磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK 蛋白在所述生物样品中的过量表达通过下列步骤测定：
a)测定所述生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的 表达水平，
b)测定在包含对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合不敏感的人肺 癌细胞的生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的 表达水平，
c)测定在步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK 蛋白的表达水平的差异，由此确定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的 MAPK蛋白的过量表达。
3.按照权利要求2的方法，其中步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白 和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少10％。
4.按照权利要求2-3中任一项的方法，其中步骤a)和b)中测定的磷酸化 的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少25％。
5.按照权利要求1-4中任一项的方法，其中所述生物样品是原发性肺肿 瘤或转移瘤。
6.按照权利要求1-5中任一项的方法，其中EGFR抑制剂是erlotinib或 N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。
7.按照权利要求1-6中任一项的方法，其中所述化学治疗剂是吉西他滨 或顺铂。
8.按照权利要求1-7中任一项的方法，其中所述磷酸化的Akt蛋白或磷 酸化的MAPK蛋白的过量表达是使用特异性结合磷酸化蛋白的试剂测定 的。
9.权利要求8的方法，其中抗体、抗体衍生物或抗体片段特异性地结合 所述磷酸化的AKT蛋白或磷酸化的MAPK蛋白。
10.按照权利要求1-9中任一项的方法，其中所述磷酸化的AKT蛋白是 在与Akt1蛋白氨基酸位置473对应的氨基酸位置被磷酸化，或者所述 MAPK蛋白在与MAPK1氨基酸位置202和204对应的氨基酸位置被磷酸 化。
11.按照权利要求1-11中任一项的方法，其中MAPK蛋白的氨基酸序列 为氨基酸序列SEQ ID NO：1或2，AKT蛋白的氨基酸序列是氨基酸序列 SEQ ID NO：6，7或8。
12.按照权利要求1-11中任一项的方法，其中表达水平是应用选自由下 列各项组成的组的方法进行测定：蛋白质组学、流式细胞术、免疫细胞化 学、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定。
13.按照权利要求1-12中任一项的方法，其中磷酸化的AKT蛋白和/或 磷酸化的MAPK蛋白的过量表达通过下列步骤测定：
a)将所述生物样品进行免疫组织化学染色，
b)在肉眼观察生物样品中细胞的染色后，对于所述磷酸化的AKT蛋白和 /或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平，指定一个选自数字1，2，3和4 的等级，由此指定关于表达水平的最高可检测等级，
c)确定在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的 百分比，
d)将在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的百 分数乘以指定的等级并且乘以100，和
e)当步骤d)的乘法结果高于100时，确定所述生物样品中磷酸化的AKT 蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白过量表达。
14.结合磷酸化AKT蛋白的抗体或结合磷酸化MAPK蛋白的抗体的应 用，其用于确定包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因子抑制剂和 化学治疗剂的组合敏感。
15.一种选择抑制患者的肺癌发展的组合物的方法，所述方法包括：
a)在多种测试组合物的存在下，将来自患者的包括对EGFR抑制剂和化 学治疗剂的组合敏感的肺癌细胞的生物样品的等分试样分别暴露；
b)将与所述测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化的Akt蛋白 和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平与在不接触所述测试组合物的 生物样品的等分试样中磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的 表达水平相比较，
c)选择相对于没有接触所述测试组合物的等分试样在包含所述测试组合 物的等分试样中改变了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达 水平的测试组合物之一，其中在与所述测试组合物接触的生物样品的 等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在 没有接触所述测试组合物的生物样品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白 和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平之间至少10％的差异是选择所述 测试组合物的指示。
16.一种获得候选药剂的方法，所述方法包括：
a)将包含对EGFR抑制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样品的等 分试样与候选药剂接触，
b)测定与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/ 或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，并且测定在没有接触所述候选药剂 的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表 达水平，
c)通过将与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白 和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述候选药剂的生 物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水 平进行比较，而观察所述候选药剂的效果，
d)从所述观察到的效果获得所述药剂，其中在与所述候选药剂接触的生 物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水 平与在没有接触所述候选药剂的生物样品的等分试样中的磷酸化Akt 蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平之间至少10％的差异是所述 候选药剂效果的指示。
17.按照权利要求16的方法，其中所述候选药剂是候选抑制剂。
18.按照权利要求16的方法，其中所述候选药剂是候选增强剂。
19.一种候选药剂，其是通过按照权利要求16-18中任一项的方法获得 的。
20.一种药物制剂，其包含按照权利要求19的药剂。
21.按照权利要求19的药剂用于制备抑制肺癌发展的组合物的应用。
22.一种生产药物的方法，其包括权利要求16-18中任一项的方法的步 骤；和
i)以足以对受试者提供治疗有效量的所述药物的量合成在步骤
(c)中鉴定的候选药剂或其类似物或衍生物；和/或
ii)将步骤(c)中鉴定的候选药物候选药剂或其类似物或衍生物与 药用载体组合。
23.Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化的Akt蛋白、磷酸化的MAPK蛋白、 与磷酸化的Akt蛋白或磷酸化的MAPK蛋白选择性结合的抗体的应用， 其用于获得候选药剂或者用于选择抑制患者中肺癌的发展的组合物。
24.一种试剂盒，其包括针对磷酸化的MAPK和/或磷酸化的Akt蛋白的 抗体。
发明领域
本发明涉及一种检测包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因 子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的方法，所述方法通过测定磷酸化 的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白在生物样品中的过量表达而进行。 本发明还涉及获得候选药剂或者选择在患者中用于抑制肺癌进展的组合 物的方法，在所述方法中使用磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋 白。
发明背景
由erbB1基因编码的EGFR已经以因果方式涉及人类恶性肿瘤。特别 地，已经在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤 中观察到增加的EGFR表达。表皮生长因子受体(EGFR)，一种170-kD的 糖蛋白，由N端细胞外结构域、疏水跨膜结构域和包含激酶结构域的C 端细胞内区域组成。EGFR配体-诱导的二聚体化作用激活内部的RTK结 构域(一种Src同源结构域1，SH1)，这引起在细胞质结构域非催化尾的 6个特异EGFR酪氨酸残基的自动磷酸化作用。
癌细胞中EGFR激活的细胞作用包括增加的增殖、促进细胞运动、黏 附、侵入、血管发生、以及通过抑制细胞程序性死亡而增加的细胞存活。 激活的EGFR通过刺激促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应而诱导肿 瘤细胞增殖。一旦配体结合到EGFR上时，SOS鸟嘌呤核苷酸交换因子就 通过Grb2连接蛋白补充到质膜上，其在小G蛋白Ras上刺激GTP交换 成GDP，随后激活由Raf、MEK和ERK组成的MAPK级联反应。激活 的ERKs(pMAPK，pERK1/2)又磷酸化并且激活转录因子，诸如ELK-1或 c-Myc，从而促进细胞生长。
多种生长因子途径通过多种激酶的激活而促进NSCLC细胞的发展和 存活。EGFR还经由通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途径和STAT途径 进行信号传导而增强癌细胞的存活。Akt还通过其它生长因子激活，包括 胰岛素生长因子-1、碱性成纤维细胞生长因子以及白细胞介素3和6。Akt 的3个同种型1-3都是以相似的方式在活化结构域的残基T308和COOH- 末端结构域的S473被磷酸化(pAKT)。
Erlotinib(是一种有效的表皮生长因子受体(HER1/EGFR)酪 氨酸-激酶抑制剂(TKI)，当用作单独的药剂时，其为先前化学治疗失败的 非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者提供生存益处(WO 01/34574)。的功效在许多试验中进行研究。它的化学名为N-(3- 乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。
TALENT试验是在一线NSCLC患者中进行的安慰剂-对照的III期研 究，所述患者接受吉西他滨和顺铂(这种同时的化学治疗是非美国护理标 准(non-US standard of care)的)组合erlotinib(150mg/天)或 者组合安慰剂。初级目的是存活持续时间，次级目的是发展时间、反应率； 反应的持续时间；药物动力学和药效参数，以及生活质量。还评估了 HER1/EGFR和HER2表达率。进行了标准的安全性分析。TALENT试验 总的结果是阴性的。对于初级和次级目的，与单独的吉西他滨和顺铂相比， erlotinib加化学疗法(吉西他滨和顺铂)不存在明显的益处 (Gatzemeier，U.，等.，Proc Am Soc Clin Oncol 23(2004)617(Abstract 7010))。在使用erlotinib加卡铂和紫杉醇的基于美国的TRIBUTE研究中 观察到相同的结果(Herbst，R.S.，等.，J Clin Oncol(2004)ASCO Annual Meeting Proceedings.Post-Meeting Edition；22(July 15 Suppl.)(Abstract 7011))。将单独的药剂erlotinib作为二线或三线治疗剂用于非小细胞肺癌 (NSCLC)(BR.21；NCIC/OSIP)的随机化安慰剂-对照的III期研究发现，与 安慰剂(4.7个月)相比，使用erlotinib在存活上有统计学显著的提高(6.7 个月)。
许多研究涉及非小细胞肺癌中生物标记的研究以及它们与某些 EGFR抑制剂药物的关系。Han，等.，Int J Cancer 113(2005)109-115用 Gefitinib(IressaTM，EGFR TKI)单一治疗研究了65名患者。他们分析EGFR 下游分子在化疗-抗性非小细胞肺癌中作为gefitinib的应答预见性标记。 Cappuzzo，F.等.，JNCI 96(2004)1133-1141用Gefitinib(Iressa；EGFR TKI) 单一治疗研究了106名患者。他们在患有晚期非小细胞肺癌的患者中研究 Akt磷酸化作用和gefitinib的功效，并且发现接受gefitinib的具有P-Akt- 阳性肿瘤的患者比患有P-Akt-阴性肿瘤的患者从所述治疗受益更多。 Vicent，S.等.，Br J Cancer 90(2004)1047-1052研究了111名NSCLC患者。 他们发现在非小细胞肺癌中pERK被激活并且与晚期肿瘤相关。Han，S.W. 等.，J Clin Oncol 23(2005)2493-2501用Gefitinib(EGFR TKI)单一治疗研 究了90名患者。他们分析表皮生长因子受体突变在用gefitinib治疗的非 小细胞肺癌患者中的预见性和预后作用。Mukohara，T.等.，Lung Cancer 41 (2003)123-130研究了60名患者，每个阶段20名患者，其进行新佐剂化 学治疗或者放射治疗。EGFR表达与pERK和pAkt表达相关。正如作者 本身所提及的那样，样本的大小太小。Raben，D.等.，Int J Radiation Oncology Biol.Phys 59(2004)27-38研究了对于非小细胞肺癌的靶向治 疗。Ono，M.等.，Mol Cancer Ther 3(2004)465-472检验了9种NSCLC细 胞系，并且用gefitinib处理。Hirsch，F.R.等.，Curr Opin Oncol 17(2005) 118-122综述了Akt和MAPK的磷酸化作用状况作为gefitinib抗性的潜在 标记。Meert，等.，Clinical Cancer Research 9(2003)2316-2326在EGFR抑制 剂活性方面研究了NSCLC细胞系。EGFR和Her2表达水平都不与EGFR 抑制剂的敏感性相关。Brognard，J.等.，Cell Death and Differentiation 9 (2002)893-904分析了19株NSCLC细胞系，其中17株表现出Erk1/2磷 酸化作用和组成型活性。David，O.等.，Clinical Cancer Research 10(2004) 6865-6871公开pAkt的过量表达是NSCLC中独立的预后因子。Kakiuchi， S.等.，Human Molecular Genetics 13(2004)3029-3043研究了33名NSCLC 患者的基因组广谱cDNA微点阵。所有微点阵都在单一治疗设备中给予 gefitinib。对于Akt/pAkt表达水平、EGFR基因状况或者pEGFR染色以及 gefitinib应答之间的相关性没有发现任何证据。Kim，R.H.等.，Cancer Cell 7 (2005)263-273公开了癌基因DJ-1表达与pAkt水平相等。Balsara，B.R. 等.，Carcinogenesis 25(2004)2053-2059研究了110名具有TMA pAkt表达 的NSCLC患者。在pAkt阴性和阳性之间不存在存活的显著差异。Hirami， Y.等.，Cancer Letters 214(2004)157-164研究了非小细胞肺癌中表皮生长 因子受体、pAkt和低氧诱导因子-1α的关系。Lee，S.H.等.，APMIS 110(2002) 587-592分析NSCLC患者的43LN转移。NSCLC中的Akt激活在肿瘤发 育中而不是在发展中起作用。Engelman，J.A.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2004)3788-3793分析erbB-3在gefitinib-敏感性非小细胞肺癌细胞系 中介导磷酸肌醇3-激酶活性。David，O.，J Cell Mol Med 5(2001)430-433 讨论了Akt和PTEN在肺癌中作为新的诊断标记的作用。Mantha，A.等.， Clin.Cancer Res.11(2005)2398-2407研究了抑制表皮生长因子受体功能 的甲羟戊酸途径的靶向。
在WO 2004/046386中研究了与EGFR阳性癌症相关的预后标记。 US 2004/0157255公开了应答EGFR抑制剂药物的基因表达标记。 WO 2004/063709公开了测定对表皮生长因子受体调节剂敏感性的生物标 记和方法。WO 01/00245描述了人源化抗-ErbB2抗体和用抗-ErbB2抗体 诸如人源化抗-erbB2抗体治疗癌症的方法。
发明概述
还存在提供测定对EGFR抑制剂治疗的敏感性、特别是EGFR抑制剂 与化学治疗剂组合治疗的敏感性的方法的需要。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种测定包含人肺癌细胞 的生物样品是否对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的 方法，所述方法包括测定磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白在生 物样品中的过量表达，由此磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白 的过量表达是包含人肺癌细胞的生物样品对表皮生长因子受体抑制剂和 化学治疗剂的组合敏感的指示。
在本发明的另一个实施方案中，应用与磷酸化的AKT蛋白结合的抗 体或与磷酸化的MAPK蛋白结合的抗体来测定包含人肺癌细胞的生物样 品是否对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合敏感。
在本发明的另一个实施方案中，提供选择用来在患者中抑制肺癌发展 的组合物的方法，所述方法包括：
a)在多种测试组合物存在下，分别暴露包含来自患者的对EGFR抑 制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样品的等分试样；
b)将与测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和 /或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与没有接触测试组合物的生物 样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表 达水平进行比较；
c)选择相对于没有接触测试组合物的等分试样，在包含所述测试组 合物的等分试样中改变了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋 白的表达水平的测试组合物之一，其中在与所述测试组合物接触 的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋 白的表达水平与在没有接触所述测试组合物的生物样品的等分 试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平之 间存在至少10％的差异是选择所述测试组合物的指示。
在本发明的另一个实施方案中，提供了获得候选药剂的方法，所述方 法包括：
(a)将包含对EGFR抑制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样 品的等分试样与候选药剂接触，
(b)测定与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt 蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，并且测定在没有接 触所述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/ 或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，
(c)通过将与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化 Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所 述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷 酸化MAPK蛋白的表达水平进行比较，而观察所述候选药剂的 效果，
(d)从所述观察到的效果获得所述药剂，其中在与所述候选药剂接 触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化 MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述候选药剂的生物样 品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的 表达水平之间存在至少10％的差异是所述候选药剂效果的指 示。
在本发明的另一个实施方案中，提过通过按照本发明的方法获得 (derived)的候选药剂和包括按照本发明的药剂的药物制剂。
在本发明的另一个实施方案中，按照本发明的药剂用来制备抑制肺癌 发展的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供生产药物的方法，其包括本发明 的方法的步骤和
(i)以足以对受试者提供治疗有效量的所述药物的量合成在步 骤(c)中鉴定的候选药剂或其类似物或衍生物；和/或
(ii)将步骤(c)中鉴定的候选药物候选药剂或其类似物或衍生物 与药用载体组合。
在本发明的另一个实施方案中，应用Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化 Akt蛋白、磷酸化MAPK蛋白、选择性与磷酸化Akt蛋白或磷酸化MAPK 蛋白结合的抗体来获得候选药剂，或者来选择在患者中抑制肺癌发展的组 合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供包含针对磷酸化MAPK和/或磷 酸化Akt蛋白的抗体的试剂盒。
术语“生物样品”应该一般意指从个体、体液、细胞系、组织培养物 或其它来源获得的任何生物样品。体液例如淋巴、血清、血浆、尿、精液、 滑液和脊髓液。按照本发明，所述生物样品包括肺癌细胞和非肺癌细胞(其 它细胞)。获得来自哺乳动物的组织活检和体液的方法是本领域公知的。
术语“表达的水平(level of expression)”或“表达水平(expression level)”通常是指样品中氨基酸产物或蛋白的量，优选为按照本发明的样 品中磷酸化的氨基酸产物或或磷酸化的蛋白的量。“表达”是指这样的过 程，即通过这样的过程基因编码的信息转化成在在细胞中存在并且运作的 结构，按照本发明包括它们的磷酸化作用。当用于本文时，“表达的基因” 包括转录成mRNA然后翻译成蛋白并且翻译后修饰如磷酸化的那些基因。 只是为了完整，这一术语还应该包括转录成RNA但是不翻译成蛋白的那 些表达的基因(例如，转运和核糖体RNAs)。术语“过量表达”和“低 量表达(underexpression)”分别是指当与用作对照的样品中的基线表达水 平相比时表达水平的向上或向下的偏差。因此，“过量表达”也是“增加 的表达”，“低量表达”是“减少的表达”。
本文中术语“抗体”以最宽泛的意义应用，并且特别涵盖完整的单克 隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体 (multispecific antibodies)(例如双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它 们表现出理想的生物活性。
当用于本文时，术语“单克隆抗体”是指从一群基本上均一的抗体获 得的抗体，即，包括所述群体的个体抗体是相同的，除了可能天然存在的 突变之外，而且这种突变可能以较少量存在。单克隆抗体是高度特异的， 针对单一的抗原性位点。此外，多克隆抗体制备物包含针对不同决定簇(表 位)的不同的抗体，与多克隆抗体制备物相反，每一单克隆抗体针对抗原 上的单一的决定簇。除了它们的特异性，由于它们可以不受其它抗体的污 染而合成，所以单克隆抗体是是有利的。修饰词“单克隆”是指抗体的特 征，即从基本上均一的抗体群体获得，并且不解释成(constructed)需要 通过任何具体方法的抗体生产。例如，按照本发明应用的单克隆抗体可以 通过最先由Kohler，G.等.，Nature 256(1975)495描述的杂交瘤方法进行制 备，或者可以通过重组DNA方法进行制备(参见，例如，U.S.Pat.No. 4,816,567)。“抗体片段”包括完整的抗体的片段。
“结合”按照本发明的目的抗原(即磷酸化MAPK或磷酸化的pAKT 蛋白)的抗体是这样的一种抗体，即能够以足够的亲和力与所述抗原结合， 以致所述抗体用于检测所述抗原的存在。按照本发明的抗体是一种结合磷 酸化的MAPK或磷酸化的pAKT蛋白的抗体，与非磷酸化的MAPK或非 磷酸化的pAKT蛋白相比，它通常优选地结合磷酸化的MAPK或磷酸化 的pAKT蛋白，或者不显著地与非磷酸化的MAPK或非磷酸化的pAKT 蛋白交叉反应。在这样的实施方案中，当通过荧光激活细胞分选术(FACS) 分析或放射免疫沉淀(RIA)测定时，所述抗体与非磷酸化的蛋白的结合程 度应该低于10％。换句话说，它应该特异性地结合磷酸化MAPK或磷酸 化pAKT蛋白，并且不特异性地结合或者全然不结合非磷酸化MAPK或 非磷酸化pAKT蛋白。
“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗药剂的实例 包括烷基化试剂，诸如塞替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)、烷基磺酸酯诸 如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶诸如苯并多巴(benzodopa)、卡 波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；氮丙啶和 methylamelamines，包括六甲蜜胺、三乙蜜胺(triethylenemelamine)、三 乙磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙硫代磷酰胺 (triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)； 氮芥(nitrogen mustards)诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、 cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、氮 芥氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥， 苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，曲磷胺，乌拉莫司汀；亚硝基脲(nitrosureas)， 诸如卡莫司汀，氮脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗 生素诸如阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，偶氮丝氨酸，博来霉素，放 线菌素C，calicheamicin，carabicin，去甲柔红霉素，嗜癌霉素，色霉素，放 线菌素D，柔红霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表 柔比星，依索比星，伊达比星，马塞罗霉素，丝裂霉素，麦考酚酸，诺拉霉 素，橄榄霉素，培洛霉素，poffiromycin，嘌罗霉素，三铁阿霉素，罗多比星， 链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢 物诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如denopterin，甲氨 喋呤，喋罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨，6-巯嘌呤， thiamiprine，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物诸如安西他滨，阿扎胞 苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨， 氟尿苷，5-FU；雄激素诸如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷， 睾内酯；抗肾上腺(anti-adrenals)诸如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶 酸补偿物诸如frolinic acid；醋葡醛内酯；羟醛磷酰胺配糖 (aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群； 依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利 醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托 蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星；鬼 臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮 杂酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘 露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷 (″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替哌；紫杉烷类，例如，紫杉醇， Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(， Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌 呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊 苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨； 诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；适罗达；伊班膦酸盐； CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸； esperamicins；卡培他滨；以及任何上述物质的药用盐，酸或衍生物。下列 物质也包含在本发明中，它们是：作用调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗 激素药剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制的 4(5)-咪唑(aromatase inhibiting 4(5)-imidazoles)，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔 芬，keoxifene，LY117018，奥那司酮，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素 诸如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及药用盐、 酸或者任何上述物质的衍生物。“化学治疗剂”本身可以是上文提及的用 于治疗癌症组合的化学化合物的组合，即，所述组合可以是吉西他滨/顺 铂，还可以如顺铂/紫杉醇、顺铂/多西他赛、顺铂/长春瑞滨、吉西他滨/ 卡铂、或卡铂/多西他赛。
术语“EGFR抑制剂”是指与EGFR结合并且任选地抑制EGFR活化 的治疗药剂。这样的药剂的实例包括与EGFR结合的抗体和小分子。与 EGFR结合的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见，US 4,943,533，Mendelsohn等.)以及其变体，诸如嵌合的225 (C225或Cetuximab；)和改造的人225(H225)(参见 WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；结合11型突变体EGFR的抗体(US 5,212,290)；如US 5,891,996所述与EGFR结合的人源化的和嵌合的抗体； 以及结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF(参见WO 98/50433，Abgenix)。 抗EGFR抗体可以与细胞毒素试剂缀合，这样产生一种免疫缀合物(参见， 例如，EP 0 659 439 A2，Merck Patent GmbH)。与EGFR结合的小分子的 实例包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)，CP-358774 (Genentech/OSI)和AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)。本申请中 特别优选的是EGFR酪氨酸激酶抑制剂，特别是小分子EGFR酪氨酸激酶 抑制剂，例如例如，“小分子”可以是具有低于每摩尔大约10,000 克、优选地低于每摩尔大约5,000克的分子量的肽或肽拟物。优选地，“小 分子”是一种化合物，即，有机或无机化合物，其具有这样的分子量：低 于每摩尔大约5,000克，优选地低于每摩尔大约1,000克，更优选地低于 每摩尔大约500克，以及这样的化合物的盐、酯和其它药用形式。因此， 在本发明的一个优选的实施方案中，EGFR抑制剂是EGFR酪氨酸激酶抑 制剂，其为具有下述分子量的化合物：低于每摩尔大约5,000克，优选地 低于每摩尔大约1,000克，以及这样的化合物的盐、酯和其它药用形式。 换句话说，所述EGFR抑制剂是一种抑制EGFR酪氨酸激酶活性的化合物， 并且具有这样的分子量：低于每摩尔大约5,000克，优选地低于每摩尔大 约1,000克，更优选地低于每摩尔大约500克，以及这样的化合物的盐、 酯和其它药用形式。
“吉西他滨”是化学治疗剂2′，2′-二氟脱氧胞苷(dFdC)，其为脱氧胞苷 的嘧啶类似物，其中脱氧核糖部分在2′位置包含2个氟原子(参见 Heinemann，V.等.，Cancer Res 48(1988)4024)。它可以作为从Eli Lilly和Company，Indianapolis，Indiana，USA商购获得。
当贯穿本申请应用时，“顺铂”是化学治疗剂顺-二氨基二氯铂(参见 US 5,562,925)，作为从Bristol-Myers Squibb Company，New York， NY，USA商购获得。“顺铂”是一种重金属复合物，其包含一个中央的铂 原子，铂原子被在顺式位置上的2个氯原子和2个氨分子围绕。
按照本发明，表述“包含对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的 组合敏感的人肺癌细胞的生物样品”应该意指，与只用表皮生长因子抑制 剂治疗比较，所述包含人肺癌细胞的生物样品对用表皮生长因子抑制剂和 化学治疗剂的组合治疗敏感。“敏感”还可以理解为“与之反应”或“表 现出与之反应”，特别是这样的反应对肺癌患者有益。因而，与只用表皮 生长因子抑制剂治疗比较，可以测定肺癌患者是否对用表皮生长因子受体 抑制剂和化学治疗剂的组合治疗敏感。这意味着患者将从这样的治疗中受 益。
“MAPK”蛋白是高度保守的胞质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一 员，叫作促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)或细胞外信号调控的激酶 (ERKs)。这一蛋白家族具有一些亚组。ERKs被激活并且酪氨酸或苏氨酸 被磷酸化，以应答广泛种类的细胞外信号，包括渗透压、热激、促炎细胞 因子、激素和分裂原。当用于本发明时，术语“MAPK蛋白”优选地是指 MAPK蛋白家族的一员，包括或者优选地由MAPK1和MAPK3组成。 MAPK1(ERK2)的氨基酸序列是SEQ ID NO：1，MAPK3(ERK1)(SEQ ID NO：2)。这些氨基酸序列由mRNA序列编码，即，对于MAPK1，cDNA 序列SEQ ID NO：3和4，对于MAPK 3，为SEQ ID NO：5。MAPK1的初 级磷酸化位点是Thr185和Tyr185，MAPK3的初级磷酸化位点是Thr202 和Tyr204。这些磷酸化位点还由用于本发明的抗体识别，即，优选地由针 对MAPK1和MAPK3磷酸化形式的多克隆抗体血清识别。
术语“Akt”蛋白是指第二信使调控的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的 Akt/PKB亚家族的蛋白，该亚家族蛋白具有3个成员，分别叫作 Akt1/PKBα，Akt2/PKBβ(Staal，S.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987) 5034-5037)和Akt3/PKBγ(Nakatani，K.等.，Biochem.Biophys.Res.Comm. 257(1999)906-910；US 6,881,555)。所述同种型是相似的，并且响应磷脂 酰肌醇3′-OH激酶(PI3K)信号传导通过磷酸化被激活。PI3K/Akt/PKB途径 似乎还对于肿瘤发生中的调控细胞存活/细胞死亡很重要(Dudek，H.等.， Science 275(1997)661-665)。当用于本申请时，术语“Akt蛋白”是指Akt 蛋白家族的一员，Akt蛋白家族包括或者优选地由Akt1、Akt2和Akt3组 成。Akt1/PKBα的磷酸化发生在两个位点Thr308和Ser473上(Meier，R.，等.，J. Biol.Chem.272(1997)30491-30497)。等效的磷酸化位点发生在 Akt2/PKBβ(Thr309和Ser474)和Akt3/PKBγ(Thr305和Ser472)中。术语“磷酸 化的Akt”蛋白是指磷酸化的“Akt”蛋白，优选地在上述位点磷酸化。当用 于本发明时，术语“MAPK蛋白”优选是指MAPK蛋白家族的一员，该 蛋白家族包括或者优选地由MAPK1和MAPK3组成。Akt 1也叫作人 RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.37)(RAC-PK-α)，蛋白激酶B (PKB)(C-AKT)，并且Akt 1的氨基酸序列是SEQ ID NO：6。AKT2也叫 作人RAC-β丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.37)(RAC-PK-β)，蛋白激酶 Akt-2或蛋白激酶B，β(PKBβ)，并且Akt 2的氨基酸序列是SEQ ID NO：7。 AKT3也叫作人RAC-γ丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.37)(RAC-PK-γ)， 蛋白激酶Akt-3或蛋白激酶B，γ(PKBγ)(STK-2)，并且Akt 3的氨基酸序 列是SEQ ID NO：8。
发明详述
文献中阐释了分子生物学和核酸化学的常规技术，这些技术是本领域 技术之内的。例如，参见Sambrook，J.等.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York， 1989；Gait，M.J.(ed.)，Oligonucleotide Synthesis-A Practical Approach，IRL Press，1984；Hames，B.D.，和Higgins，S.J.(eds.)，Nucleic Acid Hybridisation- A Practical Approach，IRL Press，1985；以及系列丛书，Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.，所有这些通过参考结合于此。本文提及 的所有专利、专利申请和公布，上文所述和下文所述的，都通过参考结合 于此。
在本发明的一个实施方案中，提供确定包含人肺癌细胞的生物样品是 否对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的方法，所述方法 包括确定生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过 量表达，其中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达 是包含人肺癌细胞的生物样品对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂 的组合敏感的指示。
优选地，在按照本发明的方法中，生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/ 或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达通过下列步骤确定：
a)测定生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达 水平，
b)测定在包含对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合不敏感的人肺 癌细胞的生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的 表达水平，
c)测定步骤a)和b)中而测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK 蛋白的表达水平的差异，由此确定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的 MAPK蛋白的过量表达。
优选地，步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的 MAPK蛋白的表达水平的差异至少为10％。更优选地，步骤a)和b)中测 定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异至 少为25％。在另一个实施方案中，步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋 白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异至少为50％，75％，100 ％，125％，150％，175％，200％，300％，400％，500％或1,000％。步 骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达 水平的差异可以多达10,000或50,000％。步骤a)和b)中测定的磷酸化的 AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异优选地在10％到 10,000％之间，更优选地25％到10,000％，50％到10,000％，100％到 10,000％，甚至更优选地25％到5,000％，50％到5,000％，100％到5,000 ％。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述生物样品是原发性肺肿瘤或 转移瘤(局部的或远端的)，例如，其可以通过肺部组织活检或者通过组 织活检方式从其它器官获得。例如，转移瘤还可以是肝脏或淋巴节的远端 转移瘤。必须理解当转移瘤发源于肺部时，这样的远端转移瘤也包括肺癌 细胞。
在另一个实施方案中，所述癌症是除肺癌以外的另一种癌症，如胰腺 癌。然而，具有实体瘤的其它癌症也是可行的，诸如卵巢、结肠直肠、头 颈、肾细胞癌、神经胶质瘤以及胃肠癌，特别是胃癌。
在另一个优选的实施方案中，EGFR抑制剂是EGFR酪氨酸激酶抑制 剂，特别是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂，例如因此，换句 话说，在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述EGFR抑制剂是 erlotinib或N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。
在本发明的另一个优选实施方案中，化学治疗剂是吉西他滨和/或顺 铂。
在本发明的另一个实施方案中，磷酸化的Akt蛋白或磷酸化的MAPK 蛋白的过量表达是使用特异性结合磷酸化的蛋白并且优选地不特异性或 者全然不结合非磷酸化蛋白的试剂而测定的。优选地，抗体、抗体衍生物 或抗体片段特异性地结合磷酸化的AKT蛋白或者磷酸化的MAPK蛋白， 并且优选地不特异性地或全然不结合非磷酸化的AKT蛋白或非磷酸化的 MAPK蛋白。
在本发明的另一个优选的实施方案中，磷酸化的AKT蛋白是在与 Akt1蛋白氨基酸位置473对应的氨基酸位置被磷酸化，或者MAPK蛋白 在与MAPK1氨基酸位置202和204对应的氨基酸位置被磷酸化。优选地， MAPK蛋白的氨基酸序列为氨基酸序列SEQ ID NO：1或2，AKT蛋白的 氨基酸序列是氨基酸序列SEQ ID NO：6，7或8。
存在可以用于本发明方法的许多不同类型的免疫检测，例如，酶联免 疫吸附测定(ELISA)，荧光免疫吸附测定(FIA)，化学物质联接的免疫吸附 测定(chemical linked immunosorbent assay，CLIA)，放射免疫测定(RIA)， 和免疫印迹。关于可以应用的不同免疫检测的综述，参见：Lottspeich和 Zorbas(eds.)，Bioanalytik，第一版1998，Spektrum Akademischer Verlag， Heidelberg，Berlin，德国。因此，在本发明的另一个实施方案中，表达水 平应用选自由下列各项组成的组的方法进行测定：蛋白质组学、流式细胞 术、免疫细胞化学、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定。
在本发明的一个优选实施方案中，磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的 MAPK蛋白的过量表达通过下列步骤测定：
a)将生物样品进行免疫组织化学染色，
b)在肉眼观察生物样品中细胞的染色后，对于磷酸化的AKT蛋白和/或磷 酸化的MAPK蛋白的表达水平，指定一个选自数字1，2，3和4的等 级，由此指定关于表达水平的最高可检测的等级，
c)确定在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的 百分比，
d)将在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的百 分数乘以指定的等级并且乘以100，和
e)当步骤d)的乘法结果高于100时，确定生物样品中磷酸化的AKT蛋白 和/或磷酸化的MAPK蛋白过量表达。
在本发明的另一个实施方案中，提供确定肺癌患者是否受益于表皮生 长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合的方法，所述方法包括确定来自患 者的样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达， 其中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达是患者受 益于表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂组合的指示。上文所述的所有 其它优选的实施方案同等地适用于这一实施方案。优选地，在按照本发明 的方法中，来自患者的样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK 蛋白的过量表达通过下列步骤确定：
a)测定来自患者的样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白 的表达水平，
b)在来自肺癌患者的样品中，测定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的 MAPK蛋白的表达水平，其中所述肺癌患者不受益于表皮生长因子抑 制剂和化学治疗剂的组合，
c)确定步骤a)和b)测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白 的表达水平的差异，由此确定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK 蛋白的过量表达。术语“受益”意指与只用表皮生长因子受体抑制剂 治疗相比，患者没有从表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合 治疗中受益。
在本发明的另一个优选的实施方案中，将与磷酸化的AKT蛋白结合 的抗体或者与磷酸化的MAPK蛋白结合的抗体用来确定包含人肺癌细胞 的生物样品是否对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合敏感。
在本发明的另一个实施方案中，提供了选择抑制患者的肺癌发展的组 合物的方法，所述方法包括：
a)在多种测试组合物的存在下，将来自患者的包含对EGFR抑制剂和化 学治疗剂的组合敏感的肺癌细胞的生物样品的等分试样分别暴露；
b)将与测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化的Akt蛋白和/或 磷酸化的MAPK蛋白的表达水平与在不接触测试组合物的生物样品的 等分试样中磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平相 比较，
c)选择相对于没有接触测试组合物的等分试样，在包含所述测试组合物 的等分试样中改变了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水 平的测试组合物之一，其中在与所述测试组合物接触的生物样品的等 分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有 接触所述测试组合物的生物样品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或 磷酸化MAPK蛋白的表达水平之间存在至少10％的差异是选择所述测 试组合物的指示。
优选地，步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的 表达水平的差异为至少25％。更优选地，步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和 /或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少50％。在另一个实施方 案中，步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水 平的差异为至少75％，100％，125％，150％，175％，200％，300％， 400％，500％或1,000％。步骤c)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸 化的MAPK蛋白的表达水平的差异可以多达10,000或50,000％。步骤c) 中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异优选 地在10％到10,000％之间，更优选地，25％到10,000％，50％到10,000％， 100％到10,000％，甚至更优选地25％到5,000％，50％到5,000％，100％ 到5,000％。
在本发明的另一个实施方案中，提供获得候选药剂的方法，所述方法 包括：
(a)将包含对EGFR抑制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样 品的等分试样与候选药剂接触，
(b)测定与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt 蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，并且测定在没有接 触所述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/ 或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，
(c)通过将与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化 Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所 述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷 酸化MAPK蛋白的表达水平进行比较，而观察所述候选药剂的 效果，
(d)从所述观察到的效果获得所述药剂，其中在与所述测试组合物 接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化 MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述测试组合物的生物 样品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白 的表达水平之间存在至少10％的差异是所述候选药剂效果的 指示。
优选地，步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的 表达水平的差异为至少25％。更优选地，步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和 /或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少50％。在另一个实施方 案中，步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水 平的差异为至少75％，100％，125％，150％，175％，200％，300％， 400％，500％或1,000％。步骤d)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸 化的MAPK蛋白的表达水平的差异可以多达10,000或50,000％。步骤d) 中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异优选 地在10％到10,000％之间，更优选地，25％到10,000％，50％到10,000％， 100％到10,000％，甚至更优选地25％到5,000％，50％到5,000％，100％ 到5,000％。
在一个优选实施方案中，所述候选药剂是候选的抑制剂或候选的增强 剂。
在本发明的另一个实施方案中，提供了通过按照本发明的方法获得的 候选药剂。
在另一个实施方案中，提供了包括按照本发明的药剂的药物制剂。
在另一个实施方案中，将按照本发明的一种药剂用于制备抑制肺癌发 展的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供生产药物的方法，其包括本发明 的方法的步骤以及
(i)以足以对受试者提供治疗有效量的所述药物的量合成在步骤
(c)中鉴定的候选药剂或其类似物或衍生物；和/或
(ii)将步骤(c)中鉴定的候选药物候选药剂或其类似物或衍生物与 药用载体组合。
在另一个实施方案中，应用Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化Akt蛋白、 磷酸化MAPK蛋白、选择性与磷酸化Akt蛋白或磷酸化MAPK蛋白结合 的抗体来获得候选药剂，或者来选择在患者中抑制肺癌发展的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，考虑包括针对磷酸化MAPK和/或磷 酸化Akt蛋白的抗体的试剂盒。本领域已知的这样的试剂盒还包括塑料器 皿，例如，其可以在扩增步骤中用作96或384孔形式的微量滴定板，或 者只用作普通反应管，例如由Eppendorf，Hamburg，德国制备，并且所述 试剂盒包括实行按照本发明的方法的所有其它试剂，所述方法优选地为免 疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光免疫吸附测定(FIA)、化学 物质联接的免疫吸附测定(CLIA)、放射免疫测定(RIA)和免疫印迹。关于 可以应用的不同免疫检测的综述，参见：Lottspeich和Zorbas(eds.)， Bioanalytik，第一版1998，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg， Berlin，德国。
提供下述实施例、参考文献、序列表和附图以帮助理解本发明，在附 上的权利要求中阐述本发明真正的范围。应该理解，在不背离本发明的实 质时，在提出的步骤中可以进行更改。
附图描述
图1在随机分配到Erlotinib/吉西他滨/顺铂(A)或安慰剂/吉西他滨 /顺铂治疗的所有患者中的至死时间(OS)分析的 Kaplan-Meier曲线(圆圈表示检查的观察时间，此时观察在 事件发生前结束)。
图2在所有患者中用生物标记数据进行至死时间(OS)分析的 Kaplan-Meier曲线，其中所述患者随机分配到Erlotinib/吉西 他滨/顺铂(A)或安慰剂/吉西他滨/顺铂治疗中(圆圈表示检查 的观察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图3在随机分配到Erlotinib/吉西他滨/顺铂(A)或安慰剂/吉西他滨 /顺铂治疗的所有患者中的发展时间/死亡(PFS)分析的 Kaplan-Meier曲线(圆圈表示检查的观察时间，此时观察在 事件发生前结束)。
图4在所有患者中用生物标记数据进行发展时间/死亡(PFS)分析 的Kaplan-Meier曲线，其中所述患者随机分配到Erlotinib/ 吉西他滨/顺铂(A)或安慰剂/吉西他滨/顺铂治疗中(圆圈表示 检查的观察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图5在用安慰剂/吉西他滨/顺铂处理的所有生物标记患者中至死 时间(OS)分析的Kaplan-Meier曲线，将具有pMAPK H-Score ≥100的患者(H)与具有pMAPK H-Score＜100的患者进行比 较(圆圈表示检查的观察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图6在所有具有pMAPK H-Score＜100的生物标记患者中至死时 间(OS)分析的Kaplan-Meier曲线，将Erlotinib/吉西他滨/顺铂 (A)与安慰剂/吉西他滨/顺铂治疗进行比较(圆圈表示检查的 观察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图7在分别具有pMAPK H-Score＜100和pMAPK H-Score≥100 的所有生物标记患者中至死时间(OS)分析的Kaplan-Meier曲 线，将Erlotinib/吉西他滨/顺铂(LA，HA)与安慰剂/吉西他滨/ 顺铂(H)治疗进行比较(圆圈表示检查的观察时间，此时观察 在事件发生前结束)。
图8在分别具有pMAPK H-Score＜100和pMAPK H-Score≥100 的所有生物标记患者中发展时间/死亡(PFS)分析的 Kaplan-Meier曲线，将Erlotinib/吉西他滨/顺铂(LA，HA)与安 慰剂/吉西他滨/顺铂(H)治疗进行比较(圆圈表示检查的观察 时间，此时观察在事件发生前结束)。
图9在所有安慰剂/吉西他滨/顺铂治疗的生物标记患者中至死时 间(OS)分析的Kaplan-Meier曲线，将pAKT1H-Score＜300 (L)和pAKT1 H-Score≥300(H)进行比较(圆圈表示检查的观 察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图10在所有Erlotinib/吉西他滨/顺铂治疗的生物标记患者中至死 时间(OS)分析的Kaplan-Meier曲线，将pAKT1 H-Score＜300 (L)和pAKT1 H-Score≥300(H)进行比较(圆圈表示检查的观 察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图11在分别具有p AKT1 H-Score＜300和p AKT1 H-Score≥300 的所有生物标记患者中至死时间(OS)分析的Kaplan-Meier曲 线，将Erlotinib/吉西他滨/顺铂(LA，HA)与安慰剂/吉西他滨/ 顺铂(H)治疗进行比较(圆圈表示检查的观察时间，此时观察 在事件发生前结束)。
实施例1
对于肿瘤组织样品的生物标记分析
关于临床研究的探索性肿瘤生物标记分析的目的是鉴定对于 治疗的阳性或阴性临床结果预测为最好的那些标记或标记组合。 由于本研究的临床结果并不允许产生关于如何选择从治疗受益 更多的患者群体的假定，所以特别的重点是在这样的标记的鉴别上，所述 标记区分相对于单独的化学治疗对照组特别受益于组合的患者 (亚组)。另外，研究了区分相对于单独的化学治疗对照组对于 的具体组合有不利作用的患者(亚组)的标记鉴别。
本研究的目的是分析与EGFR信号传导途径相关的肿瘤-特异性生物 标记，例如，EGFR，HER2，pAKT和pMAPK。
生物标记数据与临床数据相关(综合的和治疗特异性分析)。
材料和方法：
临床样本：
生物标记分析在141名患者的样本子集中进行，对于这一分析已经收 到来自初始诊断的福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织块。
用于IHC检测的抗体：
pMAPK IHC流程：
1.从石蜡-排列-块上切割约3-4μm厚的切片。
2.将切片封固在载玻片上，并且让它们干燥过夜。
3.在二甲苯中将载玻片上的石蜡溶掉，接着进行递减的乙醇系列：
-二甲苯过夜
-二甲苯2×10分钟
-abs.乙醇2×10min.
-96％乙醇2×5min.
-80％乙醇1×5min.
-70％乙醇2×5min.
-PBS缓冲液10min.(更换缓冲液一次或两次)
4.Antigene retrival/样品预处理
在1×柠檬酸缓冲液pH6(Biocyc GmbH，货号400300692)中高压锅 5分钟120℃。在TBS/PBS(1∶10)缓冲液中洗涤5分钟。
5.过氧化物酶封闭
-将载玻片在3％H2O2中温育10分钟。
-在TBS/PBS缓冲液中洗涤2×5分钟。
6.抗体温育
-将载玻片置于用Tris-缓冲液稀释的正常血清(1.5％)中或其它封闭 溶液中。
-将以1∶150稀释的一抗(Zymed兔抗磷酸-ERK1+2目录号36-8800) 加到载玻片上，并且在30℃湿润的室内温育2小时。
-在TBS/PBS缓冲液中洗涤2×5分钟。
-将Envision Polymer HRP(Dako)置于载玻片上，并且在30℃湿润 的室内温育30分钟。
-在TBS/PBS缓冲液中洗涤2×5分钟。
7.检测
-将载玻片用0.05M Tris缓冲液pH7.6洗涤20分钟
-将载玻片用DAB-色原(Liquid DAB Dako code no.K3467)覆盖5 分钟，并且将其温育5-10分钟。
-将载玻片用demin.水洗涤5分钟以终止颜色反应。
-用苏木精(HarrisHTX 31000，Medite GmbH)进行复染 色
-用水润洗
-在HCL-乙醇中分辨
-在水中，，blue“5min
-上升的乙醇系列
-二甲苯
-封盖
pAKT IHC流程：
流程同pMAPK，除了下列各项：
-比较4.：在柠檬酸缓冲液pH9(Dako code no.S2367)中进行样品预 处理
-比较6.：一抗(abcam AKT phospho S473)以1∶450稀释(比较6.)
IHC数据报告：
一名病理学家评估了所有的免疫染色。核染色强度(pAKT，pMAPK) 通过肉眼检查以4步等级(0，1，2，3)进行评估。除了核染色强度以外，还 记录了阳性细胞的百分数和分析失败的原因(即，在组织点中缺少肿瘤细 胞或在TMA载玻片上缺少组织点)。
探索性的统计学分析：
生物标记数据的统计学分析目的在于研究通过单独的每一标记和/或 通过适当的组合来预测临床益处和/或毒性的潜能。
按照经验，许多生物标记在患者之间和患者内部表现出倾斜的 (skewed)统计学分布。通常还存在一些所述倾斜(skewness)的生化背 景，原因在于变化过程有乘法结构。当要应用线性统计学方法(例如，回 归)时，倾斜的分布存在问题。当在统计学模型中用作共变量(covariates) 时，倾斜还可能使结果不清楚。因此，需要找到适当的转化，其将这些测 定转化成具有近似高斯形状的分布。生物标记区域的典型选择是log(x+c) 形式的转化。这些转化不改变值的顺序，以便基于秩的非参数分析或截点 保持不被转化改变。当要应用线性多变量方法如判别分析和主成分分析 时，这样的转化也是必要的。
叙述性地研究了不同标记的基本统计学和相倚性。关于可靠性和有效 性，进行了比较不同检测方法如IHC的方法学分析。对的受益定 义为临床终点存活时间(或至死时间，TTD)，PFS时间(发展时间，TTP/D)， 客观反应，最佳反应(CR/PR/SD/PD)。
由这些分析产生的p-值不能以确定的意义来解释；它们被视为特殊的 描述工具，以指导针对有效的候选预测规则的研究。考虑到它们对临床终 点预测(例如，寻找截点)的潜力，在单变量水平上评估标记。为了研究 标记的组合，应用了进一步的多变量技术(例如，线性判别分析，多Logistic 回归，带旋转的主成分分析，聚类分析，CART方法)。研究了生物标记 和反应与临床共变量的相关性。将来自生物标记的候选组用至事件时间变 量进行检验(Kaplan-Meier曲线，Cox比例风险模型，logrank检验)。
结果：
与全部研究群体比较，分析TMA样本子集
考虑到基线患者特征和临床结果参数，将具有用于生物标记分析的样 品的患者子集与全部研究群体比较。概要在下表中显示。
发现：
具有生物标记数据的患者子集对于BO16411研究群体不是典型性的。 在主要群体和生物标记亚组之间关于TTD和TTP风险比率存在差异。与 主要的临床群体相比，生物标记亚组-治疗的患者具有更坏的预 后(prognosis)。当与主要研究群体比较时，一些基线共变量表明，生物 标记亚组--并且在这一亚组内特别是-相关的患者代表了更加 病态的病例混合。KM图(图1-4)也应该考虑。
pMAPK IHC分析的结果
●pMAPK IHC数据表现出了充分的分散度，符合进一步的统计学分析。
为了测定pMAPK表达和临床结果之间的相关性，通过叙述统计学分 析确定了截点值：Franklin H-得分通过结合染色强度和染色的肿瘤细胞的 百分数而确定(pMAPK_hsco＝(pMAPK_Nuclear_Staining+1)* pMAPK_Nuclear_Pos_Cells；范围：0-400)。“阳性”pMAPK染色由＝/＞100 的H-得分定义，除了染色是“阴性”的以外。
●Kaplan-Meier图在图5-8中显示
发现：
●对于用化学治疗/安慰剂治疗的患者，“阳性”pMAPK表达与更坏的预 后相关(TTD：HR 4.882，p＝0.0001)，然而，“阴性”pAKT表达似乎与 更长的存活相关
●趋势：“阳性pMAPK”患者可能受益于化学治疗/组合(HR 0.500，p：0.0516)(----)
pAKT IHC分析的结果
●pAKT IHC数据表现出充分的分散度，符合进一步的统计学分析
●为了确定pAKT表达和临床结果之间的相关性，通过叙述统计学分析 确定截断值：Franklin H-得分通过结合核染色强度和染色的肿瘤细胞 的百分数而确定(pMAPK_hsco＝(pMAPK_Nuclear_Staining+1)* pMAPK_Nuclear_Pos_Cells；范围：0-400)。“阳性”pAKT染色由＝/＞ 300的H-得分定义，否则染色是“阴性”。
●Kaplan-Meier图在图9-11中显示
IHC和临床数据的相关性
发现：
●对于用化学治疗/安慰剂治疗的患者，“阳性”pAKt表达与更坏的预后 相关(TTD：HR 2.258，p＝0.0573)，然而，“阴性”pAKT表达似乎与更 长的存活相关
●对于用化学治疗/combo治疗的患者，没有发现相似的差异。
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>化学治疗应答者的确定
<130>23128
<150>EP05010244.1
<151>2005-05-11
<150>EP05011070.9
<151>2005-05-23
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
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<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Glu Met Val Arg Gly
1 5 10 15
Gln Val Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Asn Leu Ser Tyr Ile Gly
20 25 30
Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Cys Ser Ala Tyr Asp Asn Val Asn Lys
35 40 45
Val Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr Tyr
50 55 60
Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Ile Leu Leu Arg Phe Arg His
65 70 75 80
Glu Asn Ile Ile Gly Ile Asn Asp Ile Ile Arg Ala Pro Thr Ile Glu
85 90 95
Gln Met Lys Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp Leu
100 105 110
Tyr Lys Leu Leu Lys Thr Gln His Leu Ser Asn Asp His Ile Cys Tyr
115 120 125
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130 135 140
Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Thr Thr
145 150 155 160
Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala Asp Pro
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Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp
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Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Ser
195 200 205
Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser Asn
210 215 220
Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His Ile
225 230 235 240
Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile Ile
245 250 255
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Leu Leu Asp Lys Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Glu Val
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Asp Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala
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gtccgagtgg ctgtcggctc ttcagctctc ccgctcggcg tcttccttcc tcctcccggt 120
cagcgtcggc ggctgcaccg gcggcggcgc agtccctgcg ggaggggcga caagagctga 180
gcggcggccg ccgagcgtcg agctcagcgc ggcggaggcg gcggcggccc ggcagccaac 240
atggcggcgg cggcggcggc gggcgcgggc ccggagatgg tccgcgggca ggtgttcgac 300
gtggggccgc gctacaccaa cctctcgtac atcggcgagg gcgcctacgg catggtgtgc 360
tctgcttatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctatca agaaaatcag cccctttgag 420
caccagacct actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat 480
gagaacatca ttggaatcaa tgacattatt cgagcaccaa ccatcgagca aatgaaagat 540
gtatatatag tacaggacct catggaaaca gatctttaca agctcttgaa gacacaacac 600
ctcagcaatg accatatctg ctattttctc taccagatcc tcagagggtt aaaatatatc 660
cattcagcta acgttctgca ccgtgacctc aagccttcca acctgctgct caacaccacc 720
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aattccaagg gctacaccaa gtccattgat atttggtctg taggctgcat tctggcagaa 900
atgctttcta acaggcccat ctttccaggg aagcattatc ttgaccagct gaaacacatt 960
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aatgctgact ccaaagctct ggacttattg gacaaaatgt tgacattcaa cccacacaag 1140
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Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile
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癌细胞中EGFR激活的细胞作用包括增加的增殖、促进细胞运动、黏 附、侵入、血管发生、以及通过抑制细胞程序性死亡而增加的细胞存活。 激活的EGFR通过刺激促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应而诱导肿 瘤细胞增殖。一旦配体结合到EGFR上时，SOS鸟嘌呤核苷酸交换因子就 通过Grb2连接蛋白补充到质膜上，其在小G蛋白Ras上刺激GTP交换 成GDP，随后激活由Raf、MEK和ERK组成的MAPK级联反应。激活 的ERKs(pMAPK，pERK1/2)又磷酸化并且激活转录因子，诸如ELK-1或 c-Myc，从而促进细胞生长。
多种生长因子途径通过多种激酶的激活而促进NSCLC细胞的发展和 存活。EGFR还经由通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途径和STAT途径 进行信号传导而增强癌细胞的存活。Akt还通过其它生长因子激活，包括 胰岛素生长因子-1、碱性成纤维细胞生长因子以及白细胞介素3和6。Akt 的3个同种型1-3都是以相似的方式在活化结构域的残基T308和COOH- 末端结构域的S473被磷酸化(pAKT)。
Erlotinib(是一种有效的表皮生长因子受体(HER1/EGFR)酪 氨酸-激酶抑制剂(TKI)，当用作单独的药剂时，其为先前化学治疗失败的 非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者提供生存益处(WO 01/34574)。的功效在许多试验中进行研究。它的化学名为N-(3- 乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。
TALENT试验是在一线NSCLC患者中进行的安慰剂-对照的III期研 究，所述患者接受吉西他滨和顺铂(这种同时的化学治疗是非美国护理标 准(non-US standard of care)的)组合erlotinib(150mg/天)或 者组合安慰剂。初级目的是存活持续时间，次级目的是发展时间、反应率； 反应的持续时间；药物动力学和药效参数，以及生活质量。还评估了 HER1/EGFR和HER2表达率。进行了标准的安全性分析。TALENT试验 总的结果是阴性的。对于初级和次级目的，与单独的吉西他滨和顺铂相比， erlotinib加化学疗法(吉西他滨和顺铂)不存在明显的益处 (Gatzemeier，U.，等.，Proc Am Soc Clin Oncol 23(2004)617(Abstract 7010))。在使用erlotinib加卡铂和紫杉醇的基于美国的TRIBUTE研究中 观察到相同的结果(Herbst，R.S.，等.，J Clin Oncol(2004)ASCO Annual Meeting Proceedings.Post-Meeting Edition；22(July 15 Suppl.)(Abstract 7011))。将单独的药剂erlotinib作为二线或三线治疗剂用于非小细胞肺癌 (NSCLC)(BR.21；NCIC/OSIP)的随机化安慰剂-对照的III期研究发现，与 安慰剂(4.7个月)相比，使用erlotinib在存活上有统计学显著的提高(6.7 个月)。
许多研究涉及非小细胞肺癌中生物标记的研究以及它们与某些 EGFR抑制剂药物的关系。Han，等.，Int J Cancer 113(2005)109-115用 Gefitinib(IressaTM，EGFR TKI)单一治疗研究了65名患者。他们分析EGFR 下游分子在化疗-抗性非小细胞肺癌中作为gefitinib的应答预见性标记。 Cappuzzo，F.等.，JNCI 96(2004)1133-1141用Gefitinib(Iressa；EGFR TKI) 单一治疗研究了106名患者。他们在患有晚期非小细胞肺癌的患者中研究 Akt磷酸化作用和gefitinib的功效，并且发现接受gefitinib的具有P-Akt- 阳性肿瘤的患者比患有P-Akt-阴性肿瘤的患者从所述治疗受益更多。 Vicent，S.等.，Br J Cancer 90(2004)1047-1052研究了111名NSCLC患者。 他们发现在非小细胞肺癌中pERK被激活并且与晚期肿瘤相关。Han，S.W. 等.，J Clin Oncol 23(2005)2493-2501用Gefitinib(EGFR TKI)单一治疗研 究了90名患者。他们分析表皮生长因子受体突变在用gefitinib治疗的非 小细胞肺癌患者中的预见性和预后作用。Mukohara，T.等.，Lung Cancer 41 (2003)123-130研究了60名患者，每个阶段20名患者，其进行新佐剂化 学治疗或者放射治疗。EGFR表达与pERK和pAkt表达相关。正如作者 本身所提及的那样，样本的大小太小。Raben，D.等.，Int J Radiation Oncology Biol.Phys 59(2004)27-38研究了对于非小细胞肺癌的靶向治 疗。Ono，M.等.，Mol Cancer Ther 3(2004)465-472检验了9种NSCLC细 胞系，并且用gefitinib处理。Hirsch，F.R.等.，Curr Opin Oncol 17(2005) 118-122综述了Akt和MAPK的磷酸化作用状况作为gefitinib抗性的潜在 标记。Meert，等.，Clinical Cancer Research 9(2003)2316-2326在EGFR抑制 剂活性方面研究了NSCLC细胞系。EGFR和Her2表达水平都不与EGFR 抑制剂的敏感性相关。Brognard，J.等.，Cell Death and Differentiation 9 (2002)893-904分析了19株NSCLC细胞系，其中17株表现出Erk1/2磷 酸化作用和组成型活性。David，O.等.，Clinical Cancer Research 10(2004) 6865-6871公开pAkt的过量表达是NSCLC中独立的预后因子。Kakiuchi， S.等.，Human Molecular Genetics 13(2004)3029-3043研究了33名NSCLC 患者的基因组广谱cDNA微点阵。所有微点阵都在单一治疗设备中给予 gefitinib。对于Akt/pAkt表达水平、EGFR基因状况或者pEGFR染色以及 gefitinib应答之间的相关性没有发现任何证据。Kim，R.H.等.，Cancer Cell 7 (2005)263-273公开了癌基因DJ-1表达与pAkt水平相等。Balsara，B.R. 等.，Carcinogenesis 25(2004)2053-2059研究了110名具有TMA pAkt表达 的NSCLC患者。在pAkt阴性和阳性之间不存在存活的显著差异。Hirami， Y.等.，Cancer Letters 214(2004)157-164研究了非小细胞肺癌中表皮生长 因子受体、pAkt和低氧诱导因子-1α的关系。Lee，S.H.等.，APMIS 110(2002) 587-592分析NSCLC患者的43LN转移。NSCLC中的Akt激活在肿瘤发 育中而不是在发展中起作用。Engelman，J.A.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2004)3788-3793分析erbB-3在gefitinib-敏感性非小细胞肺癌细胞系 中介导磷酸肌醇3-激酶活性。David，O.，J Cell Mol Med 5(2001)430-433 讨论了Akt和PTEN在肺癌中作为新的诊断标记的作用。Mantha，A.等.， Clin.Cancer Res.11(2005)2398-2407研究了抑制表皮生长因子受体功能 的甲羟戊酸途径的靶向。
在WO 2004/046386中研究了与EGFR阳性癌症相关的预后标记。 US 2004/0157255公开了应答EGFR抑制剂药物的基因表达标记。 WO 2004/063709公开了测定对表皮生长因子受体调节剂敏感性的生物标 记和方法。WO 01/00245描述了人源化抗-ErbB2抗体和用抗-ErbB2抗体 诸如人源化抗-erbB2抗体治疗癌症的方法。
发明概述
还存在提供测定对EGFR抑制剂治疗的敏感性、特别是EGFR抑制剂 与化学治疗剂组合治疗的敏感性的方法的需要。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种测定包含人肺癌细胞 的生物样品是否对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的 方法，所述方法包括测定磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白在生 物样品中的过量表达，由此磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白 的过量表达是包含人肺癌细胞的生物样品对表皮生长因子受体抑制剂和 化学治疗剂的组合敏感的指示。
在本发明的另一个实施方案中，应用与磷酸化的AKT蛋白结合的抗 体或与磷酸化的MAPK蛋白结合的抗体来测定包含人肺癌细胞的生物样 品是否对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合敏感。
在本发明的另一个实施方案中，提供选择用来在患者中抑制肺癌发展 的组合物的方法，所述方法包括：
a)在多种测试组合物存在下，分别暴露包含来自患者的对EGFR抑 制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样品的等分试样；
b)将与测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和 /或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与没有接触测试组合物的生物 样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表 达水平进行比较；
c)选择相对于没有接触测试组合物的等分试样，在包含所述测试组 合物的等分试样中改变了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋 白的表达水平的测试组合物之一，其中在与所述测试组合物接触 的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋 白的表达水平与在没有接触所述测试组合物的生物样品的等分 试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平之 间存在至少10％的差异是选择所述测试组合物的指示。
在本发明的另一个实施方案中，提供了获得候选药剂的方法，所述方 法包括：
(a)将包含对EGFR抑制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样 品的等分试样与候选药剂接触，
(b)测定与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt 蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，并且测定在没有接 触所述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/ 或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，
(c)通过将与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化 Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所 述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷 酸化MAPK蛋白的表达水平进行比较，而观察所述候选药剂的 效果，
(d)从所述观察到的效果获得所述药剂，其中在与所述候选药剂接 触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化 MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述候选药剂的生物样 品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的 表达水平之间存在至少10％的差异是所述候选药剂效果的指 示。
在本发明的另一个实施方案中，提过通过按照本发明的方法获得 (derived)的候选药剂和包括按照本发明的药剂的药物制剂。
在本发明的另一个实施方案中，按照本发明的药剂用来制备抑制肺癌 发展的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供生产药物的方法，其包括本发明 的方法的步骤和
(i)以足以对受试者提供治疗有效量的所述药物的量合成在步 骤(c)中鉴定的候选药剂或其类似物或衍生物；和/或
(ii)将步骤(c)中鉴定的候选药物候选药剂或其类似物或衍生物 与药用载体组合。
在本发明的另一个实施方案中，应用Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化 Akt蛋白、磷酸化MAPK蛋白、选择性与磷酸化Akt蛋白或磷酸化MAPK 蛋白结合的抗体来获得候选药剂，或者来选择在患者中抑制肺癌发展的组 合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供包含针对磷酸化MAPK和/或磷 酸化Akt蛋白的抗体的试剂盒。
术语“生物样品”应该一般意指从个体、体液、细胞系、组织培养物 或其它来源获得的任何生物样品。体液例如淋巴、血清、血浆、尿、精液、 滑液和脊髓液。按照本发明，所述生物样品包括肺癌细胞和非肺癌细胞(其 它细胞)。获得来自哺乳动物的组织活检和体液的方法是本领域公知的。
术语“表达的水平(level of expression)”或“表达水平(expression level)”通常是指样品中氨基酸产物或蛋白的量，优选为按照本发明的样 品中磷酸化的氨基酸产物或或磷酸化的蛋白的量。“表达”是指这样的过 程，即通过这样的过程基因编码的信息转化成在在细胞中存在并且运作的 结构，按照本发明包括它们的磷酸化作用。当用于本文时，“表达的基因” 包括转录成mRNA然后翻译成蛋白并且翻译后修饰如磷酸化的那些基因。 只是为了完整，这一术语还应该包括转录成RNA但是不翻译成蛋白的那 些表达的基因(例如，转运和核糖体RNAs)。术语“过量表达”和“低 量表达(underexpression)”分别是指当与用作对照的样品中的基线表达水 平相比时表达水平的向上或向下的偏差。因此，“过量表达”也是“增加 的表达”，“低量表达”是“减少的表达”。
本文中术语“抗体”以最宽泛的意义应用，并且特别涵盖完整的单克 隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体 (multispecific antibodies)(例如双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它 们表现出理想的生物活性。
当用于本文时，术语“单克隆抗体”是指从一群基本上均一的抗体获 得的抗体，即，包括所述群体的个体抗体是相同的，除了可能天然存在的 突变之外，而且这种突变可能以较少量存在。单克隆抗体是高度特异的， 针对单一的抗原性位点。此外，多克隆抗体制备物包含针对不同决定簇(表 位)的不同的抗体，与多克隆抗体制备物相反，每一单克隆抗体针对抗原 上的单一的决定簇。除了它们的特异性，由于它们可以不受其它抗体的污 染而合成，所以单克隆抗体是是有利的。修饰词“单克隆”是指抗体的特 征，即从基本上均一的抗体群体获得，并且不解释成(constructed)需要 通过任何具体方法的抗体生产。例如，按照本发明应用的单克隆抗体可以 通过最先由Kohler，G.等.，Nature 256(1975)495描述的杂交瘤方法进行制 备，或者可以通过重组DNA方法进行制备(参见，例如，U.S.Pat.No. 4,816,567)。“抗体片段”包括完整的抗体的片段。
“结合”按照本发明的目的抗原(即磷酸化MAPK或磷酸化的pAKT 蛋白)的抗体是这样的一种抗体，即能够以足够的亲和力与所述抗原结合， 以致所述抗体用于检测所述抗原的存在。按照本发明的抗体是一种结合磷 酸化的MAPK或磷酸化的pAKT蛋白的抗体，与非磷酸化的MAPK或非 磷酸化的pAKT蛋白相比，它通常优选地结合磷酸化的MAPK或磷酸化 的pAKT蛋白，或者不显著地与非磷酸化的MAPK或非磷酸化的pAKT 蛋白交叉反应。在这样的实施方案中，当通过荧光激活细胞分选术(FACS) 分析或放射免疫沉淀(RIA)测定时，所述抗体与非磷酸化的蛋白的结合程 度应该低于10％。换句话说，它应该特异性地结合磷酸化MAPK或磷酸 化pAKT蛋白，并且不特异性地结合或者全然不结合非磷酸化MAPK或 非磷酸化pAKT蛋白。
“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗药剂的实例 包括烷基化试剂，诸如塞替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)、烷基磺酸酯诸 如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶诸如苯并多巴(benzodopa)、卡 波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；氮丙啶和 methylamelamines，包括六甲蜜胺、三乙蜜胺(triethylenemelamine)、三 乙磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙硫代磷酰胺 (triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)； 氮芥(nitrogen mustards)诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、 cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、氮 芥氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥， 苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，曲磷胺，乌拉莫司汀；亚硝基脲(nitrosureas)， 诸如卡莫司汀，氮脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗 生素诸如阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，偶氮丝氨酸，博来霉素，放 线菌素C，calicheamicin，carabicin，去甲柔红霉素，嗜癌霉素，色霉素，放 线菌素D，柔红霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表 柔比星，依索比星，伊达比星，马塞罗霉素，丝裂霉素，麦考酚酸，诺拉霉 素，橄榄霉素，培洛霉素，poffiromycin，嘌罗霉素，三铁阿霉素，罗多比星， 链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢 物诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如denopterin，甲氨 喋呤，喋罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨，6-巯嘌呤， thiamiprine，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物诸如安西他滨，阿扎胞 苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨， 氟尿苷，5-FU；雄激素诸如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷， 睾内酯；抗肾上腺(anti-adrenals)诸如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶 酸补偿物诸如frolinic acid；醋葡醛内酯；羟醛磷酰胺配糖 (aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群； 依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利 醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托 蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星；鬼 臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮 杂酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘 露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷 (″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替哌；紫杉烷类，例如，紫杉醇， Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(， Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌 呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊 苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨； 诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；适罗达；伊班膦酸盐； CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸； esperamicins；卡培他滨；以及任何上述物质的药用盐，酸或衍生物。下列 物质也包含在本发明中，它们是：作用调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗 激素药剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制的 4(5)-咪唑(aromatase inhibiting 4(5)-imidazoles)，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔 芬，keoxifene，LY117018，奥那司酮，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素 诸如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及药用盐、 酸或者任何上述物质的衍生物。“化学治疗剂”本身可以是上文提及的用 于治疗癌症组合的化学化合物的组合，即，所述组合可以是吉西他滨/顺 铂，还可以如顺铂/紫杉醇、顺铂/多西他赛、顺铂/长春瑞滨、吉西他滨/ 卡铂、或卡铂/多西他赛。
术语“EGFR抑制剂”是指与EGFR结合并且任选地抑制EGFR活化 的治疗药剂。这样的药剂的实例包括与EGFR结合的抗体和小分子。与 EGFR结合的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见，US 4,943,533，Mendelsohn等.)以及其变体，诸如嵌合的225 (C225或Cetuximab；)和改造的人225(H225)(参见 WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；结合11型突变体EGFR的抗体(US 5,212,290)；如US 5,891,996所述与EGFR结合的人源化的和嵌合的抗体； 以及结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF(参见WO 98/50433，Abgenix)。 抗EGFR抗体可以与细胞毒素试剂缀合，这样产生一种免疫缀合物(参见， 例如，EP 0 659 439 A2，Merck Patent GmbH)。与EGFR结合的小分子的 实例包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)，CP-358774 (Genentech/OSI)和AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)。本申请中 特别优选的是EGFR酪氨酸激酶抑制剂，特别是小分子EGFR酪氨酸激酶 抑制剂，例如例如，“小分子”可以是具有低于每摩尔大约10,000 克、优选地低于每摩尔大约5,000克的分子量的肽或肽拟物。优选地，“小 分子”是一种化合物，即，有机或无机化合物，其具有这样的分子量：低 于每摩尔大约5,000克，优选地低于每摩尔大约1,000克，更优选地低于 每摩尔大约500克，以及这样的化合物的盐、酯和其它药用形式。因此， 在本发明的一个优选的实施方案中，EGFR抑制剂是EGFR酪氨酸激酶抑 制剂，其为具有下述分子量的化合物：低于每摩尔大约5,000克，优选地 低于每摩尔大约1,000克，以及这样的化合物的盐、酯和其它药用形式。 换句话说，所述EGFR抑制剂是一种抑制EGFR酪氨酸激酶活性的化合物， 并且具有这样的分子量：低于每摩尔大约5,000克，优选地低于每摩尔大 约1,000克，更优选地低于每摩尔大约500克，以及这样的化合物的盐、 酯和其它药用形式。
“吉西他滨”是化学治疗剂2′，2′-二氟脱氧胞苷(dFdC)，其为脱氧胞苷 的嘧啶类似物，其中脱氧核糖部分在2′位置包含2个氟原子(参见 Heinemann，V.等.，Cancer Res 48(1988)4024)。它可以作为从Eli Lilly和Company，Indianapolis，Indiana，USA商购获得。
当贯穿本申请应用时，“顺铂”是化学治疗剂顺-二氨基二氯铂(参见 US 5,562,925)，作为从Bristol-Myers Squibb Company，New York， NY，USA商购获得。“顺铂”是一种重金属复合物，其包含一个中央的铂 原子，铂原子被在顺式位置上的2个氯原子和2个氨分子围绕。
按照本发明，表述“包含对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的 组合敏感的人肺癌细胞的生物样品”应该意指，与只用表皮生长因子抑制 剂治疗比较，所述包含人肺癌细胞的生物样品对用表皮生长因子抑制剂和 化学治疗剂的组合治疗敏感。“敏感”还可以理解为“与之反应”或“表 现出与之反应”，特别是这样的反应对肺癌患者有益。因而，与只用表皮 生长因子抑制剂治疗比较，可以测定肺癌患者是否对用表皮生长因子受体 抑制剂和化学治疗剂的组合治疗敏感。这意味着患者将从这样的治疗中受 益。
“MAPK”蛋白是高度保守的胞质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一 员，叫作促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)或细胞外信号调控的激酶 (ERKs)。这一蛋白家族具有一些亚组。ERKs被激活并且酪氨酸或苏氨酸 被磷酸化，以应答广泛种类的细胞外信号，包括渗透压、热激、促炎细胞 因子、激素和分裂原。当用于本发明时，术语“MAPK蛋白”优选地是指 MAPK蛋白家族的一员，包括或者优选地由MAPK1和MAPK3组成。 MAPK1(ERK2)的氨基酸序列是SEQ ID NO：1，MAPK3(ERK1)(SEQ ID NO：2)。这些氨基酸序列由mRNA序列编码，即，对于MAPK1，cDNA 序列SEQ ID NO：3和4，对于MAPK 3，为SEQ ID NO：5。MAPK1的初 级磷酸化位点是Thr185和Tyr185，MAPK3的初级磷酸化位点是Thr202 和Tyr204。这些磷酸化位点还由用于本发明的抗体识别，即，优选地由针 对MAPK1和MAPK3磷酸化形式的多克隆抗体血清识别。
术语“Akt”蛋白是指第二信使调控的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的 Akt/PKB亚家族的蛋白，该亚家族蛋白具有3个成员，分别叫作 Akt1/PKBα，Akt2/PKBβ(Staal，S.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987) 5034-5037)和Akt3/PKBγ(Nakatani，K.等.，Biochem.Biophys.Res.Comm. 257(1999)906-910；US 6,881,555)。所述同种型是相似的，并且响应磷脂 酰肌醇3′-OH激酶(PI3K)信号传导通过磷酸化被激活。PI3K/Akt/PKB途径 似乎还对于肿瘤发生中的调控细胞存活/细胞死亡很重要(Dudek，H.等.， Science 275(1997)661-665)。当用于本申请时，术语“Akt蛋白”是指Akt 蛋白家族的一员，Akt蛋白家族包括或者优选地由Akt1、Akt2和Akt3组 成。Akt1/PKBα的磷酸化发生在两个位点Thr308和Ser473上(Meier，R.，等.，J. Biol.Chem.272(1997)30491-30497)。等效的磷酸化位点发生在 Akt2/PKBβ(Thr309和Ser474)和Akt3/PKBγ(Thr305和Ser472)中。术语“磷酸 化的Akt”蛋白是指磷酸化的“Akt”蛋白，优选地在上述位点磷酸化。当用 于本发明时，术语“MAPK蛋白”优选是指MAPK蛋白家族的一员，该 蛋白家族包括或者优选地由MAPK1和MAPK3组成。Akt 1也叫作人 RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.37)(RAC-PK-α)，蛋白激酶B (PKB)(C-AKT)，并且Akt 1的氨基酸序列是SEQ ID NO：6。AKT2也叫 作人RAC-β丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.37)(RAC-PK-β)，蛋白激酶 Akt-2或蛋白激酶B，β(PKBβ)，并且Akt 2的氨基酸序列是SEQ ID NO：7。 AKT3也叫作人RAC-γ丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.37)(RAC-PK-γ)， 蛋白激酶Akt-3或蛋白激酶B，γ(PKBγ)(STK-2)，并且Akt 3的氨基酸序 列是SEQ ID NO：8。
发明详述
文献中阐释了分子生物学和核酸化学的常规技术，这些技术是本领域 技术之内的。例如，参见Sambrook，J.等.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York， 1989；Gait，M.J.(ed.)，Oligonucleotide Synthesis-A Practical Approach，IRL Press，1984；Hames，B.D.，和Higgins，S.J.(eds.)，Nucleic Acid Hybridisation- A Practical Approach，IRL Press，1985；以及系列丛书，Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.，所有这些通过参考结合于此。本文提及 的所有专利、专利申请和公布，上文所述和下文所述的，都通过参考结合 于此。
在本发明的一个实施方案中，提供确定包含人肺癌细胞的生物样品是 否对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的方法，所述方法 包括确定生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过 量表达，其中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达 是包含人肺癌细胞的生物样品对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂 的组合敏感的指示。
优选地，在按照本发明的方法中，生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/ 或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达通过下列步骤确定：
a)测定生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达 水平，
b)测定在包含对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合不敏感的人肺 癌细胞的生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的 表达水平，
c)测定步骤a)和b)中而测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK 蛋白的表达水平的差异，由此确定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的 MAPK蛋白的过量表达。
优选地，步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的 MAPK蛋白的表达水平的差异至少为10％。更优选地，步骤a)和b)中测 定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异至 少为25％。在另一个实施方案中，步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋 白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异至少为50％，75％，100 ％，125％，150％，175％，200％，300％，400％，500％或1,000％。步 骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达 水平的差异可以多达10,000或50,000％。步骤a)和b)中测定的磷酸化的 AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异优选地在10％到 10,000％之间，更优选地25％到10,000％，50％到10,000％，100％到 10,000％，甚至更优选地25％到5,000％，50％到5,000％，100％到5,000 ％。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述生物样品是原发性肺肿瘤或 转移瘤(局部的或远端的)，例如，其可以通过肺部组织活检或者通过组 织活检方式从其它器官获得。例如，转移瘤还可以是肝脏或淋巴节的远端 转移瘤。必须理解当转移瘤发源于肺部时，这样的远端转移瘤也包括肺癌 细胞。
在另一个实施方案中，所述癌症是除肺癌以外的另一种癌症，如胰腺 癌。然而，具有实体瘤的其它癌症也是可行的，诸如卵巢、结肠直肠、头 颈、肾细胞癌、神经胶质瘤以及胃肠癌，特别是胃癌。
在另一个优选的实施方案中，EGFR抑制剂是EGFR酪氨酸激酶抑制 剂，特别是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂，例如因此，换句 话说，在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述EGFR抑制剂是 erlotinib或N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。
在本发明的另一个优选实施方案中，化学治疗剂是吉西他滨和/或顺 铂。
在本发明的另一个实施方案中，磷酸化的Akt蛋白或磷酸化的MAPK 蛋白的过量表达是使用特异性结合磷酸化的蛋白并且优选地不特异性或 者全然不结合非磷酸化蛋白的试剂而测定的。优选地，抗体、抗体衍生物 或抗体片段特异性地结合磷酸化的AKT蛋白或者磷酸化的MAPK蛋白， 并且优选地不特异性地或全然不结合非磷酸化的AKT蛋白或非磷酸化的 MAPK蛋白。
在本发明的另一个优选的实施方案中，磷酸化的AKT蛋白是在与 Akt1蛋白氨基酸位置473对应的氨基酸位置被磷酸化，或者MAPK蛋白 在与MAPK1氨基酸位置202和204对应的氨基酸位置被磷酸化。优选地， MAPK蛋白的氨基酸序列为氨基酸序列SEQ ID NO：1或2，AKT蛋白的 氨基酸序列是氨基酸序列SEQ ID NO：6，7或8。
存在可以用于本发明方法的许多不同类型的免疫检测，例如，酶联免 疫吸附测定(ELISA)，荧光免疫吸附测定(FIA)，化学物质联接的免疫吸附 测定(chemical linked immunosorbent assay，CLIA)，放射免疫测定(RIA)， 和免疫印迹。关于可以应用的不同免疫检测的综述，参见：Lottspeich和 Zorbas(eds.)，Bioanalytik，第一版1998，Spektrum Akademischer Verlag， Heidelberg，Berlin，德国。因此，在本发明的另一个实施方案中，表达水 平应用选自由下列各项组成的组的方法进行测定：蛋白质组学、流式细胞 术、免疫细胞化学、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定。
在本发明的一个优选实施方案中，磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的 MAPK蛋白的过量表达通过下列步骤测定：
a)将生物样品进行免疫组织化学染色，
b)在肉眼观察生物样品中细胞的染色后，对于磷酸化的AKT蛋白和/或磷 酸化的MAPK蛋白的表达水平，指定一个选自数字1，2，3和4的等 级，由此指定关于表达水平的最高可检测的等级，
c)确定在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的 百分比，
d)将在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的百 分数乘以指定的等级并且乘以100，和
e)当步骤d)的乘法结果高于100时，确定生物样品中磷酸化的AKT蛋白 和/或磷酸化的MAPK蛋白过量表达。
在本发明的另一个实施方案中，提供确定肺癌患者是否受益于表皮生 长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合的方法，所述方法包括确定来自患 者的样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达， 其中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达是患者受 益于表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂组合的指示。上文所述的所有 其它优选的实施方案同等地适用于这一实施方案。优选地，在按照本发明 的方法中，来自患者的样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK 蛋白的过量表达通过下列步骤确定：
a)测定来自患者的样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白 的表达水平，
b)在来自肺癌患者的样品中，测定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的 MAPK蛋白的表达水平，其中所述肺癌患者不受益于表皮生长因子抑 制剂和化学治疗剂的组合，
c)确定步骤a)和b)测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白 的表达水平的差异，由此确定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK 蛋白的过量表达。术语“受益”意指与只用表皮生长因子受体抑制剂 治疗相比，患者没有从表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合 治疗中受益。
在本发明的另一个优选的实施方案中，将与磷酸化的AKT蛋白结合 的抗体或者与磷酸化的MAPK蛋白结合的抗体用来确定包含人肺癌细胞 的生物样品是否对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合敏感。
在本发明的另一个实施方案中，提供了选择抑制患者的肺癌发展的组 合物的方法，所述方法包括：
a)在多种测试组合物的存在下，将来自患者的包含对EGFR抑制剂和化 学治疗剂的组合敏感的肺癌细胞的生物样品的等分试样分别暴露；
b)将与测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化的Akt蛋白和/或 磷酸化的MAPK蛋白的表达水平与在不接触测试组合物的生物样品的 等分试样中磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平相 比较，
c)选择相对于没有接触测试组合物的等分试样，在包含所述测试组合物 的等分试样中改变了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水 平的测试组合物之一，其中在与所述测试组合物接触的生物样品的等 分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有 接触所述测试组合物的生物样品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或 磷酸化MAPK蛋白的表达水平之间存在至少10％的差异是选择所述测 试组合物的指示。
优选地，步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的 表达水平的差异为至少25％。更优选地，步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和 /或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少50％。在另一个实施方 案中，步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水 平的差异为至少75％，100％，125％，150％，175％，200％，300％， 400％，500％或1,000％。步骤c)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸 化的MAPK蛋白的表达水平的差异可以多达10,000或50,000％。步骤c) 中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异优选 地在10％到10,000％之间，更优选地，25％到10,000％，50％到10,000％， 100％到10,000％，甚至更优选地25％到5,000％，50％到5,000％，100％ 到5,000％。
在本发明的另一个实施方案中，提供获得候选药剂的方法，所述方法 包括：
(a)将包含对EGFR抑制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样 品的等分试样与候选药剂接触，
(b)测定与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt 蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，并且测定在没有接 触所述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/ 或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，
(c)通过将与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化 Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所 述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷 酸化MAPK蛋白的表达水平进行比较，而观察所述候选药剂的 效果，
(d)从所述观察到的效果获得所述药剂，其中在与所述测试组合物 接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化 MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述测试组合物的生物 样品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白 的表达水平之间存在至少10％的差异是所述候选药剂效果的 指示。
优选地，步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的 表达水平的差异为至少25％。更优选地，步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和 /或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少50％。在另一个实施方 案中，步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水 平的差异为至少75％，100％，125％，150％，175％，200％，300％， 400％，500％或1,000％。步骤d)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸 化的MAPK蛋白的表达水平的差异可以多达10,000或50,000％。步骤d) 中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异优选 地在10％到10,000％之间，更优选地，25％到10,000％，50％到10,000％， 100％到10,000％，甚至更优选地25％到5,000％，50％到5,000％，100％ 到5,000％。
在一个优选实施方案中，所述候选药剂是候选的抑制剂或候选的增强 剂。
在本发明的另一个实施方案中，提供了通过按照本发明的方法获得的 候选药剂。
在另一个实施方案中，提供了包括按照本发明的药剂的药物制剂。
在另一个实施方案中，将按照本发明的一种药剂用于制备抑制肺癌发 展的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供生产药物的方法，其包括本发明 的方法的步骤以及
(i)以足以对受试者提供治疗有效量的所述药物的量合成在步骤
(c)中鉴定的候选药剂或其类似物或衍生物；和/或
(ii)将步骤(c)中鉴定的候选药物候选药剂或其类似物或衍生物与 药用载体组合。
在另一个实施方案中，应用Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化Akt蛋白、 磷酸化MAPK蛋白、选择性与磷酸化Akt蛋白或磷酸化MAPK蛋白结合 的抗体来获得候选药剂，或者来选择在患者中抑制肺癌发展的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，考虑包括针对磷酸化MAPK和/或磷 酸化Akt蛋白的抗体的试剂盒。本领域已知的这样的试剂盒还包括塑料器 皿，例如，其可以在扩增步骤中用作96或384孔形式的微量滴定板，或 者只用作普通反应管，例如由Eppendorf，Hamburg，德国制备，并且所述 试剂盒包括实行按照本发明的方法的所有其它试剂，所述方法优选地为免 疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光免疫吸附测定(FIA)、化学 物质联接的免疫吸附测定(CLIA)、放射免疫测定(RIA)和免疫印迹。关于 可以应用的不同免疫检测的综述，参见：Lottspeich和Zorbas(eds.)， Bioanalytik，第一版1998，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg， Berlin，德国。
提供下述实施例、参考文献、序列表和附图以帮助理解本发明，在附 上的权利要求中阐述本发明真正的范围。应该理解，在不背离本发明的实 质时，在提出的步骤中可以进行更改。
附图描述
图1在随机分配到Erlotinib/吉西他滨/顺铂(A)或安慰剂/吉西他滨 /顺铂治疗的所有患者中的至死时间(OS)分析的 Kaplan-Meier曲线(圆圈表示检查的观察时间，此时观察在 事件发生前结束)。
图2在所有患者中用生物标记数据进行至死时间(OS)分析的 Kaplan-Meier曲线，其中所述患者随机分配到Erlotinib/吉西 他滨/顺铂(A)或安慰剂/吉西他滨/顺铂治疗中(圆圈表示检查 的观察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图3在随机分配到Erlotinib/吉西他滨/顺铂(A)或安慰剂/吉西他滨 /顺铂治疗的所有患者中的发展时间/死亡(PFS)分析的 Kaplan-Meier曲线(圆圈表示检查的观察时间，此时观察在 事件发生前结束)。
图4在所有患者中用生物标记数据进行发展时间/死亡(PFS)分析 的Kaplan-Meier曲线，其中所述患者随机分配到Erlotinib/ 吉西他滨/顺铂(A)或安慰剂/吉西他滨/顺铂治疗中(圆圈表示 检查的观察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图5在用安慰剂/吉西他滨/顺铂处理的所有生物标记患者中至死 时间(OS)分析的Kaplan-Meier曲线，将具有pMAPK H-Score ≥100的患者(H)与具有pMAPK H-Score＜100的患者进行比 较(圆圈表示检查的观察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图6在所有具有pMAPK H-Score＜100的生物标记患者中至死时 间(OS)分析的Kaplan-Meier曲线，将Erlotinib/吉西他滨/顺铂 (A)与安慰剂/吉西他滨/顺铂治疗进行比较(圆圈表示检查的 观察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图7在分别具有pMAPK H-Score＜100和pMAPK H-Score≥100 的所有生物标记患者中至死时间(OS)分析的Kaplan-Meier曲 线，将Erlotinib/吉西他滨/顺铂(LA，HA)与安慰剂/吉西他滨/ 顺铂(H)治疗进行比较(圆圈表示检查的观察时间，此时观察 在事件发生前结束)。
图8在分别具有pMAPK H-Score＜100和pMAPK H-Score≥100 的所有生物标记患者中发展时间/死亡(PFS)分析的 Kaplan-Meier曲线，将Erlotinib/吉西他滨/顺铂(LA，HA)与安 慰剂/吉西他滨/顺铂(H)治疗进行比较(圆圈表示检查的观察 时间，此时观察在事件发生前结束)。
图9在所有安慰剂/吉西他滨/顺铂治疗的生物标记患者中至死时 间(OS)分析的Kaplan-Meier曲线，将pAKT1H-Score＜300 (L)和pAKT1 H-Score≥300(H)进行比较(圆圈表示检查的观 察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图10在所有Erlotinib/吉西他滨/顺铂治疗的生物标记患者中至死 时间(OS)分析的Kaplan-Meier曲线，将pAKT1 H-Score＜300 (L)和pAKT1 H-Score≥300(H)进行比较(圆圈表示检查的观 察时间，此时观察在事件发生前结束)。
图11在分别具有p AKT1 H-Score＜300和p AKT1 H-Score≥300 的所有生物标记患者中至死时间(OS)分析的Kaplan-Meier曲 线，将Erlotinib/吉西他滨/顺铂(LA，HA)与安慰剂/吉西他滨/ 顺铂(H)治疗进行比较(圆圈表示检查的观察时间，此时观察 在事件发生前结束)。
实施例1
对于肿瘤组织样品的生物标记分析
关于临床研究的探索性肿瘤生物标记分析的目的是鉴定对于 治疗的阳性或阴性临床结果预测为最好的那些标记或标记组合。 由于本研究的临床结果并不允许产生关于如何选择从治疗受益 更多的患者群体的假定，所以特别的重点是在这样的标记的鉴别上，所述 标记区分相对于单独的化学治疗对照组特别受益于组合的患者 (亚组)。另外，研究了区分相对于单独的化学治疗对照组对于 的具体组合有不利作用的患者(亚组)的标记鉴别。
本研究的目的是分析与EGFR信号传导途径相关的肿瘤-特异性生物 标记，例如，EGFR，HER2，pAKT和pMAPK。
生物标记数据与临床数据相关(综合的和治疗特异性分析)。
材料和方法：
临床样本：
生物标记分析在141名患者的样本子集中进行，对于这一分析已经收 到来自初始诊断的福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织块。
用于IHC检测的抗体：
pMAPK IHC流程：
1.从石蜡-排列-块上切割约3-4μm厚的切片。
2.将切片封固在载玻片上，并且让它们干燥过夜。
3.在二甲苯中将载玻片上的石蜡溶掉，接着进行递减的乙醇系列：
-二甲苯过夜
-二甲苯2×10分钟
-abs.乙醇2×10min.
-96％乙醇2×5min.
-80％乙醇1×5min.
-70％乙醇2×5min.
-PBS缓冲液10min.(更换缓冲液一次或两次)
4.Antigene retrival/样品预处理
在1×柠檬酸缓冲液pH6(Biocyc GmbH，货号400300692)中高压锅 5分钟120℃。在TBS/PBS(1∶10)缓冲液中洗涤5分钟。
5.过氧化物酶封闭
-将载玻片在3％H2O2中温育10分钟。
-在TBS/PBS缓冲液中洗涤2×5分钟。
6.抗体温育
-将载玻片置于用Tris-缓冲液稀释的正常血清(1.5％)中或其它封闭 溶液中。
-将以1∶150稀释的一抗(Zymed兔抗磷酸-ERK1+2目录号36-8800) 加到载玻片上，并且在30℃湿润的室内温育2小时。
-在TBS/PBS缓冲液中洗涤2×5分钟。
-将Envision Polymer HRP(Dako)置于载玻片上，并且在30℃湿润 的室内温育30分钟。
-在TBS/PBS缓冲液中洗涤2×5分钟。
7.检测
-将载玻片用0.05M Tris缓冲液pH7.6洗涤20分钟
-将载玻片用DAB-色原(Liquid DAB Dako code no.K3467)覆盖5 分钟，并且将其温育5-10分钟。
-将载玻片用demin.水洗涤5分钟以终止颜色反应。
-用苏木精(HarrisHTX 31000，Medite GmbH)进行复染 色
-用水润洗
-在HCL-乙醇中分辨
-在水中，，blue“5min
-上升的乙醇系列
-二甲苯
-封盖
pAKT IHC流程：
流程同pMAPK，除了下列各项：
-比较4.：在柠檬酸缓冲液pH9(Dako code no.S2367)中进行样品预 处理
-比较6.：一抗(abcam AKT phospho S473)以1∶450稀释(比较6.)
IHC数据报告：
一名病理学家评估了所有的免疫染色。核染色强度(pAKT，pMAPK) 通过肉眼检查以4步等级(0，1，2，3)进行评估。除了核染色强度以外，还 记录了阳性细胞的百分数和分析失败的原因(即，在组织点中缺少肿瘤细 胞或在TMA载玻片上缺少组织点)。
探索性的统计学分析：
生物标记数据的统计学分析目的在于研究通过单独的每一标记和/或 通过适当的组合来预测临床益处和/或毒性的潜能。
按照经验，许多生物标记在患者之间和患者内部表现出倾斜的 (skewed)统计学分布。通常还存在一些所述倾斜(skewness)的生化背 景，原因在于变化过程有乘法结构。当要应用线性统计学方法(例如，回 归)时，倾斜的分布存在问题。当在统计学模型中用作共变量(covariates) 时，倾斜还可能使结果不清楚。因此，需要找到适当的转化，其将这些测 定转化成具有近似高斯形状的分布。生物标记区域的典型选择是log(x+c) 形式的转化。这些转化不改变值的顺序，以便基于秩的非参数分析或截点 保持不被转化改变。当要应用线性多变量方法如判别分析和主成分分析 时，这样的转化也是必要的。
叙述性地研究了不同标记的基本统计学和相倚性。关于可靠性和有效 性，进行了比较不同检测方法如IHC的方法学分析。对的受益定 义为临床终点存活时间(或至死时间，TTD)，PFS时间(发展时间，TTP/D)， 客观反应，最佳反应(CR/PR/SD/PD)。
由这些分析产生的p-值不能以确定的意义来解释；它们被视为特殊的 描述工具，以指导针对有效的候选预测规则的研究。考虑到它们对临床终 点预测(例如，寻找截点)的潜力，在单变量水平上评估标记。为了研究 标记的组合，应用了进一步的多变量技术(例如，线性判别分析，多Logistic 回归，带旋转的主成分分析，聚类分析，CART方法)。研究了生物标记 和反应与临床共变量的相关性。将来自生物标记的候选组用至事件时间变 量进行检验(Kaplan-Meier曲线，Cox比例风险模型，logrank检验)。
结果：
与全部研究群体比较，分析TMA样本子集
考虑到基线患者特征和临床结果参数，将具有用于生物标记分析的样 品的患者子集与全部研究群体比较。概要在下表中显示。
发现：
具有生物标记数据的患者子集对于BO16411研究群体不是典型性的。 在主要群体和生物标记亚组之间关于TTD和TTP风险比率存在差异。与 主要的临床群体相比，生物标记亚组-治疗的患者具有更坏的预 后(prognosis)。当与主要研究群体比较时，一些基线共变量表明，生物 标记亚组--并且在这一亚组内特别是-相关的患者代表了更加 病态的病例混合。KM图(图1-4)也应该考虑。
pMAPK IHC分析的结果
●pMAPK IHC数据表现出了充分的分散度，符合进一步的统计学分析。
为了测定pMAPK表达和临床结果之间的相关性，通过叙述统计学分 析确定了截点值：Franklin H-得分通过结合染色强度和染色的肿瘤细胞的 百分数而确定(pMAPK_hsco＝(pMAPK_Nuclear_Staining+1)* pMAPK_Nuclear_Pos_Cells；范围：0-400)。“阳性”pMAPK染色由＝/＞100 的H-得分定义，除了染色是“阴性”的以外。
●Kaplan-Meier图在图5-8中显示
发现：
●对于用化学治疗/安慰剂治疗的患者，“阳性”pMAPK表达与更坏的预 后相关(TTD：HR 4.882，p＝0.0001)，然而，“阴性”pAKT表达似乎与 更长的存活相关
●趋势：“阳性pMAPK”患者可能受益于化学治疗/组合(HR 0.500，p：0.0516)(----)
pAKT IHC分析的结果
●pAKT IHC数据表现出充分的分散度，符合进一步的统计学分析
●为了确定pAKT表达和临床结果之间的相关性，通过叙述统计学分析 确定截断值：Franklin H-得分通过结合核染色强度和染色的肿瘤细胞 的百分数而确定(pMAPK_hsco＝(pMAPK_Nuclear_Staining+1)* pMAPK_Nuclear_Pos_Cells；范围：0-400)。“阳性”pAKT染色由＝/＞ 300的H-得分定义，否则染色是“阴性”。
●Kaplan-Meier图在图9-11中显示
IHC和临床数据的相关性
发现：
●对于用化学治疗/安慰剂治疗的患者，“阳性”pAKt表达与更坏的预后 相关(TTD：HR 2.258，p＝0.0573)，然而，“阴性”pAKT表达似乎与更 长的存活相关
●对于用化学治疗/combo治疗的患者，没有发现相似的差异。
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>化学治疗应答者的确定
<130>23128
<150>EP05010244.1
<151>2005-05-11
<150>EP05011070.9
<151>2005-05-23
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
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<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Glu Met Val Arg Gly
1 5 10 15
Gln Val Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Asn Leu Ser Tyr Ile Gly
20 25 30
Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Cys Ser Ala Tyr Asp Asn Val Asn Lys
35 40 45
Val Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr Tyr
50 55 60
Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Ile Leu Leu Arg Phe Arg His
65 70 75 80
Glu Asn Ile Ile Gly Ile Asn Asp Ile Ile Arg Ala Pro Thr Ile Glu
85 90 95
Gln Met Lys Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp Leu
100 105 110
Tyr Lys Leu Leu Lys Thr Gln His Leu Ser Asn Asp His Ile Cys Tyr
115 120 125
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130 135 140
Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Thr Thr
145 150 155 160
Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala Asp Pro
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Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp
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Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Ser
195 200 205
Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser Asn
210 215 220
Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His Ile
225 230 235 240
Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile Ile
245 250 255
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Leu Leu Asp Lys Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Glu Val
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Asp Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala
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gtccgagtgg ctgtcggctc ttcagctctc ccgctcggcg tcttccttcc tcctcccggt 120
cagcgtcggc ggctgcaccg gcggcggcgc agtccctgcg ggaggggcga caagagctga 180
gcggcggccg ccgagcgtcg agctcagcgc ggcggaggcg gcggcggccc ggcagccaac 240
atggcggcgg cggcggcggc gggcgcgggc ccggagatgg tccgcgggca ggtgttcgac 300
gtggggccgc gctacaccaa cctctcgtac atcggcgagg gcgcctacgg catggtgtgc 360
tctgcttatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctatca agaaaatcag cccctttgag 420
caccagacct actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat 480
gagaacatca ttggaatcaa tgacattatt cgagcaccaa ccatcgagca aatgaaagat 540
gtatatatag tacaggacct catggaaaca gatctttaca agctcttgaa gacacaacac 600
ctcagcaatg accatatctg ctattttctc taccagatcc tcagagggtt aaaatatatc 660
cattcagcta acgttctgca ccgtgacctc aagccttcca acctgctgct caacaccacc 720
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aattccaagg gctacaccaa gtccattgat atttggtctg taggctgcat tctggcagaa 900
atgctttcta acaggcccat ctttccaggg aagcattatc ttgaccagct gaaacacatt 960
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aatgctgact ccaaagctct ggacttattg gacaaaatgt tgacattcaa cccacacaag 1140
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