发明领域
[0001] 本发明涉及喜树碱类化合物，特别是喜树碱、10-羟基喜树碱和10-甲
氧基喜树碱的聚乙二醇化合物，及其在制备抗
肿瘤等相关作用药物中的用途。
背景技术
[0002] 喜树 碱(Camptothecin，CPT，式1) 是从 珙桐科
植物 喜树 (Camptotheca acuminata)中分离得到的一种天然产物。自从Wall等在1966年报道了这个化合物之后，70年代初即由于其优异的抗癌活性被引入临床。考虑到喜树碱在
水中基本不溶，使用其
羧酸酯形式(式1)作为临床活性组分。在临床实验中，出现了诸如腹泻、出血性膀胱炎等严重药物副反应，以致于不得不终止临床实验。
[0003]
[0004] 式1喜树碱的内酯和羧酸酯形式
[0005] 在80年代，发现了拓扑异构酶I(Topo I)是CPT分子的唯一结合目标，而Topo I在DNA的复制中具有决定性的作用。
[0006] Topo I在DNA复制过程中形成一个暂时性单链缺口，使得双螺旋结构的半保留复制顺利进行。这个过程中，形成了Topo I-DNA二元复合物。CPT及其衍生物可以在DNA复制的S期与Topo I-DNA复合物特异性结合，最终形成一个不可逆的Topo I-CPT-DNA三元复合物，终止了DNA的复制，最终导致细胞死亡。这个机理已被实验证实，三元复合物的单晶结构也已经得到(PNAS，2002，15387)。 另外，文章也指出，CPT在这个三元复合物中，起着类似于一个碱基对的作用。从而，对于CPT的修饰产物在空间上的位阻将大为降低。 [0007] 由于抑制肿瘤细胞拓扑异构酶I的独特作用机制，喜树碱已经成为抗肿瘤药物开发的重点，尤其是
水溶性好、代谢稳定的喜树碱衍生物引起了广泛的关注。
[0008] 构效关系研究表明，六元内酯环是喜树碱类衍生物抗肿瘤活性的关键药效基团，然而，内酯环在人
血浆中存在着与羧酸形式的平衡(见式1)，羧酸形式的喜树碱衍生物抗肿瘤活性下降并且不良反应上升。但是由于羧酸形式与人血浆
白蛋白结合能
力是内酯形式的150倍，平衡向羧酸形式方向位移，导致血液中内酯形式的浓度远远低于羧酸形式。因此增加体内代谢的
稳定性从而降低不良反应已经成为该类化合物研究的重点。
[0009] 另外，构效关系研究结果也指出喜树碱的20-(S)羟基、D环吡啶、六元E环以及分子的平面结构对于好的药效至关重要，对于A、B环的修饰可以提高药效，而其他环的修饰对于药效而言是不利的(Expert Opin.Ther.Patents，2009，195，555-574.；Chem.Med.Chem.，2007，2，1807-1813)。
[0010] 喜树碱类天然产物在水中的溶解性能非常差，在药物传递、代谢过程中极其不利，因而，寻找易溶于水的目标结构也是非常重要的。
发明内容
[0011] 本
发明人经研究现已发现喜树碱及其衍生物尤其是10-羟基喜树碱和10-甲氧基喜树碱经聚乙二醇共价修饰后，活性保持相当，毒
副作用降低，且显著增加其水溶性及稳定性，延长了其在体内的
半衰期。
[0012] 本发明涉及式(I)所示的喜树碱类化合物的聚乙二醇化合物：
[0013]
[0014] 其中，R1＝H，OH，OMe，或结构O-X1-mPEG1，R2为结构 X2-mPEG2；其中，mPEG1与mPEG2分别独立的为CH2CH2(OCH2CH2)n1-OCH3，n1＝0-1000；X1与X2分别独立的为 n2为0-4，X3可以为A、B或Y；
[0015] A ＝ -(NH-CR3R4-CO)n3-(NH-CR5R6-CO)n4-(NH-CR7R8-CO)n5-(NH-CR9R10-CO)n6-Z-；R3到R10分别独立的为H，取代或未取代的C1-C6直链或者支链烷基，取代或未取代的C2-C6直链或者支链烯基或者炔基，取代或未取代的C1-C6直链或者支链烷氧基，取代或未取代的C1-C6直链或者支链烷硫基，取代或未取代的C2-C6直链或者支链烯基或者炔基氧基，取代或未取代的C2-C6直链或者支链烯基或者炔基，环烷基或环链烯基，芳基，杂环基；-(CH2)n7-CO-O-mPEG；-(CH2)n7-CO-NH-mPEG；n7为1-6，mPEG定义同前；其中，优选地，杂环烷基为其环结构中含1-5个(优选1-3个)独立地选自N、O和S等的杂
原子的环状基团；芳基为未取代的或被独立地选自卤素，硝基，羧基或C1-C4烷基的取代基单取代或二取代或三取代的4、5、6、或7元单环或双环芳香基团，如苯基或者或
萘基等；杂环基可为未取代的或被独立地选自卤素，硝基，羧基或C1-C4烷基的取代基单取代或二取代的、含有1-5个独立地选自N、O和S等的杂原子的4、5、6、或7元单环或双环芳香基团，如吡咯基，呋喃基，吡啶基等；n3到n6分别独立的为0或1；Z为O或NH；
[0016] B＝-NH-(CH2)n8-S-S-(CH2)n9-C(O)-Z-；n8为2-5，n9为1-4；Z为O或NH； [0017] Y＝-NH-(CH2)n10-S-M-，n10为2-5；
[0018] M为 更 为 优 选 的，M 为n10＝2。
[0019] 本发明式(I)中的喜树碱类化合物选自喜树碱、10-羟基喜树碱和10-甲氧基喜树碱。
[0020] 本发明式(I)所示的喜树碱类化合物的聚乙二醇化合物优选是20-聚乙二醇5000单甲醚
琥珀酸单酯-10-甲氧基喜树碱(MC5001)。
[0021] 本发明再一方面涉及含至少一种式(I)化合物及药用载体或赋形剂的药物组合物。
[0022] 本发明还涉及至少一种式(I)化合物在制备抗肿瘤等相关的药物中的用途。 [0023] 根据本发明，在本发明中使用的缩写词具有下面的含义：
[0024] Boc-HCPT-叔丁氧羰基-羟基喜树碱
[0025] PEG-聚乙二醇
[0026] mPEG-单甲氧基聚乙二醇
[0027] Et3N-三乙胺
[0028] RP-HPLC-反相高效液相色谱
[0029] TLC-薄层色谱
[0030] EDC·HCl-1-乙基-3-(3-二甲基
氨基丙基)
碳二亚胺
盐酸盐
[0031] DCM-二氯甲烷
[0032] DMAP-N，N-二甲基-4-氨基吡啶
[0034] MALDI-TOF-MS-基质辅助激光解析飞行时间质谱
[0035] TCID50-半数培养感染剂量
[0036] MDCK-犬肾细胞
[0037] MTT-四氮唑蓝
[0038] DMEM-Dulbecco极限必需培养基
[0039] 根据本发明，本发明所涉及的mPEG-OH可以作为商品化
试剂从德国Fluka公司购买，mPEG-NH2可以购买或通过以下反应得到：
[0040]
[0041] 本发明以平均分子量为1000、2000、5000和10000的CH3O-PEG-OH(mPEG)为原料，合成系列单位点mPEG修饰以及双位点mPEG修饰的喜树碱衍生物。各化合物经RP-HPLC以及TLC分析为单一峰，经质谱和氢谱、碳谱核磁分析，确证结构正确。
[0042] 根据本发明，本发明的药物组合物制成适用于
哺乳动物用的各种剂型，包括但不限于混悬剂、溶液剂、乳剂等注射剂形式，例如用甘露醇作赋形剂制成的注射剂。根据本发明，本发明的药物组合物可以以标准方式施用，例如肠胃外施用包括但不限于静脉内的、动脉内的、腹膜内的、皮下的、肌肉内的施用或连续输注。
具体实施方式
[0044] 下述实施例代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例的限制。实施例所用平均分子量为1000、2000、5000和10000的CH3O-PEG-OH(mPEG)为德国Fluka公司产品，1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)与二甲胺基吡啶(DMAP)均为国产分析纯试剂。
[0045] 实施例120-聚乙二醇5000单甲醚琥珀酸单酯-10-甲氧基喜树碱(MC5001)的合成
[0046] 1.聚乙二醇单甲醚琥珀酸单酯的合成
[0047] (参考：Polymer Bulletin，1980，3，347-352.)
[0048] 聚乙二醇单甲醚(30g，6mmol)、琥珀酸酐(3g，30mmol)以及N，N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP，300mg，2.46mmol)置于100ml两颈瓶中，在氮气保护下，加入50ml二氯甲烷。常温搅拌反应5-6 天，薄层色谱监测反应
进程至反应完全。依次用1N HCl(60ml×2)、蒸馏水(60ml×2)洗涤，
硫酸镁干燥，过滤，蒸去大量的二氯甲烷
溶剂，乙醚分散。白色固体
1
(20.5g)，收率67％。H NMR(DCCl3)4.26(t，2H)，3.4-4.0(m，PEG)，3.384(s，3H)，2.6(m，4H)。 [0049] 2.10-甲氧基喜树碱的合成(MeO-CPT)
[0050] (参 考：Bioorg.& Med.Chem.Letters，2008，18，6441-6443；CN200410052756.7，page 8)。
[0051] 两颈瓶中加入10-羟基喜树碱(182mg，0.5mmol)和无水碳酸
钾(210mg，1.5mmol)，在氮气保护下，加入无水丙
酮40ml，加热至回流反应10分钟。加入碘甲烷(200μL，2.5mmol)，回流反应至原料基本消失，约6个小时左右。
[0052] 反应液倒入100ml二氯甲烷中，依次用1N盐酸(100ml×2)、水(100ml×2)洗涤，
硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干。氯仿重结晶，收得晶体少量。加入石油醚适量，大量黄色粉末固体析出，过滤，减压抽干。黄色粉末固体。收率约50％(100mg)。
[0053]
[0054] 3.20-聚乙二醇5000单甲醚琥珀酸单酯-10-甲氧基喜树碱(MC5001)的合成 [0055] 聚乙二醇5000单甲醚琥珀酸单酯(mPEG5000-Suc.，1.0g，0.2mmol)，1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，12omg，0.4mol)和N，N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP，48.8mg，0.4mol)置于两口瓶中，在氮气保护下，加入30ml二氯甲烷溶解。常温搅拌反应30分钟后，加入10-甲氧基喜树碱(MeO-CPT，103mg， 0.28mmol)。常温反应24小时。TLC监测至几乎不再反应。停止反应，抽去大量二氯甲烷，柱层析(
100-200目
硅胶，先用乙酸乙酯洗去未反应的Boc-HCPT，然后用甲醇：二氯甲烷＝1∶100依次上升到约5∶100)分离，收集产物部分，减压蒸去溶剂，少量乙醚
固化。异丙醇(约
60ml)加热溶解，冷却析出白色固体，过滤；重复一次。乙醚洗涤产物，减压抽干。收得白色固体产物，收率66％(700mg)。经MALDI-TOF-MS鉴定，分子量在5492左右呈正态分布，分子量正确。
[0056] 实施例220-聚乙二醇5000单甲醚琥珀酸单酯-10-甲氧基喜树碱(MC5001)抗肿瘤活性的评价
[0057] 选择人胃癌细胞BGC-823、人
乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2和人大肠癌细胞HT29四种细胞株，接种细胞于含10％胎
牛血清的RPMI1640或DMEM细胞培养液中(补充青、
链霉素各100u/ml)，置于37℃含5％CO2的细胞
培养箱中，每2-3天换液一次，0.25％胰蛋白酶消化，传代和收集细胞。将对数生长期细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养液配制成2.5×104/ml浓度的细胞悬液，按每孔3000细胞(100μl)加入到96孔细胞培养板中，培养24小时后每孔加入含有不同浓度受试物的培养基100μl，每个浓度设3～4个平行孔。培养72小时后弃上清。每孔加入100μl新鲜配制的0.5mg/ml四氮唑蓝(MTT)的无血清培养液，37℃培养4小时后弃上清。以100μl DMSO溶解，轻度振荡15分钟后，用酶标仪检测吸光度(OD值)，检测
波长为570nm、参比波长为450nm。设置受试药品浓度为10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μg/ml，另设空白对照。药物临用前，用细胞培养液溶解使用。
[0058]
数据处理：抑制率＝(对照组OD值-
给药组OD值)/对照组OD值×100％；药物效应指标用半数浓度(IC50)表示，并列出实测最大抑制率(Imax)。用MicroCal Origin
软件作图，及该软件中的四参数Logistic程序拟合肿瘤细胞生长曲线，求出半数抑制浓度(IC50，μg/ml)。具体结果见表1。
[0059] 表110-羟基喜树碱抑制各种受试细胞生长的作用
[0060]
[0061] 表2MC-5001抑制各种受试细胞生长的作用
[0062]
