导言

本发明涉及埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)的一个新菌 株及其应用。本发明此外涉及整合该菌株的制剂与方法。本发明也涉 及反刍动物饲料、以及预防和治疗反刍动物乳酸中毒症(lactic acidosis)的制剂与方法。

背景

乳酸中毒症

乳酸中毒症是在突然过量摄入易发酵的碳水化合物、尤其是当反 刍动物从粗饲料饮食转向含有高水平淀粉的高能或能量丰富的精饲料 饮食时可能发生的反刍动物消化系统疾病。该疾病以瘤胃内有机酸、 尤其是乳酸的蓄积为特征(Dawson和Allison，1988)。研究显示， 饮食中易发酵碳水化合物比例的突然增加带来的乳酸生产细菌与乳酸 利用细菌数量之间的总体失衡，是乳酸中毒症发作的主要原因 (Slyter，1976)。

通过给予含有高数量乳酸利用细菌的物质来控制瘤胃微生物数 量，从而预防乳酸中毒症，此方法在几十年中得到提倡，但是从未在 大范围内得以实践。在瘤胃中加强乳酸盐利用，这通过给以已适应动 物的瘤胃液(Allison等，1964；Braun等，1992)和给以乳酸利用者 的纯化或混合的细菌培养物(1,251,483 Wilker等，1971；3,857,971 Abdo & Cahilly，1974；4,138,498 Das，1979；5,380,525Leedle 等，1991；Hession & Kung，1992；Robinson等，1992；Wiryawan & Brooker，1995)得以实现。

一些含有活细菌培养物的饲料添加剂取得了专利(1,251,483 Wilker等，1971；3,857,971 Abdo & Cahilly，1974；4,138,498Das， 1979；5,380,525 Leedle等，1991)，但是没有广泛的、或者根本 没有得到商业化。在这些专利其中三个(1,251,483Wilker等，1971； 3,857,971 Abdo & Cahilly，1974；4,138,498Das，1979)中， 这些培养物来自于使用最初瘤胃液接种体的连续培养发酵罐。然而， 供体动物不必适应高精饲料饮食(concentrate diet)。任何这些培 养物的pH耐受性也未提及。在另一个专利(5,380,525 Leedle等， 1991)中，培养物从适应高精饲料饮食的反刍动物富集后，在pH 5.3 得以直接或间接分离。

奶牛亚急性和急性酸中毒的发病率

因为奶牛通常被饲以含有高水平谷物的饮食，所以亚急性瘤胃酸 中毒是乳制品工业常见和严重的健康及生产问题。亚急性和急性瘤胃 酸中毒仅仅是同一个问题的不同程度。急性瘤胃酸中毒更为严重，生 理功能可能显著削弱。受影响的动物精神萎靡，通常共济失调、食欲 不振、瞳孔扩大、心率增加。腹泻将明显，动物可能变得不活动，并 在病发后2至5天内死亡(Nordlund，1995)。急性酸中毒以瘤胃pH 急剧降低(≤5.0)、乳酸浓度的巨大增加和原生动物的大幅减少为特 征(Nocek，1997)。

亚急性瘤胃酸中毒的体征非常不同于急性酸中毒。群体圈养或群 体饲养的现代乳业管理系统使识别这些症状变得困难，因为在群体中 具有这些问题的个别母牛通常不被注意。亚急性瘤胃酸中毒畜群将表 现出下列体征的部分或全部：蹄叶炎、间歇性腹泻、食欲不振或周期 采食量低、未明确定义的健康问题的高畜群淘汰率、即使能量摄入足 够却身体状况不佳、无明显原因的脓肿和咯血(咳血)或鼻衄(鼻出 血)。这些体征大多继发于酸中毒，大多在最初的酸中毒事件后数周 或数月才出现。与饲育场牛(feedlot cattle)相反，奶牛要看养数 年，因此酸中毒的管理对增加利益是重要的。

慢性蹄叶炎也许是亚急性瘤胃酸中毒畜群的最持久的临床体征。 尽管酸中毒和蹄叶炎的关联没有得到完全理解，其联系得到广泛的临 床承认及研究试验证明(Kelly & Leaver，1990；Manson & Leaver， 1988；Nocek，1997)。此外，大多乳业管理者、兽医和营养学家倾向 于低估或者忽视乳畜群蹄叶炎和蹄病(lameness)的异常发病率。明 尼苏达州的一个调查证明蹄病的平均发病率为15％，范围为0-33％ (Nordlund，Garret和Oetzel，1995)。欧洲的研究中确定蹄病为乳 腺炎和生殖之后的第三位花费最多的健康问题(McDaniel和Wilk， 1989)。因此，酸中毒的管理显然是极度重要的。

亚急性酸中毒的主要症状是采食量减少和奶生产效率的降低。因 为诊断该问题的困难，亚急性酸中毒倾向于像其他问题一样被排除， 例如不良管理、不良草料质量等，导致许多乳畜牧者最大的经济降低， 因为它是普遍存在的，特别出现于高产的乳畜群。

由于营养与代谢障碍在高产奶牛中的高发病率，用于提高以谷物 为基础的饮食的性能的营养策略聚焦于通过控制酸产物或通过刺激更 有效的微生物生长来预防瘤胃功能紊乱。目前，饲料添加剂在这方面 扮演了重要角色(Hutjens，1999)。使用特异性刺激乳酸利用细菌生 长的酵母培养株产生了许多利益，最近的一个调查显示，酵母培养在 威斯康星州33％的高产畜群中得到使用。多个研究结果提示，当用于 高乳酸盐饲料和高浓缩饲料时，Yea Sacc株84170似乎特别适于改变 瘤胃发酵和动物生产(Dawson，1995)。然而，生产结果却非常不一 致。在美国，酵母培养物添加剂的花费为每只母牛每天4-6分 (Hutjens，1999)。离子载体也因其防止重要乳酸生产者生长的能力 而在亚急性酸中毒的管理中扮演角色。尽管花费相对低廉(1-2美分/ 奶牛/天，Hutjens，1999)，但是由于最近一些离子载体毒性病例， 离子载体的使用似乎受到抵制。此外，离子载体尚未在美国注册用于 奶牛饮食。

实验上，有几种细菌具有作为反刍动物的直接饲料微生物的潜力， 但是由于许多原因没有得以商业化。例如，埃氏巨球形菌(ME)是对 饲以高谷物饮食适应的牛瘤胃中的主要乳酸利用生物。当牛从高草料 转为高精饲料饮食时，ME的数量常常不足以预防乳酸中毒症。Kung 和Hessian(1995)显示，在用高度发酵碳水化合物挑战期间，添加 ME B159防止了乳酸蓄积。Robinson等(1992)证实，添加ME的不 同菌株，在食用牛中预防了乳酸中毒症。

尽管与亚临床瘤胃酸中毒有关的花费难以精确确定，乳制品工业 潜在的花费是巨大的(Hall，1999)。Donovan(1997)保守估计美国 乳业亚临床酸中毒的花费为每年500百万至10亿美元。

Elsden和Lewis(1953)首先描述了一种从绵羊瘤胃分离出的严 格厌氧、革兰氏阴性、产生脂肪酸、不运动的球菌。然而，原始的分 离株在得到详细表型特征描述之前就被丢失。几年后，一种类似原始 分离株的生物被Elsden及其同事从绵羊瘤胃内容物中分离(Elsden 等，1956)。该生物的特征与当时任何已知物种的描述均不符合，但 是，从所研究的少数分离株的角度而言，作者避免了将该生物指定为 一个新的种属，而是将其称为LC。Gutierrez等(1959)在肿胀牛 (bloating cattle)瘤胃中遇到相似的生物，认为其属于消化链球菌 属(Peptostreptococcus)的定义内，并建议创造一个新种埃氏消化 链球菌(P.elsdenii)。随后，Rogosa(1971)证实LC型分离株为 革兰氏阴性，因此不应包括于消化链球菌属内。他建议将埃氏消化链 球菌移入一个新属巨球菌属(Mehasphaera)，并改为新组合埃氏巨球 形菌(M.elsdenii)，以Elden等的LC1分离株(1956)作为模式 菌株。埃氏巨球形菌是主要发现于乳酸发酵特别显著的幼小动物和接 受高精饲料饮食动物瘤胃中的严格厌氧性生物。该生物偶尔也从人类 粪便中分离(Sugihara等，1974)，它将乳酸主要发酵为丁酸、丙酸、 异丁酸、戊酸、CO2、H2，有时还有痕量的己酸(Stewart和Bryant， 1988)。既然埃氏巨球形菌不像月形单胞菌(Selenomonas)(也是出 现在瘤胃中的乳酸利用者)那样由葡萄糖或麦芽糖进行分解代谢阻遏， 它对乳酸分解代谢的贡献在饲以可溶性碳水化合物之后显著增强 (Stewart和Bryant，1988)。

美国专利3,956,482(Hahn等，1976)公布了在反刍动物中增加 奶产量的方法，包括步骤：向泌乳母牛瘤胃给予产生醋酸的微生物， 此微生物由培养并适应于营养培养基的0-4％埃氏巨球形菌、30-42％ 牛链球菌(Streptococcus bovis)、3-10％嗜酸乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)、12-20％青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、18-44％栖瘤胃拟杆菌(Bacteroides ruminicola) 和3-12％溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的混合物 组成。

公布在上述专利中的发明的主要缺点是牛链球菌的相对高百分比 (30-42％之间)，牛链球菌和乳杆菌是反刍动物乳酸中毒症的主要原 因。该混合物另外含有相对低百分比的埃氏巨球形菌(0-4％)，给予 该混合物可能会加重或引发瘤胃乳酸中毒症，而不是预防或治疗此病。 该混合物此外还暴露于大气中，致使大部分埃氏巨球形菌死亡。而且， 微生物混合物比纯培养物更难控制。

美国专利4,138,498(Das，1979)公布了一种给予反刍动物的 饲料添加剂，当反刍动物从粗饲料饮食转为淀粉时，可预防乳酸中毒 症或将其降至最低，该添加剂包括与可吸收动物饲料添加剂混合的埃 氏巨球形菌细菌培养物。埃氏巨球形菌为严格厌氧的，除了下文所述 的缺点之外，在此专利中公布的该饲料添加剂的一个缺点是：埃氏巨 球形菌被暴露于大气中，导致添加剂中可利用活性细胞数量的迅速降 低。

美国专利5,380,525(Leedle等，1991)公布了生物学纯的埃 氏巨球形菌培养物NRRL-18624及其在帮助反刍动物适应从粗饲料或 标准牧场到富含淀粉的高能饮食中的用途。该培养物受到下述缺点的 损害。

美国专利5,529,793(Graner等，1996)公布了乳酸生成细菌 和埃氏巨球形菌之类的乳酸利用细菌与干粉制剂或动物饲育场饮食的 混合物，用于改善反刍动物对饲料的利用。此发明的缺点是，埃氏巨 球形菌通常是严格厌氧的，因此将其用于干饲料将导致大部分细胞死 亡。

申请人对上述埃氏巨球形菌菌株进行评价，并且推导出这些菌株 由于如下缺点而一般不适于商业化及对反刍动物乳酸中毒症的大规模 预防性治疗，即他们不是：

-在高浓度饮食动物瘤胃中高度活跃并适于增殖；

-可以在pH5.0以下和低至4.5(作为急性酸中毒的特征)的相对低pH 值增殖；

-抵抗通常加入到饲育场饮食中的离子载体抗生素；以及

-即使在可溶性碳水化合物(例如葡萄糖和麦芽糖)存在时，也可优先 使用乳酸作为碳源。

 这些菌株此外的缺点为，通常它们：

-具有相对低的生长速率，即低于0.938小时-1；

-不具备在乳酸和还原糖上生长的能力；

-具有相对低的生物量产出率，即低于0.39克(升·小时)-1；

-不是离子载体抗性的；以及

-主要产生丙酸和丁酸，而不是醋酸。

发明目的

本发明目的因此是提供埃氏巨球形菌的一种新菌株及其应用，以 及整合此菌株的制剂和方法，使用该菌株可以将前述缺点克服或至少 降至最低。

发明概述

根据本发明的第一个方面，提供生物学纯的埃氏巨球形菌细菌培 养物，该培养物含有与保藏于英国苏格兰阿伯丁NCIMB、保藏号为 NCIMB 41125的埃氏巨球形菌菌株基本相同的16S核糖体RNA序列。

根据本发明的第二个方面，提供保藏在英国苏格兰阿伯丁NCIMB、 保藏号为NCIMB4 1125的埃氏巨球形菌菌株的生物纯细菌培养物。

与本发明第一和第二方面一致的埃氏巨球形菌菌株还以其下述特 点为特征：

-即使在糖的存在下，也能非常有效的利用乳酸；

-抵抗离子载体；

-相对高的生长速率；

-主要产生醋酸的能力；以及

-在5.0以下并低至4.5的相对低pH值增殖的能力。

根据本发明的第三方面，提供帮助反刍动物适应从以粗饲料为基 础的饮食到以高能量精饲料为基础的饮食的组合物，该组合物基本由 本发明第一或第二方面的细菌培养物组成。

根据本发明的第四方面，提供促进反刍动物适应从以粗饲料为基 础的饮食到以高能量精饲料为基础的饮食的方法，包括步骤有：对所 述反刍动物瘤胃给以有效量的根据本发明第一或第二方面的细菌培养 物。

根据本发明的第五方面，提供反刍动物饲料添加剂，其包括载体 和有效量的根据本发明第一或第二方面的细菌培养物。

培养物优选置于无氧容器中。

根据本发明的第六方面，提供用于治疗瘤胃乳酸中毒症并预防下 述之一或更多的方法，即瘤胃乳酸中毒症、瘤胃炎、瘤胃乳酸中毒症 引发的蹄叶炎、瘤胃乳酸中毒症引发的肿胀和肝脓肿，该方法包括步 骤：将有效量的根据本发明第一或第二方面的细菌培养物无氧条件下 给予反刍动物瘤胃。

根据本发明的第七方面，提供用于治疗瘤胃乳酸中毒症并预防下 述之一或更多的兽医学试剂，即瘤胃乳酸中毒症、瘤胃炎、瘤胃乳酸 中毒症引发的蹄叶炎、瘤胃乳酸中毒症引发的肿胀和肝脓肿，该试剂 包括有效量的根据本发明第一或第二方面的细菌培养物。

根据本发明的第八方面，提供用于治疗反刍动物瘤胃乳酸中毒症 和预防下述之一或更多的制剂，即瘤胃乳酸中毒症、瘤胃炎、瘤胃乳 酸中毒症引发的蹄叶炎、瘤胃乳酸中毒症引发的肿胀和肝脓肿，该制 剂包括：

-根据本发明第一或第二方面的细菌培养物种菌；以及

-分开的厌氧生长培养基，

该制剂成分置于无氧容器的分隔的室中，这些室彼此无氧连接，以将 培养物无氧接种于生长培养基。

根据本发明的另一方面，提供在反刍动物中实现下述改进之一或 更多的方法，即：

-增加的奶产量；

-改进的饲育场性能；

-提高的生长速率；

-育肥时间(finishing time)的缩短；

-较低的消化系统发病率和死亡率；

-较低的乳酸中毒症及相关疾病发病率；

-改进的饲料转化效率；以及

-以相对较高精饲料饮食饲养的能力，

包括步骤为：向反刍动物瘤胃给以有效量的根据本发明第一或第二方 面的细菌培养物。

培养物优选无氧给予。

根据本发明的另一方面，提供在比传统方法相对较短的时间内分 离高等瘤胃微生物(superior ruminal microorganism)的生物纯培 养物的方法，该方法包括步骤为：

-获得瘤胃液样品；以及

-在预先选择的生长培养基中培养该样品，

该方法特征在于，预先选择选自生长培养基成分、稀释率、pH、温度、 抗微生物试剂、气体环境、氧化还原电位、缺乏营养素和攻击生物的 多个参数，以有利于高等瘤胃微生物但不利于次等瘤胃微生物。

现在，本发明将结合下面的实施例及附图得到更详细的描述，其 中：

图1为乳酸利用者在多个pH值的生长速率曲线图；

图2为乳酸利用分离株在多个pH值于葡萄糖培养基上的生长速率(小 时-1)曲线图；和

图3为根据本发明的埃氏巨球形菌的系统发生树。

根据本发明，能够利用乳酸的生物直接分离自适应高精饲料饮食 的反刍动物。目的是为作为大量培养的保藏接种体的目的，选择具有 最佳特征组合的培养物，用于预防和/或治疗性处理乳酸中毒症。

乳酸利用细菌必须高度活跃并且适于在高精饲料饮食的动物瘤胃 中繁殖，以使其有效。该生物应该能够在低于pH 5.0的pH值下繁殖。 选择的分离株还应该抵抗通常添加于饲育场饮食中的离子载体抗生 素。即使在可溶性碳水化合物例如葡萄糖和麦芽糖(在高精饲料饮食 中将大比例存在)存在下，乳酸应该优先作为碳源使用。

方法

1.分离期间使用的动物

瘤胃内容物样品来自对乳酸利用细菌进行预选择的动物，即Dairy Cow Nutrition单位(Irene，the Agricultural Council，南非)的 泌乳瘘奶牛(lactating fistulated dairy cow)和Chalmar Beef 的饲育场牛(比勒陀利亚，南非)，它们在育肥期末被屠宰。所有动 物均适应于高精饲料饮食，该饮食增加了天然出现的乳酸利用细菌的 数量。

2.样品的收集及制备

瘤胃内容物样品收集自经饲养和挤奶后约09h00的奶牛。来自饲 育场动物的瘤胃内容物样品在动物被屠宰15-30分钟后获得。塑料螺 旋帽样品瓶中被充以经两层粗纱布过滤的瘤胃液。瘤胃液直接转移至 发酵罐。

pH助恒器(auxostat)

通过将pH定量泵改变为培养基添加泵，New Brunswick Scientific Bioflo1连续培养系统得以改良为pH助恒器。pH使用连接到Digital Data Systems 302 pH计和滴定管的Schott S23158 pH电极监控。只 要pH增加至超过设定值，低缓冲的培养基即被加入，直至达到要求的 数值。培养容器的工作体积为270ml。对于特定生物，在助恒器培养 期间获得的最大稀释速率是该生物在此条件下最大生长速率的量度标 准。

4.通过助恒器分离瘤胃乳酸利用细菌

4.1.生长条件和培养基

过滤的瘤胃液首先用于填充发酵罐(270毫升)，经激活的滴定管 按比例向培养体系添加消毒培养基(培养基1)来提高培养pH。培养 基1为半确定的不含瘤胃液的培养基，其组成为：乳酸钠(70％)， 10克/升；蛋白胨2克/升；KH2PO41克/升；(NH4)2SO43克/升；MgSO4·7H2O0.2克/升；CaCl2·2H2O 0.06克/升；维生素(吡哆醇盐酸盐，4毫 克/升；吡哆胺，4毫克/升；核黄素，4毫克/升；维生素B1盐酸盐， 4毫克/升；烟酰胺，4毫克/升；Ca-D-泛酸盐，4毫克/升；4-氨基苯 甲酸，0.2毫克/升；生物素，0.2毫克/升，叶酸，0.1毫克/升，以 及维生素B12，0.02毫克/升)；Na2S·9H2O，0.25克/升；半胱氨酸， 0.25克/升；防沫剂0.07毫升/升，以及莫能菌素，10毫克/升。乳酸 钠和矿物溶液均被加于贮液瓶中，并高压灭菌60分钟。蛋白胨溶解于 300毫升蒸馏水中，在底部出口安装Quick-fit玻璃连接管的1.0升 Schott瓶中单独高压灭菌。两个还原试剂和维生素溶液也预先经过过 滤除菌。高压灭菌后，贮液瓶以无氧气体充气过夜，其他成分在冷却 后分别加入。pH使用5N盐酸调节到要求值。

随后连续培养直至在显微镜下观察到纯培养物。使用消毒注射器 将样品从发酵罐中取出，注射器被密封并转移至无氧柜(Forma Scientific model 1024)中。用一滴培养物在皮氏培养皿中划线，该 培养皿中含有用2％琼脂凝固的培养基1。随后于39℃孵育过夜，使 用消毒针和注射器将单菌落转移至容纳于30毫升血清瓶的新鲜培养 基1中。于39℃孵育24小时后，培养物被转移到几个含有培养基1 的斜面上并培养过夜。这些斜面在液氮上长期保存。

4.2.分离株在发酵罐中的分批生长速率

分离株的生长速率通过使用分批培养技术并监控光密度随时间的 增加而得以证实。将光密度(OD)的自然对数对时间绘图，曲线的线 性部分被用来测定代表该生物最大生长速率的斜率。分批生长速率的 测定在恒化培养物中进行，培养物以消毒培养基稀释，直至得到非常 稀的培养物悬液，并切断培养基供应以开始分批生长。使用恒化培养 物对此工作的益处在于没有滞后期，因为细胞全都是活的并且适应于 该培养基。

4.3.分析技术

挥发性脂肪酸通过气相色谱法，使用含有火焰离子化探测器和 Tupelo 1-1825柱的Carlo Erba GC4200气相色谱(Supelco Inc.， Bellefonte PA，美国)测定。操作条件如下：载气，氮气；火焰气， 氢气和空气；柱温175℃，注射端口温度200℃。Barspec数据系统 用于峰整合。新戊酸做为内部标准。酶学测定D-和L-乳酸异构体的利 用(试验组合1112 821，Boehringer Mannhe im GmbH，Mannheim)

5.通过平板涂布法分离细菌

5.1.培养基

用于平板涂布法分离的经孵育的瘤胃液乳酸(IRFL)培养基，其 组成为400毫升来自紫花苜蓿饲养绵羊经孵育的澄清瘤胃液 (Olumeyan等，1986)、371毫升蒸馏水、2克蛋白胨(Merck)、15 克琼脂、100毫升10％(w/v)D、L-乳酸钠溶液、100毫升0.04％(w/v) 溴甲酚紫溶液以及25毫升含有40克/升KH2PO4、120克/升(NH4)2SO4、 8克/升MgSO4·7H2O和2.4克/升CaCl2·2H2O的矿物溶液。在于121℃ 高压灭菌25分钟前，用乳酸(90％w/v)调节pH至5.5。灭菌后，培 养基在50℃水浴中冷却，同时以无氧气体混合物充气。无菌加入还原 试剂Na2S·9H2O(12.5％w/v)和半胱氨酸·HCl·H2O(12.5％w/v)各2 毫升。由于IRFL培养基对乳酸利用者并非是完全选择的，溴甲酚紫被 联合使用来检测乳酸利用者。当乳酸被利用时，紧邻菌落的附近出现 导致pH升高的离子平衡的变化。与菌落同心区域的颜色由黄变紫时， 指示pH高于6.3。

酸耐受在初始pH值为4.5、5.0和5.5的IRFL琼脂平板上得到测 定。

离子载体抗性在含有10ppm常用于高精饲料饮食中的离子载体 (即莫能菌素(Sigma)和拉沙里菌素(Sigma))的IRFL琼脂平板上 得到测试。可溶性糖对乳酸利用的抑制在添加了终浓度为10克/升的 麦芽糖或葡萄糖的IRFL琼脂平板上得到测试。阳性结果(即紫色的菌 落同心区域)指示由于乳酸利用而产生的碱释放速率超过来自所添加 糖的酸产生。分离株也在不含乳酸、但是添加浓度为10克/升的葡萄 糖或麦芽糖的IRFL琼脂培养基上得到筛选，来测定这两种糖的利用。

麦芽糖和葡萄糖上的生长速率在类似于SDL培养基的培养基上得 到测定，但是在此培养基中，乳酸被10克/升葡萄糖或麦芽糖代替。

5.2.平板涂布法分离和筛选

用于平板涂布法分离的样品在无氧柜中稀释(Mackie & Heath， 1979)。IRFL培养基的涂布平板用10-4至10-6稀释物制备，并于39 ℃无氧孵育。24小时后，显现紫色区域的充分隔开的菌落被转移至1.5 ml小管内的IRFL液体培养基中。在16小时内颜色改变为紫色的经过 接种的小管，对其酸耐受、离子载体抗性、代谢物阻遏以及葡萄糖和/ 或麦芽糖利用进行筛选。筛选通过平板复制(Lederberg和 Lederberg，1952)完成，使用多点接种器将20个分离株接种到一套上 文所描述的成分不同的9个琼脂平板上。

5.3.生长速率测定

生长速率以578nm混浊度的增加来测定，在SDL、SDG或SDM培 养基中进行三重测量。在读数之间，小瓶在39℃水浴中孵育。读数 持续直至混浊度达到与生物量的满意关联的限制。光密度(OD)的自 然对数对孵育时间绘图。借助电子数据表软件包，通过线性回归对代 表特定生长速率的指数生长期斜率进行计算。

在pH 5.7生长于SDL培养基的培养物于是另外孵育24小时，此 后，取出9毫升，加入1毫升10％(w/v)NaOH来分析形成的终产物 和乳酸异构体的利用。

5.4.平板分离株生长的生理学研究

发酵罐说明。连续培养系统通过3个容积各为约250毫升的发酵 罐而建立。使用单个蠕动泵以不同速率向三个发酵罐供应培养基。培 养物温度保持在39℃。培养基和发酵罐充以100％CO2以维持无氧环 境。培养物的pH通过按需要添加20％(w/v)磷酸保持在pH5.5。稀 释速率设定为最大生长速率的70％、80％和90％。80毫升样品从每 个处于稳态的发酵罐中无菌取出。细胞干重和培养基中残留乳酸从此 样品中测定。生物量产出速率，即稀释速率和稳态生物量的产物，使 用实际稀释速率和干重数字计算。生长产量系数，即稳态生物量浓度 对所利用底物的量的函数，使用乳酸残留物和干重数字计算。

6. 使用绵羊评价分离株CH4预防瘤胃乳酸蓄积能力的试验

6.1.方法

在 首次试验中，12只瘤胃插管的阉割公绵羊(平均活体重大约40 公斤)被随机分为处理组和对照组，每组包括6只动物。所有动物都 不加限制饲以粗饲料喂养21天。在第21天，在供以每只动物1000 克玉米面、同时每只动物瘤胃内给以麦芽糖浆300克之前，动物被禁 食11小时。一小时后所有仍未被各动物消耗的玉米面得以直接填充入 其瘤胃。处理组的动物其后立即经瘤胃内给以1×1011cfu的CH4，同 时，对照组的动物类似地给以CH4制剂的无细胞过滤液，即无CH4。 瘤胃液样品以2小时为间隔采集，直至给药后12小时，用于测量瘤胃 乳酸浓度。

在 第二次试验中，使用另一组12只瘤胃插管的阉割公羊，平均活 体重29公斤，先前没有暴露于精饲料喂养。它们可以随意使用埃塞俄 比亚画眉草(Eragrostis teff)碎干草和蛋白质-矿物质舐盐。小羊 被随机分为每组6只动物的两组，即处理组和对照组。在实验第一天 (Day 1)，所有小羊不加限制的得到如下饮食：玉米，888；糖蜜， 69；尿素，17；石灰石，11；磷酸氢二钙，6；盐，4；硫酸胺，4；含 有莫能菌素的矿物质-维生素预混合料，1(克/公斤DM)的。在精饲 料喂养的第一天，处理组的每只动物在12:00(即饲食后3小时)瘤 胃内接受CH4。对照组动物类似地给以水。在精饲料喂养开始(Day 1) 的前一天以及精饲料喂养的第一、第二、第三和第七天的多个时间获 取瘤胃样品，用于测量瘤胃乳酸浓度。

7.分离株CH4在高产奶牛中的评价

7.1.用于动物实验的乳酸利用者的培养

使用Watson-Marlow 505S定量给样泵将工作体积为10升的Braun Biostat B发酵罐改造为恒化器，该泵装备有55rpm驱动器，用于从 50升不锈钢桶转运消毒的培养基。

经汲取管和蠕动泵(Watson-Marlow 505S)持续将超过发酵罐10升 水平的培养物转移到在膛式冷藏器中冷却的50升聚丙烯玻璃瓶中，从 而保持工作体积恒定。此收获泵的传送速率设定为培养基供应泵的约 120％。从发酵罐去除的过量体积含有来自顶部空间的无氧气体。

装备Mil1ipore HVMP 0.45微米(15平方英尺)过滤器以及 Millipore Masterflex Easy-Load蠕动泵的切向流过滤系统 (Millipore Pellicon)，用于浓缩培养物。

使用的培养基为CSL4。维生素、还原试剂、矿物质和微量元素溶 液在加入培养基贮存器之前先经过过滤除菌。高压灭菌后，将贮存器 以无氧气体充气。

生产方法为交错型生产方法。两个连续生产得以执行，每个产生 足以用于一天的动物组处理的细胞。由于每天的产物被收集进入50 升容器中，浓缩步骤的数量限制在每个生产一步。培养物的稀释速率 为0.4小时-1，批次之间的“停歇时间”为50分钟。由45升组成的支 持性运转在第一天生产之前开始，以促进恒化器培养进入稳态。

7.2.实验动物

60只高产奶牛根据先前哺乳期奶产量和体重分区组，其后在每区 组中随机分配至下述处理组之一：1)对照饮食60％精饲料；2)对照 饮食60％精饲料+CH4；3)对照饮食70％精饲料；4)对照饮食70 ％精饲料+CH4。母牛在生产时、产后10天和产后20天给以CH4。

下列参数得到监测：

1.每日干物质摄入；

2.每日奶产量；  

3.每周乳脂、蛋白质和乳糖；和

4.每月身体重量和状况得分。

8.统计分析

数据使用Genstat 5程序进行完全随机区组设计变量分析。使用 先前哺乳期奶产量作为协变量，奶产量以经过协变量调节的值来报告。

使用对比测定如下处理之间差异的显著性：

□+CH4或-CH4(给药者vs.未给药者)；

□对照饮食70％精饲料vs.对照饮食70％精饲料+CH4

□对照饮食60％精饲料vs.对照饮食60％精饲料+CH4

在P＜0.10时差异是显著的，除非另外注明，在P＜0.15时确定具 有趋势。

9.埃氏巨球形菌补充对动物健康和饲育场性能的影响

纯系Bonsmara断奶阉割公牛448只(平均初始活体重215公斤)， 随机分配至2×2×2因子设计的八个试验处理中，因子为(1)CH4添 加(是或否)；(2)离子载体添加(是或否)；(3)粗饲料水平(高 或低)。使用的饲育场饮食及随后的饮食方案如下：

适应末期(第14天至结束)实验饮食的组成成分：     成分     含量(％，基于所饲喂的饮食)    高粗饲料     低粗饲料 埃塞俄比亚画眉草干草      8.0       2.0 玉米面      27.0       30.0 玉米粥片      32.0       35.0 糖蜜粗粉      12.0       12.0 酒糟      6.0       6.0 麦麸      10.0       10.0 棉籽油饼      2.0       2.0 尿素      1.0       1.0 石灰石      1.5       1.5 盐      0.5       0.5

动物被随意给以粗饲料时直至其处于最终的饲育场饮食状态的饮食适 应方案：     天   额外的干草          饮食中粗饲料水平(％)      高粗饲料    低粗饲料     1-2     随意          18       12     3-4     无          18       12     5-7     无          14        8     8-10     无          12        6     11-13     无          10        4     14至末期     无          8        2

所用的最终饲育场饮食的营养素组成(以所饲喂的百分比表示)： 营养素    高粗饲料    低粗饲料 干物质     89.6      89.8 粗蛋白质     14.4      13.4 淀粉     33.5      35.9 NDF纤维     26.9      23.9 ADF纤维      9.5       8.7 脂肪      4.6       4.8

动物圈于饲育场小型实验围圈中。每个处理组有7个围圈，每个 围圈8只动物。饲育场饮食每天早晨以无限制的水平喂养一次。所有 阉牛在到达时得到处理(标准饲育场程序)，数日内仅以长粗饲料喂 养，直至其给以CH4(处理组)或类似量的水(对照组)。在此期间， 将200毫升CH4的培养基悬液作为给每只治疗动物的一次性口服浸润 剂。

CH4培养物通过将直接从发酵罐泵入大玻璃瓶容器的1000毫升新 鲜CH4接种体接种17.5升的CSL6培养基(起始pH 5.20)而制备， 在39℃孵育过夜。培养后的培养物pH为6.63，并在48小时之后保 持相同。孵育后对CH4培养物计数。使用蠕动泵在10秒内从20升大 玻璃瓶中转移200毫升剂量每os给动物。

用于CH4培养的20升批次的CSL 6培养基： CSL6培养基(无菌：55分钟) 17.5升   乳酸钠 971.25g 靛卡红 17.5ml 痕量矿物溶液 8.75ml 矿物溶液5 87.5ml 蛋白胨 17.5g 酵母提取物 17.5g CSL 598.5g 蒸馏水 10688.2g 10 N KOH(预溶于5L H2O) 58.3ml 接种之前过滤除菌并加入 维生素溶液 35ml L-半胱氨酸 35ml

各围圈的采食量得到测量(每天/每周)，个体动物体重得到测量 (每周/两周)。这些数据用于计算饲料转化比(每圈)。动物每日得 到观察，任何表现出酸中毒体征(腹泻、水肿、沮丧)的动物都被迁 离，并且立刻在将其返回它们各自围圈之前给以处理。

统计学分析

数据使用GenStat 5程序进行分析。动物按照重量分区组。通过 在变异分析中使用2×2×2因子设计方法(ANOVA)，对CH4、离子载 体和粗饲料水平的作用进行检验。对于均一治疗差异来说，这些数据 是可接受地正常的。假设来自ANOVA的F-概率在5％是显著的，则在 5％水平，处理平均值使用Fishers′protected t-test最小显著差异 进行分离。

10.使用以16S rRNA基因序列为基础的系统发生学鉴定分离株

10.1.细菌分离株和培养条件。

最初分离自奶牛的埃氏巨球形菌分离株CH4和CH7(Wiederhold， 1994)由本发明人提供。埃氏巨球形菌的模式菌株ATCC25940从美国 典型培养物保藏中心获得。这些菌株按照以前描述在SDL培养基中培 养，推测鉴定为埃氏巨球形菌(Wiederhold，1994)。

10.2.16S核糖体RNA基因的扩增和测序。

使用标准程序从细菌细胞提取基因组DNA(Ausubel等，1988)。 用来扩增16S rRNA的引物选自所有真细菌中的普遍保守区(表1)。 使用引物FD1(覆盖位点8至26)和R11(位点1384-1400)实施PCR。 用于扩增和测序的引物的所有靶位点参见大肠杆菌编码系统(Brosius 等，1978)。100μl PCR反应混合物含有约200ng DNA、各1μM 的每种引物、各200μM的每种核苷酸(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)、 50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.4)及2.5mM MgCl和2.5UTaq 聚合酶(Boehringer Mannheim，德国)。该混合物由液体石蜡覆盖以 防止蒸发。热形式由30个热循环组成，每个热循环中，在94℃变性 1分钟，45℃退火2分钟，继而在72℃延伸3分钟(Hybaid，英国)， 在热循环仪中进行。最后的延伸在72℃进行6分钟。扩增子的同质 性经琼脂糖凝胶电泳分析(Sambrook等，1989)。PCR产物从凝胶切 下，并按照厂商说明使用Wizard PCR Preps kit(Promega，美国) 进行纯化。双链PCR扩增子的直接测序以及随后的测序反应产物在聚 丙烯酰胺凝胶上的分离，基本依照Dorsch和Stackebrandt(1992) 的方法进行。测序引物列于表1。

表1：用于扩增和测序16SrRNA基因的引物。引物序列先前已发表 (Dorsch和Stackebrandt，1992；Lane等，1985；Stackebrandt和 Charfreitag，1990；Hutson等，1993)。这些引物的组合总共覆盖 了16S rRNA基因的1419个核苷酸。 引物靶标位置a 引物序列(5′至3′) 引物靶标位置a 引物序列(5′至3′) 引物靶标位置a 引物序列(5′至3′) 反向 (反义) R11(PCR) 1384-1400 CGGTGTGTACAAGGCCC R1193 1174-1192 CGTCATCCCCGCCTTCCTC R1353 1336-1352 CGATTACTAGCGATTCC R961/R7 949-963 TCGAATTAAACCACA R5 786-802 CTACCAGGGTATCTAAT R361/R1 340-355 CTGCTGCCTCCCGTAGG 正向 (有义) FD1/F1(PCR) 8-26 AGAGTTTGATCCTGGCTCA F1353 336-1352 GGAATCGCTAGTAATCG F361 340-355 CCTACGGGAGGCAGCAG F961 949-963 TGTGGTTTAATTCGA

a引物的所有靶位点参见大肠肝菌编码系统(Brosius等，1978)。

3.数据分析

使用比对程序CLUSTALW(Genetics Computer Group，1991)，得 到的16S rDNA序列得以与从Ribosomal Database Project(RDP； Maidak等，1996)获得的序列进行自动比对。为了就包括于比对图中 的每种生物序列的大小进行标准化，对图中的序列进行修剪。总计 1388个核苷酸序列位点包括在此图中。已发表的许多出现在瘤胃中的 生物的序列包括在此比对图中(表2)。比对图中不明确的序列，通 过使用Genetics Data Environment(GDE)比对编辑器(Smith，1992) 进行手工比对。为了推测系统发生关系，使用fastDNAml(Olsen等， 1994)程序，该程序以最大似然算法(Felsenstein，1981)为基础。 使用程序Treetool(GDE)构建系统发生树。在此树构建中以大肠杆菌 和乙酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)作为外部参考 物种(out groups)。

表2：在使用程序CLUSTALW的比对图中包括的生物。所有序列获自RDP 和Genebank数据库。 瘤胃乳杆菌 (Lactobacillus ruminis)ATCC2 7780 牛链球菌ATCC 33317 产琥珀酸丝状杆菌 (Fibrobacter succinogenes)S85 ATCC 1916 瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)ATCC 35063 埃氏巨球形菌ATCC 17752 甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum)DSM 1312 埃氏巨球形菌ATCC 25940 巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)DSM 1538 埃氏巨球形菌CH4 运动甲烷微菌(Methanomicrobium mobile)ATCC 35094 埃氏巨球形菌CH7 栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)ATCC 19189 蜡形巨球形菌(M.cerevisiae) wolinella succinogenes ATCC 33913 琼氏互养菌(Synergistes jonesii) 埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli) 丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824 乙酸钙不动杆菌ATCC 33604 溶纤维真杆菌(Eubacterium cellulosolvens)ATCC 43171 卵状奎因氏菌(Quinella ovalls) 单形真杆菌(Eubacterium uniformis)ATCC 35992 反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)GA 192 解多糖梭菌(Clostridium polysaccharolyticum)ATCC 33142 粘液真杆菌(Eubacterium limosum) ATCC 8486

结果

助恒器分离

乳酸利用细菌在助恒器中的分离

分离1：当助恒器由pH的升高而触发时，装入发酵罐培养器皿的、 从母牛8710获得的瘤胃内容物立即暴露于新鲜的消毒选择培养基。最 初2小时在pH 5.30的初始稀释速率在0.53小时-1区域。在其后2小 时中，稀释速率增加到0.65小时-1。为了增加分离的特异性，pH降至 pH 5.0，此pH导致稀释速率降低为0.37小时-1。培养进一步持续24 小时，其后在富集培养体系中仅能检测到两种形态型。最初24小时之 后，随培养时间的增加，稀释速率轻微下降，在分离末期，稀释速率 仅为0.33小时-1。

在无氧柜中将发酵罐内容物划线于琼脂培养基上，含有纯培养物 的单菌落被转移到琼脂斜面，于液氮上保存，该培养物被指定为分离 株CHl。

分离2：在这个从母牛8812瘤胃内容物分离的过程中，在最初24 小时观察到0.25小时-1的稀释速率，在随后的24小时期间，稀释速 率在0.34小时-1至0.41-1之间。在48小时的培养之后，是否获得“纯” 培养物尚不明确，培养再继续进行24小时。在此期间，稀释速率为 0.41小时-1，通过来自皮氏培养皿的菌落，从发酵罐分离出纯培养物。 该分离株被命名为CH2。

分离3：在此分离期间，稀释速率经过48小时从0.28小时-1降低 至0.21小时-1。从母牛8708瘤胃获得的该分离株被指定为分离株CH3。

分离4：最初的稀释速率在0.38小时-1数量级，但是稀释速率在4 小时之内降至0.276小时-1，在48小时时期末，稀释速率仅为0.197 小时-1。在从母牛8826瘤胃内容物分离过程中获得的此分离株被指定 为CH4。

分离5：在该分离时期末，孢子形式为主要生物，实验中止。

分离6：在此分离中，稀释速率按照与其他分离相同的模式下降， 最终的稀释速率仅为0.116小时-1。分离株从饲育场牛瘤胃内容物中获 得并被指定为CH6。

分离7：在此分离中使用的瘤胃内容物获得于饲育场牛。在分离的 最初7个小时期间，稀释速率从0.142小时-1降至0.106小时-1。获得 的分离株被指定为CH7。

用于恒化研究的培养基改良

在乳酸利用者分离过程中观察到稀释速率的持续降低，显示培养 基的配制并非最佳。在分离7的最初24小时期间，稀释速率从0.142 小时-1降至0.106小时-1。将脉冲剂量为5ml的瘤胃液直接加入发酵 罐中，4小时后稀释速率达到最高点0.408小时-1。其后稀释速率缓慢 降至0.15小时-1。该“脉冲及移位(pulse and shift)”技术证明 培养基缺乏营养。

使用1ml维生素溶液的“脉冲及移位”实验导致了仅有0.28小 时-1的稀释速率峰值。然而，更大的维生素脉冲导致了0.497小时-1 的稀释速率峰值，高于使用瘤胃内容物脉冲。乳酸利用反映出同样的 结果，即不含额外维生素时分别为22和86％、以及含有额外维生素时 分别为68和91％的D-和L-乳酸异构体利用。列于方法部分中的培养 基1反映了含有较高浓度维生素的改良版本。在另一个“脉冲及移位” 实验中，确定了酵母提取物增加分离株细胞的生长。

埃氏巨球形菌ATCC 25940及助恒器分离株的生长速率vs.pH

使用改良的乳酸培养基，在4.5至6.5之间的多种pH值，细菌生 长速率使用pH助恒器得到测定。将这些生长速率与在特定pH值分批 培养中所获数值进行核对，使用平均值。

模式菌株埃氏巨球形菌ATCC 25940从pH4.5至6.0显示生长速 率的增加，继之以生长速率在pH 6.5的迅速降低(图1)。用ATCC 25940 达到的最大生长速率为0.66小时-1，符合由Therion等报道的0.6小 时-1的生长速率(1981)。

就最大速率而言，所有分离株都胜过ATCC 25940，尤其在pH值 5.5及以下(图1)。分离株的最大生长速率均在pH 5.5(对于分离 株CH7、CH6、CH4和CH3，分别以0.66、0.93、0.938和0.864的生 长速率(小时-1))达到最高点。所有分离株中，CH4得到证实是最耐 受酸的，在pH4.5具有0.389小时-1的生长速率，具有第二佳耐酸性 的生物CH6在pH 4.5仅具有0.19小时-1的生长速率。对3个分离株 即CH6、CH4和CH3，在pH5.5至6.0之间观察到生长速率的急剧降 低。分离株CH 7在pH 5.5至6.0之间的生长速率仅有轻微变化，该 变化类似ATCC 25940在pH5.5至6.5之间。

助恒器分离株在葡萄糖上的生长速率

使用分批补料生长技术，三个分离株的生长速率在pH 5.0、5.5 和6.0得到测定(图2)。与乳酸相比，葡萄糖上的三个分离株，生 长速率显著较低。与在乳酸上的0.938小时-1相比，在乳酸上最有希 望的CH4在pH 5.5、葡萄糖上达到的最大生长速率仅0.25小时-1。在 pH 6.0，分离株CH7达到这些分离株中在葡萄糖上的最大生长速率 (0.33小时-1)。

乳酸经由分离株CH4的转化

分离株CH4在乳酸培养基上以三个恒化稀释速率(即0.94、0.83 和0.75小时-1)得到培养。在稳态期间取样品，对挥发性脂肪酸(VFA) 进行分析，并测定乳酸利用。分批培养也得以进行，样品在稳定期获 取。消毒培养基样品同样对VFAs和乳酸进行分析。随着稀释速率的增 加，脂肪酸的有关产物改变，即在低稀释速率，产生较多的丁酸和戊 酸以及较少的丙酸和乙酸(表3)。在最高稀释速率，产生很少量的 丁酸以及稍多的醋酸和丙酸，没有戊酸。随稀释速率的增加，乳酸利 用如预期降低。在培养D＝0.75时，多于40％的乳酸转化为VFAs，而 且，尽管乳酸利用是高的，但是大比例的可利用能量被浪费。当CH4 分批培养时，主要产生乙酸和丙酸。在分批培养过程中产生的VFAs 的浓度大大低于预期，仅有的解释可能是：当乳酸耗竭时，CH4利用 VFAs。

表3：在多种稀释速率的恒化器培养过程及分批培养过程中，由分离 株CH4从乳酸产生的挥发性脂肪酸。 稀释速率   (h-1) 挥发性脂肪酸(mM)  ％所用的乳酸     乙酸     丙酸     正丁酸    正戊酸    0.75     7.221     5.779     11.347     6.383      92.66    0.83     10.048     12.293     0.423     0.012      53.54    0.94     8.529     10.517     0.271     0      39.65    Batch     10.659     7.737     0.266     0      97.62

平板涂布法分离及筛选

来自四只奶牛和两只饲育场牛的9个瘤胃样品的800多个菌落得 以接种于小管内的IRFL液体培养基中。孵育16小时之内，这些菌落 中的610个在培养基中产生颜色变化，即变为紫色。筛选分离株中的 十九个以用于进一步表征，因为它们满足需要的规格。

所选分离株中的四个，即AW09、AW10、AW11和AW12，可以在4.5 的初始pH生长。其他十五个分离株均在5.0的初始pH生长，那些 显示适宜的特征、即在pH5.0生长最快的培养物被选择，从而实现了 进一步的选择。

所有十九个分离株抵抗10ppm浓度的离子载体莫能菌素以及拉沙 里菌素，在麦芽糖和葡萄糖存在下利用乳酸，并可以在葡萄糖和麦芽 糖上生长。这十九个分离株均为成对或链状出现的革兰氏阴性球菌(± 1.8微米)。

分离株的生理学特征

由于在SDL培养基中孵育24小时之后，D-和L-乳酸异构体几乎 被完全利用，所以所有AW分离株使用D-和L-乳酸异构体。结果显示， 分离株包括相当统一的群，因此仅选择特定的分离株以作进一步表征。 对于这些AW分离株中的五种，在pH5.8，在葡萄糖上的生长速率为 0.38至1.05小时-1，平均0.66小时-1(+/-0.298)。检验从DL-乳 酸产生VFA的AW分离株被发现以下面2∶1.5∶1∶1.3的比例产生乙 酸、丙酸、正丁酸和正戊酸。一些这种AW分离株产生痕量的甲基丁酸 酯。对此九个分离株获得的最大生物量产出速率在0.31至0.43克(升. 小时)-1范围内。AW15具有最高的生物量产出速率，CH4和AW01以 0.39克(升.小时)-1居于其次。对此九个分离株，利用每克乳酸产生 的细胞干物质在0.1至0.17范围内。

分离株的假设性鉴定

对获得的分离株进行假设性鉴定，符合埃氏巨球形菌株形态学分 类者得以用于进一步表征。

使用绵羊评价分离株CH4预防瘤胃乳酸蓄积能力的试验

首次绵羊试验结果显示于表4中。

表4：突然饲喂精饲料、同时瘤胃内给以CH4(治疗组)或安慰剂 (对照组)的粗饲料喂养绵羊瘤胃液中的乳酸浓度。 给予CH4后的时间(h)    乳酸浓度(g/liter)     CH4处理     对照          0      ＜0.1     ＜0.1          2      0.3     1.4          6      0.8     3.6          8      0.5     5.2          10      0.4     6.1          12      0.2     5.9

第二次绵羊试验结果显示于表5中。

表5：突然改变为精饲料饮食(无限制)、并且在首次接受精饲 料饮食3小时后瘤胃内给以CH4(处理组)或安慰剂(对照组)的粗 饲料喂养绵羊瘤胃液中的乳酸浓度。 处理的天     瘤胃乳酸浓度(mMol/liter) 一天中的时间：     08:00      12:00      15:00      19:00     -1 CH4      1.4      0.7      0.6      0.7 对照      1.5      0.9      0.5      0.7     1 CH4      0.7      0.5      2.1      2.4 对照      0.5      0.2      1.5      1.8     2 CH4      2.4      1.0      1.5      1.2 对照      5.0      13.6      15.2      17.4     3 CH4      1.6      1.0      0.7      1.0 对照      7.8      4.5      3.5      2.5     7 CH4      1.8      1.6      1.0      1.2 对照      2.0      1.5      2.0      1.5     14 CH4      1.5      1.5      1.2      1.0 对照      1.8      2.0      1.2      2.0

在两个试验中，与对照比较，给以CH4引起瘤胃乳酸浓度明显而 且显著的降低(对于两个试验，P＜0.001)。在两个试验中，向瘤胃 中突然添加易发酵底物后，对照动物显示出预期的瘤胃乳酸浓度的急 剧增加。在比较中，CH4治疗的动物瘤胃乳酸水平或多或少保持在底 物添加前的水平。这清楚表明，产生的乳酸被CH4大量利用。

分离株CH4在高产奶牛中的评价

大部分的相关生产数据呈现于表6和7中。分别对所有母牛(15/ 处理)和高产者(10/处理)独自分析数据。

表6：从产犊至产后80天，生物CH4对泌乳奶牛(所有母牛)生 产力的影响。   参数                 处理组1             对比P＜   1   2   3   4   +CH4    vs   -CH4    1vs     2     3vs     4 每一处理组的母牛数 干物质摄取kg/d 奶(kg/d) 脂肪(％) 蛋白质(％) 体重 状况分值   15   24.6   36.4   3.27   3.10   662   2.80   15   24.1   34.0   3.29   3.10   608   2.48   15   23.1   33.8   3.57   3.14   618   2.45   15   22.2   32.2   3.23   3.07   612   2.28   -   0.28   0.10   0.17   0.43   0.02   0.06    -    0.59    0.16    0.85    0.93    0.004    0.08     -     0.32     0.34     0.03     0.23     0.73     0.36

处理1：对照饮食，70％精饲料+CH4

处理2：对照饮食，70％精饲料-CH4

处理3：对照饮食，60％精饲料+CH4

处理4：对照饮食，60％精饲料-CH4

表7：从产犊至产后80天，生物CH4对泌乳奶牛(高产者)生产 力的影响。     参数                   处理组1              对比P＜     1     2   3   4    +CH4     vs    -CH4   1vs   2     3vs      4 每一处理组的母牛数 干物质摄取kg/d 奶(kg/d) 脂肪(％) 蛋白质(％) 体重 状况分值   10   24.6   39.3   3.23   3.10   644   2.71     10     25.4     35.9     3.24     3.10     597     2.26   10   24.3   35.2   3.56   3.15   623   2.34   10   22.6   34.8   3.21   3.02   625   2.44   -   0.44   0.13   0.20   0.28   0.11   0.20   -   0.43   0.06   0.91   0.93   0.02   0.02    -    0.06    0.82    0.06    0.11    0.90    0.61

埃氏巨球形菌补充对动物健康和饲育场性能的作用。

贯穿饲育场试验全过程中，每只动物给予的活CH4平均为每只动 物每剂2×1011个菌落形成单位(cfu)。大部分有关结果呈现在表8 至11中。在饲育场中，第三至五周的时期一般被认为是饮食适应方面 最关键的。在第一周和第两周期间，饮食依然具有较高的粗饲料含量， 粗饲料含量逐渐降低；摄入在相对低水平开始，并逐渐升高。仅仅从 第三周开始，饮食含有最低的粗饲料水平(以及最高的精饲料水平)， 而摄入迅速增高。在第六周开始之前，动物通常被认为适应了该饮食。 第三周至第五周的确是动物适应高精饲料饮食的关键时期。

表8：饲育场中多个时期CH4处理与对照(无CH4加入)的平均 日采食量(每只动物每天的饲养物质公斤数)。 饲育场时期            处理     P-值      s.e.     加CH4   对照(无CH4)     第1-2周     7.30      7.15     0.35     0.109     第3-5周     10.18      10.02     0.30     0.103     第1-13周     9.64      9.50     0.29     0.092

CH4的总采食量轻微(但是不显著)高于对照。在第3-5周期间， 尽管CH4对于接受离子载体的动物的作用没有观察到，但是对于没有 接受离子载体的食用牛，CH4比对照具有显著(P＜0.05)更高的摄 入(10.56 vs.10.12)。同样是在此期间，尽管CH4对于高粗饲料饮 食的动物的作用没有观察到，但是对于低粗饲料饮食的食用牛，CH4 比对照趋向于(P＜0.15)具有更高的摄入(10.14vs.9.80)。

表9：饲育场中多个时期CH4处理与对照(无CH4加入)的平均 日增重(每只动物每天的公斤数)。 饲育场时期          处理 P-值      s.e.    加CH4   对照(无CH4)     第1-2周     1.76      1.81     0.51     0.053     第3-5周     2.09      1.97     0.04     0.040     第1-13周     2.19      2.20     0.67     0.019

在第3-5周的关键时期期间，CH4的总平均日增重(ADG)显著高 于(P＝0.04)对照处理。在1-2周期间，对于所有没有接受CH4的 动物，低粗饲料处理比高粗饲料处理具有显著(P＜0.05)较低的ADG (1.61vs.2.02)。然而，对于接受CH4的动物，与高粗饲料饮食相 比，在低粗饲料状态，ADG并没有显著降低(1.70vs.1.83)。在第 3-5周期间，对于没有接受离子载体的动物，CH4具有显著(P＜0.05) 高于对照的ADG(2.15vs.1.96)。

表10：饲育场中多个时期CH4处理与对照(无CH4加入)的饲料 转换比(公斤饲料/公斤增重)。 饲育场时期          处理     P-值      s.e.    加CH4  对照(无CH4)     第1-2周     4.25     4.12     0.43     0.111     第3-5周     4.89     5.14     0.04     0.081     第1-13周     5.06     5.02     0.35     0.027

在第3-5周期间，使用CH4处理的全部动物具有显著(P＝0.04) 高于对照约5％的饲料转换比(FCR)。在第1-2周期间，对于所有没 有接受CH4的动物，低粗饲料处理具有显著(P＝0.06)高于(较不 理想)高粗饲料处理的FCR(4.42vs.3.83)。然而，对于接受CH4 的动物，与高粗饲料饮食相比，在低粗饲料状态的FCR并非显著较高 (较不理想)(4.24对4.25)。

表11：诱发(pull)并治疗酸中毒和肿胀动物的次数(包括同一 动物多次诱发)及动物数量(同一动物的多次诱发仅记为1)。          处理   总数：    +CH4  对照(-CH4) 诱发的总数目 (发病率) 粗饲料- 低      6     21     27 粗饲料- 高      6     4     10      总数：      12     25     37 诱发动物 的总数 粗饲料- 低      4     15     19 粗饲料- 高      5     2     7      总数：      9     17     26

与对照相比，仅有半数的CH4处理动物具有酸中毒症状(一次或 多次)。如果考虑酸中毒事件的总数，可以观察到同样的趋势。很清 楚，酸中毒在低粗饲料饮食更为普遍，以及CH4处理在低粗饲料饮食 减轻了此问题。

以16SrRNA基因序列为基础，使用系统发生学鉴定分离株。

比较测序结果显示，代表更大表型同源群体的我们的分离株在97 至99％相似性之间(表12)。表13概述了适于将新近两个埃氏巨球形 菌分离株及ATCC菌株彼此区分的标签核苷酸位点。插入和缺失占四个 菌株之间核苷酸差异的22％。菌株间主要的核苷酸序列差异出现于核 苷酸位点529-536以及1105-1120(表13)。不同埃氏巨球形菌株之 间表现出的高度序列相似性也与其相似的表型特征一致(Wiederhold， 1994)，表型特征此外还通过菌株间紧密的系统发生聚类得到反映。 埃氏巨球形菌种菌株与蜡形巨球形菌仅具有91至92％的序列相似性， 这两个种在系统发生树中形成截然不同的簇。埃氏巨球形菌簇分叉为 从同一祖先分类学单元(ATU)进化而来的两个单源群。然而，蜡形巨 球形菌从中进化而来的ATU早于埃氏巨球形菌簇从中进化而来的ATU。 在埃氏巨球形菌株与它们各自ATU’s之间的短分枝长度(OTU)也显 示，它们比更深分叉的蜡形巨球形菌进化更晚。

表12：埃氏巨球形菌和蜡形巨球形菌16SrDNA序列的序列相似 性矩阵。序列相似性值以对合计1388个明确排列的核苷酸位点的比较 为基础。％G+C仅指分别比对的16SrDNA序列。 ATCC17752 ATCC25940 CH7 CH4    ％G+C 蜡形巨球形菌 92.0 92.0 91.5 91.5    54.3. ATCC25940 99.0 98.5 98.1    54.4 CH4 98.2 98.1 99.0         54.9 CH7 97.7         54.8 ATCC17752         53.1

表13：定义不同埃氏巨球形菌分离株和菌株的序列标签。 核苷酸 位置a ATCC 25940b CH4 CH7 ATCC 17752 87 G G A G 105 C T C T 170 T C C T 221 T C C T 241 G A A G 283 A G G A 418 A * * * 529-530 CG * * CG 533-536 CG** CGAC CGAC GC** 539 T C C T 550-552 TAC CGT CGT TAT 556 G A A G 711 G G G C 718 * * * G 850 A A G A 1084 A G A A 1105-1108 TGGA AGGG AGGG TGGA 1117-1120 TCCA CCCT CCCT TCCA 1290 A * A * 1297-1300 AAGT CGGC AAGT CGGC   1396   A   C   A   A   1425   A   A   G   A   1437   G   A   G   G   1492   T   C   C   T

a大肠杆菌编码系统(Brosius等，1978)。b表示模式菌株。星 号表示在比对中作为各个分离株和菌株序列任意位点发生核苷酸缺失 或插入的结果而在比对中引入缺口的地方。

最大似然法(Felsenstein，1981)用于从包括在比对图中的序列 来推断系统发生树，最大似然法包括寻找为产生观察到的序列数据提 供最大可能性的树(图3)。，最大似然法因为允许进化速率在不同 谱系之间具有差别，从而具有超过传统的简约法的优点，对于简约法 来说，如果不同谱系以不等的速率进化，它会导致推断出错误的树 (Felsenstein，1981)。由于树拓扑学也受到所使用的生物数量和选 择外部参考物种的影响(Stackebrandt和Ludwig，1994；Stackebrandt 和Rainey，1995)，因此出现在瘤胃中的许多显然相关和显然不相关 的生物被包括在比对图中。此图随后用于构建树。尽管系统发生树仅 仅推断自几乎完整(92％)的16SrRNA基因序列，这会降低非常密切 相关的生物之间的分辨率(Utaker等，1995；Li和Graur，1991)， 但是得自完整或部分序列的树的总体拓扑学显示彼此完全一致(Van Camp等，1993，Vandamme等，1996)。

Vandammr等人(1996)提议，如果共有多于97％rRNA序列同源 性、表现出表型一致性并且展示显著程度的DNA：DNA杂交，则不同分 离株应该作为同一种的成员。尽管生物体间DNA相似性与16S rRNA 序列同源性之间的关系不是线性的，Fox等人(1992)提议，有效的 16S rRNA序列一致性应该意味着两种生物为同一种的成员，因为这几 乎已由DNA：DNA杂交证实。尽管16SrRNA序列数据单独可能不足以 在各种情况下定义物种，但一旦有关种在16SrRNA序列数据库中得到 描述，它在确定一个菌株可能属于哪个种时是极为有用的。含有几乎 一致的16SrRNA序列的种应该指派入同一“rRNA超种 (superspecies)”或“rRNA种复合物(rRNA species complex)”。 因此，应当理解，将分离株CH4和CH7(表型上假设为埃氏巨球形菌 株)指派为同一rRNA种复合物，此复合物包括参考菌株ATCC25940 (该种的模式菌株)和ATCC 17752。由于分离株各自的系统发生关系 此外还与其表型特征一致，因此这些分离株可以认为是埃氏巨球形菌 种的菌株。蜡形巨球形菌与埃氏巨球形菌共有仅92％的16SrDNA序列 同源性的事实，以及基因型和表型数据，都证实了该属分隔为两个分 解良好的种。

本研究包括的瘤胃细菌中，与埃氏巨球形菌关系最接近的是反刍 月形单胞菌和卵形奎因氏菌。埃氏巨球形菌与反刍月形单胞菌之间明 显的系统发生关系与此两物种共有的一些表型和基因型特征一致，例 如相似的DNA G+C含量(53-54％)、厌氧性、相似范围底物的化学有 机营养新陈代谢和利用(Stackebrandt等人，1985；Stewart和Bryant， 1988；Haikara，1992)。将寡核苷酸分类技术(oligonucleotide cataloguing technique)应用于种间系统发生推断中的Stackebrandt 等人的工作支持这种系统发生关系(1985)。另一方面，反刍月形单 胞菌也与相对未知的卵形奎因氏菌关系密切，卵形奎因氏菌是在以高 糖饮食饲养动物时在瘤胃中增殖的生物。尽管尚未建立培养，这些生 物与发现于绵羊中的较大的Selenomonads共有一些生理学特征 (Stewart and Bryant，1988)。如预期，出现在瘤胃中的巨球形菌 的最远的亲缘是包括在古产烷生物簇中、被认为出现在约6至8亿年 前的生物(van Soest，1994；Woese，1987)。这些生物的进化速率 也比细菌慢，这一类的原始性也通过深度分枝的产烷生物簇得以明确 反映。

不同埃氏巨球形菌株近来的分枝可以归结于其为了适应瘤胃中高 选择性条件而对表型进行的精修(refinement)。依照Woese的观点 (1987)，生物表型的进化是为了在特定小生境中生存而获得新的或 者更有效特性的过程。精修将导致生物成为代谢多样的，巨球形菌的 情况就是这样。另一方面，相比较而言，进化较慢的产烷生物是代谢 作用单一的。

本研究证明了16SrDNA序列对区别埃氏巨球形菌密切相关菌株的 适用性。此外，本研究提供用于鉴定表型已得到表征的新近分离菌株 的系统发生框架。作为为瘤胃生态学研究而设计的种和株特异性探针 的基础，该框架将具有特别的价值。

结论

分离

在IRFL培养基中引入溴甲酚紫来促进乳酸利用细菌的检测，在本 研究的主要目的即生长较快的乳酸利用者这种情况下，被证实是成功 的。在孵育的早期阶段，这些乳酸利用细菌产生与菌落同心的紫色环 带，与琼脂培养基的淡黄色背景形成明显对比。但是，在长期培养中， 围绕菌落的pH梯度由于离子扩散而消散，整个背景变紫。区别生长较 慢的乳酸利用者的菌落与出现于瘤胃液补充当中、以其它碳源生长的 生物菌落之间的区别于是变得困难。

埃氏巨球形菌并非高精饲料饮食动物的主要乳酸利用物种 (Mackie等，1978；Mackie和Gilchrist，1979；Mackie等人，1984； van Gylswyk，1990)，但是它们在选择和筛选程序中具有优势有许多 理由。

一些筛选的菌落含有Selenomonads和其他形态型。因为没有可以 在可溶性糖存在下利用乳酸的阳性指征，这些菌落大多未被选择。 Russell和Baldwin(1978)指出，在多底物培养基中，埃氏巨球形菌 B159利用葡萄糖、麦芽糖和乳酸，但是不能同时利用蔗糖。Marounek 等人(1989)表明，对于四种埃氏巨球形菌株，在具有葡萄糖和乳酸 两种碳源的培养基中，乳酸比葡萄糖更迅速的得到利用。

其他一些实验室，研究使用乳酸利用生物接种高精饲料饮食状态 的反刍动物来预防乳酸蓄积的可能性，也使用埃氏巨球形菌株工作 (Das，1979；Leedle等人，1991；Robinson等人，1992；Kung和 Hession，1995；Wiryawan和Brooker，1995)。因为在文献中没有 提供结果，所以不可能将AW和CH分离株的生长速率与文献中的菌株 比较，来确定是否它们具有更快的生长速率或是否它们更耐受酸。然 而，AW和CH分离株可以与模式菌株埃氏巨球形菌ATCC25940比较。

对于AW分离株，用于测定生长的pH值范围不足以测定分离株的 pH范围或者生长的最优pH范围。然而，由于在pH 4.5于IRFL平板 上没有生长，可以假设对于除了这四种之外的所有分离株，最适宜pH 在pH5.7之上，最低pH将位于pH4.5和pH4.9之间。这与实施于 模式菌株埃氏巨球形菌ATCC 25940的工作一致。模式菌株埃氏巨球形 菌ATCC 25940的pH范围为pH4.6至7.8，对生长最适宜为pH6.05 (Therion等人，1982)。

对于CH分离株，最优生长pH在pH 5至6之间。在测试的pH值 范围内，最高生长速率发现于pH 5.5。在SDL培养基上，两批分离株 都比模式菌株具有更高的生长速率。在SDL培养基中获得的埃氏巨球 形菌ATCC 25940的生长速率可以同早期研究者在乳酸培养基上获得的 生长速率相比拟(Therion等人，1982)

分离株在乳酸上的生长速率高于在葡萄糖和麦芽糖上。这与以前 对埃氏巨球形菌ATCC 25940的研究一致，在该研究中，在乳酸培养基 上，pH 5.0和pH 6.5之间的生长速率被发现高于葡萄糖培养基中的 生长速率(Therion等人，1982)。此范围之外，在葡萄糖上的生长 速率较高。一个关于瘤胃细菌底物偏爱的研究报告指出，埃氏巨球形 菌B159在乳酸上的生长速率比在葡萄糖和麦芽糖上慢，然而该研究中 培养基的pH在pH 6.5之上，介于6.75和6.9之间(Russell和 Baldwin，1978)。

对在乳酸培养基上四种埃氏巨球形菌株(包括模式菌株LC1或 ATCC 25940)的发酵终产物的组成进行了测定(Marounek等人，1989)。 这些结果显示形成的脂肪酸比例在菌株间具有差异。三种菌株产生很 少或不产生戊酸，而埃氏巨球形菌L8终产物的22mol％为戊酸 (Marounek等人，1989)。本研究中测试的九种AW分离株没有展示 像Marounek等人(1989)所测试菌株那样多的菌株间差异性，但是与 分离自牛奶饮食状态的小牛瘤胃的埃氏巨球形菌L8相似，因为其也产 生戊酸。然而，CH4与模式菌株产生相同的发酵终产物。

从最大生物量产出速率角度而言，在SDL培养基中，菌株AW15将 成为为动物实验大规模生产细胞的选择，其次为CH4和AW01。在5升 工作体积的恒化器中，在SDL培养基上产生干物质100克的细胞所需 要的时间，AW15为1.9天，CH4和AW01为2.1天。

与埃氏巨球形菌模式菌株相比，所选分离株在乳酸上的生长速率 是高的。分离株是酸耐受的，可以在低于5.0的pH值生长。它们抵抗 一般添加于饲育场饮食中的离子载体，并且即使在葡萄糖和麦芽糖存 在下，也可利用乳酸的两种异构体。乳酸的发酵终产物为VFA，VFA 是反刍动物的重要能量来源。由于丙酸是反刍动物组织葡萄糖的主要 来源，因此丙酸产物在饲育场工业中尤其重要。分离株因此具有抗击 反刍动物乳酸中毒症的有效产品所要求的特征。

使用不含任何瘤胃液的培养基成功地培养了乳酸利用者。对最初 培养基仅有的改良是增加维生素含量以及向培养基中添加酵母提取 物。当作为工作培养物时，细菌在此培养基上于4℃生存非常良好达 20天。

使用pH助恒器富集瘤胃乳酸利用细菌的技术是非常成功的，富集 的瘤胃乳酸利用细菌具有预先确定的生物化学/生理学属性的组合，将 使它们潜在的高度适合于预防和抗击饲育场动物乳酸中毒症。在大多 数情况下，快速生长、形态均一的群体将在运行开始后两天内建立于 发酵罐中。经平板涂布法对分离自发酵罐内容物中的培养物的后续测 试证实，培养物拥有所要求的特征组合。

来自富集物的分离株的假设性鉴定显示：除了一个之外，所有分 离株均属于埃氏巨球形菌种。

表14：pH助恒器分离技术与传统平板涂布法筛选技术的比较。            参数 传统平板涂布法      助恒器 所用时间(天数)      90        9 所费雇工小时数      180        7 样品：细菌负荷(cfu)      12×1010        14×1012 最大比生长速率(h-1)      0.91        0.90 生物量产率(g.l-1)      0.60        0.59 生物量产生速率g(l.h)-1      0.39        0.39

由于分离株在低于6.0的pH值表现优于ATCC 25940，因此他们将 更适于饲育场动物遇到的通常低于pH6.0的瘤胃pH。另外，CH4被证 实是饲育场动物批次实验法(trial experimentation)最适宜的分离 株。

与在乳酸上获得的生长速率相比，乳酸利用分离株在葡萄糖上的 培养得到较慢的生长速率，因而建议不要使用。

被给以生物CH4的三十只母牛生产显著更多的牛奶(P＝0.10)， 具有更高的平均体重(P＝0.02)和身体状况分值(P＝0.06)。接受60％ 精饲料饮食+CH4的母牛的乳脂百分比也显著增加(3.57％vs. 3.23％)。

产乳动物试验

当母牛被饲以70％精饲料饮食并给以生物CH4时，干物质摄入没有 差别，但是奶产量从35.9升至39.3公斤/天，即以3.4公斤/天的水 平显著增加(p＝0.06)。当所有给予微生物的母牛与所有没有给予微 生物的母牛比较时，奶产量趋向于增加(P＝0.13)。当接受高精饲料 饮食的高产母牛被给以生物CH4时，体重和状况分值增加(P＝0.02)。 接受60％精饲料饮食和给予微生物的母牛引起乳脂百分比的显著升高 (P＝0.06)，并具有牛奶蛋白质升高的趋势(P＝0.11)。乳成分在当 前乳报酬体系(milk payment scheme)中扮演着重要角色。

将生物CH4给予母牛，显著增加了奶产量，并对乳组成、体重和 身体状况分值起到积极作用。干物质摄入未受影响；因此结果提示， 将生物CH4给以母牛，促成了更有利的、导致营养素利用改善的瘤胃 环境。

饲育场动物试验

与对照相比，经CH4处理的动物在饲育场关键时期(第3-5周)  期间，平均日增重(ADG)和饲料转化比(FCR)具有显著改善，并且 消化紊乱全面降低，这些显示 以CH4处理饲育场动物在以下方面有效：

● 如本实验所固有的，它帮助从粗饲料到精饲料饮食的适应。在早 期适应阶段，与高粗饲料饮食相比，CH4还减轻了低粗饲料饮食较差 的性能。

● 这里用于CH4的本申请方法有效的允许其按照意图表现。

● 在酸中毒最可能出现的关键饲育场期，正如由观察到较少的酸中 毒病例而直接证实、以及由改善的性能所间接证实的，CH4的使用有 效预防了酸中毒。这些都在酸中毒高风险饮食及饮食方案中(尤其是 在早期饲育场阶段)观察到，并且在没有使用离子载体时更为明显。

● 正如CH4较对照而言导致酸中毒病例的急剧下降所证实，CH4可 以作为兽医学试剂使用，来帮助预防和/或治疗酸中毒。

● CH4可以用于改善饲育场性能，包括生长速率(也指缩短育肥所 需要的时间)和饲料转化效率。

● CH4可以用于允许用较高精饲料饮食的饲养，即使用较少粗饲 料，并增加从高粗饲料饮食至高精饲料饮食的改变的速率，也即使用 较少粗饲料。在早期饲育场期的观察对此给以进一步直持，即，与高 粗饲料饮食相比，添加CH4时，低粗饲料饮食的负面影响大幅降低。

本发明人另外发现，与已知的埃氏巨球形菌相比，埃氏巨球形菌 CH4株是：

-在高精饲料饮食动物瘤胃中高度活跃并适于增殖；

-可以在低于pH5.0、低至4.5的相对低pH值增殖，这些pH值是 急性酸中毒的特征；

-抵抗通常添加于饲育场饮食中的离子载体抗生素；以及

-即使在可溶性碳水化合物例如葡萄糖和麦芽糖存在下，也优先利 用乳酸作为碳源。

本菌株进一步的优点是其：

-具有相对高的生长速率，即高于0.938小时-1；

-具有在还原糖和乳酸上生长的能力；

-具有相对高的生物量产出率，即高于0.39克(升·小时)-1；

-是离子载体抗性的；

-主要产生醋酸，而不是主要为丙酸和丁酸；以及

-具有独特的16S rRNA序列，因此是一个新菌株。

本申请人还另外发现，在动物被直接饲入瘤胃的麦芽糖所挑战、 或者突然从粗饲料改变为高精饲料饮食的情况下，当以CH4接种时， 在瘤胃内不产生可测量的乳酸增加。

此外，以CH4接种的高产奶牛比没有以CH4接种的对照动物多出 2.4至3.2升的奶产量。接种母牛的身体状况分值和体重在统计学上 显著高于对照动物。

应当理解，可以对本发明的微生物及其用途进行细节上的改变， 而不背离所附的权利要求的范围。

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