技术领域
[0001] 本
发明涉及兽用
生物制品技术领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法。
背景技术
[0002] 目前猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖大部分采用转瓶生产工艺，然而，传统的转瓶生产工艺却存在以下几点缺点：劳动强度大，工艺复杂，
细胞增殖慢且数量少，无法提供最佳的pH、DO等条件，只能一次
收获，收获的病毒含量低。因此，如若要大量增殖，则只能通过增加转瓶数量的方法，结果又导致车间生产所需设备、人员等需求更大。
[0003] 目前，悬浮培养技术已生成兽用生物制品的热点，通过悬浮培养技术生产出的
抗原具有病毒含量高、纯净性好等特点，广泛用于兽用生物制品。
[0004] 然而，已有的猪流行性腹泻病毒(PEDV)悬浮培养生产工艺，虽使病毒含量有所提高，但收毒次数较少(只能一次收获)，且生产成本较高。
[0005] 据此，目前急需对
现有技术改进，以提供一种劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、细胞数高、成本低、抗原病毒含量高，且可实现多次收获的猪流行性腹泻病毒生产方法。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、细胞数高、成本低、抗原病毒含量高，且可实现多次收获的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法。
[0007] 本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0008] 一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，包括如下步骤：
[0009] (1)细胞复苏及扩增
[0010] 将冻存的Vero细胞复苏到T75细胞培养瓶中，并置于36-37℃
温度下培养，长至
单层致密后，用含0.25％胰酶的细胞分散液消化后，再加入含8-10％新生
牛血清的DMEM细胞生长液传代培养，按1:(3-6)的比例逐级传代放大至3-15L转瓶内培养，转瓶按照1:(3-5)的传代比例扩传；
[0011] (2)片状载体处理
[0012] 按照20-40g/L片状载体的比例，称量好所需的片状载体放入7-50L悬浮培养罐的载体框内，组装好悬浮培养罐，打入PBS缓冲液，使之充分浸泡到片状载体，10-15min后弃去PBS缓冲液，加入新的PBS缓冲液，并使其超过片状载体上界面10-15cm；
[0013] (3)悬浮培养罐及片状载体灭菌
[0014] 按照悬浮培养的常规操作规程，对步骤(2)中含片状载体的7-50L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40-50min，冷却后取样做无菌检验；
[0015] (4)细胞上罐
[0016] 将步骤(1)中3-15L转瓶内的Vero细胞消化下来，按终浓度(1-5)×106cells/mL的接种
密度接种到步骤(3)中的7-50L悬浮培养罐内，设定温度37℃、pH 7.0-7.2、DO 30％-60％、转速50-100rpm，开始培养；
[0017] (5)细胞悬浮培养
[0018] 开始培养后22-26h，取样测定培养液的含糖量，当含糖量低于8mmoL/L时，开始灌流培养；
[0019] (6)含毒维持液配制
[0020] 取调好pH 7.0-7.4并预热的DMEM溶液，加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种，使最终含胰酶5-10μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种1％-5％，混合均匀后，置于常温待用；
[0021] (7)接毒
[0022] 当悬浮培养罐Vero细胞培养到72-96h时，停止培养，将生长液弃去，通过管道加入事先预热的PBS溶液，搅拌1-5min，弃去，再加入PBS搅拌1-5min，如此洗3-5次；然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液，设定温度37℃、pH 7.2-7.4、DO 30％-60％、转速50-100rpm，开始病毒悬浮培养；
[0023] (8)收毒
[0024] A.当病毒悬浮培养至16-24h，进行第一次收获病毒液，收获体积为培养总体积的80％-90％，放-15℃以下冷库保存；
[0025] B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含5-10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16-24h，进行第二次收获病毒液，收获体积为培养总体积的80％-90％，放-15℃以下冷库保存；
[0026] C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含5-10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16-24h，进行第三次收获病毒液，全部收完，放-15℃以下冷库保存；
[0027] 其中，每个收次的病毒液，均测定一次病毒含量。
[0028] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中Vero细胞为非洲绿猴肾传代细胞，购于ATCC，由华中农业大学动物医学院
预防兽医学实验室保管和供应。
[0029] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中片状载体直接购买自ESCO公司。
[0030] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行。
[0031] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中通过罗氏
血糖仪测定培养液的含糖量。
[0032] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中灌流培养的灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整。
[0033] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(6)中猪流行性腹泻病毒PEDV具体为猪流行性腹泻病毒PEDV-AJ1102，即Porcine epidemic diarrhea virus PEDV-AJ1102，由华中农业大学提供，并由华中农业大学于2014年10月24日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏与登记，保藏编号为CCTCC V201433。
[0034] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(6)中常温指20-25℃。
[0035] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(8)的B步骤与C步骤中DMEM溶液的添加量均与前一次病毒液的收获量相同。
[0036] 作为本发明的优选方式之一，所述步骤(8)中采用TCID50测定法检测病毒含量。
[0037] 本发明相比现有技术的优点在于：本发明使用片状载体悬浮培养，劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、成本低，通过片状载体悬浮培养出的细胞量非常大，先加入含少量胰酶的维持液，使一部分先病变，再通过换液的办法，加入含新胰酶的维持液，再促使一部分病变，重复此方法使细胞逐渐病变，实现多次收获；本发明方法在一定程度上实现了多次收获猪流行性腹泻病毒的先例，可作为优良的生产工艺方法广泛应用于兽用生物制品领域；同时，采用本发明方法生产出的抗原病毒含量更是传统生产工艺的10-30倍。
附图说明
[0038] 图1是
实施例1-3中猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法的工艺
流程图。
[0039] 本发明使用的细胞及毒株来源说明：
[0040] 本发明使用的Vero细胞为非洲绿猴肾传代细胞，购于ATCC，由华中农业大学动物医学院预防兽医学实验室保管和供应。
[0041] 本发明使用的猪流行性腹泻病毒PEDV具体为猪流行性腹泻病毒PEDV-AJ1102(Porcine epidemic diarrhea virus PEDV-AJ1102)，由华中农业大学提供，并由华中农业大学于2014年10月24日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏与登记，经鉴定表现为存活，保藏编号为CCTCC V201433；中国典型培养物保藏中心的地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心。
具体实施方式
[0042] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0043] 实施例1
[0044] 如图1所示，本实施例的一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，包括如下步骤：
[0045] (1)细胞复苏及扩增
[0046] 将冻存的Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，购于ATCC)复苏到T75细胞培养瓶中，并置于36℃温度下培养，长至单层致密后，用含0.25％胰酶的细胞分散液消化后，再加入含8％新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养，按1:3的比例逐级传代放大至3L转瓶内培养，转瓶按照1:3的传代比例扩传；
[0047] (2)片状载体处理
[0048] 按照20g/L片状载体的比例，称量好所需的片状载体(购自ESCO公司)放入7L悬浮培养罐的载体框内，组装好悬浮培养罐，打入PBS缓冲液，使之充分浸泡到片状载体，10min后弃去PBS缓冲液，加入新的PBS缓冲液，并使其超过片状载体上界面10cm；
[0049] (3)悬浮培养罐及片状载体灭菌
[0050] 按照悬浮培养的常规操作规程，对步骤(2)中含片状载体的7L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40min，冷却后取样做无菌检验，无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行；
[0051] (4)细胞上罐
[0052] 将步骤(1)中3L转瓶内的Vero细胞消化下来，按终浓度1×106cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的7L悬浮培养罐内，设定温度37℃、pH 7.0、DO 30％、转速50rpm，开始培养；
[0053] (5)细胞悬浮培养
[0054] 开始培养后22h，通过罗氏血糖仪取样测定培养液的含糖量，当含糖量低于8mmoL/L时，开始灌流培养，灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整；
[0055] (6)含毒维持液配制
[0056] 取调好pH 7.0并预热的DMEM溶液，加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种(猪流行性腹泻病毒AJ1102株)，使最终含胰酶5μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种1％，混合均匀后，置于常温待用；
[0057] (7)接毒
[0058] 当悬浮培养罐Vero细胞培养到72h时，停止培养，将生长液弃去，通过管道加入事先预热的PBS溶液，搅拌1min，弃去，再加入PBS搅拌1min，如此洗3次；然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液，设定温度37℃、pH 7.2、DO 30％、转速50rpm，开始病毒悬浮培养；
[0059] (8)收毒
[0060] A.当病毒悬浮培养至24h，进行第一次收获病毒液，收获体积为培养总体积的80％，放-15℃以下冷库保存；
[0061] B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含5μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养22h(DMEM溶液添加量与一次收毒液的收获量相同)，进行第二次收获病毒液，收获体积为培养总体积的80％，放-15℃以下冷库保存；
[0062] C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含5μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养22h(DMEM溶液添加量与二次收毒液的收获量相同)，进行第三次收获病毒液，全部收完，放-15℃以下冷库保存；
[0063] 其中，每个收次的病毒液，均采用TCID50测定法检测一次病毒含量。
[0064] 实施例2
[0065] 如图1所示，本实施例的一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，包括如下步骤：
[0066] (1)细胞复苏及扩增
[0067] 将冻存的Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，购于ATCC)复苏到T75细胞培养瓶中，并置于37℃温度下培养，长至单层致密后，用含0.25％胰酶的细胞分散液消化后，再加入含10％新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养，按1:6的比例逐级传代放大至15L转瓶内培养，转瓶按照1:5的传代比例扩传；
[0068] (2)片状载体处理
[0069] 按照40g/L片状载体的比例，称量好所需的片状载体(购自ESCO公司)放入50L悬浮培养罐的载体框内，组装好悬浮培养罐，打入PBS缓冲液，使之充分浸泡到片状载体，15min后弃去PBS缓冲液，加入新的PBS缓冲液，并使其超过片状载体上界面15cm；
[0070] (3)悬浮培养罐及片状载体灭菌
[0071] 按照悬浮培养的常规操作规程，对步骤(2)中含片状载体的50L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌50min，冷却后取样做无菌检验，无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行；
[0072] (4)细胞上罐
[0073] 将步骤(1)中15L转瓶内的Vero细胞消化下来，按终浓度5×106cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的50L悬浮培养罐内，设定温度37℃、pH 7.2、DO 60％、转速100rpm，开始培养；
[0074] (5)细胞悬浮培养
[0075] 开始培养后26h，通过罗氏血糖仪取样测定培养液的含糖量，当含糖量低于8mmoL/L时，开始灌流培养，灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整；
[0076] (6)含毒维持液配制
[0077] 取调好pH 7.4并预热的DMEM溶液，加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种(猪流行性腹泻病毒AJ1102株)，使最终含胰酶10μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种5％，混合均匀后，置于常温待用；
[0078] (7)接毒
[0079] 当悬浮培养罐Vero细胞培养到96h时，停止培养，将生长液弃去，通过管道加入事先预热的PBS溶液，搅拌5min，弃去，再加入PBS搅拌5min，如此洗5次；然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液，设定温度37℃、pH 7.4、DO 60％、转速100rpm，开始病毒悬浮培养；
[0080] (8)收毒
[0081] A.当病毒悬浮培养至24h，进行第一次收获病毒液，收获体积为培养总体积的90％，放-15℃以下冷库保存；
[0082] B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养20h(DMEM溶液添加量与一次收毒液的收获量相同)，进行第二次收获病毒液，收获体积为培养总体积的90％，放-15℃以下冷库保存；
[0083] C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养20h(DMEM溶液添加量与二次收毒液的收获量相同)，进行第三次收获病毒液，全部收完，放-15℃以下冷库保存；
[0084] 其中，每个收次的病毒液，均采用TCID50测定法检测一次病毒含量。
[0085] 实施例3
[0086] 如图1所示，本实施例的一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，包括如下步骤：
[0087] (1)细胞复苏及扩增
[0088] 将冻存的Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，购于ATCC)复苏到T75细胞培养瓶中，并置于36.5℃温度下培养，长至单层致密后，用含0.25％胰酶的细胞分散液消化后，再加入含9％新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养，按1:4的比例逐级传代放大至10L转瓶内培养，转瓶按照1:4的传代比例扩传；
[0089] (2)片状载体处理
[0090] 按照30g/L片状载体的比例，称量好所需的片状载体(购自ESCO公司)放入40L悬浮培养罐的载体框内，组装好悬浮培养罐，打入PBS缓冲液，使之充分浸泡到片状载体，12min后弃去PBS缓冲液，加入新的PBS缓冲液，并使其超过片状载体上界面13cm；
[0091] (3)悬浮培养罐及片状载体灭菌
[0092] 按照悬浮培养的常规操作规程，对步骤(2)中含片状载体的40L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40min，冷却后取样做无菌检验，无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行；
[0093] (4)细胞上罐
[0094] 将步骤(1)中10L转瓶内的Vero细胞消化下来，按终浓度3×106cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的40L悬浮培养罐内，设定温度37℃、pH 7.0、DO 45％、转速75rpm，开始培养；
[0095] (5)细胞悬浮培养
[0096] 开始培养后24h，通过罗氏血糖仪取样测定培养液的含糖量，当含糖量低于8mmoL/L时，开始灌流培养，灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整；
[0097] (6)含毒维持液配制
[0098] 取调好pH 7.2并预热的DMEM溶液，加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种(猪流行性腹泻病毒AJ1102株)，使最终含胰酶7.5μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种2.5％，混合均匀后，置于常温待用；
[0099] (7)接毒
[0100] 当悬浮培养罐Vero细胞培养到90h时，停止培养，将生长液弃去，通过管道加入事先预热的PBS溶液，搅拌3min，弃去，再加入PBS搅拌3min，如此洗4次；然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液，设定温度37℃、pH 7.1、DO 45％、转速75rpm，开始病毒悬浮培养；
[0101] (8)收毒
[0102] A.当病毒悬浮培养至24h，进行第一次收获病毒液，收获体积为培养总体积的85％，放-15℃以下冷库保存；
[0103] B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含7.5μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养20h(DMEM溶液添加量与一次收毒液的收获量相同)，进行第二次收获病毒液，收获体积为培养总体积的85％，放-15℃以下冷库保存；
[0104] C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含7.5μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养18h(DMEM溶液添加量与二次收毒液的收获量相同)，进行第三次收获病毒液，全部收完，放-15℃以下冷库保存；
[0105] 其中，每个收次的病毒液，均采用TCID50测定法检测一次病毒含量。
[0106] 实施例4
[0107] 本实施例用以说明采用实施例3方法所得的病毒液中抗原病毒含量测定结果。
[0108] 采用实施例3方法进行连续4个批次(批号分别为：171103、171104、171205、171206)的病毒培养，各批次抗原病毒含量如表1所示。
[0109] 表1 各批次的抗原病毒含量
[0110]
[0111] 由表1可知，采用本发明方法所得抗原病毒含量高，是传统生产工艺的10-30倍，并且，各批次所得的病毒含量稳定。
[0112] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
