一种牛副流感3型病毒3种基因型多重RT‑PCR检测方法
阅读：1022发布：2020-08-01
专利汇可以提供一种牛副流感3型病毒3种基因型多重RT‑PCR检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且根据Genbank上发表的 牛 副流感3型病毒（Bovine parainfluenza 3 virus，BPI3V）3种基因型分离株的HN基因进行序列比较分析，参考3个基因型分离株NM09、TVMDL15、SD0835各自的HN基因序列保守区设计特异性引物，建立了在同一体系内检测BPI3V的3种基因型的多重RT‑PCR方法。方法可同时检测出A型BPI3V 长度为150bp、B型BPI3V 长度为253bp和C型BPI3V 长度为342bp的特异性 片段 ，且最低阳性质粒检测分别为0.89×104copies/µL、0.92×104copies/µL、1.53×104copies/µL，具有良好的 稳定性 和特异性。，下面是一种牛副流感3型病毒3种基因型多重RT‑PCR检测方法专利的具体信息内容。
1.一种多重RT-PCR检测牛副流感3型病毒（BPI3V）3种基因型的方法，包括检测牛副流感3型病毒（BPI3V）3种基因型的引物。
2.所述3种基因型的引物用于临床检测牛副流感3型病毒3种基因型。
一种牛副流感3型病毒3种基因型多重RT-PCR检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于病毒检测领域，具体涉及病毒性传染病的检测方法，特别是涉及一种牛副流感3型病毒3种基因型的检测方法及应用领域。
背景技术
[0002] 牛副流感是由牛副流感3型病毒引起的一种急性、接触性传染病，以呼吸道症状为主，单一病毒感染症状较轻，混合感染其他病毒细菌或在应激因素的作用下会引起严重的临床症状甚至导致病牛的大量死亡。牛副流感3型病毒（Bovine parainfluenza 3 virus ，BPI3V），是副黏病毒科呼吸道病毒属的单股负链RNA病毒，基因组由约15000多个核苷酸组成，至少编码6种结构蛋白。该病毒目前分为BPI3V基因A型、BPI3V基因B型和BPI3V基因C型3个基因型。牛副流感3型病毒自1959年被美国的Reisinger等从犊牛肾脏中首次分离之后，陆续被世界上许多国家分离。国内首次关于BPI3V的报道是在2001年童泽恩等对有呼吸道症状死牛剖检后发现疑似牛副流感。我国牛群中第一次被分离到BPI3V是在2009年，由刘鹏等分离内蒙分离株(NM09)并在2012年由中国学者Wen等鉴定为BPI3V基因A型，中国学者Zhu等分离并鉴定出BPI3V基因C型山东分离株(SD0835)。我国目前没有分离到BPI3V基因B型。到目前为止，国内外许多学者都建立了针对检测BPI3V的RT-PCR方法，但没有针对BPI3V的3种亚型的RT-PCR检测方法。随着国内外对BPI3V的广泛研究，越来越多地区被发现有BPI3V的流行，而近几年我国多个省份的血清学调查也显示牛副流感3型病毒抗体阳性率较高，其中内蒙古血清阳性率达84.31%（霍志云，2012）和95.20%（张欣欣，2016）。鉴于内蒙古部分地区牛副流感血清学调查阳性率高，但对其病原学调查尚不充分。同时多重RT-PCR以其操作简便、快速的优点常用于临床实践。本研究以建立了BPI3V的HN基因为靶序列，建立了检测BPI3V和区分其3种基因型的多重RT-PCR检测方法。为该病检验检疫提供有效实用的检测方法。
发明内容
[0003] 根据Genbank上发表的BPI3V的3种基因型分离株NM09（登录号：JQ063064)、TVMDL15（登录号：KJ647284)、SD0835（登录号：HQ530153)各自的HN基因进行序列比较分析，设计了3对特异性引物，建立了检测BPI3V的3种基因型的多重RT-PCR检测方法，从而实现对BPI3V的高效、快速、准确检测分型。
[0004] 本发明的目的在于除通过多重RT-PCR方法可用于BPI3V的临床检测，还能同时鉴别检测BPI3V的3种基因型。
[0005] 本发明的目的在于提供一种多重RT-PCR检测牛副流感3型病毒（BPI3V）3种基因型的引物，所述引物如表一所示。
[0007] 本发明具体提供了一种多重RT-PCR检测牛副流感3型病毒（BPI3V）3种基因型检测方法，具体步骤如下。
[0008] 1.引物和探针的设计与合成：根据Genbank上发表的牛副流感3型病毒A型分离株NM09、B型分离株TVMDL15、C型分离株SD0835各自的HN基因序列比较分析，使用Oligo 6.0软件设计了特异性引物，引物交由宝生物工程 (大连)有限公司合成，扩增长度分别为：150bp、253bp、342bp。
[0009] 2.阳性克隆质粒模板的制备取毒液200μL，根据Takara病毒DNA/RNA提取试剂盒的说明书提取。A型BPI3V和B型BPI3V阳性克隆质粒由宝生物工程（大连）有限公司合成。利用C型BPI3V的cDNA、A型BPI3V和B型BPI3V阳性克隆质粒分别进行PCR反应，同时设定阴性对照（ddH2O）。反应采用25µL的体系包括：Mix 12.5µL、上下游引物各1.0µL、DNA模板1.0µL、加ddH2O 至25µL。循环参数为：95℃预变性5 min；95℃20s，50℃～52℃30s，72℃40s，共35个循环，最后72℃延伸8min；目的片段长度分别为150bp、253bp、342bp，
C型BPI3V的cDNA的PCR产物回收经试剂盒纯化后连接入pMD19-T载体，转化至DH5a大肠埃希菌，选取经双酶切鉴定和通过序列测定分析验证的C型阳性克隆质粒作为其标准阳性。
C型BPI3V的cDNA的PCR产物回收经试剂盒纯化后连接入pMD19-T载体，转化至DH5a大肠埃希菌，选取经双酶切鉴定和通过序列测定分析验证的C型阳性克隆质粒作为其标准阳性。
[0010] 3.多重RT-PCR反应体系及参数：50μL体系中加入高保真酶1µL，10×PCR Buffer 5µL，dNTP 5µL、MgSO4 2µL、（BPI3Va、BPI3Vb、BPI3Vc的引物按4:4:1混合）上下游混合引物各1.5µL、DNA模板3.0µL、ddH2O 31µL。
循环参数为：95℃预变性5 min；95℃20s，51.5℃30s，72℃40s，共35个循环，最后72℃延伸
8min；目的片段为150bp+253bp+342bp。
循环参数为：95℃预变性5 min；95℃20s，51.5℃30s，72℃40s，共35个循环，最后72℃延伸
8min；目的片段为150bp+253bp+342bp。
[0011] 本发明中，参照基因库中编号为JQ063064、KJ647284、HQ530153的BPI3V的3种基因型分离株NM09、TVMDL15、SD0835的HN基因序列设计引物，其全基因序列长度分别为15474bp、15456bp、15474bp，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。
[0012] 本发明中，以BPI3V的C基因型cDNA为模板，用C型引物扩增出长度为342bp的片段，该片段克隆至pMD-19T载体，得到标准阳性模板。
[0013] 本发明中，以BPI3V的A型和B型阳性克隆质粒基因为模板，用A型和B型引物引物扩增出长度为150bp和253bp的片段，确认合成标准阳性模板可用。
[0014] 同时，本发明充分考虑到，当BPI3V的A型、B型和C型三模板同时扩增时，会竞争酶、引物，对扩增产生影响，对共扩增体系的反应条件和检测低限进行了优化研究。三重RT-PCR体系则按照4:1:1的比例配制。反应参数为：95℃5 min；95℃20s，51.5℃30s，72℃40s，共35个循环；最后72℃延伸8min。
[0015] 进一步本发明对牛传染性鼻气管炎病毒检测方法的特异性、灵敏性和可重复进行了确证。
[0016] 用本发明提供的扩增体系分别扩增了牛传染性鼻气管炎病毒、牛支原体、牛病毒性腹泻病毒、小反刍兽疫的等核酸样品，均未出现条带，表明该方法具有较好的特异性。
[0017] 选取pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNc浓度分别为28ng/µL、30ng/µL、51ng/µL的混合阳性质粒依次进行10倍倍比稀释，稀释的9个梯度分别为模板进行扩增，结
4
果可知混合引物对混合模板扩增的最低阳性质粒检测分别为0.89×10copies/µL、0.92×
104copies/µL、1.53×104copies/µL，表明该方法具有良好的灵敏性。
4
果可知混合引物对混合模板扩增的最低阳性质粒检测分别为0.89×10copies/µL、0.92×
104copies/µL、1.53×104copies/µL，表明该方法具有良好的灵敏性。
[0018] 分别以pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa + pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNb + pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa + pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa + pMD19-T-HNb + pMD19-T-HNc为模板，进行每类模板3个重复的扩增，扩增条带稳定，表明该方法具有良好的重复性。
[0019] 通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。
[0020] 针对鉴定区分BPIV3的3种基因型的RT-PCR方法是首次被建立，通过此法可了解在家畜群里感染BPI3V的基因型等信息，以此进一步进行病毒分子流行病学的研究以及相应的疫苗研制。本方法检测快速方便，传统的病毒分离法的检测时间至少要在7d以上，该发明检测时间包括样品前处理到获得检测结果在3h之内。检测灵敏度高，该方法可检测到1pg的重组质粒。特异性好，通过对牛传染性鼻气管炎病毒、牛支原体、牛病毒性腹泻病毒、小反刍兽疫等核酸样品检测，只有BPIV3阳性模板扩增出预期条带。重复性好，通过分别对7种混合和单一模板进行三次重复性检测，条带均得到一致性结果。本方法可进行定性检测快速分型，方法流程简单，易于操作，可快速掌握，只要具备分子生物学基础知识，无需特别训练就能快速完成。用该发明方法对A型BPI3V病毒cDNA、C型BPI3V病毒cDNA及混合其cDNA作为模板进行扩增来验证本方法的准确性，同时临床收集的33份鼻拭子和12份牛肺用该体系进行检测，均得到预期结果。
[0021] 本方法能同时鉴别检测BPIV3的3个基因型，对相关病毒检验检疫技术的研究有实际的借鉴意义。通过此法可了解在家畜群里BPI3V的基因型信息，同时对部分地区饲养的奶牛进行病毒分子流行病学的研究，以此了解疾病流行情况，为预防和控制牛副流感提供数据和技术支持。该方法能够广泛应用于出入境检验检疫部门、畜牧兽医部门和养殖单位，为疫病的有效防控具有重要意义。附图说明
[0022] 图1：病毒3种亚型单重PCR扩增结果：其中1为阴性对照，2、3、4为BPI3Va、BPI3Vb、BPI3Vc的扩增片段（342bp、150bp、253bp），M为DL500marker。
[0023]图2：病毒的3种亚型阳性克隆质粒多重PCR结果：其中1为阴性对照，2、3、4为BPI3Va、BPI3Vb、BPI3Vc的扩增片段（150bp、253bp、342bp），5、6、7为BPI3Va+BPI3Vb、BPI3Vb+BPI3Vc、BPI3Va+BPI3Vc的扩增片段（150bp+253bp、253bp+342bp、150bp+342bp），8为BPI3Va+BPI3Vb+BPI3Vc的扩增片段（150bp+253bp+342bp），M为DL500marker。
[0024] 图3：多重RT-PCR方法灵敏性试验结果：其中1为阴性对照，2 10为pMD19-T-HNa:~
10 2 10
0.89×10 copies/µL 0.89×10 copies/µL,pMD19-T-HNb:0.92×10 copies/µL 0.92×~ ~
102copies/µL,pMD19-T-HNc:1.53×1010copies/µL 1.53×102copies/µL; M为
~
DL500marker。
10 2 10
0.89×10 copies/µL 0.89×10 copies/µL,pMD19-T-HNb:0.92×10 copies/µL 0.92×~ ~
102copies/µL,pMD19-T-HNc:1.53×1010copies/µL 1.53×102copies/µL; M为
~
DL500marker。
[0025] 图4：多重RT-PCR方法特异性试验结果：其中1为阴性对照，2为阳性对照，3～9分别为牛传染性鼻气管炎病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛病毒性腹泻病毒、羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒、牛支原体，M为DL500marker。
[0026] 图5：多重RT-PCR方法重复性试验结果：其中1～3为BPI3Va，4～6为BPI3Vc，7～9为BPI3Vb，10～12为BPI3Va+BPI3Vb，13～15为BPI3Vb+BPI3Vc，16～18为BPI3Va+BPI3Vc， 19～21为BPI3Va+BPI3Vb+BPI3Vc，22为阴性对照，M为DL500marker。
[0027] 图6：多重RT-PCR方法对病毒核酸的检测结果：其中1为阴性对照，2为阳性对照，3为BPI3Va+BPI3Vc，4为BPI3Vc；5为BPI3Va，M为DL500marker。
[0028]
具体实施方式
[0029] 实施例一：牛副流感3型病毒3种基因型多重RT-PCR检测方法引物和探针的设计与合成：根据Genbank上发表的牛副流感3型病毒A型分离株NM09、B型分离株TVMDL15、C型分离株SD0835各自的HN基因序列比较分析，使用Oligo 6.0软件设计了特异性引物，引物交由宝生物工程 (大连)有限公司合成，扩增长度分别为：150bp、253bp、342bp。本发明中的引物代号序列见表1，其中参照基因库中编号为JQ063064、KJ647284、HQ530153的BPI3V的3种基因型分离株NM09、TVMDL15、SD0835的HN基因序列设计引物，其全基因序列长度分别为
15474bp、15456bp、15474bp，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。
15474bp、15456bp、15474bp，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。
[0030] 表1 多重RT-PCR扩增3种BPI3V基因型基因的引物序列.实施例二：阳性克隆质粒模板的制备
取毒液200μL，根据Takara病毒DNA/RNA提取试剂盒的说明书提取。A型BPI3V和B型BPI3V阳性克隆质粒由宝生物工程（大连）有限公司合成。利用C型BPI3V的cDNA进行PCR反应，同时设定阴性对照（ddH2O）。反应采用25µL的体系包括：Mix 12.5µL、上下游引物各1.0µL、DNA模板1.0µL、加ddH2O 至25µL。循环参数为：95℃预变性5 min；95℃20s，52℃30s，72℃
40s，共35个循环，最后72℃延伸8min；目的片段长度为342bp。PCR产物回收经试剂盒纯化后连接入pMD19-T载体，转化至DH5a大肠埃希菌，选取经PCR扩增鉴定和通过序列测定分析验证阳性克隆质粒作为其标准阳性模板。
取毒液200μL，根据Takara病毒DNA/RNA提取试剂盒的说明书提取。A型BPI3V和B型BPI3V阳性克隆质粒由宝生物工程（大连）有限公司合成。利用C型BPI3V的cDNA进行PCR反应，同时设定阴性对照（ddH2O）。反应采用25µL的体系包括：Mix 12.5µL、上下游引物各1.0µL、DNA模板1.0µL、加ddH2O 至25µL。循环参数为：95℃预变性5 min；95℃20s，52℃30s，72℃
40s，共35个循环，最后72℃延伸8min；目的片段长度为342bp。PCR产物回收经试剂盒纯化后连接入pMD19-T载体，转化至DH5a大肠埃希菌，选取经PCR扩增鉴定和通过序列测定分析验证阳性克隆质粒作为其标准阳性模板。
[0031] 1.重组质粒的PCR扩增鉴定：3基因型重组质粒分别取1μL为模板，加入Premix12.5μL，上、下游引物(10pmoL)各1μL，补水至25μL，进行PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果参见附图1。
[0032] 2.重组质粒的测序鉴定：将PCR扩增鉴定为阳性质粒的菌液过夜培养，送公司测序。琼脂糖凝胶电泳可知，分别以BPI3V的A型、B型和C型重组质粒为模板进行单重PCR反应，扩增出大小相符的150bp、253bp和342bp的片段，测序鉴定均正确，经鉴定正确的重组质粒即为阳性模板。
[0033] 实施例三：多重RT-PCR扩增体系的建立采用单一模板和混合模板，其中混合模板的组分均为等浓度混合，同时设定阴性对照（ddH2O）。反应采用50µL的体系，包括：高保真酶1µL，10×PCR Buffer 5µL，dNTP 5µL、MgSO4
2µL、（BPI3Va、BPI3Vb、BPI3Vc的引物按4:4:1混合）上下游混合引物各1.5µL、DNA模板3.0µL、ddH2O 31µL。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃20s，51.5℃30s，72℃40s，共35个循环，最后72℃延伸8min。结果表明，引物对各自模板具有较好的特异性，凝胶电泳结果参见附图
2。
2µL、（BPI3Va、BPI3Vb、BPI3Vc的引物按4:4:1混合）上下游混合引物各1.5µL、DNA模板3.0µL、ddH2O 31µL。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃20s，51.5℃30s，72℃40s，共35个循环，最后72℃延伸8min。结果表明，引物对各自模板具有较好的特异性，凝胶电泳结果参见附图
2。
[0034] 实施例四：灵敏性试验、特异性试验和重复性试验选取pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNc浓度分别为28ng/µL、30ng/µL、51ng/µL的混合阳性质粒依次进行10倍倍比稀释，稀释的9个梯度分别为模板进行扩增，取制备的标准阳性混合质粒作为阳性对照，同时设立阴性对照。2%琼脂糖凝电泳检测。反应结果由附图
3可知，混合引物对混合模板扩增的灵敏度较高，对pMD19-T-HNa 、 pMD19-T-HNb 、pMD19-T-HNc的最低阳性质粒检测分别为0.89×104copies/µL、0.92×104copies/µL、1.53×
104copies/µL。特异性试验用牛传染性鼻气管炎病毒、牛支原体、牛病毒性腹泻病毒、小反刍兽疫的等核酸样品按优化后的反应体系和反应参数进行PCR反应。同时设立阴性对照和阳性对照，2%琼脂糖凝电泳检测。反应结果由附图4可知除阳性对照出现3个目的条带外，其余包括阴性对照均未出现条带，表明本法特异性高。分别以pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa + pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNb + pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa + pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa + pMD19-T-HNb + pMD19-T-HNc为模板，进行每类模板3个重复的扩增，同时设立阴性对照和阳性对照，2%琼脂糖凝电泳检测。反应结果由附图5可知扩增条带稳定，表明该方法具有良好的重复性。
3可知，混合引物对混合模板扩增的灵敏度较高，对pMD19-T-HNa 、 pMD19-T-HNb 、pMD19-T-HNc的最低阳性质粒检测分别为0.89×104copies/µL、0.92×104copies/µL、1.53×
104copies/µL。特异性试验用牛传染性鼻气管炎病毒、牛支原体、牛病毒性腹泻病毒、小反刍兽疫的等核酸样品按优化后的反应体系和反应参数进行PCR反应。同时设立阴性对照和阳性对照，2%琼脂糖凝电泳检测。反应结果由附图4可知除阳性对照出现3个目的条带外，其余包括阴性对照均未出现条带，表明本法特异性高。分别以pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa + pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNb + pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa + pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa + pMD19-T-HNb + pMD19-T-HNc为模板，进行每类模板3个重复的扩增，同时设立阴性对照和阳性对照，2%琼脂糖凝电泳检测。反应结果由附图5可知扩增条带稳定，表明该方法具有良好的重复性。
[0035] 实施例五：多重RT-PCR方法对病毒核酸及临床样品的检测结果采用所建多重RT-PCR方法，以A型BPI3V病毒cDNA、C型BPI3V病毒cDNA及混合其cDNA作为模板分别扩增出150bp、342bp、150bp+342bp的目的片段，证实了本方法的准确性。结果参见附图6。应用本法检测的临床33份鼻拭子样品和11份牛肺样品均为阴性。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 抗纤维蛋白溶解化合物 | 2020-05-17 | 943 |
| 钨（VI）盐用于治疗非糖尿病哺乳动物的雌性不育症的用途 | 2020-05-20 | 447 |
| 乳房内乳头密封剂 | 2020-05-20 | 967 |
| 抗微生物聚酰胺组合物和乳腺炎治疗 | 2020-05-16 | 261 |
| 用于兽医学和人类医学预防和治疗的新疫苗 | 2020-05-14 | 383 |
| 喹诺酮－抗生素的新用途 | 2020-05-15 | 204 |
| 用于CDKL5失调的治疗的三环二苯并硫氮杂卓类化合物 | 2020-05-17 | 704 |
| 用于医学和兽医学的眼科药物组合物 | 2020-05-12 | 404 |
| 用于诱导呕吐的兽医学方法 | 2020-05-12 | 670 |
| 基于重组猪腺病毒的病毒载体和病毒疫苗 | 2020-05-18 | 874 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈