诊断和治疗自闭症的方法
阅读：182发布：2020-05-16
专利汇可以提供诊断和治疗自闭症的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且包括 自闭症 谱系障碍 的诊断和 治疗 方法。在一种实施方式中，如果患者样本中发现mGluR网络基因中的至少一个CNV，则诊断患者为患有 自闭症谱系障碍 。具有至少一个mGluR网络基因CNV的患者用(+)-5- 氧 代-D-脯 氨 酸哌啶酰胺一 水 合物(NS-105)(也称为NFC-1或法索西坦)有效地治疗。，下面是诊断和治疗自闭症的方法专利的具体信息内容。
1.一种治疗人患者的自闭症的方法，包括：向所述患者施用治疗有效量的法索西坦(NS-105或NFC-1)，从而改善所述患者自闭症的至少一种症状，其中所述患者在选自如下的基因中具有至少一个CNV：ACAT1，ACAT2，ACCN1，ACCN2，ACP1，ACTB，ACTR2，ADA，ADCY1，ADD1，ADD2，ADORA1，ADRA1B，ADRA2A，ADRA2C，ADRB2，ADRBK1，ALDOA，ANXA2，APP，APTX，AQP1，ARHGAP24，ARL15，ARRB1，ARRB2，ATXN7L3，BDKRB1，BDKRB2，BTBD2，BTG2，C17orf44，C1orf116，C7orf25，CA8，CACNA1B，CACYBP，CALB2，CALM1，CALM2，CALM3，CAMK1，CAMK2B，CAMK4，CCNB1，CDC42，CENTG1，CHGB，CHP，CHRM2，CHRM3，CIC，CMPK，CNP，CNR1，CNTN4，COPB2，CRHR1，CTNNA2，CYCS，DCN，DHCR7，DISC1，DLST，DPP6，DRD2，DRD3，DSTN，DYNLL1，ECHS1，EGFR，EIF3S3，ERBB2，F2R，F2RL2，F2RL3，F3，FKBP3，FPR1，FSCN1，FURIN，FYN，GAPDH，GLP1R，GLP2R，GNA15，GNAI1，GNAI2，GNAI3，GNAO1，GNAQ，GNB2L1，GOT1，GP1BA，GPR26，GRB2，GRB7，GRIA1，GRIK1，GRIK3，GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，GRM8，GSN，HBXIP，HD，HNRPA3，HOMER1，HOMER3，HRPT2，HSP90AB1，HTR2A，IL8RB，IMPDH2，IQGAP2，ITGB1，ITGB7，ITPR1，KIAA0090，KIAA1683，LAMA4，LARP7，LRP2BP，LRRC59，LTA，LYAR，LYN，MAP4，MAPK1，MAPT，MARK4，MC4R，MGC11082，MRPL14，MRPS16，MTHFD1，MTNR1A，MTNR1B，MX1，MYC，MYO6，NANS，NARG1，NCK1，NEGR1，NFKBIA，NLN，NMI，NPY2R，NUDC，OPRD1，PAFAH1B3，PCBP1，PCBP3，PCDHA4，PCID1，PCMT1，PDCD5，PDE1B，PDE1C，PDE6G，PGM1，PHKB，PHKG2，PICK1，PIK3CA，PIK3R1，PLA2G7，PLCB1，PLCB3，PLCG2，PPIH，PPP2R1A，PRDX1，PRKCA，PRLHR，PRMT1，PRPSAP1，PSAT1，PSEN1，PSMA1，PSMC1，PSMD1，PSMD11，PSMD13，PSMD6，PSME1，PTHR2，PXN，PYGL，PYGM，QRICH2，RAB2，RALA，RANBP1，RAP2A，RCC1，RCC2，RGS12，RGS2，RHOA，RIF1，RPA2，RPLP2，RPN2，RPS14，RRM1，RUVBL2，RYR1，RYR2，S100A6，SACS，SARS，SCTR，SDC3，SELE，SERPINB9，SET，SETD4，SF3B14，SGTB，SHANK1，SHBG，SIAH1，SLC2A1，SLC6A3，SLC7A10，SNCA，SNRPB2，SOCS6，SOCS7，SORD，SRC，STAU1，STRAP，STX12，SYK，TBCA，TBXA2R，TCP1，TEAD3，TFAM，TGM2，TJP1，TK1，TLR10，TMEM4，TNIK，TPI1，TRAF2，TRMT112，TUBA1，TUBA1A，TUBA1B，TUBA2，TUBB，TUBG1，TXN，TXNDC4，TXNL2，TYMS，UBQLN4，UCHL1，USP24，VHL，VIPR1，YWHAQ，和ZAP70。
2.权利要求1的方法，其中所述患者经诊断患有自闭症谱系障碍，广泛性发育障碍，或一种或多种选自如下的病症：自闭性障碍(典型自闭症)，阿斯伯格综合征，儿童崩解症，雷特氏症，未另行说明的广泛性发展障碍(PDD-NOS)和社会(语用)交际障碍(SCD)。
3.权利要求1或2的方法，其中所述CNV是重复或缺失。
4.权利要求1或2的方法，其中所述自闭症是综合征的ASD。
5.权利要求1或2的方法，其中所述患者患有ASD和22q11.2缺失或重复综合征，胎儿丙戊酸盐综合征或反应停胎儿病。
6.权利要求1或2的方法，其中所述患者在选自如下的基因中具有至少两个CNV：ACAT1，ACAT2，ACCN1，ACCN2，ACP1，ACTB，ACTR2，ADA，ADCY1，ADD1，ADD2，ADORA1，ADRA1B，ADRA2A，ADRA2C，ADRB2，ADRBK1，ALDOA，ANXA2，APP，APTX，AQP1，ARHGAP24，ARL15，ARRB1，ARRB2，ATXN7L3，BDKRB1，BDKRB2，BTBD2，BTG2，C17orf44，C1orf116，C7orf25，CA8，CACNA1B，CACYBP，CALB2，CALM1，CALM2，CALM3，CAMK1，CAMK2B，CAMK4，CCNB1，CDC42，CENTG1，CHGB，CHP，CHRM2，CHRM3，CIC，CMPK，CNP，CNR1，CNTN4，COPB2，CRHR1，CTNNA2，CYCS，DCN，DHCR7，DISC1，DLST，DPP6，DRD2，DRD3，DSTN，DYNLL1，ECHS1，EGFR，EIF3S3，ERBB2，F2R，F2RL2，F2RL3，F3，FKBP3，FPR1，FSCN1，FURIN，FYN，GAPDH，GLP1R，GLP2R，GNA15，GNAI1，GNAI2，GNAI3，GNAO1，GNAQ，GNB2L1，GOT1，GP1BA，GPR26，GRB2，GRB7，GRIA1，GRIK1，GRIK3，GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，GRM8，GSN，HBXIP，HD，HNRPA3，HOMER1，HOMER3，HRPT2，HSP90AB1，HTR2A，IL8RB，IMPDH2，IQGAP2，ITGB1，ITGB7，ITPR1，KIAA0090，KIAA1683，LAMA4，LARP7，LRP2BP，LRRC59，LTA，LYAR，LYN，MAP4，MAPK1，MAPT，MARK4，MC4R，MGC11082，MRPL14，MRPS16，MTHFD1，MTNR1A，MTNR1B，MX1，MYC，MYO6，NANS，NARG1，NCK1，NEGR1，NFKBIA，NLN，NMI，NPY2R，NUDC，OPRD1，PAFAH1B3，PCBP1，PCBP3，PCDHA4，PCID1，PCMT1，PDCD5，PDE1B，PDE1C，PDE6G，PGM1，PHKB，PHKG2，PICK1，PIK3CA，PIK3R1，PLA2G7，PLCB1，PLCB3，PLCG2，PPIH，PPP2R1A，PRDX1，PRKCA，PRLHR，PRMT1，PRPSAP1，PSAT1，PSEN1，PSMA1，PSMC1，PSMD1，PSMD11，PSMD13，PSMD6，PSME1，PTHR2，PXN，PYGL，PYGM，QRICH2，RAB2，RALA，RANBP1，RAP2A，RCC1，RCC2，RGS12，RGS2，RHOA，RIF1，RPA2，RPLP2，RPN2，RPS14，RRM1，RUVBL2，RYR1，RYR2，S100A6，SACS，SARS，SCTR，SDC3，SELE，SERPINB9，SET，SETD4，SF3B14，SGTB，SHANK1，SHBG，SIAH1，SLC2A1，SLC6A3，SLC7A10，SNCA，SNRPB2，SOCS6，SOCS7，SORD，SRC，STAU1，STRAP，STX12，SYK，TBCA，TBXA2R，TCP1，TEAD3，TFAM，TGM2，TJP1，TK1，TLR10，TMEM4，TNIK，TPI1，TRAF2，TRMT112，TUBA1，TUBA1A，TUBA1B，TUBA2，TUBB，TUBG1，TXN，TXNDC4，TXNL2，TYMS，UBQLN4，UCHL1，USP24，VHL，VIPR1，YWHAQ，和ZAP70。
7.一种治疗受试者的自闭症的方法，包括：向受试者施用有效量的代谢型谷氨酸受体(mGluR)的非选择性激活剂，从而改善自闭症的至少一种症状。
8.一种治疗受试者的自闭症的方法，包括：向受试者施用有效量的代谢型谷氨酸受体(mGluR)的非选择性激活剂，从而改善自闭症的至少一种症状，所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变。
9.一种治疗受试者的自闭症的方法，包括：从基因筛检获得结果，所述基因筛检确定受试者是否在mGluR网络基因中具有基因突变，并且如果所述结果显示所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变，则通过施用有效量的mGluR的非选择性激活剂治疗所述受试者。
10.权利要求8的方法，其中所述基因突变是拷贝数变异(CNV)或单核苷酸变异(SNV)。
11.权利要求7至10任一项的方法，其中所述mGluR的非选择性激活剂是法索西坦。
12.权利要求11的方法，其中法索西坦是法索西坦一水合物(NS-105或NFC-1)。
13.权利要求11或12的方法，其中法索西坦以下述剂量施用：50mg、100mg、150mg、
200mg、250mg、300mg、350mg、或400mg，并且其中所述剂量每天施用一次、两次或三次。
14.权利要求11或12的方法，其中法索西坦以下述剂量施用：50-400mg、100-400mg、或
200-400mg，并且其中所述剂量每天施用一次、两次或三次。
15.权利要求11或12的方法，其中法索西坦以下述剂量施用：200-400mg，例如200mg、
300mg、或400mg，并且其中所述剂量每天施用两次。
16.权利要求7-15任一项的方法，其中所述受试者在至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个mGluR网络基因中具有CNV。
17.权利要求10-16任一项的方法，其中mGluR网络基因中的CNV如下确定：从所述受试者获得包含核酸的样本，并对所述样本进行筛检，所述筛检评估至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、或所有的Tier 1mGluR网络基因中的CNV。
18.权利要求10-17任一项的方法，其中mGluR网络基因中的CNV如下确定：从所述受试者获得包含核酸的样本，并对所述样本进行筛检，所述筛检评估至少50个、至少100个、至少
150个、至少175个、或所有的Tier2mGluR网络基因中的CNV。
19.权利要求10-18任一项的方法，其中mGluR网络基因中的CNV如下确定：从所述受试者获得核酸样本，并对所述样本进行筛检，所述筛检评估至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、或所有的Tier 3mGluR网络基因中的CNV。
20.权利要求19的方法，其中所述筛检不评估以下一个或多个中的CNV：GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，或GRM8。
21.权利要求1-20任一项的方法，其中所述受试者在以下一个或多个中不具有CNV：
GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，或GRM8。
22.权利要求1-21任一项的方法，其中所述受试者是儿童受试者。
23.权利要求22的方法，其中所述儿童受试者介于下述年龄之间：5岁至17岁，5岁至8岁，8岁至17岁，8岁至12岁，或12岁至17岁。
24.权利要求1-21任一项的方法，其中所述受试者是成人。
25.权利要求1-22任一项的方法，其中所述mGluR的非选择性激活剂与另一种药物治疗或非药物治疗组合施用。
26.权利要求7-25任一项的方法，其中所述患者经诊断患有自闭症谱系障碍，广泛性发育障碍，或一种或多种选自如下的病症：自闭性障碍(典型自闭症)，阿斯伯格综合征，儿童崩解症，雷特氏症，未另行说明的广泛性发展障碍(PDD-NOS)和社会(语用)交际障碍(SCD)。
27.权利要求26的方法，其中所述自闭症是综合征的ASD。
28.权利要求26或27的方法，其中所述患者患有ASD和22q11.2缺失或重复综合征，胎儿丙戊酸盐综合征或反应停胎儿病。
29.一种诊断受试者的自闭症的方法，包括：从受试者分离包含核酸的样本，分析所述样本的至少一个mGluR网络基因中是否存在基因突变，和如果所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变则诊断为患有自闭症。
30.一种诊断受试者的自闭症的方法，包括：从受试者分离包含核酸的样本，从所述样本中分离核酸，分析所述核酸的至少一个mGluR网络基因中是否存在基因突变，和如果所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变则诊断为患有自闭症。
31.一种鉴定受试者患有自闭症的方法，包括：从患者获得样本，任选地从所述样本中分离核酸，任选地扩增所述核酸，和分析所述样本中的核酸的至少一个mGluR网络基因中是否存在基因突变例如CNV，其中如果检测到所述受试者mGluR网络基因中具有至少一个基因突变例如CNV，则将所述受试者鉴定为患有自闭症。
32.一种诊断受试者的自闭症的方法，包括：分析关于一个或多个mGluR网络基因的基因信息，将所述受试者的信息与不患有自闭症的对照受试者进行比较，和如果所述基因信息显示所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变，则诊断为患有自闭症。
33.确认受试者患有自闭症的诊断的方法，包括：
从通过下述方法诊断为患有自闭症的受试者获得含有核酸的样本，所述方法包括：检测或分析mGluR网络基因中的基因突变；任选地扩增所述样本中的核酸；和确定受试者的mGluR网络基因中是否具有至少一个基因突变例如CNV；和
如果所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变，则确认自闭症的诊断。
34.权利要求29-33任一项的方法，其中所述分析mGluR网络基因中是否存在至少一个基因突变包括：微阵列，全基因组测序，外显子组测序，靶向测序，FISH，比较基因组杂交，基因组作图，或使用下一代测序、Sanger测序、PCR或TaqMan技术的其它方法。
35.权利要求29-34任一项的方法，其中所述受试者的至少两个mGluR网络基因中具有CNV。
36.权利要求29-35任一项的方法，其中所述方法包括如下检测mGluR网络基因中的CNV：将所述样本进行筛检，所述筛检评估至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个mGluR网络基因中的CNV。
37.权利要求29-36任一项的方法，其中mGluR网络基因中的CNV如下确定：将所述样本进行筛检，所述筛检评估至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、或所有的Tier 1 mGluR网络基因中的CNV。
38.权利要求29-37任一项的方法，其中mGluR网络基因中的CNV如下确定：将所述样本进行筛检，所述筛检评估至少50个、至少100个、至少150个、至少175个、或所有的Tier
2mGluR网络基因中的CNV。
39.权利要求29-38任一项的方法，其中mGluR网络基因中的CNV如下确定：将所述样本进行筛检，所述筛检评估至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、或所有的Tier 3mGluR网络基因中的CNV。
40.权利要求29-40任一项的方法，其中所述受试者是儿童受试者，例如介于下述年龄之间的受试者：5岁至17岁，5岁至8岁，8岁至17岁，8岁至12岁，或12岁至17岁。
41.权利要求29-40任一项的方法，其中所述受试者是成人受试者。
42.权利要求29-41任一项的方法，其中不评估所述受试者以下一个或多个中的基因突变或CNV：GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，和GRM8。
43.权利要求29-42任一项的方法，其中确定至少一个mGluR网络基因是否存在基因突变的方法包括：微阵列，全基因组测序，外显子组测序，靶向测序，FISH，比较基因组杂交，基因组作图，或使用下一代测序、Sanger测序、PCR或TaqMan技术的其它方法。
44.权利要求1-43任一项的方法，其中所述受试者患有自闭症以及ADHD。
45.权利要求1-43任一项的方法，其中所述受试者不患有以下中的一种或多种：ADHD，精神分裂症，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症或抑郁症。
46.权利要求29-45任一项的方法，其中所述患者患有自闭症谱系障碍，广泛性发育障碍，或一种或多种选自如下的病症：自闭性障碍(典型自闭症)，阿斯伯格综合征，儿童崩解症，雷特氏症，未另行说明的广泛性发展障碍(PDD-NOS)和社会(语用)交际障碍(SCD)。
47.权利要求46的方法，其中所述自闭症患有综合征的ASD。
48.权利要求46或48的方法，其中所述患者患有ASD和22q11.2缺失或重复综合征，胎儿丙戊酸盐综合征或反应停胎儿病。
诊断和治疗自闭症的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2015年6月15日提交的美国非临时专利申请号14/740,230，以及美国临时专利申请62/215,628，62/215,633，62/215,636和62/215,673的优先权，所有这些临时专利申请都是于2015年9月8日提交的。所有以上列出的申请的全部内容通过引用并入本申请中。
技术领域
[0003] 提供诊断和治疗自闭症谱系障碍的方法。
背景技术
[0004] 自闭症谱系障碍(ASD)是一系列复杂的神经发育障碍，其特征是轻度至重度的社会障碍，交流困难，限制性或重复性行为。ASD(先前称为广泛性发育障碍(PDD))是总括性术语，其包括用于单独诊断的如下各种病症：例如自闭性障碍(典型自闭症)，阿斯伯格综合征，儿童崩解症，雷特氏症，未另行说明的广泛性发展障碍(PDD-NOS)和社会(语用)交际障碍(SCD)(Vieux等人，“Autism Spectrum Disorder:DSM-5 Changes，Epidemiology&Outcomes,”The Carlat Report，Vol.11，Issue 6，June 2013)。
[0005] ASD出现在所有种族，民族和社会经济群体中(Durkin等人，“Socioeconomic inequality in the prevalence of autism spectrum disorder:evidence from a U.S.cross-sectional study,”PLOS One，5(7)，July 2010)。2013年，估计6-17岁儿童中的2％出现ASD，比2007年估计的1.16％大幅上升(参见例如，Blumberg等人，National Health Statistics Reports，No.65，March 20，2013)。虽然不知道有多少成人患有ASD，但英国研究报道，1.8％的成年男性和0.2％的成年女性患有ASD(Brugha等人，“Epidemiology of autism spectrum disorders in adults in the community in England,”
Arch.Gen.Psych.68:459-66，2011)。
Arch.Gen.Psych.68:459-66，2011)。
[0006] 随着ASD发病率的增加，社会成本随之增加。疾病预防控制中心估计，与一名未诊断为ASD的儿童相比，每年照顾一名诊断为ASD的儿童的花费要高出17,000至21,000美元。单独对于经诊断患有ASD的儿童的医疗费用可以每年提高4,100-6,200美元，对于经诊断患有ASD的儿童每年花费40,000-6,000美元的行为进行干预。据估计，2011年，诊断为ASD的儿童的社会总成本超过90亿美元。
[0008] 根据本说明书，包括治疗GRM/mGluR网络基因中具有至少一个CNV的患者的自闭症谱系障碍(ASD)的方法，如图15A-D中所示，包括施用治疗有效量的法索西坦(NS-105或NFC-1)，或脑代谢改善药的吡拉西坦家族成员。GRM/mGluR网络基因中的CNV是诊断ASD的敏感和特异性生物标志物。发明人鉴定特异性激活mGluR的药物候选物，恢复图15A-D所示的任何GRM/mGluR网络基因中具有至少一个CNV的ASD患者的正常神经生理学。
[0009] 在一些实施方式中，表16-18所述GRM/mGluR网络基因的至少一个中的CNV表明诊断为ASD。这些基因包括ACAT1，ACAT2，ACCN1，ACCN2，ACP1，ACTB，ACTR2，ADA，ADCY1，ADD1，ADD2，ADORA1，ADRA1B，ADRA2A，ADRA2C，ADRB2，ADRBK1，ALDOA，ANXA2，APP，APTX，AQP1，ARHGAP24，ARL15，ARRB1，ARRB2，ATXN7L3，BDKRB1，BDKRB2，BTBD2，BTG2，C17orf44，C1orf116，C7orf25，CA8，CACNA1B，CACYBP，CALB2，CALM1，CALM2，CALM3，CAMK1，CAMK2B，CAMK4，CCNB1，CDC42，CENTG1，CHGB，CHP，CHRM2，CHRM3，CIC，CMPK，CNP，CNR1，CNTN4，COPB2，CRHR1，CTNNA2，CYCS，DCN，DHCR7，DISC1，DLST，DPP6，DRD2，DRD3，DSTN，DYNLL1，ECHS1，EGFR，EIF3S3，ERBB2，F2R，F2RL2，F2RL3，F3，FKBP3，FPR1，FSCN1，FURIN，FYN，GAPDH，GLP1R，GLP2R，GNA15，GNAI1，GNAI2，GNAI3，GNAO1，GNAQ，GNB2L1，GOT1，GP1BA，GPR26，GRB2，GRB7，GRIA1，GRIK1，GRIK3，GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，GRM8，GSN，HBXIP，HD，HNRPA3，HOMER1，HOMER3，HRPT2，HSP90AB1，HTR2A，IL8RB，IMPDH2，IQGAP2，ITGB1，ITGB7，ITPR1，KIAA0090，KIAA1683，LAMA4，LARP7，LRP2BP，LRRC59，LTA，LYAR，LYN，MAP4，MAPK1，MAPT，MARK4，MC4R，MGC11082，MRPL14，MRPS16，MTHFD1，MTNR1A，MTNR1B，MX1，MYC，MYO6，NANS，NARG1，NCK1，NEGR1，NFKBIA，NLN，NMI，NPY2R，NUDC，OPRD1，PAFAH1B3，PCBP1，PCBP3，PCDHA4，PCID1，PCMT1，PDCD5，PDE1B，PDE1C，PDE6G，PGM1，PHKB，PHKG2，PICK1，PIK3CA，PIK3R1，PLA2G7，PLCB1，PLCB3，PLCG2，PPIH，PPP2R1A，PRDX1，PRKCA，PRLHR，PRMT1，PRPSAP1，PSAT1，PSEN1，PSMA1，PSMC1，PSMD1，PSMD11，PSMD13，PSMD6，PSME1，PTHR2，PXN，PYGL，PYGM，QRICH2，RAB2，RALA，RANBP1，RAP2A，RCC1，RCC2，RGS12，RGS2，RHOA，RIF1，RPA2，RPLP2，RPN2，RPS14，RRM1，RUVBL2，RYR1，RYR2，S100A6，SACS，SARS，SCTR，SDC3，SELE，SERPINB9，SET，SETD4，SF3B14，SGTB，SHANK1，SHBG，SIAH1，SLC2A1，SLC6A3，SLC7A10，SNCA，SNRPB2，SOCS6，SOCS7，SORD，SRC，STAU1，STRAP，STX12，SYK，TBCA，TBXA2R，TCP1，TEAD3，TFAM，TGM2，TJP1，TK1，TLR10，TMEM4，TNIK，TPI1，TRAF2，TRMT112，TUBA1，TUBA1A，TUBA1B，TUBA2，TUBB，TUBG1，TXN，TXNDC4，TXNL2，TYMS，UBQLN4，UCHL1，USP24，VHL，VIPR1，YWHAQ，和ZAP70。
[0010] 此外，在施用治疗有效量的脑代谢改善药的吡拉西坦家族成员后，将看到GRM/mGluR网络基因中至少有一个CNV的患者在ASD方面的改善，如F.Gualtieri等人，Curr.Phann.Des.，8:125-38(2002)中所述。在一种实施方式中，治疗剂是焦谷氨酰胺。
Kimura等人的美国专利号5,102,882中提供关于焦谷氨酰胺的制备和配制的细节，其可用于本发明的实践。在一种实施方式中，用于治疗确定具有如图15A-D所述表示的一个或多个CNV的患者中ASD的脑代谢改善药，是(+)-5-氧代-D-脯氨酸哌啶酰胺一水合物(法索西坦；
NS-105)。
Kimura等人的美国专利号5,102,882中提供关于焦谷氨酰胺的制备和配制的细节，其可用于本发明的实践。在一种实施方式中，用于治疗确定具有如图15A-D所述表示的一个或多个CNV的患者中ASD的脑代谢改善药，是(+)-5-氧代-D-脯氨酸哌啶酰胺一水合物(法索西坦；
NS-105)。
[0011] 在一种实施方式中，患者已经诊断为具有广泛性发育障碍，或一种或多种选自如下的病症：自闭性障碍(典型自闭症)，阿斯伯格综合征，儿童崩解症，雷特氏症，未另行说明的广泛性发展障碍(PDD-NOS)或社会(语用)交际障碍(SCD)。
[0012] CNV可以是重复或缺失。
[0013] ASD可以是综合征的或非综合征的。
[0014] 在一种实施方式中，ASD可以在具有22q11.2缺失或重复综合征，胎儿丙戊酸盐综合征或反应停胎儿病的患者中。
[0015] 在一种实施方式中，所述患者具有选自如下基因中的至少两个CNV：ACAT1，ACAT2，ACCN1，ACCN2，ACP1，ACTB，ACTR2，ADA，ADCY1，ADD1，ADD2，ADORA1，ADRA1B，ADRA2A，ADRA2C，ADRB2，ADRBK1，ALDOA，ANXA2，APP，APTX，AQP1，ARHGAP24，ARL15，ARRB1，ARRB2，ATXN7L3，BDKRB1，BDKRB2，BTBD2，BTG2，C17orf44，C1orf116，C7orf25，CA8，CACNA1B，CACYBP，CALB2，CALM1，CALM2，CALM3，CAMK1，CAMK2B，CAMK4，CCNB1，CDC42，CENTG1，CHGB，CHP，CHRM2，CHRM3，CIC，CMPK，CNP，CNR1，CNTN4，COPB2，CRHR1，CTNNA2，CYCS，DCN，DHCR7，DISC1，DLST，DPP6，DRD2，DRD3，DSTN，DYNLL1，ECHS1，EGFR，EIF3S3，ERBB2，F2R，F2RL2，F2RL3，F3，FKBP3，FPR1，FSCN1，FURIN，FYN，GAPDH，GLP1R，GLP2R，GNA15，GNAI1，GNAI2，GNAI3，GNAO1，GNAQ，GNB2L1，GOT1，GP1BA，GPR26，GRB2，GRB7，GRIA1，GRIK1，GRIK3，GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，GRM8，GSN，HBXIP，HD，HNRPA3，HOMER1，HOMER3，HRPT2，HSP90AB1，HTR2A，IL8RB，IMPDH2，IQGAP2，ITGB1，ITGB7，ITPR1，KIAA0090，KIAA1683，LAMA4，LARP7，LRP2BP，LRRC59，LTA，LYAR，LYN，MAP4，MAPK1，MAPT，MARK4，MC4R，MGC11082，MRPL14，MRPS16，MTHFD1，MTNR1A，MTNR1B，MX1，MYC，MYO6，NANS，NARG1，NCK1，NEGR1，NFKBIA，NLN，NMI，NPY2R，NUDC，OPRD1，PAFAH1B3，PCBP1，PCBP3，PCDHA4，PCID1，PCMT1，PDCD5，PDE1B，PDE1C，PDE6G，PGM1，PHKB，PHKG2，PICK1，PIK3CA，PIK3R1，PLA2G7，PLCB1，PLCB3，PLCG2，PPIH，PPP2R1A，PRDX1，PRKCA，PRLHR，PRMT1，PRPSAP1，PSAT1，PSEN1，PSMA1，PSMC1，PSMD1，PSMD11，PSMD13，PSMD6，PSME1，PTHR2，PXN，PYGL，PYGM，QRICH2，RAB2，RALA，RANBP1，RAP2A，RCC1，RCC2，RGS12，RGS2，RHOA，RIF1，RPA2，RPLP2，RPN2，RPS14，RRM1，RUVBL2，RYR1，RYR2，S100A6，SACS，SARS，SCTR，SDC3，SELE，SERPINB9，SET，SETD4，SF3B14，SGTB，SHANK1，SHBG，SIAH1，SLC2A1，SLC6A3，SLC7A10，SNCA，SNRPB2，SOCS6，SOCS7，SORD，SRC，STAU1，STRAP，STX12，SYK，TBCA，TBXA2R，TCP1，TEAD3，TFAM，TGM2，TJP1，TK1，TLR10，TMEM4，TNIK，TPI1，TRAF2，TRMT112，TUBA1，TUBA1A，TUBA1B，TUBA2，TUBB，TUBG1，TXN，TXNDC4，TXNL2，TYMS，UBQLN4，UCHL1，USP24，VHL，VIPR1，YWHAQ，和ZAP70。
[0016] 在一种实施方式中，在取自人患者的任何类型生物样本中检测CNV，所述生物样本包括但不限于体液(包括血液，尿液，血清，洗胃)，任何类型的细胞(例如脑细胞，白血细胞，单核细胞)或身体组织。
[0017] 确定患者是否具有GRM/mGluR网络基因CNV的方法包括例如，考虑到LOG-R比率(强度数据)和估计等位基因状态的BAF(B等位基因频率)两者，分析SNP-阵列上的生物样本。SNP阵列平台可以商购自例如Illumina，Affymetrix和Agilent。
[0018] 确定患者是否具有GRM/mGluR网络基因CNV的其它方法包括例如，CGH(比较基因组杂交)，其利用强度数据评价CNV；全外显子组或全基因组测序(或靶向测序)；利用特定的FISH探针；定量PCR；液滴PCR；和taqman探针。或者，使用专有方法确定CNV是否存在的某些公司可以提供样品，以根据本发明的方法测试GRV/mGluR网络基因中存在CNV。
[0019] 一些实施方式包括治疗受试者的自闭症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的代谢型谷氨酸受体(mGluR)的非选择性激活剂，从而改善自闭症的至少一种症状。一些实施方式包括治疗受试者的自闭症，其包括向受试者施用有效量的代谢型谷氨酸受体(mGluR)的非选择性激活剂，所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变(例如如图中所示16-18)，从而改善自闭症的至少一种症状。一些实施方式包括治疗受试者的自闭症的方法，其包括从基因筛检获得结果，所述基因筛检确定受试者的mGluR网络基因中是否具有基因突变，并且如果所述结果显示所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变，通过施用有效量的mGluR的非选择性激活剂治疗受试者。在一些这样的实施方式中，所述基因突变是拷贝数变异(CNV)或单核苷酸变异(SNV)。在一些这样的实施方式中，mGluR的非选择性激活剂是法索西坦例如法索西坦一水合物(NS-105或NFC-1)。
[0020] 在包括施用法索西坦的方法中，法索西坦可以如下剂量施用：50mg，100mg，150mg，200mg，250mg，300mg，350mg，或400mg，其中所述剂量是每天施用一次，两次，或三次。例如，法索西坦可以如下剂量施用：50-400mg，100-400mg，或200-400mg，其中所述剂量是每天施用一次，两次，或三次。例如，法索西坦以如下剂量施用：200-400mg，例如200mg，300mg，或
400mg，其中所述剂量是每天施用两次。
400mg，其中所述剂量是每天施用两次。
[0021] 在一些上述实施方式中，所述受试者在至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个mGluR网络基因中具有CNV。例如，受试者的mGluR网络基因中可以具有CNV，其如下得到：从所述受试者获得包含核酸的样本，并对所述样本进行筛检，所述筛检评估至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、或所有的Tier 1mGluR网络基因中具有CNV。在其它情况下，受试者的mGluR网络基因中可以具有CNV，其如下确定：从所述受试者获得包含核酸的样本，并对所述样本进行筛检，所述筛检评估至少50个、至少100个、至少150个、至少175个、或所有的Tier 2mGluR网络基因中具有CNV。再在其它情况下，受试者的mGluR网络基因中可以具有CNV，其如下确定：从所述受试者获得核酸样本，并对所述样本进行筛检，所述筛检评估至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、或所有的Tier 3mGluR网络基因中具有CNV。在一些实施方式中，所述筛检不评估以下一个或多个中的CNV：GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，或GRM8。在一些实施方式中，所述受试者在以下一个或多个中不具有CNV：GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，或GRM8。
[0022] 在一些上述实施方式中，所述受试者是儿童受试者，例如介于以下年龄之间：5岁至17岁，5岁至8岁，8岁至17岁，8岁至12岁，或12岁至17岁。在其它实施方式种，受试者是成人。
[0023] 在上述一些实施方式中，mGluR的非选择性激活剂另一种药物治疗或非药物治疗组合施用。
[0024] 在一些上述实施方式中，受试者已经诊断有自闭症谱系障碍，广泛性发育障碍，或一种或多种选自如下的病症：自闭性障碍(典型自闭症)，阿斯伯格综合征，儿童崩解症，雷特氏症，未另行说明的广泛性发展障碍(PDD-NOS)和社会(语用)交际障碍(SCD)。在一些情况下，自闭症是综合征的ASD。在一些情况下，所述患者具有ASD和22q11.2缺失或重复综合征，胎儿丙戊酸盐综合征或反应停胎儿病。在一些实施方式中，患者没有如下中的任一种：ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在其它情况下，自闭症患者也具有如下中的一种或多种：ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。
[0025] 本申请也包括诊断受试者的自闭症的方法，其包括：从受试者分离包含核酸的样本，分析所述样本的至少一个mGluR网络基因中是否存在基因突变，和如果所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变，则诊断为患有自闭症。进一步包括诊断受试者的自闭症的方法，其包括：从受试者分离包含核酸的样本，从所述样本中分离核酸，分析所述核酸的至少一个mGluR网络基因中是否存在基因突变，和如果所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变，则诊断为患有自闭症。另外的实施方式包括鉴定受试者患有自闭症的方法，其包括：从患者获得样本，任选地从所述样本中分离核酸，任选地扩增所述核酸，和分析所述样本中的核酸的至少一个mGluR网络基因中是否存在基因突变例如CNV，其中如果检测到所述受试者mGluR网络基因中的至少一个基因突变例如CNV，则所述受试者鉴定为患有自闭症。进一步包括诊断受试者的自闭症的方法，其包括：分析关于一个或多个mGluR网络基因的基因信息，将所述受试者的信息与没有自闭症的对照受试者进行比较，和如果所述基因信息显示所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变，则诊断为患有自闭症。也包括确认受试者患有自闭症的诊断的方法，其包括：从通过下述方法诊断患有自闭症受试者获得含有核酸的样本；和如果所述受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变，则确认自闭症的诊断；其中所述方法包括检测或分析mGluR网络基因中的基因突变；任选地扩增所述样本中的核酸；和确定受试者的mGluR网络基因中是否具有至少一个基因突变例如CNV。在那些方法中的任一种中，所述分析mGluR网络基因中是否存在至少一个基因突变可包括微阵列，全基因组测序，外显子组测序，靶向测序，FISH，比较基因组杂交，基因组作图，或使用下一代测序、Sanger测序、PCR或TaqMan技术的其它方法。
[0026] 在一些实施方式中，所述受试者的至少两个mGluR网络基因中具有CNV。在一些实施方式中，所述方法包括如下检测mGluR网络基因中的CNV：将所述样本进行筛检，所述筛检评估至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个mGluR网络基因中的CNV。在一些实施方式中，MGluR网络基因中的CNV如下确定：将所述样本进行筛检，所述筛检评估至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、或所有的Tier 1mGluR网络基因中的CNV。在一些实施方式中，MGluR网络基因中的CNV如下确定：将所述样本进行筛检，所述筛检评估至少50个、至少100个、至少150个、至少175个、或所有的Tier 2mGluR网络基因中的CNV。在一些实施方式中，MGluR网络基因中的CNV如下确定：将所述样本进行筛检，所述筛检评估至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、或所有的Tier3mGluR网络基因中的CNV。
[0027] 在一些上述实施方式中，所述受试者是儿童受试者，例如受试者介于如下年龄之间：5岁至17岁，5岁至8岁，8岁至17岁，8岁至12岁，或12岁至17岁。在其它实施方式中，所述受试者是成人受试者。
[0028] 在一些实施方式中，所述受试者不评估如下的一种或多种中的基因突变或CNV：GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7，和GRM8。
[0029] 在一些实施方式中，确定至少一个mGluR网络基因是否存在基因突变的方法包括微阵列，全基因组测序，外显子组测序，靶向测序，FISH，比较基因组杂交，基因组作图，或使用下一代测序、Sanger测序、PCR或TaqMan技术的其它方法。
[0030] 在一些上述实施方式中，受试者已经诊断有自闭症谱系障碍，广泛性发育障碍，或一种或多种选自如下的病症：自闭性障碍(典型自闭症)，阿斯伯格综合征，儿童崩解症，雷特氏症，未另行说明的广泛性发展障碍(PDD-NOS)和社会(语用)交际障碍(SCD)。在一些情况下，自闭症是综合征的ASD。在一些情况下，所述患者具有ASD和22q11.2缺失或重复综合征，胎儿丙戊酸盐综合征或反应停胎儿病。在一些实施方式中，患者没有如下中的任一种：ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在其它情况下，自闭症患者也具有如下中的一种或多种：ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在一些情况下，患者患有自闭症和ADHD两者。
[0032] 应该理解的是，前面的一般性描述和下面的详细描述仅仅是示例性和说明性的，而不是对权利要求的限制。
附图说明
[0034] 图1提供临床研究的设计。在这两个阶段的设计中，在发现队列(第1阶段)中使用2076例病例对4754例对照，并且1159例病例对2546例对照用于复制队列(第2阶段)。所有使用过的样本都通过最低质量控制指标，但是PennCNV的默认质量要求用来区分发现队列(最佳质量)和复制队列(较差质量)。
[0035] 图2是示出某些类别基因途径的图，所述基因途径由本申请公开的ASD相关CNVR破坏。具有被复制的CNVR破坏的外显子的所有基因提交给Ingenuity以确定途径富集的重要性。
[0037] 图4示出疾病缺陷特异性途径的靶向治疗的测试和治疗模型。通用测试和治疗模型以黑色显示，其中使用分子诊断来基因定义可能受益于靶向干预的有缺陷途径的群体。显示曲妥单抗作为靶向干预用于HER2特异性乳腺癌的实例，以及正在开发用于靶向由于有缺陷的GABAR-A途径导致的ASD的行为程序和新疗法的外推。
[0038] 图5示出GWAS预测源自欧洲人或非洲人人群中ASD的某些鉴定的基因标记CNVR。曼哈顿地块显示基因组上的每个CNVR关联性的-log 10转换的P值。显示相邻的染色体。非洲人(P<＝0.001)中复制的欧洲人(P 0.0001)中发现的区域突出显示有染色带标记的黑色箭头。欧洲人中的4,634病例对4,726对照的GWAS显示于顶部上，非洲人中的312病例对4,173对照的GWAS显示于下面。
[0039] 图6A-D示出整个mGluR基因网络的某些CNVR的代表性富集。网络节点标有它们的基因名称，红色和绿色分别表示缺失和重复，而灰色节点缺少CNV数据。深色和浅色分别代表病例和对照的富集。定义网络的基因显示为菱形，而所有其它基因显示为圆形。蓝线表示相互作用的证据。
[0040] 图7示出整个CALM1网络中最佳CNVR富集的代表性图。显示由CALM1定义的一级的直接相互作用网络。
[0041] 图8示出代表性研究设计的图。本研究结果显示，与患有ASD而无mGluR网络基因(mGluR-ASD)异常的儿童相比，患有ASD和具有mGluR网络(mGluR+ASD)基因突变的儿童更可能患有综合征的ASD。P<0.0001。
[0042] 图9示出mGluR网络中的重要CNVR。该表显示对于源自欧洲人人群的GFIN数据的GRM基因家族中的189个基因中10个最显著的CNVR，以及GRM mGluR受体本身包含的最显著的CNVR。
[0043] 图10示出源自欧洲人人群中MXD网络基因的显著CNVR。在大的CNV跨越多个基因的情况下，涉及MXD基因家族相互作用网络的组成基因是粗体的。
[0044] 图11示出源自欧洲人人群中CALM1网络基因的显著CNVR。
[0045] 图12示出源自欧洲人人群(P≤0.0001，由Fisher精确检验得到)和源自非洲人人群(P≤0.001)两者中显著的CNVR区分的病例与对照。CNVR＝拷贝数可变区域；OR＝比值比。对于每个CNVR，表都列出类型(缺失或重复)，最接近的受影响基因，染色体带，缺陷的大致尺寸(Kb)，贡献的SNPs数量，受影响的病例和对照的数量，以及Fisher精确检验的所有人群的P值和比值比(OR)，以及源自欧洲人和源自非洲人人群的子集。带星号(*)的*基因隐匿直接破坏其外显子的CNVR，而不带星号的基因位于基因间CNVR周围的基因组区域。
[0046] 图13A-B示出显著的基因家族相互作用网络(GFIN)，其通过网络置换检验(Pperm≤0.05)得到，至少5％病例中富集CNV缺陷。该表列出检验的基因家族的名称和大小，富集在二级基因相互作用网络中网络基因的数量和频率，隐匿网络缺陷的病例的数量和频率，隐匿网络缺陷的对照的数量和频率，Fisher精确检验的关联显著性，病例中CNV缺陷的富集，以及由1000次随机网络置换富集的显著性。
[0047] 图14示出由置换检验排名的显著单个基因相互作用网络。图14列出检验的名称和基因家族成员，富集的网络基因的数量和频率，隐匿缺陷的病例的数量和频率，隐匿缺陷的对照的数量和频率，和Fisher精确检验的关联显著性，效应大小的比值比，和控制所检验基因数量的同时通过网络随机置换进行关联的显著性。其它排名靠前的一级基因相互作用网络中是核受体辅阻遏子1(NCOR1；Pfisher≤1.11E-06，富集＝13.37，Pperm≤0.004)和BCL2关联永生基因1(BAG1；Pfisher≤2.18E-04，富集＝15.40，Pperm≤0.014)网络。NCOR1是转录辅调节蛋白，其似乎通过将组蛋白去乙酰化酶招募到DNA启动子区域来协助核受体下调DNA表达；它是神经干细胞的主要调节子。癌基因BCL2是阻断细胞凋亡途径的膜蛋白，BAG1形成BCL2关联永生基因和代表生长因子受体与抗凋亡机制之间的联系。BAG1基因已经涉及年龄相关的神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏病。
[0048] 图15A-D示出实施例1-4中描述的原始数据。A列列出ASD患者富集的GRM/mGluR网络基因。B列表示CNV是否是重复或缺失以及基因起始和终止位点。列J中所述的比值比描述对于对照组中没有发现CNV的任何基因为“无”。在K列富集中，术语“病例”表示与对照相比ASD患者相关基因CNV中的富集。图15A-D所列基因的任一个基因中发现至少一个CNV，A列表示诊断ASD和表明用NS-105治疗。
[0049] 图16A-D示出包括在Tier 1基因集中的mGluR网络基因。这些基因具有基于Cytoscape人类相互作用组的与mGluR基因(GRM1-8)的2级蛋白质-蛋白质相互作用，Cytoscape人类相互作用组是将生物分子相互作用网络与高通量数据集成的软件(如Shannon P(2003)Genome Research 13:2498-2504中所述)。Tier 1基因集包括76个基因。人类基因组版本18(hg18)和人类基因组版本19(hg19)两者中列出Tier 1中每个基因的确切位置。此外，对于hg19列出确定基因位置加上500千碱基(即，范围为目的基因前的500千碱基到目的基因后的500千碱基)。也列出起始单核苷酸多态性(StartSNP)(即位于目的基因前的500千碱基的SNP)和EndSNP(即位于目的基因后的500千碱基的SNP)。mGluRs基因本身称为“GRM”。扩增区域(即500千克上下游)经常隐匿调控元件，并且如果受CNV影响，则可以对基因表达和功能具有与基因序列本身中存在的CNV相同的影响。
[0050] 图17A-I示出包括Tier 2基因集中的mGluR网络基因。这些基因具有与基于Cytoscape人类相互作用组的mGluR基因(GRM1-8)的二级的蛋白质-蛋白质相互作用，但排除来自Tier 1的基因。Tier 2基因集包括197个基因。Tier 2中每个基因的确切位置列于人类基因组版本18(hg18)和人类基因组版本19(hg19)中。另外，对于hg19列出确切基因位置加上500千碱基(即，范围为目的基因前的500千碱基到目的基因后的500千碱基)。也列出hg19中的起始单核苷酸多态性(StartSNP)(即，位于目的基因前的500千碱基的SNP)和EndSNP(即，位于目的基因后的500千碱基的SNP)。
[0051] 图18A-Y示出Tier 3基因集内的基因。包括具有互补基因的基因，所述互补基因用与基于Cytoscape人类相互作用组的mGluR基因的2度蛋白质-蛋白质相互作用查询。从Tier 3中排除包含在Tiers 1和2内的基因。Tier3基因集包括599个基因。Tier 3中每个基因的确切位置列于人类基因组版本18(hg18)和人类基因组版本19(hg19)中。另外，对于hg19列出确切基因位置加上500千碱基(即，范围为目的基因前的500千碱基到目的基因后的500千碱基)。也列出hg19中的StartSNP(即，位于目的基因前的500千碱基的SNP)和EndSNP(即，位于目的基因后的500千碱基的SNP)。
具体实施方式
[0052] 定义
[0053] 本发明中，除非上下文另外明确指出，否则“一个”或“一种”意指“至少一个或至少一种”或“一个或多个或一种或多种”等。除非另有说明，否则术语“或”意指“和/或”。然而，在多项从属权利要求的情况下，术语“或”的使用仅以择一方式引用多于一个的前述权利要求替代方案。
[0054] “自闭症”和“自闭症谱系障碍”(ASD)在本申请中可互换使用。如前所述，自闭症或ASD包括一系列复杂神经发育障碍，其特征在于如下症状：例如轻微至严重的社交障碍，交流困难以及限制性或重复性行为。ASD，前面称为广泛性发育障碍(PDD)，是总括性术语，包括各种单独诊断的病症，例如自闭性障碍(典型自闭症)，阿斯伯格综合征，儿童崩解症，雷特氏症，未另行说明的广泛性发展障碍(PDD-NOS)和社会(语用)交际障碍(SCD)。
[0055] “mGluR”或代谢型谷氨酸受体指称为mGluR1，mGluR2，mGluR3，mGluR4，mGluR5，mGluR6，mGluR7和mGluR8的神经组织中表达的八种谷氨酸受体之一。它们的基因缩写为GRM1至GRM8。mGluR蛋白是G蛋白偶联受体。它们通常分为三个子组，包括mGluR1和mGluR5的组I受体归类为缓慢兴奋性受体。组II包括mGluR2和mGluR3。组III包括mGluR4，mGluR6，mGluR7和mGluR8。组II和III归类为缓慢抑制性受体。mGluRs与离子型GluRs或iGluRs不同，它们是离子通道相关的谷氨酸受体，其归类为快速兴奋性受体。
[0056] 为了本发明的目的，“mGluR网络基因”不仅包含mGluR基因GRM1，GRM2，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7和GRM8，而且还包括本申请图16-18中所列其它基因的每一个以及调节图16-18中所列基因的DNA区域。另外，“mGluR网络蛋白”是由mGluR网络基因编码的蛋白。
[0057] mGluR网络基因分为三个子集：Tier 1，Tier2，和Tier 3(参见图16-18)。图16A-D所示的Tier 1mGluR网络基因包含76个基因，包括一些GRM基因本身以及许多其它基因。图17A-I所示的Tier2mGluR网络基因包含197个基因，并且排除Tier 1基因。
[0058] Tiers 1和2一起包括在“主要mGluR网络”中。mGluR基因的“主要网络”也包括基因4-Sep，LOC642393和LOC653098，总共276个基因。目前在评估4-Sep，LOC642393和LOC653098基因方面存在技术困难。因此，它们不包括在Tiers 1和2的基因中，但它们包括在本发明基因的主要网络中。Tiers 1和Tiers 2基因的不同之处在于，以前对患有精神障碍受试者的基因分型研究中已经记录Tiers 1基因的改变。
[0059] 图18A-Y所示的Tier 3mGluR网络基因包含599个基因，所述599个基因在基于由Cytoscape Software提供的合并的人类相互作用组的mGluR网络的远端部分中(Shannon P等人(2003)Genome Research 13:2498-2504)，并且排除Tier 1和Tier 2基因。Tier 3基因因此是“远端mGluR网络”的一部分。除Tier 3基因之外，基因LOC285147，LOC147004，和LOC93444也包括在“远端mGluR网络”中，但由于在评估这些基因的基因突变方面存在技术困难，因此在本研究中没有对其进行评估并且不包括在Tier 3中。
[0060] 本申请所用的“基因突变”意指基因的DNA或调节基因的DNA中的任何改变，其导致与由未改变的DNA产生的基因产物相比功能性变化的基因产物。功能性变化可以是例如不同的表达水平(上调或下调)，或者是一种或多种生物活性的损失或变化。基因突变包括但不限于拷贝数变异(CNV)，单核苷酸变体(SNV)，本申请中也称为单核苷酸多态性(SNP)，移码突变或任何其它碱基对置换，插入和缺失或重复。
[0061] “拷贝数变异(CNV)”是指个体基因型中特定基因的拷贝数。CNV代表人类表型多样性的主要基因成分。已知基因疾病易感性不仅与单核苷酸多态性(SNP)有关，而且与结构和其它基因突变有关，包括CNV。CNV代表涉及-1千碱基(kb)或更大的DNA片段的拷贝数变化(Feuk等人2006a)。本申请描述的CNV不包括由插入/缺失转座元件(例如，约6-kb KpnI重复)引起的那些变异体，以使未来的CNV分析的复杂性最小化。因此，术语CNV包含前面引入的术语，例如大规模拷贝数变体(LCVs；Iafrate等人2004)，拷贝数多态性(CNPs；Sebat等人2004)，和中等大小的变体(ISVs；Tuzun等人2005)，但不是逆转座子插入。
[0062] “CNV缺失”或“缺失CNV”或类似术语是指其中基因，调节基因的DNA片段或基因片段缺失的CNV。“CNV复制”或“复制CNV”或类似术语是指如下CNV，其中与正常参考基因组中发现的单拷贝相比，基因，调节基因的DNA片段或基因片段存在于至少两个和可能多于两个拷贝中。
[0063] “单核苷酸多态性(SNP)”是指其中DNA中的单个碱基不同于该位置处的常见碱基的变化。这些单个碱基变化称为SNP或"snips"。数百万的SNP已编入人类基因组。一些SNP(例如导致镰状细胞的SNP)导致疾病。其它SNP是基因组的正常变异。
[0064] “样本”是指来自受试者的样本，所述样本可以测试例如一种或多种mGluR网络蛋白中存在CNV，如本文所述。样本可以包含细胞，并且其可以包含体液，例如血液，血清，血浆，脑脊髓液，尿，唾液，眼泪，胸膜液等。
[0065] 术语“受试者”和“患者”可互换地用于指代人。术语“儿童受试者”或“儿童患者”可互换使用以指代年龄小于18岁的人。“成人患者”是指18岁或以上的人。
[0066] 本申请所用的“靶核酸”是指存在于复合核酸混合物中的核酸的前述限定的区域，其中限定的野生型区域含有至少一个已知的核苷酸变异，其可以或不可以与自闭症关联。核酸分子可以通过cDNA克隆或消减杂交从天然来源分离或人工合成。核酸分子可以通过三酯合成方法或使用自动DNA合成仪人工合成。
[0067] 关于用于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。该术语当应用于DNA时，是指与其衍生的生物体的天然存在的基因组中紧邻的序列(在5'和3'方向)分离的DNA分子。例如，“分离的核酸”可以包含如下DNA分子，所述DNA分子插入载体例如质粒或病毒载体中，或整合到原核生物或真核生物的基因组DNA中。“分离的核酸分子”也可以包含cDNA分子。插入到载体中的分离的核酸分子在本申请中有时也称为重组核酸分子。
[0068] 关于RNA分子，术语“分离的核酸”主要是指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语可以指如下RNA分子，所述RNA分子已经与其在天然状态时(即，在细胞或组织中)相关联的RNA分子充分分离，使得其以“基本纯”的形式存在。
[0069] 关于核酸的术语“富集的”用于指与在正常细胞中或在从中获取序列的细胞中相比，特定的DNA或RNA序列占存在于目的细胞或溶液中总DNA或RNA的显著较高分数(2-5倍)。这可能由一个人通过优先减少其它DNA或RNA的存在量，或优先增加特定DNA或RNA序列的量，或通过两者的组合而引起。然而，应该注意的是，“富集的”并不意味着不存在其它DNA或RNA序列，只是目的序列的相对量显著增加。
[0070] 出于某些目的，核苷酸序列为纯化形式也是有利的。关于核酸的术语“纯化”不要求绝对纯度(例如均质制剂)；相反，它表示该序列比天然环境中的纯度相对较高(与天然水平相比，该水平应该至少高出2-5倍，例如以mg/ml计)。从cDNA文库分离的单个克隆可以纯化至电泳均一性。从这些克隆获得的要求保护的DNA分子可以直接从总DNA或从总RNA中获得。cDNA克隆不是天然存在的，而是优选通过操作部分纯化的天然存在的物质(信使RNA)获得的。从mRNA构建cDNA文库涉及合成物质(cDNA)的产生，通过克隆选择携带cDNA文库的细胞，可以从合成文库中分离出纯的单个cDNA克隆。因此，包括从mRNA构建cDNA文库和分离不同cDNA克隆的过程产生天然信息的大约10-6倍的纯化。因此，明确考虑纯化至少一个数量级，优选两个或三个数量级，并且更优选四个或五个数量级。
[0071] 术语“基本纯的”是指包含至少50-60wt％的目的化合物(例如核酸，寡核苷酸等)的制剂。更优选地，制剂包含至少75wt％，并且最优选90-99wt％的目的化合物。通过适合于目的化合物的方法测量纯度。
[0072] 术语“互补的”描述可以彼此形成多种有利的相互作用的两个核苷酸。例如，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，因为它们可以形成两个氢键。类似地，鸟嘌呤和胞嘧啶互补，因为它们可以形成三个氢键。因此，如果核酸序列含有以下碱基序列胸腺嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤和胞嘧啶，则“互补”的该核酸分子将是包含腺嘌呤代替胸腺嘧啶，胸腺嘧啶代替腺嘌呤，胞嘧啶代替鸟嘌呤，鸟嘌呤代替胞嘧啶的分子。因为补体可以含有与亲代核酸分子形成最佳相互作用的核酸序列，所以这种补体可以高亲和力与其亲代分子结合。
[0073] 关于单链核酸，特别是寡核苷酸，术语“特异性杂交”是指具有足够互补序列的两个单链核苷酸分子之间的缔合，以允许在本领域通常使用的预定病症下的杂交(有时称为“基本互补“)。具体而言，该术语是指寡核苷酸与本发明的单链DNA或RNA分子内含有的基本互补序列的杂交，以基本排除寡核苷酸与非互补序列的单链核酸的杂交。例如，特异性杂交可以指与任何自闭症特异性标记基因或核酸杂交但不与其它核苷酸杂交的序列。此外，“特异性杂交”的多核苷酸也可以仅与神经特异性标志物如本申请包含表中所示的自闭症特异性标志物杂交。能够使不同互补性的单链核酸分子特异性杂交的适当病症在本领域中是公知的。
[0074] 例如，用于计算实现特定序列同源性的核酸分子之间的杂交所需严格病症的一种常用公式为如下所示(Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)：
[0075] Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/#bp双链体[0076] 作为上式的说明例子，使用[Na+]＝[0.368]和50％甲酰胺，其中GC含量为42％，平均探针大小为200个碱基，Tm为57℃。同源性每下降1％，DNA双链体的Tm降低1-1.5℃。因此，使用42℃的杂交温度会观察到具有大于约75％序列同一性的靶。
[0077] 杂交和洗涤的严格性主要取决于溶液的盐浓度和温度。通常，为了使与其目标的探针的退火速率最大化，杂交通常在盐和比计算的杂交Tm低20-25℃的温度条件下进行。
[0078] 由于针对目标的探针的同一性程度，洗涤条件应该尽可能严格。通常，洗涤条件选择为比杂交Tm低12-20℃。关于本发明的核酸，中度严格杂交定义为在42℃在6xSSC，5xDenhardt's溶液，0.5％SDS和100微克/ml变性鲑精DNA中杂交，并且在55℃在2xSSC和
0.5％SDS中洗涤15分钟。高度严格杂交定义为在42℃在6xSSC，5x Denhardt's溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中杂交，并且在65℃在1xSSC和0.5％SDS中洗涤15分钟。非常高严格杂交定义为在42℃在6xSSC，5x Denhardt's溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中杂交，并且在65℃在0.1xSSC和0.5％SDS中洗涤15分钟。
0.5％SDS中洗涤15分钟。高度严格杂交定义为在42℃在6xSSC，5x Denhardt's溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中杂交，并且在65℃在1xSSC和0.5％SDS中洗涤15分钟。非常高严格杂交定义为在42℃在6xSSC，5x Denhardt's溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中杂交，并且在65℃在0.1xSSC和0.5％SDS中洗涤15分钟。
[0079] 本申请所用的术语“寡核苷酸”定义为由两个或更多个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的核酸分子，优选由多于三个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的核酸分子。寡核苷酸的确切大小取决于各种因素以及寡核苷酸的具体应用和用途。包括探针和引物的寡核苷酸可以是从3个核苷酸到全长核酸分子的任何长度，并且明确地包括从3个多核苷酸到全长多核苷酸的每个可能数量的连续核酸。优选地，寡核苷酸的长度是至少约10个核苷酸，更优选其长度是至少15个核苷酸，更优选其长度是至少约20个核苷酸。
[0080] 本申请使用的术语“探针”是指寡核苷酸，多核苷酸或核酸，或者RNA或者DNA，无论天然存在的纯化限制性酶切还是合成制备，其都能够使具有与探针互补序列的核酸退火或与具有与探针互补序列的核酸进行特定杂交。探针可以是单链或双链。探针的确切长度将取决于许多因素，包括温度，探针来源和使用的方法。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸探针通常含有15-25个或更多个核苷酸，但其可含有较少的核苷酸。本申请中的探针选择为与不同链的特定靶核酸序列互补。这意味着探针必须充分互补，以便能够在一组预定条件下“与其各自的靶链”进行“特异性杂交”或退火。因此，探针序列不需要反映靶标的确切互补序列。例如，可以将非互补核苷酸片段连接到探针的5'或3'末端，其中探针序列的其余部分与靶链互补。或者，可以将非互补碱基或较长序列散布到探针中，条件是探针序列与靶核酸的序列具有足够的互补性以与其特异性退火。
[0081] 本申请所用的术语“引物”是指寡核苷酸，RNA或DNA，单链或双链，源自生物系统，通过限制性酶切生成或合成制备，其当放置在适当的环境中时，能够在功能上充当模板依赖性核酸合成的起始物。当呈现合适的核酸模板，合适的核酸核苷三磷酸前体，聚合酶，合适的辅因子和条件例如合适的温度和pH时，引物可以在其3'末端通过添加核苷酸通过聚合酶的作用或类似活性以产生引物延伸产物。引物的长度可以变化，这取决于应用的特定条件和需求。例如，诊断应用中，寡核苷酸引物的长度通常为15-25个或更多个核苷酸。引物必须与期望的模板具有足够的互补性以引发所需延伸产物的合成，即，能够以足以提供适当并置的引物的3'羟基部分的方式与期望的模板链退火，以用于通过聚合酶或类似酶开始合成。不要求引物序列代表所需模板的确切补充。例如，非互补的核苷酸序列可以连接到另外互补引物的5'末端。或者，可以在寡核苷酸引物序列中散布非互补碱基，条件是引物序列与所需模板链的序列具有足够的互补性，以功能性地提供用于合成延伸产物的模板-引物复合物。具有与含有CNV的核酸特异性杂交的适当序列同源性的探针和引物可用于检测生物样本中存在这种核酸。
[0082] 聚合酶链式反应(PCR)已经描述于美国专利号4,683,195，4,800,195和4,965,188中，将其全部公开内容通过引用并入本申请中。
[0083] 术语“载体”涉及单链或双链环状核酸分子，其可以感染，转染或转化到细胞中并且独立地复制或在宿主细胞基因组内。圆形双链核酸分子可以在用限制性内切酶处理时切割并且由此线性化。本领域技术人员可容易地获得各种载体，限制性内切酶和对限制性内切酶所靶向的核苷酸序列的了解，并且包括任何复制子，例如质粒，黏粒，杆粒，噬菌体或病毒，向其可以连接其它基因序列或元件(DNA或RNA)以便引起所连接的序列或元件的复制。通过用限制性内切酶切割载体并且将两个片段连接在一起，可将本发明的核酸分子插入载体中。
[0084] 本领域技术人员将认识到，核酸载体可以含有除启动子元件和自闭症特异性标记基因核酸分子以外的核酸元件。这些其它核酸元件包括但不限于复制起点，核糖体结合位点，编码药物抗性酶或氨基酸代谢酶的核酸序列，编码分泌信号的核酸序列，定位信号或可用于多肽纯化的信号。
[0085] 本申请所用的术语“报道基因”，“报道基因系统”，“报道基因”或“报道基因产物”应指这样的可操作基因系统，其中核酸包含编码产物的基因，所述产物在表达时产生报道基因信号，所述报道基因信号例如可以通过生物测定法，免疫测定法，放射性免疫测定法，或比色法，荧光法，化学发光法或其它方法容易地测量。核酸可以是RNA或DNA，线性或环状，单链或双链，反义或正义(sense)极性，并且可操作地连接至表达报道基因产物的必需控制元件。所需的控制元件将根据报道基因系统的性质以及报道基因是否为DNA或RNA的形式而变化，但可以包括但不限于诸如启动子，增强子，翻译控制序列，poly(A)加接信号，转录终止信号等元件。
[0086] 使用自闭症相关CNV诊断自闭症和自闭症谱系障碍发展倾向的方法
[0087] 包括但不限于本申请提供的表和图(例如图15-18)中所列举那些的包含自闭症相关CNV的核酸，可用于根据本发明的各种目的。包含自闭症相关CNV/SNP的DNA，RNA或其片段可用作探针以检测自闭症特异性标记的存在和/或表达。其中可以使用自闭症特异性标记核酸作为用于这种测定的探针的方法包括但不限于：(1)原位杂交；(2)DNA杂交；(3)RNA杂交；和(4)各种扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)。
[0088] 此外，用于检测与自闭症相关的CNV/SNP的测定可以在任何类型的生物样本上进行，所述生物样本包括但不限于体液(包括血液，尿液，血清，洗胃)，任何类型的细胞(例如脑细胞，白细胞，单核细胞)或身体组织。这种检测方法可以包括例如DNA和RNA印迹，RFLP，直接测序和PCR扩增，随后将扩增产物与包含参考核酸序列进行微阵列杂交。
[0089] 本发明的包含自闭症相关CNV/SNP的核酸，表达其的载体，包含自闭症CNV/SNP的标记蛋白和抗自闭症特异性标记抗体可用于检测身体组织，细胞，或流体中的自闭症相关CNV/SNP，并且改变包含自闭症SNP的标记蛋白表达，其目的是评估自闭症发展中涉及的基因和蛋白质相互作用。
[0090] 在用于筛检自闭症相关CNV的一些实施方式中，样本中包含自闭症相关CNV的核酸初始例如使用PCR进行扩增，以增加与存在于样本中的其它序列相比的模板的量。这使得如果目标序列存在于样本中，则高灵敏度地检测它们。通过使用在本领域中变得日益重要的高度敏感的阵列技术，可以避免该初始步骤。另外，新的检测技术可以克服该限制，并且能够分析含有低至1微克总RNA的小样本。与传统荧光技术相反，使用共振光散射(RLS)技术，多重读取可以使用生物素标记的杂交靶标和抗生物素抗体检测低量mRNA。PCR扩增的另一替代方法涉及使用平面波导技术(PWG)来提高信噪比并且减少背景干扰。两者技术都可商购自Qiagen Inc.(USA)。
[0091] 因此，上述技术的任一种都可用于检测或量化自闭症相关CNV标志物表达，并且因此诊断自闭症或自闭症谱系障碍。
[0092] 诊断自闭症的方法
[0093] 在一些实施方式中，本发明包括受试者的自闭症(包括自闭症谱系障碍)的诊断方法，其包括分析受试者的基因信息，以确定受试者的至少一个mGluR网络基因中是否具有基因突变，如果发现基因突变，则诊断受试者为患有自闭症。在一些实施方式中，受试者患有自闭症，但没有多动症，对立违抗障碍(ODD)，行为障碍，图雷特氏综合症(TS)，焦虑性障碍，恐惧症或抑郁症。在一些实施方式中，受试者患有自闭症并且也具有如下中的一种或多种：ADHD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，和抑郁症。在一些实施方式中，受试者患有自闭症和ADHD两者。
[0094] 在其它实施方式中，本发明包括确认受试者患有自闭症的诊断。本申请所用的“确认自闭症的诊断”是指诊断已经诊断患有自闭症的受试者。在一些实施方式中，确认患有自闭症的诊断的方法包括通过不包括分析mGluR网络基因的方法分析诊断为患有自闭症的受试者的基因信息，以确定受试者的至少一个mGluR网络基因中是否具有基因突变，如果发现至少一个mGluR网络基因中的基因突变，则确认自闭症的诊断。在一些实施方式中，筛检存在mGluR网络基因变异是为了确认诊断受试者进行的两个或更多测试或评估之一。在一些实施方式中，受试者患有自闭症但不患有ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在一些实施方式中，受试者患有自闭症并且也具有如下中的一种或多种：ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，和抑郁症。在一些实施方式中，受试者患有自闭症和ADHD两者。
[0095] 在其它实施方式中，本发明包括确认受试者患有自闭症的诊断，所述受试者不患有ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症，包括通过不包括分析mGluR网络基因的方法分析诊断为患有自闭症的受试者的基因信息，以确定受试者的至少一个mGluR网络基因中是否具有基因突变，如果发现至少一个mGluR网络基因中的基因突变，则确认自闭症的诊断。
[0096] 在一种实施方式中，如果检测到mGluR网络基因中的至少一个CNV，SNV，移码突变或任何其它碱基对置换，插入，删除或重复，则诊断和/或确认自闭症。在其它实施方式中，如果检测到Tier 1mGluR网络基因中的至少一个CNV，SNV，移码突变或任何其它碱基对置换，插入或删除，则诊断和/或确认自闭症。在其它实施方式中，如果检测到Tier 2mGluR网络基因中的至少一个CNV，SNV，移码突变或任何其它碱基对置换，插入或删除，则诊断和/或确认自闭症。再在其它实施方式中，如果检测到Tier 3mGluR网络基因中的至少一个CNV，SNV，移码突变或任何其它碱基对置换，插入或删除，则诊断和/或确认自闭症。
[0097] 诊断自闭症或确认自闭症的诊断可以基于如下或根据如下确认：发现Tier 1，Tier 2和/或Tier 3mGluR网络基因中的基因突变。基因突变可以是CNV。CNV可以是包含编码和控制/调节mGluR网络基因的一些或全部DNA的DNA区域的重复或缺失。在另一实施方式中，诊断自闭症或确认自闭症的诊断是在如下患者中进行的，所述患者不患有ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在一些实施方式中，诊断自闭症或确认自闭症的诊断是在如下患者中进行的，所述患者患有自闭症以及如下中的一种或多种：ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，和抑郁症。
[0098] 在一些实施方式中，诊断自闭症或确认自闭症的诊断是基于如下发现：mGluR网络基因的拷贝数偏离正常的二倍体状态。在一些实施方式中，诊断自闭症或确认自闭症的诊断基于0或1的拷贝数，其表示CNV删除。在一些实施方式中，诊断自闭症或确认自闭症的诊断基于3或更大的拷贝数，其表示CNV重复。在另一实施方式中，诊断自闭症或确认自闭症的诊断是在如下患者中进行的，所述患者不患有ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症，出现0或1的拷贝数，3或更大的拷贝数，或者与二倍体状态有任何偏差。
[0099] 在一种实施方式中，如果检测到mGluR网络基因中至少有两个CNV，则诊断出更严重形式的自闭症。在一种实施方式中，如果检测到mGluR网络基因中的至少两个CNV，则诊断患者中更严重形式的自闭症，所述患者不患有ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。
[0100] 在一种实施方式中，诊断和/或确认自闭症的方法包括：从受试者获得含有核酸的样本；任选地扩增所述核酸；任选地标记核酸样本；将核酸应用于包含mGluR网络基因的一个或多个核酸的固相支持体，其中核酸任选地包含mGluR网络基因的SNV；除去任何未结合的核酸样本；并且检测与固相支持体上的核酸结合的任何核酸，其中如果检测到结合的核酸，则受试者诊断或确认患有自闭症。在一种实施方式中，如果分析发现测试样本不同于对照或标准，则该方法进一步包括将任何结合的核酸与标准或对照进行比较，并且诊断或确认自闭症。在本方法的另一实施方式中，患有自闭症的患者不患有ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在另一实施方式中，自闭症患者也具有如下中的一种或多种：ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。
[0101] 在本发明的某些诊断，确认和治疗方法中，受试者可以患有自闭症，但不患有如下的任一种：ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在本发明的其它诊断，确认和治疗方法中，受试者可以患有自闭症和一种或多种另外的病症，例如ADHD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在一些方法中，受试者患有自闭症和ADHD两者。
[0102] 治疗自闭症的方法
[0103] 本申请包括治疗受试者的自闭症的方法，包括施用有效量的非选择性mGluR激活剂。本申请所用的术语“治疗”包括任何施用或应用针对受试者中的疾病或病症的治疗剂，并且包括抑制疾病，阻止其发展，缓解疾病症状，或防止发生或再发生疾病或疾病症状。
[0104] 通常将mGluR蛋白质放在三个子组中，包括mGluR1和mGluR5的组I受体归类为缓慢兴奋性受体。
[0105] 组II包括mGluR2和mGluR3。组III包括mGluR4，mGluR6，mGluR7和mGluR8。组II和III归类为缓慢抑制性受体。
[0106] mGluR与离子型GluR或iGluR不同，它们是离子通道相关的谷氨酸受体并且归类为快速兴奋性受体。
[0107] “mGluR的非选择性激活剂”是指激活来自组I，II和III类别中多于一种的mGluR的分子。因此，mGluR的非选择性激活剂可以提供对mGluR网络的一般刺激。这与特定mGluR激活剂相反，例如所述特定mGluR激活剂可能仅显著地激活单个mGluR，例如mGluR5。非选择性mGluR激动剂包括例如非选择性mGluR拮抗剂(agonists)。
[0108] 在一些实施方式中，非选择性mGluR激动剂是法索西坦。法索西坦是促智(即认知增强)药物，其可以在体外研究中刺激组I和组II/III mGluR(参见Hirouchi M等人，(2000)European Journal of Pharmacology 387:9–17)。法索西坦可以通过激活组I mGluR来刺激腺苷酸环化酶活性，同时它也可以通过刺激组II和组III mGluR抑制腺苷酸环化酶活性(Oka M等人，(1997)Brain Research 754:121–130)。在以前的人体研究中，观察到法索西坦具有高生物利用度(79％-97％)，半寿期为5-6.5小时(参见Malykh AG等人，(2010)Drugs 70(3):287-312)。法索西坦是拉西坦家族化学物质的成员之一，其共享一个五碳氧基吡咯烷酮环。法索西坦的结构是：
[0109] 本文使用的术语“法索西坦”包括药学上可接受的水合物和任何固态，无定形或结晶形式的法索西坦分子。例如，本申请中的术语法索西坦包括例如如下NFC-1的形式：法索西坦一水合物。除NFC-1之外，法索西坦也称为C-NS-105，NS105和LAM-105。
[0110] NFC-1先前已经在痴呆相关认知障碍的I-III期临床试验中进行研究，但在关于痴呆的III期临床试验中不显示足够的疗效。这些试验证明NFC-1对于这些适应症通常是安全的并且耐受性良好。III期临床资料显示，NFC-1对脑梗塞患者和患有脑血管疾病的成人痴呆患者的精神症状表现出有益的疗效。
[0111] 治疗方法的每种实施方式中，可向例如mGluR网络基因中具有改变的受试者将代谢型谷氨酸受体正向变构调节剂，代谢型谷氨酸受体负向变构调节剂，或速激肽-3/神经激肽-3受体(TACR-3/NK3R)拮抗剂单独施用或与mGluRs的非选择性激活剂组合施用。在一些实施方式中，治疗剂包含ADX63365，ADX50938，ADX71149，AMN082，1-(杂)芳基-3-氨基-吡咯烷衍生物，LY341495，ADX48621，GSK1144814或SB223412。
[0112] 本申请也包括治疗自闭症的方法，包括向至少一个mGluR网络基因中具有基因突变的受试者施用法索西坦。在一些实施方式中，该受试者患有自闭症但不患有ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症，而在其它实施方式中，受试者患有自闭症以及如下中的至少一种：ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在一些实施方式中，受试者患有自闭症和ADHD两者。
[0113] 在一些实施方式中，治疗方法包括鉴定或诊断受试者的至少一个mGluR网络基因中具有基因突变，并且向鉴定或诊断的受试者施用非选择性mGluR激动剂例如法索西坦。在一些实施方式中，受试者患有自闭症，但不患有ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在其它实施方式中，受试者患有自闭症，以及一种或多种神经心理障碍，例如ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，和抑郁症。
[0114] 在一种实施方式中，向患有自闭症并且已确认为mGluR网络基因中具有至少一个基因突变的受试者施用非选择性mGluR激动剂例如法索西坦。基因突变可以在Tier 1mGluR网络基因中。基因突变可以在Tier 2mGluR网络基因中。基因突变可以在Tier 3mGluR网络基因中。基因突变可以是多于一个的基因突变，和所述多于一个改变可以在Tiers 1，2，或3之一中，或在Tiers 1，2，3的组合中。
[0115] 一些实施方式包括治疗自闭症的方法，包括获得关于受试者的mGluR网络基因的基因信息，并且如果受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变例如CNV，则施用非选择性mGluR激活剂例如法索西坦。其它实施方式包括获得关于受试者的Tier 1mGluR网络基因的基因信息，并且如果受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变例如CNV，则施用非选择性mGluR激活剂例如法索西坦。其它实施方式包括获得关于受试者的Tier2mGluR网络基因的基因信息，并且如果受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变例如CNV，则施用非选择性mGluR激活剂例如法索西坦。再有其它实施方式包括获得关于受试者的Tier 3mGluR网络基因的基因信息，并且如果受试者的mGluR网络基因中具有至少一个基因突变例如CNV，则施用非选择性mGluR激活剂例如法索西坦。任一种Tier或三种Tier的组合中具有多于一个CNV的受试者，可以通过施用非选择性mGluR激活剂例如法索西坦进行治疗。在一些实施方式中，可以治疗如下受试者，其患有自闭症，但不患有ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，或抑郁症。在本发明其它治疗方法的实施方式中，受试者除自闭症之外，还具有一种或多种神经心理障碍，例如ADHD，ODD，行为障碍，TS，焦虑性障碍，恐惧症，和抑郁症。
[0116] 剂量给药
[0117] 在一些实施方式中，法索西坦可以作为法索西坦一水合物(NFC-1)施用。在一些实施方式中，法索西坦可以通过口服施用(即，经口)。在一些实施方式中，法索西坦可以作为胶囊施用。在一些实施方式中，法索西坦胶囊可以包含50，60，70，80，90，100，110，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，或200mg法索西坦一水合物。在一些实施方式中，法索西坦可以每天施用一次或每天施用两次。在一些实施方式中，法索西坦的日剂量可以为50mg，每天一次；100mg，每天一次；200mg，每天一次；400mg，每天一次；50mg，每天两次；100mg，每天两次；200mg，每天两次；或400mg，每天两次。在一些实施方式中，法索西坦剂量给药可以使用一系列剂量递增调整。在一些实施方式中，使用药物水平或临床应答的药代动力学数据确定剂量给药的变化。在一些实施方式中，不使用法索西坦剂量递增。在一些实施方式中，以预期临床有效而无需剂量递增方案的剂量的法索西坦，治疗受试者。
[0118] 组合治疗
[0119] 在一些实施方式中，法索西坦与其它试剂组合用于治疗自闭症。
[0120] 试剂盒和制品
[0121] 上述产品的任一种都可以并入试剂盒中，所述试剂盒可以包含自闭症相关CNV/SNP特异性标记多核苷酸或固定在基因芯片上的一个或多个这样的标记，寡核苷酸，多肽，肽，抗体，标签，标记，或报道分子，药学上可接受的载体，生理上可接受的载体，使用说明，容器，施用容器，检测底物或其任何组合。
[0122] 包括包含图15-18所述自闭症相关CNV/SNP特异性标记多核苷酸或Tier 1，2和/或3基因中任一种的载体和探针。
[0123] 包括表达本发明的自闭症相关CNV/SNP或其功能片段的宿主细胞。
[0124] 实施例
[0125] 实施例1
[0126] 进行结构变体的大型全基因组关联研究(GWAS)，该研究对自闭症患者的基因家族蛋白相互作用网络进行破坏。发现ASD中的多个有缺陷的网络，最显著地是5.8％的ASD患者在代谢型谷氨酸受体(mGluR)信号通路中罕见的拷贝数变异(CNV)。在ADHD和精神分裂症两者中都发现有缺陷的mGluR信号传导，两种常见的神经精神障碍都与ASD高度相符。此外，发现其它有吸引力的候选者，例如涉及癌症的MAX二聚化蛋白(MXD)网络和在神经元组织中活跃的钙调蛋白1(CALM1)基因相互作用网络。对于潜在的自闭症发现许多有缺陷的基因家族相互作用，给出许多新的转译机会来探索治疗干预措施。
[0127] 为了鉴别和全面表征ASD潜在的有缺陷的基因网络，进行大规模的关于自闭症患者富集的拷贝数变异(CNV)的基因组关联研究。通过将先前公布的大型ASD研究中受影响的病例与费城儿童医院最近招募的病例相结合，对迄今为止ASD中罕见的致病性CNV进行最大规模的研究之一。总之，将来自ASD患者的6,742个基因型样本与费城儿童医院(CHOP)招募的12544名神经正常对照的样本进行比较。
[0128] 这些病例各自由神经发育专家进行筛检，以排除已知自闭症综合症病因的患者。对于绝大多数ASD病例以及所有对照都进行基因分型。在清除数据以去除样本重复数据并且对CNV进行标准QC后，使用来自HapMap 3和人类基因组多样性分析(Human Genome Diversity Panel)的人群定义的训练集推断出5627个受影响的病例和9644个无病对照的大陆血统(表1)。使用该QC标准，估计在通过PCR测定的121个不同基因组区域中，调用CNV的敏感性和特异性分别为约70％和100％。在所有种族中，病例组对对照组中CNV的负担增加，在源自较大的欧洲(分别为63.3对54.5Kb)和非洲(分别为70.4对48.0Kb)的人群中存在统计学上的显著性差异(P≤0.001)。
[0129] 表1：CNV在样本和估计祖先中的分布。
[0130]
[0131] 参考表1，CNV＝拷贝数变异。所述表显示估计的大陆血统中病例，对照和CNV覆盖率的分布。对于估计祖先的病例组和对照组，所述表列出通过质量控制的受试者数量及其群组的CNV负担，CNV负担定义为每组以Kb计的CNV的平均跨度。
[0132] 参考表1，*CNV负担的统计学上的显著性(P≤0.01，得自PLINK置换检验)差异用星号标记(*)。
[0133] 实施例2
[0134] 在源自欧洲人的数据集(4,602例病例对照4,722例对照；P≤0.0001，得自Fisher精确检验)中发现的泛种族CNV区域(CNVR)进行搜索，并且复制独立的非洲人血统ASD数据集(312例病例对4,169例对照；P≤0.001，得自Fisher精确检验)，随后测量整个多种族发现队列(5,627例病例对9,644对照)的最大功率的总体显著性(图5，图10)。
[0135] 图5示出源自欧洲人或源自非洲人人群中ASD的通过GWAS分析的CNVR。曼哈顿地块显示沿着基因组每个CNVR关联性的-log10转化的P值。相邻染色体以红色和蓝色交替显示。在欧洲人(P≤0.0001)中发现和在非洲人(P≤0.001)中复制的区域用染色带标记的黑色箭头突出显示。上方显示GWAS为欧洲人中的4,634例病例对4,726例对照，下方显示GWAS为非洲人中的312例病例对4,173例对照。
[0136] 基于这些选择标准，显现两大知名ASD风险位点，在Prader Willi/Angelman综合征(15q11-13)临界区隐匿多个重复，和在DiGeorge综合征(22q11)临界区检测到多个缺失，但显著小于22q11缺失综合征。也发现染色体5q11上的聚ADP-核糖聚合酶家族8(PARP8)中隐匿缺失的第三基因座。PARP8先前已确定为与荷兰人群中的ASD相关，但先前在源自欧洲人和源自非洲人人群中没有描述其泛种族分布。
[0137] 实施例3
[0138] 使用先前施用于ADHD的方法检查源自具有定位于Prader Willi/Angelman综合征(15q11-13)临界区，DiGeorge综合征(22q11)临界区和新型PARP8(5q11)区的成员的基因家族的基因相互作用网络；然而，几乎没有隐匿显著CNVR的最重要基因中的任一个聚类在基因家族内。因此，寻找基因家族相互作用网络(GFIN)的范围扩大到在整个基因组中寻找患有自闭症中富集的CNV的GFIN。对于每个基因家族，GFIN定义为由其多重成员产生的基因相互作用网络。使用标准的HUGO基因名称定义1,732个GFIN，其中搜索与ASD相关联的网络缺陷富集。然而，由于在ASD病例相对于无病的对照的先验过量的CNV负担(表1)，因此预期较大的GFIN仅凭其增加的大小和复杂性就表现出显著的病例缺陷富集。因此，对于每个GFIN，病例富集的网络置换检验用于1000个随机网络基因组，以控制GFIN大小和复杂性。采用这种方法，与ASD相关联的网络缺陷通过使如下最小化来识别：源自病例相对于对照的任何先验过量CNV负担的统计假象，以及可以在采集的人类相互用组数据中固有的其它未知偏差。
[0139] 在1,732个GFIN中，使用网络置换检验以定义的CNV排列1557个GFIN，以得到ASD中基因缺陷的富集。顶部的GFIN(图13A-B)是由影响谷氨酸能神经传递的GRM家族基因定义的代谢型谷氨酸受体(mGluR)途径。GRM家族包含8个成员，所有这些成员在人类相互作用组中定义为累积产生279个基因的GFIN(图6A-D)。在对于GRM家族基因的该GFIN中，我们发现5.8％的源自欧洲人的ASD病例有CNV缺陷(265/4,602)，而种族匹配的对照仅3％有CNV缺陷(153/4,722)，1.8倍富集频率(PFisher≤2.40E-09)。通过1,000个随机网络置换，我们从病例的mGluR途径中发现该过剩富集也是统计学上的显著性(Pperm≤0.05)。另外，我们mGluR网络中69.2％(124/181)的信息基因显示病例中的CNV过量。然而，隐匿最显著的CNVR对该整体网络显著性有贡献的成分基因显示，重复的mGluR基因本身(GRM1，GRM3，GRM4，GRM5，GRM6，GRM7和GRM8)不能单独实现显著性，但存在如下倾向：病例特有的特定子集的mGluR受体(GRM1，GRM3，GRM5，GRM7，GRM8)中的CNV缺陷过量(图9)。
[0140] 图6A-D显示mGluR基因网络中的最佳CNVR的富集。网络节点标记有基因名称，其中红色和绿色分别表示缺失和重复，而灰色节点缺乏CNV数据。黑色和浅色分别代表病例和对照中的富集。定义网络的基因以菱形显示，而所有其他基因以圆形显示。蓝线表示相互作用的证据。
[0141] 实施例4
[0142] 许多关于CNV的大型研究都牵涉ASD病因中的谷氨酸能信号通路中的基因，并且已经报道GRM8的SNP和CNV重复与之前人类中的ASD相关联。此外，最近的一项功能研究表明，在结节性硬化症和脆性X小鼠模型中，两种不同形式的综合征自闭症，自闭症表型通过在每个综合征的相反方向上调节GRM5而得到改善，这表明GRM5功能活性是定义综合征自闭症中突触联系生理学的轴的中心。本申请的GRM网络发现表明，mGluR信号传导中的罕见缺陷也有助于脆性X和结节性硬化症之外的ASD，并且功能性mGluR突触病理生理学可以从mGluR途径中数十个甚至数百个有缺陷的基因开始，其可以占ASD内表型的多达6％(图13A-B)。
[0143] 另外，已经表明mGluR在ADHD中的重要性，ADHD是自闭症谱系中高度同时发生的神经精神障碍。然而，与ADHD相比，ADHD中的mGluR受体本身(GRM)中的缺陷是导致整体网络显著性的最显著的拷贝数缺陷之一，发现在ASD中，成分GRM的缺陷仅稍微贡献于mGluR途径的整体显著性。然而，鉴定为病例特有和因此富集的GRM1，GRM3，GRM5，GRM7和GRM8中的缺陷是识别为ADHD致病性的相同GRM，并且可影响谷氨酸能信号传导。
[0144] 置换检验所得的最排名靠前的GFIN中，MAX二聚体蛋白(MXD)GFIN(PFisher≤3.83E-23，富集＝2.53，Pperm≤0.042)是最富集的。MXD家族基因编码如下蛋白，所述蛋白与调节细胞增殖，分化和凋亡的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLHZ)转录因子的MYC/MAX网络相互作用(MIM600021)；MXD基因是重要的候选肿瘤抑制基因，因为MXD-MYC-MAX网络在各种类型的癌症中失调。有趣的是，已报道自闭症和特定类型的癌症之间的流行病学联系，最近，抗癌治疗剂显示通过调节突触NLGN蛋白水平来调节小鼠中的ASD表型。在有助于MXD GFIN显著性的组分基因中，在PARP10(P≤4.06E-11，OR＝2.04)和UBE3A(1.50E-06，OR＝无穷大)中的重复是最显著富集的(图12)。值得注意的是，如前所述，发现PARP8在种族间存在显著性(图12)，而先前描述UBE3A结构缺陷在ASD中的重要性。
[0145] 未发现的其它特别重要的GFIN是POU5类同源框(POU5F)GIFN(PFisher≤2.96E-17，富集＝2.3，Pperm≤0.008，和SWI/SNF相关，基质相关，染色质的肌动蛋白依赖性调节子，亚家族c(SMARCC)GFIN(PFisher≤1.22E-09，富集＝1.9，Pperm≤0.035)。POU5F家族基因编码含有POU同源结构域的转录因子，其作用已在胚胎发育中得到证实，特别是在早期胚胎发生期间，并且它对于胚胎干细胞多能性是必需的。SMARCC基因家族的成分基因是SWI/SNF家族蛋白的成员，其成员显示解旋酶和腺苷三磷酸酶活性，并且认为通过改变这些基因周围的染色质结构来调节某些基因的转录。最有趣的是，KIAA家族基因排在GFIN之首(PFisher≤3.12E-23，富集＝1.6，Pperm≤0.040)。在Kazusa cDNA测序项目中已经鉴定KIAA基因，并且是从新的大型人类cDNA中预测的；然而，它们具有未知功能。
[0146] 一些基因家族的成员可贡献不成比例的GFIN显著性，因为它们高度连接到ASD中CND缺陷富集的相互作用的基因伙伴。因此，1,732个基因家族分解成它们的15,352个组成重复基因，其中1,218个具有定义网络的数据以通过全基因组网络置换检验显著性。在1,000个随机基因网络中，通过网络置换检验CNV缺陷富集的病例，钙调蛋白1(CALM1)基因相互作用网络排名最高(图7，图14)，其代表新的和引人关注的ASD候选基因。CALM1网络中，
14/4,618病例中发现CNV缺陷，而对照中仅1/4726发现CNV缺陷(Pfisher≤4.16E-04，富集＝14.37，Pperm≤0.002)，这些缺陷的分布使得病例中富集90％(9/10)的基因隐匿CALM1相互作用组中的CNV。仔细观察对CALM1网络显著性有贡献的最重要的CNVR(图11)，发现没有单个基因本身是显著性的；相反，除了只有一个基因(PTH2R)外，每个贡献的CNVR都标记出病例特有的高渗透性罕见缺陷。钙调蛋白是钙调蛋白家族的原始型，其中发现有近20个成员。钙调蛋白含有149个氨基酸，其定义四个钙结合结构域，用于Ca 2+介导配位大量酶，离子通道和其它蛋白质(包括激酶和磷酸酶)；其功能包括如下方面的作用：生长和细胞周期调控以及信号转导和神经递质的合成和释放[MIM 114180]。
14/4,618病例中发现CNV缺陷，而对照中仅1/4726发现CNV缺陷(Pfisher≤4.16E-04，富集＝14.37，Pperm≤0.002)，这些缺陷的分布使得病例中富集90％(9/10)的基因隐匿CALM1相互作用组中的CNV。仔细观察对CALM1网络显著性有贡献的最重要的CNVR(图11)，发现没有单个基因本身是显著性的；相反，除了只有一个基因(PTH2R)外，每个贡献的CNVR都标记出病例特有的高渗透性罕见缺陷。钙调蛋白是钙调蛋白家族的原始型，其中发现有近20个成员。钙调蛋白含有149个氨基酸，其定义四个钙结合结构域，用于Ca 2+介导配位大量酶，离子通道和其它蛋白质(包括激酶和磷酸酶)；其功能包括如下方面的作用：生长和细胞周期调控以及信号转导和神经递质的合成和释放[MIM 114180]。
[0147] 图7显示CALM1网络中最优CNVR的富集。显示由CALM1定义的一级定向的相互作用网络。
[0148] 本申请描述的全面，公正分析方法已经确定多组特定有缺陷的生物途径，所述生物途径促成ASD的潜在病因。在用于结构缺陷的GFIN稳健富集中，最富集的是与癌症发病机理有关的MXD家族基因的富集，从而提供具体的基因缺陷，以探究所报道的特定癌症与ASD的巧合。排名最靠前的成分重复基因相互作用网络涉及CALM1及其多个相互作用伙伴中的缺陷，所述伙伴在调节神经元突触上的电压非依赖性钙激活的动作电位方面是重要的。此外，对于定义mGluR途径的GRM的GFIN内的缺陷存在明显富集。虽然已经显示特定的mGluR基因家族成员是潜在的综合征的ASD，但这些发现表明，mGluR信号传导中的罕见缺陷也对整个GFIN中的GRM基因的特发性自闭症有贡献。
[0149] 鉴于未满足的更好治疗神经发育疾病的需求，本文报道的功能多样化的有缺陷的基因相互作用网络组呈现出引人关注的基因生物标志物，认为用于ASD和整个神经精神疾病谱系中的靶向治疗性干预。
[0150] 适用于实施例1-4的方法
[0151] 大多数病例(6,742例中有5,049例)和所有对照(12,544例)都通过费城儿童医院(CHOP)应用基因组学中心使用Infinium II平台对具有550K，610K，660K和1M标志物的HumanHap BeadChip进行各种迭代以全基因组覆盖进行基因分型。由AGP联盟对1,693例病例进行基因分型。从先前公布的大型ASD研究中重新使用所有病例和～\n50％对照。所有病例都由ADI-R/ADOS诊断并且符合ASD标准。复制样本通过从簇中选择质量最佳的独特样本(基于用于QC样本的基因表型统计)来除去，所述簇通过如下所有样本对的单连锁聚类来定义，所述所有样本对具有通过140K非相关SNP进行状态测量(IBS≥0.9)的高配对同一性。样本的种族是通过在140K非相关SNP的相同子组中通过主成分分析估计前10个特征向量的监督k均值分类(k＝3)推断的。我们使用HapMap 3和已知的大陆血统的人类基因组多样性面板样本来训练由R语言实现的用于统计计算的k均值分类器。
[0152] CNV推断和关联
[0153] 利用组合包括基因分型荧光强度(Log R Ratio)，SNP小等位基因(B等位基因频率)的群体频率和SNP间隔的多个值的PennCNV算法所得的CNV称为隐马尔可夫模型。术语“CNV”代表单个CNV称呼，而“CNVR”代表受试者间享有的群体水平的变异。纳入CNV分析样本的质量控制阈值包括SNP的高检出率(检出率≥95％)，低标准差归一化强度(标准差≤0.3)，低绝对基因组波形伪影(|GCWF|≤0.02)和低的称为CNV的数量(#CNV≤100)。病例和对照之间以CNV负担(定义为CNV的平均跨度)计的全基因组差异和显著性的估计值使用PLINK计算。CNVR基于个体CNV的基因组边界定义，并且使用Fisher精确检验对于每个CNVR评估病例和对照之间CNVR频率差异的显著性。
[0154] 基因家族相互作用网络的定义和关联
[0155] 先前在ADHD上的工作在本申请中扩展到通过网络置换检验排列所有GFIN。具体而言，使用来自通过人类相互作用组数据库访问的三种不同酵母双杂交产生的数据集的合并的人类相互作用组数据，针对所有基因家族定义定向的二级基因相互作用网络，就像ADHD中唯一的代谢型谷氨酸受体基因家族网络所起的作用那样。具体而言，GFIN用来指代源自这些基因家族的相互作用网络。总之，发现2611个基因家族，其中至少两个成员基于官方HUGO基因命名，并且产生正在使用的1,732个GFIN。对于定义CNV的1,557个GFIN，计算网络内所有隐匿CNV的基因的累积网络富集值的比值比。此外，对于每个GFIN，其富集通过从随机的N个基因组获得的1000个二级基因相互作用网络的置换检验进行量化，其中N是给定基因家族的成员数。由于关注的CNV非常罕见，因此在校正多个GFIN测试后，通过置换检验获得显著性的功效相对不足。然而，所有GFIN都按其名义/边际显著性的顺序进行报道。
[0156] CNV的实验验证
[0157] 使用在Life Technology的ABI GeneAmp 9700系统上运行的商购可得qPCR Taqman探针来验证所鉴定的显著的CNVR。图9列出251种反应，所述反应使用121种不同的基因组探针对DNA可用的85种不同样品进行测试。对于缺失，灵敏度＝0.65，特异性＝1.00，NPV＝1.00，PPV＝0.88。对于重复，灵敏度＝0.68，特异性＝0.99，NPV＝0.94，PPV＝0.91。
[0158] 结论
[0159] 本申请提供的数据表明，在鉴定mGluR网络基因中至少有一个CNV后，可诊断为ASD，所述mGluR网络基因选自：ACAT1，ACAT2，ACP1，ACTR2，ADCY1，ADD1，ADRA2C，ADRBK1，AGAP2，ALDOA，APTX，ARHGAP24，ARL15，BDKRB1，BDKRB2，C1orf116，C4orf3，C7orf25，CA8，CACNA1B，CALB2，CALM1，CAMK2B，CHP，CHRM3，CNPY2，CNR1，COPB2，DCN，DHCR7，DISC1，DSTN，ECHS1，EGFR，ERBB2，ERP44，F2RL2，FKBP3，FURIN，GLP1R，GLP2R，GNA15，GNAI1，GNAI2，GNAI3，GNAO1，GNAQ，GNB2L1，GRB2，GRB7，GRIK1，GRM1，GRM3，GRM5，GRM7，GRM8，GSN，HNRNPA3，HOMER1，HOMER3，HTT，IMPDH2，IQGAP2，ITGB7，ITPR1，LAMA4，LRP2BP，LYAR，LYN，MAP4，MAPK1，MTHFD1，MTNR1A，MX1，MYO6，NAA15，NCK1，NPY2R，PCBP1，PCBP3，PCDHA4，PDE1C，PICK1，PIK3CA，PLA2G7，PLCB1，PRDX1，PRKCA，PRPSAP1，PSMC1，PSMD1，PSMD13，PSME1，PXN，RAB2A，RANBP1，RAP2A，RCC1，RGS12，RPA2，RPN2，RUVBL2，RYR2，S100A6，SACS，SDC3，SERPINB9，SLC6A3，SNRPB2，SRC，STRAP，STX12，SYK，TCP1，TEAD3，TFAM，TJP1，TRAF2，TUBA1A，TUBA3C，TXN，UBQLN4，VHL，和YWHAQ(也示于图15A-D中)。
[0160] 这些基因中的CNV是敏感和特异性生物标志物，用于选择和治疗由于有缺陷的mGluR途径导致的ADHD。此外，本发明人已鉴定特异性激活mGluR的药物候选物，可能恢复任何mGluR网络基因中具有突变的ASD患者的正常神经生理学，如图15A-D所示。
[0161] 例如，在实施本申请描述的测试和治疗范例中可以施用的化合物包括吡拉西坦家族的脑代谢改善药，如F.Gualtieri等人，Curr.Phann.Des.，8:125-38(2002)中所述。更优选地，治疗剂是焦谷氨酰胺。Kimura等人的美国专利号5,102,882中提供可用于本发明实践的关于焦谷氨酰胺的制备和配制的细节。用于治疗确定具有如图15A-D所述表示的一个或多个CNV的ASD患者的特别优选的试剂是(+)-5-氧代-D-脯氨酸哌啶酰胺一水合物(NS-105)。
[0162] 实施例5
[0163] mGluR拷贝数变异在基因和环境形态综合征自闭症谱系障碍中的作用
[0164] 通过mGluR5介导的异常信号参与脆性X综合征和结节性硬化症的自闭症谱系障碍(ASD)的病理生理过程。但是，其它mGluR相关网络/信号基因在综合征型ASD中的作用尚不清楚。为了确定拷贝数变异体(CNV)在综合征性ASD中是否富集，使用微阵列来鉴定ASD儿童中的mGluR网络CNV。我们着手确定1)在mGluR网络基因中，伴有或不伴有CNV的ASD儿童的综合征特征的比率是否有所不同；和2)在儿童具有22q11.2缺失综合征的ASD儿童(其所有具有均有RANBP1单倍不足性，RANBP1是22q11.2区域中的mGluR网络基因)中，儿童的mGluR网络基因中“第二次打击”是否发生频率较高。
[0165] 筛检在我们的生物储备库中有父母报告的个体ASD(n＝6,452)，以在费城儿童医院的电子健康记录中进行父母同意接受临床评估(n＝539)。我们的综合征比较队列包括22q11.2缺失综合征患儿，其中完全获得过去的医学和神经心理学评估(n＝75)，包括诊断为ASD的那些(n＝25)和不涉及ASD的那些(n＝50)。
[0166] 患者分类(综合征vs非综合征)通过盲法医学图表审查在所有mGluR阳性和100随机选择的mGluR阴性病例中完成。
[0167] 我们在本申请进一步解释的结果显示，11.5％的ASD具有mGluR CNV而在健康对照中为3.2％(p<0.001)。综合征的ASD在mGluR CNV患儿中更为普遍(72％对16％，p<0.001)。对具有22q11.2缺失综合征的比较队列的患儿(n＝25，具有ASD；n＝50，无ASD)，对于mGluR网络基因RANBP1的所有单倍型不足的儿童进行评估，以确定mGluR网络基因的“第二次打击”是否赋予额外的ASD风险。22q11.2DS+ASD中的20％在其mGluR信号基因中具有“第二次打击”，而在22q11.2DS-ASD中为2％(p<0.014)。结论：我们认为改变的RANBP1表达可提供ASD在22q11.2DS，反应停胎儿病和胎儿丙戊酸盐综合征之间机制上的联系，为ASD表观上无关的基因和环境形式提供联系。
[0168] 结果表明，mGluR网络基因中的CNV，以前涉及脆性X综合征和结节性硬化症的神经发育改变，可与许多其它基因和环境形式的自闭症谱系障碍有关。如前面的实例所讨论的，自闭症谱系障碍(ASD)发生在大约1/88的个体中，其特征是社会交往障碍以及重复性的兴趣和活动。大约20％的病例发生在可鉴定综合征的情况下。ASD的基因综合征是异质的，包括细胞基因学可见的染色体改变(例如三体性21)，微缺失和微重复综合征(例如22q11.2缺失综合征[22q11.2DS]；22q11.2重复综合征[22q11.2DupS])和单基因疾病(例如脆性X综合征[FXS]，结节性硬化症[TS])。另外，产前暴露于沙利度胺，丙戊酸，米索前列醇，乙醇和母体风疹感染，都与ASD风险升高有关。
[0169] 发展为大多数特发性和综合征型形式ASD的ASD的机制仍然难以捉摸。最近，通过代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)的信号传导已经牵涉到FXS和TS中ASD的发展。在FXS中，脆性X智力低下蛋白(FMRP)的异常产生消除通过mGluR途径的信号传导的正常抑制。结节性硬化症导致过度抑制信号传导。Auerbach及其同事(2011)证明FXS和TS的小鼠模型中异常的突触学习和非典型行为，并且通过将两种菌株一起培育来逆转这些效应，隐匿两者突变的小鼠具有正常的mGluR信号传导，以及与对照小鼠无法区分的学习和行为。其它研究已经证实，在脆性X小鼠中，通过施用mGluR5拮抗剂，其学习和行为正常化。除了阐明FXS和TS中认知和行为差异的机制之外，这些研究还为药物治疗提供了一个有前途的途径。为了确定其它形式的综合征的ASD是否可以(通过破坏mGluR基因网络)共享类似的机制，我们分析在费城儿童医院接受的539名患有ASD(不过滤共存基因性综合征)儿童的DNA。
[0170] 提供以下材料和方法以便于实施例5的实施。
[0171] 参与者：对来自我们生物储备库的父母健康问卷报告的ASD患者的表型数据(n＝6,452)进行评估，以确定在费城儿童医院接受临床评估的患者，并且同意电子健康记录图表审查。选择这些病例(n＝539)的DNA用于进一步的表型和基因型分析。在费城儿童医院为了另一个目的抽血时，招募儿童纳入应用基因组学生物储备库的总中心，因此在该患者队列中有至少一个医疗问题的儿童人数过多。所有患者的父母都同意参加该研究，该研究经费城儿童医院的机构审查委员会批准(IRB 06-004886)。
[0172] 图表回顾：受试者选择和随机化过程：随机选择所有mGluR CNV患者(n＝62)和100例无mGluR CNV患者进行图表评估。选择该程序是为了确保所有患有mGluR CNV的患者都能获得详细的图表回顾，并且具有适当大小的比较队列。完成三步过程以确保盲性图表审查。如下完成162个图表的选择：由基因学家访问CNV数据，而不访问电子健康记录(CK)。另一位无法获得CNV数据和电子健康记录的作者使患者ID(RTS)盲性并且随机化。最后，一位能够访问电子健康记录但对mGluR状态(TLW)不知情的医生审查记录ASD诊断和存在其它医疗合并症的图表。
[0173] ASD：审查图表以确认诊断为ASD，并且确定每个患者的合并症。ASD的诊断在图表中得到确认，但这是回顾性图表审查，黄金标准的研究工具(例如自闭症)。
[0174] 医学合并症：记录每名患者的结构性出生缺陷，基因测试和医学病症。病例如果患有ASD并且存在医疗状况或结构性出生缺陷(例如腭裂)，则该病例归类为“综合征的ASD”，其发生率低于总人口的1％。建立该标准是为了定义一组ASD和其它医学问题不太可能偶然发生的患者，其中以1/88的ASD基线率和<1％普通人群中发生的医疗状况，两者偶然发生的复合可能性将约为0.001％。参见图8。
[0175] 基因分型阵列和CNV调用：来自ASD受试者的DNA分别在来自Illumina的Human610-Quad或HumanHap550 SNP阵列上进行基因分型。对于22q11 DS队列，将受试者分类在Illumina SNP阵列(Human610-Quad v1.0或HumanHap550)或Affymetrix 6.0 SNP阵列上。使用GenomeStudio(Illumina)进行聚类和SNP调用以生成标准化强度(即Log-R比率，LRR)和B等位基因频率(BAF)。波纹校正[PMID：18784189]后，使用PennCNV算法[PMID：17921354]进行调用CNV。简而言之，PennCNV使用隐马尔可夫模型(HMM)，其结合来自LRR，BAF的信息以及阵列的特征(例如邻近SNP之间的距离)检测CNV。
[0176] CNV质量控制：从CNV调用中排除质量差的SNP阵列的样本，因为通常对于这些样本的假阳性的比例显著增加。如下这些样本包括在分析中：所述样本中，基因分型检出率>96％，LRR标准偏差(LRR sd)<0.4，波形校正后的GC-波形因子(GCWF)为-0.2至0.2，和样本的总CNV调用数<100。
[0177] CNV注释：对于综合征的ASD区域，基因组坐标是由Betancur描述的[PMID：21129364]。由来自人类相互作用组数据库的Cytoscape评估的GRM/mGluR网络基因由Elia等人[PMID：22138692]使用UCSC基因组浏览器定义为基因坐标(UCSC基因)来描述。来自Cytoscape的该网络用于定义mGluR+对mGluR-子集。对于22q11DS队列分析，另外的GRM/mGluR网络基因如下鉴定：基于使用程序Ingenuity Pathway Analysis(Ingenuity Systems Inc./Qiagen；Redwood City，Calif.)的八个GRM基因的一级相互作用网络，以及Kelleher等人[PMID：22558107]中描述的编码组I mGluR信号传导途径的基因。分析CNV调用与已知的综合症区域和GRM网络基因的重叠。在临床细胞基因学实验室检测中检测到的所有综合征异常在相应的SNP阵列上得到证实。
[0178] 结果：与非综合征的ASD相比，mGluR网络拷贝数变异(CNV)普遍出现在综合征的ASD中
[0179] 与在16％的非综合征的ASD患者中发现mGluR网络基因中的CNV相比，在74％的综合征的ASD患者中发现mGluR网络基因中的CNV(p<0.001)。患有综合征的ASD患者中的大多数mGluR CNV(75％)纳入较大的临床显著性CNV。由于mGluR网络基因存在于22q11.2区域(RANBP1)中和21号染色体(APP GRIK1 MX1 PCBP3 SETD4)上，存在22q11.2DS，22q11.2DupS或三体性21的ASD患者占其中综合征的ASD+mGluR网络改变的患者中的15个(33％)。观察到细胞基因学改变的其余部分具有单独的非重叠缺失或重复。在排除患有三体21，22q11.2DS和22q11.2DupS(本研究中之前与ASD相关的儿童中的综合征)的患儿后重复该分析。排除后，效果仍然显著(p<0.001)。
[0180] 22q11.2缺失综合征中的自闭症谱系障碍与mGluR通路中的“第二次打击”相关联[0181] 作为比较队列，检查来自完成高密度微阵列评估(Affymetrix 6.0，Illumina500K和Illumina 610Q)的22q11.2DS以及患有ASD(n＝25)和无ASD(n＝50)的儿童的数据和临床发育评估(通过平行研究注册，由费城机构审查委员会儿童医院批准，IRB 07-005352)，用于确认22q11.2区域外存在第二次mGluR网络打击。对于“第二次打击”，22q11.2区域之外的mGluR网络基因缺失，其在20％(5/25)的ASD患者中发现，而无ASD中仅2％(1/50)(p<0.014)。
[0182] 先前研究已经证明，通过mGluR5的异常信号(太多或太少)可是FXS和TS中异常神经发育(并可能是ASD)的基础。我们的数据表明，紊乱的mGluR网络可是在细胞基因学上不同形式的综合征ASD中可见ASD比率增加的原因。22q11.2区域中以及21号染色体上发现mGluR网络基因，这可与唐氏综合征和22q11.2DS中ASD患病率增加有关。然而，所有患有三体性21或22q11.2DS的患者都隐匿mGluR网络的改变，表明该区域之外的第二次打击对于表达ASD表型可是必需的。
[0183] 22q11.2缺失综合征，22q11.2重复综合征，反应停胎儿病和胎儿丙戊酸盐综合征中的自闭症谱系障碍
[0184] 22q11.2DS是人类最常见的微缺失综合征，4000个人中出现1人。通常的缺失跨度为约3Mb和包括约45个基因，从而引起各种医学和行为障碍。ASD发生率为约20％，精神病发生率为25％。22q11.2DupS导致22q11.2 DS中可见相同类型的出生缺陷和医学合并症，但比率较低(在我们的临床队列超过60名患者中)。literature.sup.29或我们的队列中，22q11DupS没有精神病病例。4岁以后具有发育评估记录的我们病例中，ASD患病率为27％，略高于22q11.2DS患儿的比率。
[0185] 在怀孕期间暴露于沙利度胺导致各种出生缺陷，这在22q11.2DS中已有报道，其中包括一些极其罕见的实例(如短肢畸形，放射线缺陷)。Miller和Stromland报道在早期胚胎发生期间暴露于沙利度胺后的ASD风险升高。这项研究包括由精神科医生进行的前瞻性评估是针对怀孕期间暴露于沙利度胺的成人进行的，由医生进行评估以记录出生缺陷和相关特征。暴露于沙利度胺后的所有ASD病例都有耳部异常，表明受精后在24-28天之间暴露于沙利度胺。此时暴露的个体中，ASD的发生率为27％。这项研究的复制于另外的儿童队列是不可能的，因为在二十世纪六十年代，孕妇使用沙利度胺受到广泛限制；因此，另外的病例不可用。虽然已经提出反应停胎儿病中许多出生缺陷的原因的几种机制，但动物研究沙利度胺的致畸作用由于显着的种属差异而受到限制。二十世纪六十年代广泛使用沙利度胺的原因之一是由于在人类中高度致畸的水平，动物没有致畸性。这导致研究者确定沙利度胺致畸机理的能力受到显著限制，因为研究发生在沙利度胺不特别致畸的动物上，或使用的剂量远远高于人体使用的剂量。最近立法的变化允许在人类胚胎干细胞中完成研究，这是第一种使用人类细胞和剂量的方法，这种方法会与上世纪五六十年代服用沙利度胺的女性的经历相似。这项由Meganathan及其同事进行的研究(2012年)提出，沙利度胺的致畸作用可通过RANBP1介导。丙戊酸(VPA)广泛用作抗惊厥药，情绪稳定剂和预防偏头痛。在怀孕期间暴露于VPA导致几个出生缺陷的增加率，所有这些在22q11.2DS中都有报道，其中大部分出现在反应停胎儿病中。没有进行22q11.2DS中出现的所有出生缺陷与暴露综合征的比较，因为22q11.2DS包括我们不建议的在反应停胎儿病或胎儿丙戊酸盐综合征中影响的数十个另外基因缺失。除了结构性缺陷之外，子宫内暴露于VPA的儿童发展为ASD的风险也增加。自闭症的啮齿类动物模型使用产前暴露于VPA来重现自闭症的一些神经解剖学特征和异常行为。由于其作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的作用，VPA影响许多基因的表达。基于同源性，预测在VPA治疗的大鼠中RanBP1mRNA的表达降低。此外，最近研究显示，用mGluR拮抗剂治疗VPA暴露小鼠的非典型行为逆转。
[0186] 结论
[0187] 在具有不同形式综合征(包括22q11.2DS，22q11.2DupS，三体性21和大量其他看似无关的染色体改变)的ASD患者中，mGluR网络中的基因紊乱发生率很高。此外，在22q11.2DS儿童中，20％的ASD患儿的mGluR网络中出现“第二次打击”，无ASD的儿童仅为2％(p<0.014)。重要的是，所有患有自闭症表型的4名儿童的RANBP1基因附近有小的缺失。虽然RANBP1的表达水平在可用于测试的一个个体中未受影响(数据未显示)，但这些非典型缺失可影响基因功能，从而导致RANBP1蛋白质失调。
[0188] 总之，这些数据表明，mGluR网络调节异常作为可能的许可因子，其增加发展ASD的倾向，包括综合征型ASD，以及ASD个体中出现22q11.2缺失或重复综合征，胎儿丙戊酸盐综合征和反应停胎儿病。
[0189] 影响网络中第二基因的CNV引起ASD患病率的显著增加，表明mGluR信号传导在多个点处可能受到干扰。
[0190] 图15A-D中所述基因中的CNV是敏感和特异性生物标志物，其用于选择和治疗ASD，综合征的ASD，和具有22q11.2缺失或重复综合征，胎儿丙戊酸盐综合征和反应停胎儿病的个体中的ASD。此外，本发明人鉴定特异性激活mGluRs的候选药物，其可恢复任何mGluR网络基因突变的患者的正常神经生理学，如图15A-D所示。
[0191] 例如，可以在实施本申请所述测试和治疗范例中施用的化合物包括吡拉西坦家族的脑代谢改善药，如F.Gualtieri等人，Curr.Phann.Des.，8:125-38(2002)中所述。更优选地，治疗剂是焦谷氨酰胺。Kimura等人的美国专利号5,102,882中提供关于焦谷氨酰胺的制备和配制的细节，其可用于本发明的实践。特别优选的用于治疗确定具有如图15A-D所述表示的一个或多个CNV的患者中ASD的试剂，是(+)-5-氧代-D-脯氨酸哌啶酰胺一水合物(NS-105)。
[0192] 因此，在一种实施方式中，包括治疗ASD，综合征的ASD，和具有22q11.2缺失或重复综合征，胎儿丙戊酸盐综合征或反应停胎儿病的患者中ASD的方法，其包括向患者施用NS-105，所述患者的GRM/mGluR网络基因中具有至少一个CNV，所述GRM/mGluR网络基因选自：
ACAT1，ACAT2，ACP1，ACTR2，ADCY1，ADD1，ADRA2C，ADRBK1，AGAP2，ALDOA，APTX，ARHGAP24，ARL15，BDKRB1，BDKRB2，C1orf116，C4orf3，C7orf25，CA8，CACNA1B，CALB2，CALM1，CAMK2B，CHP，CHRM3，CNPY2，CNR1，COPB2，DCN，DHCR7，DISC1，DSTN，ECHS1，EGFR，ERBB2，ERP44，F2RL2，FKBP3，FURIN，GLP1R，GLP2R，GNA15，GNAI1，GNAI2，GNAI3，GNAO1，GNAQ，GNB2L1，GRB2，GRB7，GRIK1，GRM1，GRM3，GRM5，GRM7，GRM8，GSN，HNRNPA3，HOMER1，HOMER3，HTT，IMPDH2，IQGAP2，ITGB7，ITPR1，LAMA4，LRP2BP，LYAR，LYN，MAP4，MAPK1，MTHFD1，MTNR1A，MX1，MYO6，NAA15，NCK1，NPY2R，PCBP1，PCBP3，PCDHA4，PDE1C，PICK1，PIK3CA，PLA2G7，PLCB1，PRDX1，PRKCA，PRPSAP1，PSMC1，PSMD1，PSMD13，PSME1，PXN，RAB2A，RANBP1，RAP2A，RCC1，RGS12，RPA2，RPN2，RUVBL2，RYR2，S100A6，SACS，SDC3，SERPINB9，SLC6A3，SNRPB2，SRC，STRAP，STX12，SYK，TCP1，TEAD3，TFAM，TJP1，TRAF2，TUBA1A，TUBA3C，TXN，UBQLN4，VHL，和YWHAQ。
ACAT1，ACAT2，ACP1，ACTR2，ADCY1，ADD1，ADRA2C，ADRBK1，AGAP2，ALDOA，APTX，ARHGAP24，ARL15，BDKRB1，BDKRB2，C1orf116，C4orf3，C7orf25，CA8，CACNA1B，CALB2，CALM1，CAMK2B，CHP，CHRM3，CNPY2，CNR1，COPB2，DCN，DHCR7，DISC1，DSTN，ECHS1，EGFR，ERBB2，ERP44，F2RL2，FKBP3，FURIN，GLP1R，GLP2R，GNA15，GNAI1，GNAI2，GNAI3，GNAO1，GNAQ，GNB2L1，GRB2，GRB7，GRIK1，GRM1，GRM3，GRM5，GRM7，GRM8，GSN，HNRNPA3，HOMER1，HOMER3，HTT，IMPDH2，IQGAP2，ITGB7，ITPR1，LAMA4，LRP2BP，LYAR，LYN，MAP4，MAPK1，MTHFD1，MTNR1A，MX1，MYO6，NAA15，NCK1，NPY2R，PCBP1，PCBP3，PCDHA4，PDE1C，PICK1，PIK3CA，PLA2G7，PLCB1，PRDX1，PRKCA，PRPSAP1，PSMC1，PSMD1，PSMD13，PSME1，PXN，RAB2A，RANBP1，RAP2A，RCC1，RGS12，RPA2，RPN2，RUVBL2，RYR2，S100A6，SACS，SDC3，SERPINB9，SLC6A3，SNRPB2，SRC，STRAP，STX12，SYK，TCP1，TEAD3，TFAM，TJP1，TRAF2，TUBA1A，TUBA3C，TXN，UBQLN4，VHL，和YWHAQ。
[0193] 实施例6
[0194] 用法索西坦一水合物(NFC-1)治疗mGluR网络基因中具有CNV的ADHD患者及其对自闭症症状的影响
[0195] 进行开放标签的Ib期临床试验，以研究NFC-1(法索西坦一水合物)在青少年受试者中的安全性，药代动力学和疗效，所述青少年受试者的年龄介于12岁至17岁之间，先前诊断患有ADHD，其mGluR网络基因中也具有至少一个基因突变。
[0196] 该研究包括30名12至17岁的ADHD受试者，任何血统或种族，以及体重在其年龄的第5至第95百分位数内，否则判断为处于良好的医疗健康状况。如果受试者的mGluR网络基因中具有至少一个拷贝数变异(缺失或重复)形式的至少一个基因突变从而潜在破坏该基因功能，则将受试者进行基因分型并且包括在该试验中。30名受试者中有17名具有tier 1mGluR网络基因中的CNV，而7名受试者具有tier 2基因中的CNV和6名受试者具有tier 3基因中的CNV。入选时，一些试验受试者证据显示共病表型，包括具有与自闭症有关的症状的一些受试者。
[0197] 排除标准包括在精神或身体上患有临床上重大疾病的受试者，研究者认为可能混淆研究结果或可能阻止他们完成研究的如下受试者：妊娠或哺乳受试者，对于非法药物测试为阳性和有滥用药物史的受试者，食用含酒精饮料的受试者，或研究者另外对其顺从性或适应性关注的受试者。
[0198] 包含法索西坦一水合物作为活性成分的50mg或200mg的NFC-1胶囊和包含微纤维素的安慰剂胶囊用于研究。试验设计为电话筛检(1天)，入选阶段(1至2天)，目前进行ADHD药物治疗的受试者的洗脱阶段(1-14天)，药代动力学(PK)评估(2天)，随后在最后一次剂量后的约四周进行剂量递增阶段(35天)和随访电话访问，最长为127天。所有ADHD药物在研究前的洗脱阶段中止。兴奋剂的洗脱期为2-3天，阿托莫西汀或去甲肾上腺素能激动剂的洗脱期为10-12天。研究期间没有开始新的ADHD药物治疗。
[0199] 试验的剂量递增阶段在初始洗脱期以及PK和初始安全性评估后进行5周的时间。在第1周期间，所有受试者每天两次施用安慰剂胶囊。安慰剂治疗一周后，患者开始施用
50mg NFC-1(每日两次)，持续1周。如果法索西坦先前剂量水平的安全性和应答性数据显示其是适宜的，则将受试者升级至下一个较高剂量(100，200或400mg)。显示对50mg剂量(每日两次)耐受以及对该药物应答的受试者在试验剩余的3周内保持在该水平。
50mg NFC-1(每日两次)，持续1周。如果法索西坦先前剂量水平的安全性和应答性数据显示其是适宜的，则将受试者升级至下一个较高剂量(100，200或400mg)。显示对50mg剂量(每日两次)耐受以及对该药物应答的受试者在试验剩余的3周内保持在该水平。
[0200] 显示耐受但对50mg剂量(每日两次)没有应答或部分应答的受试者在接下来的一周内上移至下一个较高剂量的100mg。显示在100mg耐受性但没有应答或部分应答的受试者将在下一周上移至200mg剂量，同时显示在100mg有耐受性和应答的受试者将保持在100mg(每日两次)以用于剩余的试验。类似地，上移至200mg剂量显示耐受性和应答两者的受试者在试验的最后一周保持在200mg，而显示耐受但是没有应答或部分应答的受试者最后一周移至400mg剂量。在30名试验受试者中，3名接受最大剂量100mg，9名接受最大剂量200mg，其余18名接受最大剂量400mg。
[0201] 虽然这项研究并非专门针对确定自闭症患者或监测他们的症状，但30名ADHD受试者中有7人显示出某些自闭症迹象，特别是缺乏社交互动或参与，这似乎从NFC-1治疗中得到改善。例如，两名受试者在治疗后显示社交互动增加。长期没有与近亲属沟通的这些受试者之一开始与该亲属进行接触。一位受试者从没有目光接触到开始与临床医师谈话。该相同的受试者也有快速重复动作的情节，特别是在兴奋的时候。这些动作在NFC-1治疗时停止，并且在药物停药后再次开始。一位老师在试用期间也评论说该受试者也增加社交互动。一位受试者从不想和同龄人谈论到加入学校辩论队。据报道，一名受试者能够更好地与同龄人交往，并且组织同行聚会。一位受试者能够在学校去其储物柜而没有害怕。而在另一受试者中，自我谈话减少。因此，总体而言，在这七个受试者中，在NFC-1药物治疗中，社交互动似乎有所改善。
[0202] 等同物
[0203] 认为前述书面说明书足以使本领域技术人员能够实践实施方式。前面的说明书和实施例详细描述某些实施方式，并且描述发明人预期的最佳模实施方式。然而，应该理解的是，无论上述内容在文本中有多详细的描述，实践方式都可以以多种方式实践，并且应该根据所附权利要求及其任何等同物来解释。
[0204] 本申请所使用的术语“约”是指数值，包括例如整数，分数和百分比，无论是否明确指出都如此。术语“约”通常指本领域技术人员会认为等同于所述值(例如具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所述范围的+/-5-10％)。当术语“至少”和“约”在列表的数值或范围前时，这些术语修改列表中提供的所有值或范围。在某些情况下，术语“约”可包括四舍五入到最接近有效数字的数值。
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