抗PACAP抗体及其用途
阅读：980发布：2020-08-27
专利汇可以提供抗PACAP抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及对PACAP具有结合特异性的拮抗性 抗体 及其 抗原 结合 片段 。这些抗体抑制、阻断或中和与PACAP相关联的至少一种 生物 学效应，例如血管舒张。在示例性实施方案中，这些抗体及其抗原结合片段可包含本文所述的特定的VH、VL和CDR多肽。在一些实施方案中，这些抗体及其抗原结合片段结合和/或竞争结合至人PACAP上的特异性表位。本发明还涉及使用这些拮抗性抗PA-CAP抗体及其结合片段用于诊断、评估和 治疗 与PACAP相关联的 疾病 和病症以及其中PACAP相关活性(诸如血管舒张、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活)的拮抗作用对治疗有益的病状，例如头痛和偏头痛适应症。，下面是抗PACAP抗体及其用途专利的具体信息内容。
1.一种人、人源化或嵌合的抗人垂体腺苷酸环化酶激活多肽(“PACAP”)抗体或抗体片段，其拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应。
2.一种人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其与选自由Ab10和Ab20组成的组的抗体或前述抗体的任一个的抗原结合片段特异性竞争结合至人PACAP。
3.一种人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其特异性结合至选自由Ab10和
Ab20组成的组的抗PACAP抗体或前述抗体的任一个的抗原结合片段所结合的至少一种线性或构象表位。
4.根据前述权利要求中任一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其结合至与Ab10或Ab20或前述抗体的任一个的抗原结合片段中的任一个相同的表位。
5.根据前述权利要求中任一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其特异性结合至人PACAP上的表位或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体，其中所述表位选自由以下组成的组：
(i)人PACAP的残基19、22、23和27中的至少一个；
(ii)人PACAP的残基19、22、23、24和27中的至少一个；
(iii)(i)-(ii)中任一项的残基中的至少两个；
(iv)(i)-(ii)中任一项的残基中的至少三个；
(v)(i)-(ii)中任一项的残基中的至少四个；以及
(vi)(ii)中的所有五个残基。
6.如前述权利要求中任一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其特异性结合至人PACAP上的表位或其片段或变体，所述表位或其片段或变体含有(a)对应的氨基酸残基，其包括人PACAP的残基19、22、23和27的一个或多个；或者(b)含有如权利要求5所述的残基(i)或(ii)；(c)含有存在于人野生型PACAP38和人野生型人PACAP27中的对应的氨基酸残基的人PACAP或其片段或变体上的表位。
7.如权利要求3-6中的一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其特
异性结合至人PACAP上的表位(或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体)，其中所述表位通过例如如实施例12中所公开的丙氨酸扫描来鉴定。
8.如前述权利要求中任一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其
(a)不结合至或不明显结合至人血管活性肠肽(“VIP”)；(b)对于人PACAP的KD比所述抗体或抗体片段对人VIP的KD低(强)至少10、100、1000、10,000或100,000倍；或(c)抑制或中和由人PACAP引发的至少一种生物学效应。
9.如前述权利要求中任一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其包括以下的一种或多种：
(i)抑制、阻断或防止PAC1受体(“PAC1-R”)、1型血管活性肠肽受体(“VPAC1-R”)和/或2型血管活性肠肽受体(“VPAC2-R”)中的至少一种的PACAP激活；
(ii)抑制、阻断或防止PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；
(iii)抑制、阻断或防止PAC1-R的PACAP激活；
(iv)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种；
(v)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种；
(vi)能够抑制PACAP结合至表达PAC1-R的细胞；
(vii)能够抑制PACAP结合至表达VPAC1-R的细胞；
(viii)能够抑制PACAP结合至表达VPAC2-R的细胞；
(ix)抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)结合至所述细胞表面，
(x)抑制PACAP介导的此类抗体例如通过糖胺聚糖(“GAG”)结合至所述细胞表面；
(xi)抑制、阻断或防止PACAP诱导的cAMP产生；和/或
(xii)当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张。
10.如前述权利要求中任一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其
适用于治疗患有与增加的血管舒张、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活相关联的急性、发作性或慢性病状的人类受试者。
11.如前述权利要求中任一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其
特异性结合至与选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体相同的或重叠的一个或多个线性或构象表位并且/或者竞争结合至与人PACAP上的与选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体相同的或重叠的一个或多个线性或构象表位。
12.如前述权利要求中任一项所述的人、人源化或嵌合的，其中由所述抗体结合的所述表位通过例如如实施例12中所公开的丙氨酸扫描来鉴定。
13.一种人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其包含选自Ab10或Ab20的
抗PACAP抗体的至少2个、至少3个、至少4个或至少5个互补决定区(“CDR”)，优选VH CDR3和VL CDR3。
14.根据权利要求13所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其包含
选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体的全部6个CDR。
15.根据前述权利要求中任一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片
段，其包含含有假定改变结合亲和力或免疫原性的一种或多种修饰的前述任一种的序列变体。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)可变重链，其包含由SEQ ID NO:404组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:406组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:408组成的CDR3序列；和/或
(b)可变轻链，其包含由SEQ ID NO:424组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:426组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:428组成的CDR3序列，
其中任选地所述抗体包含：包含与SEQ ID NO:402具有至少80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的可变重链，和/或包含与SEQ ID NO:422具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的可变轻链；或者具有SEQ ID NO:402的氨基酸序列的可变重链和/或具有SEQ ID NO:422的氨基酸序列的可变轻链；或者具有SEQ ID NO:401的氨基酸序列的重链和/或具有SEQ ID NO:
421的氨基酸序列的轻链。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)可变重链，其包含由SEQ ID NO:444组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:446组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:448组成的CDR3序列；和/或
(b)可变轻链，其包含由SEQ ID NO:464组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:466组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:468组成的CDR3序列；
其中任选地所述抗体包含：包含与SEQ ID NO:442具有至少80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的可变重链，和/或包含与SEQ ID NO:462具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的可变轻链；或者具有SEQ ID NO:442的氨基酸序列的可变重链和/或具有SEQ ID NO:462的氨基酸序列的可变轻链；或者具有SEQ ID NO:441的氨基酸序列的重链和/或具有SEQ ID NO:
461的氨基酸序列的轻链。
18.如权利要求1-15中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗
原结合片段选自由以下组成的组：scFv、骆驼抗体、纳米抗体、免疫球蛋白新抗原受体(“IgNAR”)、片段抗原结合(“Fab”)片段、Fab’片段、MetMab样抗体、单价抗原结合片段和F(ab’)2片段。
19.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗
原结合片段基本上或完全缺乏N-糖基化和/或O-糖基化。
20.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗
原结合片段包含人恒定结构域，其中任选地所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
21.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗
原结合片段包含Fc区，其已被修饰以改变效应子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中的至少一个，其中任选地所述Fc区含有改变或消除N-糖基化和/或O-糖基化的一个或多个突变。
22.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗
原结合片段以以下结合亲和力(KD)结合至PACAP：小于或等于5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、
5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M或10-13M，例如如通过ELISA、生物层干涉测量(“BLI”)、KINEXA或表面等离子体共振在25℃或37℃下所确定的。
23.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗
原结合片段以以下结合亲和力(KD)结合至PACAP：小于或等于5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M或10-12M。
24.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其以以下解离速率
(koff)结合至PACAP：小于或等于5x10-4s-1、10-4s-1、5x10-5s-1或10-5s-1。
25.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗
原结合片段直接或间接地附接到可检测标记或治疗剂。
26.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其(a)当向受试者
施用时，抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；(b)结合至PACAP27和/或PACAP38并且阻断PACAP27和/或PACAP38结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R；(c)结合至PACAP27和/或PACAP38并且阻断PACAP27和/或PACAP38结合至PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一个；或者(d)结合至PACAP27和/或PACAP38并且阻断PACAP27和/或PACAP38结合至表达PAC1-R的细胞、表达VPAC1-R的细胞和/或表达VPAC2-R的细胞。
27.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其(a)中和或抑制
PAC1-R、VPAC1-R或VPAC2-R的至少一种的PACAP激活；(b)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；(d)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R或VPAC2-R中的至少一种；(e)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种；或(f)能够抑制PACAP结合至表达PAC1-R的细胞、表达VPAC1-R的细胞和/或表达VPAC2-R的细胞。
28.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其(a)抑制PACAP诱
导的cAMP产生；或(b)减少PACAP诱导的血管舒张、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
29.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗
原结合片段以以下KD结合至PACAP：(a)小于约100nM；(b)小于约40nM；(c)小于约100pM；(d)小于约50pM；(e)小于约25pM；或(f)在约10pM和约100pM之间。
30.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，(a)与VIP相比，其
对于PACAP具有更强的亲和力和/或不结合至VIP；或(b)所述抗体或抗原结合片段对PACAP的亲和力比所述抗体或抗原结合片段对VIP的亲和力强至少10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、
30000000倍或更多。
31.如前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗
原结合片段被附接到至少一个效应子部分、化学接头、可检测部分(诸如荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料、化学发光部分或其混合物)；或功能性部分。
32.一种针对根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段产生的
抗独特型抗体，其任选地中和与所述抗独特型抗体结合的所述抗PACAP抗体的一种或多种生物学效应。
33.一种使用如权利要求32所述的抗独特型抗体在受试者中监测所述抗PACAP抗体或
抗原结合片段的体内水平或在受试者中中和所述抗PACAP抗体的体内效应的方法。
34.一种适用于治疗性、预防性或诊断性用途的组合物，其包含治疗、预防或诊断有效量的根据权利要求1-32中任一项所述的至少一种抗PACAP抗体或抗原结合片段或抗独特型抗体。
35.如权利要求34所述的组合物，其适于(a)通过注射、局部、口服、吸入或经皮肤施用；
或(b)皮下、静脉内、肌内、鞘内、颊内、阴道内、经皮肤、腹膜内或肛门施用。
36.如权利要求34所述的组合物，其适于皮下施用或适于静脉内施用。
37.如权利要求34-37中任一项所述的组合物，其还包含药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂或其混合物。
38.如权利要求34-38中任一项所述的组合物，其还包含另一种活性剂，诸如化学疗法
剂、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、细胞因子、抗增殖剂、止吐剂或细胞毒素。
39.如权利要求34-38中任一项所述的组合物，其是冻干的、稳定化的并且/或者被配制用于通过注射施用。
40.一条或多条分离的核酸序列，其编码根据权利要求1-32中任一项所述的抗PACAP抗
体或抗原结合片段或抗独特型抗体。
41.一种或多种载体，其含有如权利要求40所述的一条或多条分离的核酸序列。
42.一种宿主细胞，其包含如权利要求40所述的一条或多条分离的核酸序列或如权利
要求41所述的一种或多种载体。
43.如权利要求42所述的宿主细胞，其为哺乳动物、细菌、真菌、酵母、禽类、两栖动物、植物或昆虫细胞，诸如丝状真菌或酵母，或者为哺乳动物细胞，任选毕赤酵母或CHO细胞。
44.一种表达抗PACAP抗体或抗原结合片段的方法，其包括在为所述抗体或抗原结合片
段的表达提供的条件下培养如权利要求42-43中任一项所述的宿主细胞或表达如权利要求
40所述的核酸的宿主细胞。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述宿主细胞为稳定表达并分泌所述抗体或抗原
结合片段至培养基中的酵母或CHO细胞。
46.一种在受试者中阻断、抑制、阻断或中和与PACAP相关联的一种或多种生物学效应
的方法，所述方法包括向所述受试者施用拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应的治疗或预防有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段。
47.一种在受试者中阻断、抑制或中和与垂体腺苷酸环化酶激活肽(“PACAP”)相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向受试者施用拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应并且基本上不与血管活性肠肽(“VIP”)相互作用(结合)的治疗或预防有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段。
48.一种在受试者中阻断、抑制或中和与垂体腺苷酸环化酶激活肽(“PACAP”)相关联的一种或多种生物学效应(例如血管舒张效应)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其包含以下中的一种或多种：
(a)抑制、阻断或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；
(b)中和或抑制PAC1受体(“PAC1-R”)、1型血管活性肠肽受体(“VPAC1-R”)和/或2型血管活性肠肽受体(“VPAC2-R”)中的至少一种的PACAP激活；
(c)抑制、阻断或中和PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；
(d)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种；
(e)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种；
(f)能够抑制PACAP结合至表达PAC1-R的细胞；
(g)能够抑制PACAP结合至表达VPAC1-R和/或VPAC2-R的细胞；
(h)抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)结合至所述细胞表面；
(i)抑制PACAP介导的此类抗体例如通过GAG结合至所述细胞表面；
(j)抑制PACAP诱导的环磷酸腺苷(“cAMP”)产生；和/或
(k)当向所述受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
49.一种在受试者中阻断、抑制或中和与垂体腺苷酸环化酶激活肽(“PACAP”)相关联或由垂体腺苷酸环化酶激活肽(“PACAP”)引发的血管舒张(例如硬膜动脉的血管舒张)的方法，所述方法包括向受试者施用阻断、抑制或中和与PACAP相关联或由PACAP引发的血管舒张的治疗或预防有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段。
50.一种在受试者中治疗或预防头痛或偏头痛的发病、频率、严重性或持续时间的方
法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的人、人源化或嵌合的抗人垂体腺苷酸环化酶激活多肽(“PACAP”)抗体或抗体片段，其引发以下效应中的一种或多种：
(a)抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；
(b)中和或抑制PAC1受体(“PAC1-R”)、1型血管活性肠肽受体(“VPAC1-R”)和/或2型血管活性肠肽受体(“VPAC2-R”)中的至少一种的PACAP激活；
(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；
(d)中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；(e)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或
VPAC2-R中的至少一种；(f)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种；
(e)能够抑制PACAP结合至表达PAC1-R的细胞；
(f)能够抑制PACAP结合至表达VPAC1-R和/或VPAC2-R的细胞；
(g)抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)结合至所述细胞表面；
(h)抑制PACAP介导的此类抗体例如通过GAG结合至所述细胞表面；
(i)抑制PACAP诱导的环磷酸腺苷(“cAMP”)产生；和/或
(j)当向所述受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述头痛或偏头痛选自先兆偏头痛、无先兆偏头
痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛和紧张性头痛。
52.一种治疗患有与增加的血管舒张、肥大细胞脱颗粒和神经元激活中的至少一种相
关联的急性、发作性或慢性病状或者前述任何病状的组合的人类受试者的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的拮抗性人、人源化或嵌合的抗人垂体腺苷酸环化酶激活多肽(“PACAP”)抗体或抗体片段。
53.一种在受试者中阻断、抑制或中和与垂体腺苷酸环化酶激活肽(“PACAP”)相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应的有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片段。
54.一种在受试者中阻断、抑制或中和与垂体腺苷酸环化酶激活肽(“PACAP”)相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应并且基本上不与血管活性肠肽(“VIP”)相互作用(结合)的有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片段。
55.一种在受试者中阻断、抑制或中和与垂体腺苷酸环化酶激活肽(“PACAP”)相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其(a)抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；(b)中和或抑制PAC1受体(“PAC1-R”)、1型血管活性肠肽受体(“VPAC1-R”)和/或2型血管活性肠肽受体(“VPAC2-R”)中的至少一种的PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；(e)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种；(f)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种；(g)能够抑制PACAP结合至表达PAC1-R的细胞；(h)能够抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)结合至细胞表面；(i)抑制PACAP介导的此类抗体例如通过GAG结合至细胞表面；(j)抑制PACAP诱导的环磷酸腺苷(“cAMP”)产生；并且/或者(k)当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
56.一种在受试者中治疗或预防头痛或偏头痛的发病、频率、严重性或持续时间的方
法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的人、人源化或嵌合的抗人垂体腺苷酸环化酶激活多肽(“PACAP”)抗体或抗原结合片段，其(a)抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；(b)中和或抑制PAC1受体(“PAC1-R”)、1型血管活性肠肽受体(“VPAC1-R”)和/或2型血管活性肠肽受体(“VPAC2-R”)中的至少一种的PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；(e)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种；(f)能够抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种；(g)能够抑制PACAP结合至表达PAC1-R的细胞；
(h)能够抑制PACAP假设通过糖胺聚糖(“GAG”)结合至细胞表面；(i)抑制PACAP介导的此类抗体例如通过GAG结合至细胞表面；(j)抑制PACAP诱导的环磷酸腺苷(“cAMP”)产生；并且/或者(k)当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述头痛或偏头痛选自先兆偏头痛、无先兆偏头
痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛和紧张性头痛。
58.一种治疗患有与增加的血管舒张、肥大细胞脱颗粒和神经元激活中的至少一种相
关联的急性、发作性或慢性病状或者前述任何病状的组合的人类受试者的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的拮抗性人、人源化或嵌合的抗人垂体腺苷酸环化酶激活多肽(“PACAP”)抗体或抗原结合片段。
59.如权利要求46-58中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-31中任一项所
述的抗PACAP抗体或抗原结合片段。
60.如权利要求46-59中任一项所述的方法，其中所述抗PACAP抗体或抗原结合片段结
合至PACAP27和/或PACAP38并且阻断PACAP27和/或PACAP38结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R。
61.如权利要求46-59中任一项所述的方法，其中所述抗PACAP抗体或抗原结合片段结
合至PACAP27和/或PACAP38结合并且阻断PACAP27和/或PACAP38结合至PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一个。
62.如权利要求46-59中任一项所述的方法，其中所述抗PACAP抗体或抗原结合片段结
合至PACAP27和/或PACAP38结合并且阻断PACAP27和/或PACAP38结合至表达PAC1-R的细胞。
63.如权利要求46-62中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段对PACAP的
亲和力比所述抗体或抗原结合片段对VIP的亲和力强至少10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、
30000000倍或更多。
64.如权利要求46-63中任一项所述的方法，其中所述受试者患有：(a)选自由以下组成的组的病状：先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、紧张性头痛、正头痛、热潮红、慢性阵发性半侧颅痛、头部潜在的结构性问题引起的继发性头痛、颈部潜在的结构性问题引起的继发性头痛、颅神经痛、窦性头痛、与鼻窦炎相关联的头痛、过敏诱导的头痛、过敏诱导的偏头痛、三叉神经痛、疱疹后神经痛、幻肢疼痛、纤维肌痛、反射交感性营养不良、疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛、手术后切口疼痛、手术后疼痛、创伤相关疼痛、下背痛、眼痛、牙痛、复杂性区域疼痛综合征、癌症疼痛、原发性或转移性骨癌疼痛、骨折疼痛、骨质疏松性骨折疼痛、烧伤引起的疼痛、痛风关节疼痛、与镰状细胞危象相关联的疼痛、与颞下颌关节紊乱相关联的疼痛、肝硬化、肝炎、神经源性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、内脏痛、月经痛、卵巢痛、骨关节炎疼痛、类风湿性关节炎疼痛、糖尿病性神经病、坐骨神经痛、消化不良、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩氏病、回肠炎、溃疡性结肠炎、肾绞痛、痛经、膀胱炎、间质性膀胱炎、月经期、分娩、绝经、胰腺炎、精神分裂症、抑郁症、创伤后应激障碍(“PTSD”)、焦虑症、自身免疫性糖尿病、舍格伦氏综合征、多发性硬化症、膀胱过度活动症、支气管高反应性、哮喘、中风、支气管炎、支气管扩张、肺气肿、慢性阻塞性肺病(“COPD”)、炎性皮炎、腺组织中的腺癌、器官胚胎组织中的胚细胞瘤、上皮组织中的癌、形成血细胞的组织中的白血病、淋巴组织中的淋巴瘤、骨髓中的骨髓瘤、结缔组织或支持组织中的肉瘤、肾上腺癌、AIDS相关淋巴瘤、贫血、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、化学疗法、结肠癌、血细胞减少、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头癌、颈癌、肝胆癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、神经系统肿瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、骨髓癌、多发性骨髓瘤、转移到骨的肿瘤、浸润神经和空腔脏器的肿瘤、神经结构附近的肿瘤、寻常痤疮、特应性皮炎、荨麻疹、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和红斑痤疮、内皮功能障碍、雷诺氏综合征、冠心病(“CHD”)、冠状动脉疾病(“CAD”)、心力衰竭、外周动脉疾病(“PAD”)、糖尿病、肺动脉高压(“PH”)、结缔组织病、变应性皮炎、银屑病、瘙痒、神经源性皮肤发红、红斑、结节病、休克、败血症、阿片戒断综合征、吗啡耐受和癫痫；(b)与畏光相关联的选自由以下组成的组的眼部病症：全色盲、无虹膜、由抗胆碱能药物引起的畏光、无晶状体、牛眼、白内障、视锥细胞营养不良、眼睛先天性异常、病毒性结膜炎、角膜磨损、角膜营养不良、角膜溃疡、角膜上皮破裂、晶状体异位、眼内炎、由疾病引起的眼创伤、由损伤引起的眼创伤、由感染引起的眼创伤、睑板腺囊肿、巩膜外层炎、青光眼、圆锥角膜、视神经发育不全、水眼、先天性青光眼性虹膜炎、视神经炎、色素播散综合征、瞳孔扩大、视网膜脱落、角膜瘢痕形成、巩膜瘢痕形成和葡萄膜炎；(c)与畏光相关联的选自由以下组成的组的神经系统相关或神经学病状：自闭症谱系障碍、奇阿畸形、诵读困难、脑炎、脑膜炎、蛛网膜下腔出血、颅后窝肿瘤、强直性脊柱炎、白化病、核黄素缺乏症、苯二氮 类药物、化学疗法、基孔肯雅病、胱氨酸病、埃勒斯-当洛斯综合征、宿醉、流感、感染性单核细胞增多症、镁缺乏症、汞中毒、偏头痛、狂犬病和酪氨酸血症II型；或者(d)畏光相关联的选自由以下组成的组的病症：先兆偏头痛、无先兆偏头痛、虹膜炎、葡萄膜炎、脑膜炎、抑郁症、躁郁症、丛集性头痛或另一种三叉神经自主性头痛(“TAC”)或眼睑痉挛、抑郁症、广场恐怖症和躁郁症。
65.如权利要求46-63中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的组
的病状：偏头痛、头痛以及疼痛相关联的疾病或病状。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述头痛或偏头痛选自由以下组成的组：先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛和紧张性头痛。
67.如权利要求46-66中任一项所述的方法，其中所述抗体为任选地根据权利要求1-31
中任一项所述的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片段。
68.如权利要求46-67中任一项所述的方法，其中由所述施用的抗体结合的所述表位通
过丙氨酸扫描来鉴定。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述抗PACAP抗体或抗原结合片段包含选自Ab10或
Ab20的抗PACAP抗体的相同CDR。
70.如权利要求46-69中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分别施用或共同施用
另一种药剂，诸如(a)化疗剂、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、细胞因子、抗增殖剂、止吐剂或细胞毒素；(b)止痛剂；(c)非类固醇抗炎药(“NSAID”)、阿片类止痛剂、另一种抗体或非抗体生物制剂，任选抗NGF抗体或抗原结合片段；或(d)选自环氧合酶1和/或环氧合酶2抑制剂的NSAID。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述另一种药剂为抗降钙素基因相关肽(“CGRP”)抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述另一种药剂为(a)选自由以下组成的组的
NSAID：(1)丙酸衍生物，包括布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯芬酸和酮洛芬；(2)乙酸衍生物，包括托美丁和舒林酸；(3)芬那酸衍生物，包括甲芬那酸和甲氯芬那酸；(4)联苯羧酸衍生物，包括二氟尼柳和氟苯柳；和(5)昔康类，包括吡罗昔康、舒多昔康和伊索昔康；(b)选自由以下组成的组的阿片类止痛剂：可待因、二氢可待因、二乙酰吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、左啡诺、羟吗啡酮、阿芬太尼、丁丙诺啡、布托啡诺、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、纳布啡、丙氧芬、喷他佐辛和其药学上可接受的盐；(c)吗啡或吗啡衍生物或其药学上可接受的盐。
73.如权利要求72所述的方法，其中与单独施用所述阿片类止痛剂或者所述抗PACAP抗
体或抗原结合片段相比，组合施用所述阿片类止痛剂和所述抗PACAP抗体或抗原结合片段增加了止痛效果。
74.如权利要求46-73中任一项所述的方法，其中所述受试者已预先接受了抗CGRP抗体
或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段，并且任选地所述受试者为对抗CGRP抗体和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段治疗不充分应答的偏头痛患者，或者所述受试者已引发对抗CGRP抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段的免疫应答。
75.根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗体片段或方法，其抑制PACAP
对血管舒张、cAMP产生、导致Ca++和PLD水平降低的PLC或腺苷酸环化酶活性的影响。
76.根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗体片段或方法，其抑制PACAP
对其结合至PAC1-R、VPAC1-R或VPAC2-R中的任一个或全部的影响。
77.根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗体片段或方法，其抑制PACAP
对神经发育、神经保护、神经调节、神经源性炎症或伤害感受的影响。
78.根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或抗体片段或方法，其调节PACAP
例如通过与至少一种糖胺聚糖(“GAG”)诸如肝素、软骨素、角蛋白和透明质酸的相互作用与所述细胞表面的相互作用。
79.如权利要求78所述的抗体或抗体片段，其阻断或抑制PACAP38和/或PACAP27的非受
体依赖性细胞摄取。
80.如权利要求78-79中任一项所述的抗体或抗体片段，其抑制或阻断细胞对PACAP38
和/或PACAP27的GAG依赖性摄取。
81.一种疗法或预防的方法，所述方法包括施用根据前述权利要求中任一项所述的抗
PACAP抗体或抗体片段。
82.一种用于人类疗法的组合物，其含有根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗
体或抗体片段。
83.如权利要求82所述的组合物，其含有另一种活性剂，诸如(a)化疗剂、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、细胞因子、抗增殖剂、止吐剂或细胞毒素；(b)止痛剂；(c)非类固醇抗炎药(“NSAID”)、阿片类止痛剂、另一种抗体或非抗体生物制剂；(d)抗NGF抗体或抗体片段；(e)抗降钙素基因相关肽(“CGRP”)抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段；(f)选自环氧合酶1和/或环氧合酶2抑制剂的NSAID；(g)选自由以下组成的组的NSAID：(1)丙酸衍生物，包括布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯芬酸和酮洛芬；(2)乙酸衍生物，包括托美丁和舒林酸；(3)芬那酸衍生物，包括甲芬那酸和甲氯芬那酸；(4)联苯羧酸衍生物，包括二氟尼柳和氟苯柳；和(5)昔康类，包括吡罗昔康、舒多昔康和伊索昔康；(h)选自由以下组成的组的阿片类止痛剂：可待因、二氢可待因、二乙酰吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、左啡诺、羟吗啡酮、阿芬太尼、丁丙诺啡、布托啡诺、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、纳布啡、丙氧芬、喷他佐辛和其药学上可接受的盐；或者(i)吗啡或吗啡衍生物或其药学上可接受的盐。
84.如权利要求83所述的组合物，其中与单独施用所述阿片类止痛剂或者所述抗PACAP
抗体或抗原结合片段相比，所述阿片类止痛剂和所述抗PACAP抗体或抗原结合片段增加了止痛效果。
85.根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或片段或组合物，其中所述抗
PACAP抗体或片段以及与其组合或组合施用的另一种活性剂引发对治疗或预防PACAP相关联的效应例如偏头痛或疼痛的协同或累加影响累加效应。
86.根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或片段或组合物在疗法或诊断例
如偏头痛治疗或预防中的用途。
87.根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或片段或组合物在治疗以下的一
种或多种中的用途：热潮红、先兆偏头痛或无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛或紧张性头痛。
88.根据前述权利要求中任一项所述的抗PACAP抗体或片段或组合物在缓解头痛、控制
头痛、降低头痛的发病率或延迟头痛发展或进展中的用途，所述头痛例如先兆偏头痛或无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛或紧张性头痛。
89.如权利要求88所述的用途，其用于已预先接受或正在接受抗CGRP抗体或抗体片段
和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段的受试者中，并且任选地所述受试者为对抗CGRP抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段治疗不充分应答的偏头痛患者，或者所述受试者已预先接受至少一种抗CGRP抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段的施用并且已引发对抗CGRP抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段的免疫应答。
抗PACAP抗体及其用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2015年4月16日提交的美国临时申请序列号 62/148,550、2015年4月16日提交的美国临时申请序列号62/148,557、 2015年4月16日提交的美国临时申请序列号
62/148,562、2015年4 月16日提交的美国临时申请序列号62/148,596、2015年4月16日提交的美国临时申请序列号62/148,643、2015年4月16日提交的美国临时申请序列号62/148,
583、2015年4月16日提交的美国临时申请序列号62/148,640的权益，所述临时申请各自以引用的方式在此整体并入。
62/148,562、2015年4 月16日提交的美国临时申请序列号62/148,596、2015年4月16日提交的美国临时申请序列号62/148,643、2015年4月16日提交的美国临时申请序列号62/148,
583、2015年4月16日提交的美国临时申请序列号62/148,640的权益，所述临时申请各自以引用的方式在此整体并入。
[0003] 序列公开
[0004] 本申请包括作为其公开内容的一部分的名称为“43257o5809.txt”的电子序列表文本文件，其大小为165,209字节并于2016年2月29 日创建，所述电子序列表文本文件在此整体并入。发明领域
[0005] 本发明总体涉及抗体及其抗原结合片段，优选人源化、嵌合和人的抗体及其抗原结合片段，以及含有此类抗体及其抗原结合片段的组合物，其中此类抗体及其抗原结合片段特异性结合至垂体腺苷酸环化酶激活多肽(“PACAP”)，以及所述抗体、抗原结合片段及其组合物的治疗和诊断用途。
[0006] 背景
[0007] 垂体腺苷酸环化酶激活多肽(“PACAP”)是促胰液素/血管活性肠肽(“VIP”)/生长激素释放激素(“GHRH”)家族的成员。PACAP是多功能血管舒张肽，其以两种α-酰胺化的活性形式存在，一种具有38个氨基酸(PACAP38；SEQ ID NO:1241)，并且另一种具有27个氨基酸 (PACAP27；SEQ ID NO:1242)。两种肽具有相同的N末端27个氨基酸并且由相同的前体蛋白preproPACAP合成(参见Moody等，Curr. Opin.Endocrinol.Diabetes Obes.,18(1):61-67 2011)。PACAP38是更普遍的活性形式，代表哺乳动物组织中高达90％的PACAP形式(参见 Kaiser和Russo,Neuropeptides,47:451-461 2013)。PACAP38的序列在所有哺乳动物中是相同的，并且与禽类和两栖类的直向同源物只有一个氨基酸不同(参见Vaudry等,
Pharmacol.Rev.,52:269-324 2000)。促胰液素/VIP/GHRH家族包括哺乳动物肽组氨酸甲硫氨酸酰胺 (“PHM”)、促胰液素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(“GLP1”)、胰高血糖素样肽-
2(“GLP2”)、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(“GIP”)和生长激素释放因子(“GRF”)。PACAP27在氨基酸水平与VIP具有68％的序列同一性(参见Vaudry等2000)。
Pharmacol.Rev.,52:269-324 2000)。促胰液素/VIP/GHRH家族包括哺乳动物肽组氨酸甲硫氨酸酰胺 (“PHM”)、促胰液素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(“GLP1”)、胰高血糖素样肽-
2(“GLP2”)、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(“GIP”)和生长激素释放因子(“GRF”)。PACAP27在氨基酸水平与VIP具有68％的序列同一性(参见Vaudry等2000)。
[0008] PACAP广泛分布在脑和外周器官，例如内分泌系统、性腺、交感神经元、呼吸系统、胃肠道、心血管系统和泌尿生殖道中(参见Schytz 等，Neurotherapeutics,7:191-196 2010)。具体地，PACAP在整个神经系统中表达，包括在三叉神经血管系统、三叉神经节、脊髓、下丘脑和垂体中的存在。PACAP在神经发育、神经保护、神经调节、神经源性炎症和伤害感受中具有多重作用(参见Kaiser和Russo 2013)。
[0009] 与其广泛分布一致，PACAP发挥多效性作用，其包括调节神经递质释放、血管舒张、支气管舒张和激活肠蠕动、增加胰岛素和组胺分泌以及刺激细胞增殖和/或分化。已表明PACAP在许多组织中作为激素、神经激素、神经递质和营养因子起作用(Vaudry等， Pharmacological Rev.,52(2):269-324,2000)。
[0010] PACAP的生物学效应通过三种不同的G蛋白偶联受体介导： PAC1-R、1型血管活性肠肽受体(“VPAC1-R”)和2型血管活性肠肽受体(“VPAC2-R”)。这些受体在不同组织中表达。PAC1-R在神经系统(例如嗅球、丘脑、下丘脑、小脑和脊髓背角)、垂体和肾上腺中特别丰富。
相比之下，VPAC1-R和VPAC2-R主要在肺、肝和睾丸中表达，尽管它们也在其它组织中被检测到。已在神经系统(例如大脑皮质和海马体)、肺平滑肌细胞、肝平滑肌细胞、肠平滑肌细胞、巨核细胞和血小板中检测到VPAC1-R表达。VPAC1-R与受体相关膜蛋白 (“RAMP”，特别是RAMP2)相缔合(参见Christopoulos等，J.Biol. Chem.,278:3293-3297,2002)。VPAC2-R表达谱包括神经(例如丘脑、海马体、脑干和背根神经节(“DRG”))、心血管系统、胃肠系统、胰腺和生殖系统(参见Usdin等，Endocrin.,135:2662-2680,1994；Sheward 等，Neurosci.,
67:409-418,1995)。
相比之下，VPAC1-R和VPAC2-R主要在肺、肝和睾丸中表达，尽管它们也在其它组织中被检测到。已在神经系统(例如大脑皮质和海马体)、肺平滑肌细胞、肝平滑肌细胞、肠平滑肌细胞、巨核细胞和血小板中检测到VPAC1-R表达。VPAC1-R与受体相关膜蛋白 (“RAMP”，特别是RAMP2)相缔合(参见Christopoulos等，J.Biol. Chem.,278:3293-3297,2002)。VPAC2-R表达谱包括神经(例如丘脑、海马体、脑干和背根神经节(“DRG”))、心血管系统、胃肠系统、胰腺和生殖系统(参见Usdin等，Endocrin.,135:2662-2680,1994；Sheward 等，Neurosci.,
67:409-418,1995)。
[0011] PAC1-R对PACAP38和PACAP27具有选择性。具体地，PAC1-R 以比VIP大100-1000倍的亲和力结合至PACAP，即对于 PACAP27/PACAP38的KD～0.5nM对比对于VIP的KD～500nM。相反，VPAC1-R和VPAC2-R对于PACAP和VIP具有相等的亲和力(KD～1nM)(参见Schytz等2010)。
[0012] 在激活后，这些受体都能够导致环磷酸腺苷(“cAMP”)的下游产生和/或磷脂酶C(“PLC”)的激活和/或磷脂酶D(“PLD”)的调节。具体地， PAC1-R偶联至通过cAMP和Ca2+作用的双重信号转导途径，而 VPAC1-R和VPAC2-R主要偶联至腺苷酸环化酶。PAC1-R偶联至Gs蛋白，所述Gs蛋白激活腺苷酸环化酶以形成cAMP，其继而激活蛋白激酶A。PAP1-R还偶联至Gq并且从而激活PLC，所述PLC产生磷酸肌醇，所述磷酸肌醇增加胞质钙从细胞内钙储存中的释放。有一些证据表明PAC1-R在PLD激活中的作用(参见McCulloch等，Ann.N. Y.Acad.Sci.，921:175-185，2000)。另一种PACAP信号传导途径通过非选择性阳离子通道的激活导致细胞内钠水平升高(参见Roy等， American Journal of Physiology:
Regulatory,Integrative and Comparative Physiology,304(12):R1070-R1084,2013)。
Regulatory,Integrative and Comparative Physiology,304(12):R1070-R1084,2013)。
[0013] 假设PACAP在多种疾病和病症(包括但不限于偏头痛、头痛和疼痛)中发挥作用，尽管PACAP的这种作用尚未得到临床证实。认为偏头痛具有神经血管组分。偏头痛影响到美国约10％的成年人口，并且通常伴有严重的头痛。大约20-30％的偏头痛患者经历先兆，包括在事件发生之前和/或伴随事件的局灶性神经学现象。PACAP在偏头痛中的作用已被若干观察结果表明：(1)与发作间水平相比，人类的 PACAP的血浆水平在偏头痛发作(猝发)期间升高(参见Tuka等， Cephalalgia,33(13):1085-1095 2013)；(2)在健康受试者中输注 PACAP38触发头痛，并且在偏头痛患者中头痛之后是偏头痛样发作 (分别参见Schytz等，Brain,132:16-25,2009；和Amin等，Brain, 137:779-794,2014)；(3)PACAP诱导的血管舒张可能在神经源性炎症中发挥作用(参见Kaiser和Russo,Neuropeptides,47:451-461,
2013)； (4)PACAP诱导的偏头痛与畏光、高声恐怖、恶心和对曲坦类反应相关联(参见Amin等，Brain,32:140-149 2012)。也已证明PACAP诱导血管舒张、畏光以及肥大细胞脱颗粒和神经元激活(参见Markovics 等，Neurobiology of Disease,45:633-644 2012；Baun等，Cephalalgia, 32(4):337-345 2012；Chan等，Pharmacology&Therapeutics, 129:332-351
2011)。
2013)； (4)PACAP诱导的偏头痛与畏光、高声恐怖、恶心和对曲坦类反应相关联(参见Amin等，Brain,32:140-149 2012)。也已证明PACAP诱导血管舒张、畏光以及肥大细胞脱颗粒和神经元激活(参见Markovics 等，Neurobiology of Disease,45:633-644 2012；Baun等，Cephalalgia, 32(4):337-345 2012；Chan等，Pharmacology&Therapeutics, 129:332-351
2011)。
[0014] 偏头痛的一种有效治疗是施用曲坦类，其是基于色胺的药物的家族，包括舒马曲坦和利扎曲坦。这个家族的成员对多种血清素受体(包括5-HT1B、5-HT1D和5-HT1F)具有亲和力。这种药物家族的成员选择性地收缩脑血管，但也会对冠状血管造成血管收缩效应(参见Durham, New Eng.J.Med.,350(11):1073-75 2004)。在确定的心脏病患者中在施用后存在冠状动脉痉挛的理论风险，并且在极少数情况下服用曲坦类类之后可能发生心脏事件。因此，它们对于一些冠状动脉血管疾病患者是禁忌的。
[0015] 相似地，常常可通过施用某些麻醉剂或非类固醇抗炎药 (“NSAID”)来解决疼痛。然而，施用这些治疗常常具有负面后果。 NSAID有可能会引起肾衰竭、肠道出血、以及肝功能异常。麻醉剂有可能会引起恶心、呕吐、心理功能受损以及成瘾。因此，希望鉴定出用于疼痛的替代治疗以便避免这些负面后果中的某些。
[0016] PACAP也可能涉及偏头痛、头痛和疼痛以外的疾病和病症。例如，PACAP可能与焦虑症(WO 2012/106407)；血小板减少症(WO 2004/062684)；和炎性皮肤病(WO 2010/007175)相关或甚至在其中发挥因果作用。PACAP和PAC1-R多态性与女性的创伤后应激综合征 (“PTSD”)、重性抑郁症和广泛性焦虑症相关联，表明PACAP在这些病状中的作用。此外，支持PACAP在血小板减少症中的作用，三体性18患者具有过量的PACAP并表现出有缺陷的巨核细胞成熟(参见 Schytz等2010；和Moody等，Curr.Opin.Endocrinol.Diabetes Obes., 18(1):61-67,2011)。
[0017] 此外，PACAP和其它神经肽(诸如降钙素基因相关肽(“CGRP”)、物质P、神经激肽A、缓激肽和内皮素-1)在下尿路(“LUT”)中表达(参见Arms和Vizzard,Handbook Exp.Pharmacol.,202:395-423,2011)，并且据报道可能在LUT功能异常和尿路病症(诸如尿路感染(“UTI”)、异常排尿、尿急、夜尿、尿失禁、膀胱过度活动症以及与此类病状相关联的疼痛)中起作用。
[0018] PACAP和PACAP受体也被认为能够调节炎性和神经性疼痛，并且参与前伤害感受(pronociception)和抗伤害感受(antinociception) 两者(参见Davis-Taber等，J.Pain,9(5):449-56 2008)。还已报道，脊髓脱敏和诱导神经性疼痛需要PACAP(参见Mabuchi等，J.Neurosci., 24(33):7283-91,2004)。此外，据报道吗啡戒断行为在PACAP受体缺陷小鼠中被修改，这进一步表明PACAP在吗啡戒断抗焦虑应答中的效应(参见Martin等,Mol.Brain Res.,110(1):109-18,2003)。
[0019] 发明简述
[0020] 在一方面，本发明总体涉及抗PACAP抗体及其抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体及其抗原结合片段，其拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应。在某些实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段抑制或中和由 PACAP引发的至少一种生物学效应，所述PACAP包括PACAP27和 /或PACAP38，如下文所述。在其它实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的PACAP激活；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R 中的每一种的PACAP激活；并且/或者中和或抑制PAC1-R的PACAP 激活；并且/或者抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)与细胞表面的结合。在又其它实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段能够抑制PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的结合；能够抑制PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种的结合；或者能够抑制PACAP与PAC1-R的结合。在其它实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段抑制PACAP诱导的 cAMP产生。在其它实施方案中，当向受试者(例如人)施用时，单独的或组合的抗PACAP抗体及其抗原结合片段减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。在相关实施方案中，人或人源化抗PACAP抗体及其抗原结合片段适用于治疗患有与增加的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活相关联的急性、发作性或慢性病状的人类受试者。
[0021] 在另一个实施方案中，所述方法提供了选自由以下组成的组的哺乳动物的真核宿主细胞：幼仓鼠肾(“BHK”)细胞；中国仓鼠卵巢 (“CHO”)细胞；小鼠塞尔托利细胞(“TM4”细胞)；非洲绿猴肾细胞 (“VERO-76”细胞)；人宫颈癌(“HELA”)细胞；犬肾细胞(“MDCK”)；布法罗大鼠肝脏(“BRL”)细胞；人肺细胞；人肝(“Hep G2”)细胞；小鼠乳腺肿瘤(“MMT”)细胞；TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。优选地，哺乳动物宿主细胞为CHO细胞。更优选地，哺乳动物宿主细胞为CHO K1细胞。
[0022] 在一个优选的实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段基本上不与VIP相互作用(结合)。本发明还包括此类抗PACAP抗体及其抗原结合片段的治疗用途(作为单一疗法或组合疗法)和诊断用途。
[0023] 更具体地，根据本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段可包括人、人源化和嵌合的抗体及其片段，以及scFv、骆驼抗体、鲨鱼抗体、纳米抗体、免疫球蛋白新抗原受体(“IgNAR”)、片段抗原结合 (“Fab”)片段、Fab'片段、MetMab样抗体、双特异性抗体、单价抗体片段和F(ab′)2片段。此外，根据本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以基本上或完全缺乏N-糖基化和/或O-糖基化。在一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包含人恒定结构域，例如 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体或其片段的恒定结构域。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可包括已被修饰以改变 (增强或损害)效应子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中的至少一个的Fc区。例如，Fc区可含有改变或消除N-糖基化和/或O-糖基化的一个或多个突变。
[0024] 在一些实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段以以下 KD与PACAP结合：小于或等于5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、 5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、 10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M或10-13M，例如如通过ELISA、生物层干涉测量(“BLI”)、动力学排除测定 ( Sapidyne Instruments，Boise，ID)或SPR
在例如25℃或 37℃下所确定的。优选地，人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体及其抗原结合片段以以下KD与PACAP结合：小于或等于5x10-10M、10-10 M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M或10-12M。
优选地，人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体及其抗原结合片段以以下KD与PACAP结合：小于约
100nM、小于约40nM、小于约1nM、小于约100pM、小于约50pM或小于约25pM。可替代地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段以处于约10pM与约100pM之间的KD与PACAP结合。在另一个实施方案中，人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体及其抗原结合片段以以下解离速率(koff)与PACAP结合：小于或等于5x10-4s-1、 10-4s-1、5x10-5s-1或10-5s-1。
在例如25℃或 37℃下所确定的。优选地，人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体及其抗原结合片段以以下KD与PACAP结合：小于或等于5x10-10M、10-10 M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M或10-12M。
优选地，人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体及其抗原结合片段以以下KD与PACAP结合：小于约
100nM、小于约40nM、小于约1nM、小于约100pM、小于约50pM或小于约25pM。可替代地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段以处于约10pM与约100pM之间的KD与PACAP结合。在另一个实施方案中，人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体及其抗原结合片段以以下解离速率(koff)与PACAP结合：小于或等于5x10-4s-1、 10-4s-1、5x10-5s-1或10-5s-1。
[0025] 在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段将特异性结合线性或构象表位并且/或者与选自由Ab10和Ab20组成的组的抗PACAP抗体竞争结合人PACAP上的相同的线性或构象表位(下文公开了这些抗PACAP抗体的可变区和恒定区的特定氨基酸序列，以及编码此类可变区和恒定区的核酸，以及使用丙氨酸扫描方法确定的在此结合的表位)。具体地，本发明包括抗PACAP抗体及其抗原结合片段，其与选自由Ab10和Ab20组成的组的抗PACAP抗体特异性结合人PACAP上的相同的线性或构象表位。如下文所公开的，在示例性实施方案中，使用丙氨酸扫描突变策略确定所述表位。
[0026] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其与Ab10或Ab20中的任一个或前述任一个的结合片段结合相同的表位。
[0027] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括特异性结合人PACAP上的表位或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其中所述表位选自由以下组成的组：
[0028] a.人PACAP的残基19、22、23和27中的至少一个；
[0029] b.人PACAP的残基19、22、23、24和27中的至少一个；
[0030] c.(a)-(b)中任一项的残基中的至少两个；
[0031] d.(a)-(b)中任一项的残基中的至少三个；
[0032] e.(a)-(b)中任一项的残基中的至少四个；
[0033] f.(b)中的所有五个残基。
[0034] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括特异性结合人PACAP上的表位或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，所述表位包括人 PACAP的残基19、22、23和27中的一个或多个。
[0035] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括特异性结合人PACAP上的表位或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，所述表位存在于人野生型PACAP38中，但不存在于人野生型人PACAP27中。
[0036] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括特异性结合人PACAP上的表位或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其中所述表位通过例如如实施例12所公开的丙氨酸扫描或另一种本领域公认的方法来鉴定。
[0037] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括特异性结合人PACAP上的表位或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其中所述表位由以上(a)或(b)的残基组成。
[0038] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括特异性结合人PACAP上的表位或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，所述表位存在于人野生型PACAP38和人野生型人PACAP27中。
[0039] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括与人野生型人PACAP38特异性结合但不与人野生型人PACAP27结合或明显结合的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段。
[0040] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其对于人PACAP38的 KD比所述抗体或抗体片段对人PACAP27的KD低(强)至少10倍、100 倍、1,000倍、10,000倍或100,000倍。
[0041] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括不与人血管活性肠肽(“VIP”)结合或明显结合的人、人源化或嵌合的抗 PACAP抗体或抗体片段。
[0042] 在又一实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包括人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其对于人PACAP的KD比所述抗体或抗体片段对人VIP的KD小(弱)至少10、100、1,000、 10,000或100,000倍。
[0043] 在一些实施方案中，本发明提供抗PACAP抗体及其抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体及其抗原结合片段，其包含选自由Ab10和Ab20组成的组的抗PACAP抗体的至少2个互补决定区(“CDR”)、或至少3个CDR、或至少4个CDR、或至少5 个CDR或所有6个CDR。在不存在所有6个CDR的情况下，优选至少存在VH CDR3和VL CDR3。在示例性实施方案中，抗体及其抗原结合片段包含Ab10或Ab20之一的可变重链(“VH”)和/或可变轻链 (“VL”)。
[0044] 在一个具体的实施方案中，根据本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，并且包含(a)可变重链，其包含由SEQ ID NO:404组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:406组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:408组成的 CDR3序列；和/或(b)可变轻链，其包含由SEQ ID NO:424组成的 CDR1序列；由SEQ ID NO:426组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO: 428组成的CDR3序列。可替代地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)可变重链，其包含与SEQ ID NO:402具有至少80％、 85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或(b)可变轻链，其包含与SEQ ID NO:422具有至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包含(a)具有 SEQ ID NO:402的氨基酸序列的可变重链和/或(b)具有SEQ ID NO: 422的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:401的氨基酸序列的重链和/或 (b)具有SEQ ID NO:421的氨基酸序列的轻链。
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或(b)可变轻链，其包含与SEQ ID NO:422具有至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包含(a)具有 SEQ ID NO:402的氨基酸序列的可变重链和/或(b)具有SEQ ID NO: 422的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:401的氨基酸序列的重链和/或 (b)具有SEQ ID NO:421的氨基酸序列的轻链。
[0045] 在另一个具体的实施方案中，根据本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，并且包含(a)可变重链，其包含由SEQ ID NO:444组成的CDR1 序列；由SEQ ID NO:446组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:448 组成的CDR3序列；和/或(b)可变轻链，其包含由SEQ ID NO:464组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:466组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:468组成的CDR3序列。可替代地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)可变重链，其包含与SEQ ID NO:442具有至少 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或(b)可变轻链，其包含与SEQ ID NO:462具有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段并且包含(a) 具有SEQ ID NO:
442的氨基酸序列的可变重链和/或(b)具有SEQ ID NO:462的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:441的氨基酸序列的重链和/或(b)具有SEQ ID NO:461的氨基酸序列的轻链。
442的氨基酸序列的可变重链和/或(b)具有SEQ ID NO:462的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:441的氨基酸序列的重链和/或(b)具有SEQ ID NO:461的氨基酸序列的轻链。
[0046] 此外，在一些实施方案中，抗PACAP抗体及抗原结合片段可包括通过诱变(例如亲和力成熟)进行修饰以改变一种或多种性质(诸如结合亲和力或免疫原性)的任何公开抗体的序列变体。
[0047] 在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段被直接或间接附接到另一个部分，诸如可检测标记或治疗剂。
[0048] 在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；中和或抑制PAC1-R、 VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的PACAP激活；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；能够抑制PACAP与PAC1-R、 VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的结合；能够抑制PACAP与 PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种的结合；或者能够抑制PACAP与PAC1-R的结合；并且/或者抑制PACAP例如通过GAG 与细胞表面的结合；抑制PACAP诱导的cAMP产生；并且/或者当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
[0049] 在另一个实施方案中，人或人源化抗PACAP抗体及其抗原结合片段适用于治疗患有与增加的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/ 或神经元激活相关联的急性、发作性或慢性病状的人类受试者。
[0050] 在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段基本上不与VIP相互作用(即结合)。优选地，与VIP相比，抗PACAP抗体及其抗原结合片段对PACAP具有更强的亲和力，即尽管存在一些交叉反应性，但与VIP相比，所述抗体优先与PACAP结合。例如，所述抗体及其抗原结合片段对PACAP的亲和力比所述抗体及其抗原结合片段对VIP的亲和力强至少10倍、30倍、100倍、300倍、1000 倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000 倍、3000000倍、10000000倍、30000000倍或更强(例如，所述抗体或片段用于结合人PACAP的KD比用于结合VIP的KD低10倍、30 倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000 倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍或30000000 倍)。
[0051] 在一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段被附接到至少一个效应子部分，例如其包含化学接头。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段被附接到一个或多个可检测部分，例如其包含荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料、化学发光部分或其混合物。
[0052] 在一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段被附接到一个或多个功能性部分。
[0053] 本发明还预期针对如上所述的抗PACAP抗体及其抗原结合片段产生的抗体，例如抗独特型抗体。此外，本发明提供使用抗独特型抗体在受试者中监测所述抗PACAP抗体及其抗原结合片段的体内水平或者在施用所述抗PACAP抗体或其抗原结合片段的受试者中中和所述抗PACAP抗体的方法。
[0054] 此外，本发明包括适用于治疗、预防或诊断用途的组合物，其包含治疗、预防或诊断有效量的至少一种如本文所述的抗PACAP抗体或抗原结合片段。具体地，本文提供了含有用于治疗或预防偏头痛或其它头痛适应症的本发明的抗PACAP抗体或其结合片段的组合物和剂型。本文还提供了含有用于治疗或预防畏光的本发明的抗PACAP 抗体或其结合片段的剂型。所述组合物可适用于皮下施用、肌内施用和/或静脉内施用。所述组合物可以是冻干的。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂或其混合物。
[0055] 另外，在一些实施方案中，所述组合物还包含另一种活性剂，例如化疗剂、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、细胞因子、抗增殖剂和止吐剂。优选地，所述另一治疗剂为止痛剂，例如NSAID、阿片类止痛剂、抗体(例如，抗人神经生长因子(“NGF”)抗体或抗体片段；或抗人CGRP或抗人CGRP受体抗体或抗体片段)；或非抗体生物制剂，诸如NGF或CGRP多肽片段或缀合物；或 (肉毒杆菌毒素)。与本发明的抗PACAP抗体组合使用的合适的NSAID包括但不限于环氧合酶1和/或环氧合酶2抑制剂；丙酸衍生物，包括布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯芬酸和酮洛芬；乙酸衍生物，包括托美丁和舒林酸；芬那酸衍生物，包括甲芬那酸和甲氯芬那酸；联苯羧酸衍生物，包括二氟尼柳和氟苯柳；和昔康类，包括吡罗昔康、舒多昔康和伊索昔康。与本发明的抗PACAP抗体组合使用的合适的阿片类止痛剂包括例如可待因、二氢可待因、吗啡或吗啡衍生物或其药学上可接受的盐、二乙酰吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、左啡诺、羟吗啡酮、阿芬太尼、丁丙诺啡、布托啡诺、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、纳布啡、丙氧芬和喷他佐辛、或其药学上可接受的盐。阿片类止痛剂和抗 PACAP抗体或其抗原结合片段的组合施用可增加由此引发的止痛效果。
[0056] 本发明还预期了编码本文所述抗PACAP抗体或抗原结合片段的分离的核酸序列，以及含有这些分离的核酸序列的载体。
[0057] 另外，本发明提供了包含上文所述的这些分离的核酸序列或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可为选自由以下组成的组的哺乳动物的真核宿主细胞：幼仓鼠肾(“BHK”)细胞；中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞；小鼠塞尔托利细胞(“TM4”细胞)；非洲绿猴肾细胞(“VERO-76”细胞)；人宫颈癌(“HELA”)细胞；犬肾细胞(“MDCK”)；布法罗大鼠肝脏 (“BRL”)细胞；人肺细胞；人肝(“Hep G2”)细胞；小鼠乳腺肿瘤(“MMT”) 细胞；TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。优选地，哺乳动物宿主细胞为CHO细胞。更优选地，哺乳动物宿主细胞为CHO K1细胞。宿主细胞可为原核细胞(即细菌细胞)或真核细胞(包括哺乳动物、真菌、酵母、禽类或昆虫细胞)。在一个实施方案中，所述宿主细胞是丝状真菌或酵母细胞。优选地，所述酵母物种属于毕赤酵母属 (Pichia)。最优选地，毕赤酵母属的物种选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)或多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)(安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))。
[0058] 本发明还提供了表达抗PACAP抗体及其抗原结合片段(通常为人、人源化或嵌合的抗体及其抗原结合片段)的方法，所述方法包括在为所述抗体或其抗原结合片段的表达提供的条件下培养本文所述的宿主细胞。所述宿主细胞可以是细胞培养物，诸如稳定表达所述抗体或其抗原结合片段且以至少10-25mg/升将所述抗体或其抗原结合片段分泌至培养基中的中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞或多倍体酵母培养物。多倍体酵母可通过以下方法制成，所述方法包括：(i)将至少一种含有可操作地连接到启动子和信号序列的编码所述抗体的一个或多个异源多核苷酸的表达载体引入到单倍体酵母细胞中；(ii)通过接合或原生质球融合由所述第一和/或第二单倍体酵母细胞产生多倍体酵母；(iii)选择稳定表达所述抗体的多倍体酵母细胞；和(iv)由所述稳定表达所述抗体的多倍体酵母细胞在培养基中产生稳定的多倍体酵母培养物。优选地，所述酵母物种属于毕赤酵母属。
[0059] 在其它实施方案中，哺乳动物细胞培养物可通过以下方法制成，所述方法包括：(i)将至少一种含有可操作地连接到启动子和信号序列的编码所述抗体的一个或多个异源多核苷酸的表达载体引入到哺乳动物细胞中；(ii)产生用于培养以表达编码所述抗体的一种或多种异源多核苷酸的单细胞；(iii)选择稳定表达所述抗体的哺乳动物细胞；和(iv)由所述稳定表达所述抗体的哺乳动物细胞在培养基中产生稳定的细胞培养物。优选地，所述哺乳动物物种为CHO细胞。
[0060] 本发明还涉及抗PACAP抗体及其抗原结合片段(优选为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其片段)的治疗和诊断用途。
[0061] 在一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中阻断、抑制或中和与PACAP相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向受试者施用拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应的有效量的人或人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段。在一个具体的实施方案中，所述方法采用抗PACAP 抗体或其抗原结合片段，其与选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体特异性结合相同的或重叠的线性或构象表位并且/或者竞争结合人 PACAP上的相同的或重叠的线性或构象表位。
[0062] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中阻断、抑制或中和与PACAP相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向受试者施用拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应并且基本上不与VIP相互作用(结合)的有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或或其抗原结合片段，例如，与 VIP相比，抗PACAP抗体或其抗原结合片段对于PACAP具有更强的亲和力，即尽管存在一些交叉反应性，但与VIP相比，所述抗体优先与PACAP结合。例如，所述抗体或其抗原结合片段对PACAP的亲和力比所述抗体或其抗原结合片段对VIP的亲和力高至少10倍、 30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000 倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000 倍或更高(例如，所述抗体或片段用于结合人PACAP的KD比用于结合VIP的KD低10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、 10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000 倍、10000000倍、30000000倍或更低)。在一个具体的实施方案中，所述方法采用抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其与选自Ab10或 Ab20的抗PACAP抗体特异性结合相同的或重叠的线性或构象表位并且/或者竞争结合人PACAP上的相同的或重叠的线性或构象表位。
[0063] 在又一实施方案中，本发明提供了用于在受试者中阻断、抑制或中和与PACAP相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的 PACAP激活；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；能够抑制PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的结合；能够抑制PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种的结合；或者能够抑制PACAP与PAC1-R的结合；并且/或者抑制PACAP例如通过GAG与细胞表面的结合；抑制PACAP诱导的 cAMP产生；并且/或者当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。在一个具体的实施方案中，所述方法采用抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其与选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体特异性结合相同的或重叠的线性或构象表位并且/或者竞争结合人PACAP上的相同的或重叠的线性或构象表位。
[0064] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中治疗或预防头痛或偏头痛的发病、频率、严重性或持续时间的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的 PACAP激活；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；能够抑制PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的结合；能够抑制PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种的结合；或者能够抑制PACAP与PAC1-R的结合；并且/或者抑制PACAP例如通过GAG与细胞表面的结合；抑制PACAP诱导的 cAMP产生；并且/或者当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。在另一个实施方案中，本发明提供了用于在人类受试者中治疗或预防与增加的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活相关联的急性、发作性或慢性病状的方法。
[0065] 在一个具体的实施方案中，所述方法采用抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其与选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体特异性结合相同的或重叠的线性或构象表位并且/或者竞争结合人PACAP上的相同的或重叠的线性或构象表位。例如，可以使用丙氨酸扫描突变策略鉴定所述表位。
[0066] 在一个具体的实施方案中，通过施用本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段治疗和/或预防的头痛或/或偏头痛选自先兆偏头痛或无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛和紧张性头痛。
[0067] 在另一个具体的实施方案中，受试者患有与畏光相关联的选自由以下组成的组的眼部病症：全色盲，无虹膜，由抗胆碱能药物引起的畏光，无晶状体(眼睛的晶状体不存在)，牛眼(角膜和虹膜之间异常狭窄的角)，白内障，视锥细胞营养不良，眼睛先天性异常，病毒性结膜炎(“红眼病”)，角膜磨损，角膜营养不良，角膜溃疡，角膜上皮破裂，晶状体异位，眼内炎，由疾病、损伤或感染引起的眼创伤诸如睑板腺囊肿，巩膜外层炎，青光眼，圆锥角膜，或视神经发育不全，水眼，或先天性青光眼性虹膜炎，视神经炎，色素播散综合征，瞳孔扩大(天然或化学诱导)，视网膜脱落，角膜瘢痕形成或巩膜瘢痕形成和葡萄膜炎。
[0068] 在另一个具体的实施方案中，受试者患有与畏光相关联的选自由以下组成的组的神经系统相关或神经学病状：自闭症谱系障碍、奇阿畸形(chiari malformation)、诵读困难、脑炎包括肌痛性脑脊髓炎(也称为“慢性疲乏综合征”)、脑膜炎、蛛网膜下腔出血、颅后窝肿瘤、强直性脊柱炎、白化病、核黄素缺乏症、苯二氮 类药物(长期使用或戒断苯二氮类药物)、化学疗法、基孔肯雅病(chikungunya)、胱氨酸病、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、宿醉、流感、感染性单核细胞增多症、镁缺乏症、汞中毒、偏头痛、狂犬病和酪氨酸血症II型(也称为“里奇纳-汉哈特综合征(Richner-Hanhart
syndrome)”)。
syndrome)”)。
[0069] 在另一个具体的实施方案中，受试者患有畏光相关联的选自由以下组成的组的病症：偏头痛(具有或不具有先兆)、虹膜炎、葡萄膜炎、脑膜炎、抑郁症、躁郁症、丛集性头痛或另一种三叉神经自主性头痛 (“TAC”)或眼睑痉挛、抑郁症、广场恐怖症、创伤后应激障碍(“PTSD”)、创伤性脑损伤和躁郁症。
[0070] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于中和PACAP诱导的 PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R信号传导的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其与选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体特异性结合相同的或重叠的线性或构象表位并且/或者竞争结合人PACAP上的相同的或重叠的线性或构象表位。
[0071] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于抑制PACAP诱导的 cAMP产生的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的抗 PACAP抗体或其抗原结合片段，其与选自Ab10或Ab20的抗PACAP 抗体特异性结合相同的或重叠的线性或构象表位并且/或者竞争结合人PACAP上的相同的或重叠的线性或构象表位。
[0072] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于抑制PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其与选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体特异性结合相同的或重叠的线性或构象表位并且/或者竞争结合人PACAP上的相同的或重叠的线性或构象表位。
[0073] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中治疗或预防与升高的PACAP水平相关联的病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其与选自 Ab10或Ab20的抗PACAP抗体特异性结合相同的或重叠的线性或构象表位并且/或者竞争结合人PACAP上的相同的或重叠的线性或构象表位。例如，可以使用丙氨酸扫描突变策略鉴定所述表位。
[0074] 适用于本发明的示例性抗PACAP抗体及其抗原结合片段包含 VH链，其具有与选自SEQ ID NO:402和442的VH链具有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和/或VL链，其具有与选自SEQ ID NO:422和462的VL链具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和/或其中包含的至少2、3、4、5或全部 6个CDR。
[0075] 在一个实施方案中，所述方法中采用的抗PACAP抗体或其抗原结合片段与PACAP27和/或PACAP38结合并阻断PACAP27和/或 PACAP38与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R的结合。在另一个实施方案中，所述方法中采用的抗PACAP抗体或其抗原结合片段与 PACAP27和/或PACAP38结合并阻断PACAP27和/或PACAP38与 PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一个的结合。优选地，抗 PACAP抗体或其抗原结合片段与PACAP27和/或PACAP38结合并阻断PACAP27和/或PACAP38与PAC1-R的结合。
[0076] 更具体地，根据本发明的方法中采用的抗PACAP抗体及其抗原结合片段可包括人、人源化和嵌合的抗体及其片段，以及scFv、骆驼抗体、鲨鱼抗体、纳米抗体、IgNAR、Fab片段、Fab′片段、MetMab 样抗体、双特异性抗体、单价抗体片段和F(ab′)2片段。此外，根据本发明的方法中采用的抗PACAP抗体或其抗原结合片段可基本上或完全缺乏N-糖基化和/或O-糖基化。在一个实施方案中，所包括的方法中使用的抗PACAP抗体或其抗原结合片段包含人恒定结构域，例如 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在另一个实施方案中，抗PACAP 抗体或其抗原结合片段包含已被修饰以改变(增强或损害)效应子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中的至少一个的Fc区。例如，Fc区可含有改变或消除N-糖基化和/或O-糖基化的一个或多个突变。
[0077] 在一个实施方案中，所述本发明的方法采用抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其以以下KD与PACAP结合：小于或等于5x10-5M、 10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9 M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12 M、5x10-13M或10-13M。优选地，人、人源化或嵌合的抗PACAP 抗体或其抗原结合片段以以下KD与PACAP结合：小于或等于5x10-10 M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M或10-12M。更优选地，所述方法采用人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其以以下KD与PACAP结合：小于约100nM、小于约40nM、小于约1nM、小于约100pM、小于约50pM或小于约25pM。可替代地，抗PACAP抗体或其抗原结合片段以处于约10pM与约100pM之间的KD与PACAP结合。在另一个实施方案中，人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段以以下解离速率(koff)与PACAP结合：小于或等于5x10-4s-1、10-4s-1、5x10-5s-1或10-5s-1。
[0078] 在另一个实施方案中，所述本发明的方法中使用的抗PACAP抗体或其抗原结合片段被直接或间接附接到另一个部分，诸如可检测标记或治疗剂；被附接到至少一个效应子部分，例如其包含化学接头；并且/或者被附接到一个或多个可检测部分，例如其包含荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料、化学发光部分或其混合物；并且/或者被附接到一个或多个功能性部分。
[0079] 在另一个实施方案中，所述方法还包括分别施用或共施用例如选自以下的另一种药剂：化疗剂、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、细胞因子、抗增殖剂和止吐剂。优选地，所述另一治疗剂为止痛剂，例如 NSAID(诸如环氧合酶1和/或环氧合酶2抑制剂；丙酸衍生物，包括布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯芬酸和酮洛芬；乙酸衍生物，包括托美丁和舒林酸；芬那酸衍生物，包括甲芬那酸和甲氯芬那酸；联苯羧酸衍生物，包括二氟尼柳和氟苯柳；和昔康类，包括吡罗昔康、舒多昔康和伊索昔康)，阿片类止痛剂(诸如吗啡或吗啡衍生物或其药学上可接受的盐、可待因、二氢可待因、二乙酰吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、左啡诺、羟吗啡酮、阿芬太尼、丁丙诺啡、布托啡诺、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、纳布啡、丙氧芬和喷他佐辛、或其药学上可接受的盐)，另一种抗体(诸如抗NGF抗体或抗体片段或者抗CGRP 或抗CGRP受体(“抗CGRP-R”)抗体或抗体片段)，或非抗体生物制剂，例如
[0080] 在一个实施方案中，与单独施用阿片类止痛剂或者抗PACAP抗体或其抗原结合片段相比，组合施用阿片类止痛剂和抗PACAP抗体或其抗原结合片段增加了止痛效果。
[0081] 在另一个实施方案中，受试者已预先进行治疗(“经治疗的受试者”)并且接受抗CGRP或抗CGRP-R抗体或其抗体片段。经治疗的受试者可能是对抗CGRP或抗CGRP-R抗体治疗不充分应答的偏头痛患者(“不良应答者”)。可替代地，经治疗的受试者可已预先接受至少一种抗CGRP或抗CGRP-R抗体或其抗体片段的施用，并且已引发对所述抗体或其抗体片段的免疫应答。示例性抗CGRP和抗CGRP-R 抗体及其抗体片段公开在美国专利号9,102,731；9,115,194；8,734,802； 8,623,366；8,597,649和8,586,045；以及美国专利申请公布号
20120294822、20120294802和20120294797中，其各自的内容以引用的方式整体并入本文。
20120294822、20120294802和20120294797中，其各自的内容以引用的方式整体并入本文。
[0082] 本发明的一方面总体涉及抗PACAP抗体及其抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗人PACAP抗体或其抗体片段，其可拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应。
[0083] 此外，本发明涉及抗PACAP抗体及其抗原结合片段，其可包括人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗体片段，其与选自由Ab10 和Ab20组成的组的抗体或其抗原结合片段竞争与人PACAP特异性结合。
[0084] 另外，本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段可包括人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗体片段，其可与由可选自由Ab10 和Ab20组成的组的抗PACAP抗体或其抗原结合片段结合的至少一个线性或构象表位特异性结合。所述表位可通过例如如实施例12所公开的丙氨酸扫描或另一种本领域公认的方法来鉴定。
[0085] 此外，在另一个实施方案中，本发明抗PACAP抗体及其抗原结合片段可包括人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其与 Ab10或Ab20中的任一个或其抗原结合片段结合相同的表位。所述表位可通过例如如实施例12所公开的丙氨酸扫描或另一种本领域公认的方法来鉴定。
[0086] 在本发明的另一实施方案中，本发明的抗PACAP抗体或其抗原结合片段可包括可特异性结合人PACAP上的表位或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其中所述表位包括以下的一个或多个：
[0087] (i)人PACAP的残基19、22、23和27中的至少一个；
[0088] (ii)人PACAP的残基19、22、23、24和27中的至少一个；
[0089] (iii)(i)-(ii)中任一项的残基中的至少两个；
[0090] (iv)(i)-(ii)中任一项的残基中的至少三个；
[0091] (v)(i)-(ii)中任一项的残基中的至少四个；以及
[0092] (v)(ii)中的所有五个残基。
[0093] 在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的抗PACAP抗体或其抗原结合片段可包括特异性结合人PACAP上的表位或其可能含有对应的氨基酸残基的片段或变体的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，所述表位可包括人PACAP的残基19、22、23和27。此外，在本发明的另一个实施方案中，抗PACAP抗体或其抗原结合片段可包括特异性结合人PACAP上的表位(或其可含有对应的氨基酸残基的片段或变体)的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，所述表位可存在于人野生型PACAP38中，但不存在于人野生型人PACAP27中。所述表位可通过例如如实施例12所公开的丙氨酸扫描或另一种本领域公认的方法来鉴定。
[0094] 在本发明的一个另外的实施方案中，本发明的抗PACAP抗体或其抗原结合片段可包括特异性结合人PACAP上的表位或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗体片段，其中所述表位可由如上所述的(i)-(ii)的残基组成。所述表位可通过例如如实施例12所公开的丙氨酸扫描或另一种本领域公认的方法来鉴定。
[0095] 本发明的另一个方面还包括抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其可包括特异性结合人PACAP上的表位(或其含有对应的氨基酸残基的片段或变体)的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，所述表位可存在于人野生型PACAP38和人野生型人PACAP27中。
[0096] 另外，抗PACAP抗体或其抗原结合片段可包括与人野生型人 PACAP38特异性结合但不与人野生型人PACAP27结合或明显结合的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗体片段。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段可包括人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗体片段，其对于人 PACAP38的KD可比所述抗体或抗体片段对人PACAP27的KD低(强) 至少10、100、1000、10,000或100,000倍。
[0097] 在另一个实施方案中，本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段可包括不与人血管活性肠肽(“VIP”)结合或明显结合的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗体片段。所述抗PACAP抗体或其抗体片段对于人PACAP的KD可比所述抗体或抗体片段对人VIP的KD低(强)至少10、100、1000、10,000或100,000倍。
[0098] 在本发明的实施方案中，如本文所公开的人、人源化或嵌合的抗 PACAP抗体或抗体片段可抑制或中和由人PACAP引发的至少一种生物学效应。
[0099] 在另一个实施方案中，本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段可包括人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗体片段，其可包含以下性质中的一种或多种：(a)抑制、阻断或防止PAC1受体 (“PAC1-R”)、1型血管活性肠肽受体(“VPAC1-R”)和/或2型血管活性肠肽受体(“VPAC2-R”)中的至少一种的PACAP激活；(b)抑制、阻断或防止PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活； (c)抑制、阻断或防止PAC1-R的PACAP激活；(d)能够抑制PACAP 与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的结合；(e)能够抑制PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种的结合；(f)能够抑制PACAP与表达PAC1-R的细胞的结合；(g)能够抑制 PACAP与表达VPAC1-R的细胞的结合；(h)能够抑制PACAP与表达 VPAC2-R的细胞的结合；(i)抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”) 与细胞表面的结合；(j)不抑制PACAP介导的此类抗体例如通过GAG 与细胞表面的结合；(k)抑制PACAP介导的此类抗体例如通过糖胺聚糖(“GAG”)与细胞表面的结合；(l)抑制、阻断或防止PACAP诱导的 cAMP产生；(m)当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张；和/或(n)当向受试者施用时，减少PACAP诱导的畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
[0100] 本发明还可涉及抗PACAP抗体及其抗原结合片段，其可优选地为在人类受试者中基本上为非免疫原性的人、人源化或嵌合的抗 PACAP抗体或抗体片段。本发明还可涉及抗PACAP抗体及其抗原结合片段，其可优选地为可适用于治疗患有与增加的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活相关联的急性、发作性或慢性病状的人类受试者的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段。
[0101] 本发明的另一个实施方案涉及抗PACAP抗体或其抗原结合片段，其可优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其特异性结合至与可选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体相同的或重叠的一个或多个线性或构象表位并且/或者可竞争结合至人PACAP上的与可选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体相同的或重叠的一个或多个线性或构象表位。本发明的又一实施方案涉及抗PACAP抗体或其抗原结合片段，优选人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其可特异性结合至人PACAP上的与可选自Ab10或Ab20的抗 PACAP抗体相同的或重叠的一个或多个线性或构象表位。如本文所述的由本发明的抗体或抗体片段所结合的所述表位可通过例如如实施例12所公开的丙氨酸扫描或另一种本领域公认的方法来鉴定。
[0102] 本发明还可体现可优选地为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段的抗PACAP抗体及其抗原结合片段，其可包含可选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体的至少2个互补决定区(“CDR”)，优选包括VH CDR3和/或VL CDR3。本发明生物另一个另外的实施方案可包括可优选地为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段的抗PACAP抗体及其抗原结合片段，其可包含可选自Ab10或Ab20 的抗PACAP抗体的至少3个、至少4个、至少5个或全部6个CDR。在不可存在所有6个CDR的情况下，优选至少可存在VH CDR3和 VL CDR3。
[0103] 在本发明的另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗体片段，可包含本发明的任何抗体或抗体片段的序列变体，所述序列变体可含有可假定改变结合亲和力或免疫原性的一种或多种修饰。
[0104] 在一个具体的实施方案中，根据本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，并且包含(a)可变重链，其包含由SEQ ID NO:404组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:406组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:408组成的 CDR3序列；和/或(b)可变轻链，其包含由SEQ ID NO:424组成的 CDR1序列；由SEQ ID NO:426组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO: 428组成的CDR3序列。可替代地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)可变重链，其包含与SEQ ID NO:402具有至少80％、 85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或(b)可变轻链，其包含与SEQ ID NO:422具有至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包含(a)具有 SEQ ID NO:402的氨基酸序列的可变重链和/或(b)具有SEQ ID NO: 422的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:401的氨基酸序列的重链和/或 (b)具有SEQ ID NO:421的氨基酸序列的轻链。
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或(b)可变轻链，其包含与SEQ ID NO:422具有至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包含(a)具有 SEQ ID NO:402的氨基酸序列的可变重链和/或(b)具有SEQ ID NO: 422的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:401的氨基酸序列的重链和/或 (b)具有SEQ ID NO:421的氨基酸序列的轻链。
[0105] 在另一个具体的实施方案中，根据本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，并且包含(a)可变重链，其包含由SEQ ID NO:444组成的CDR1 序列；由SEQ ID NO:446组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:448 组成的CDR3序列；和/或(b)可变轻链，其包含由SEQ ID NO:464组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:466组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:468组成的CDR3序列。可替代地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)可变重链，其包含与SEQ ID NO:442具有至少 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或(b)可变轻链，其包含与SEQ ID NO:462具有至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段并且包含(a) 具有SEQ ID NO:
442的氨基酸序列的可变重链和/或(b)具有SEQ ID NO:462的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:441的氨基酸序列的重链和/或(b)具有SEQ ID NO:461的氨基酸序列的轻链。
442的氨基酸序列的可变重链和/或(b)具有SEQ ID NO:462的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:441的氨基酸序列的重链和/或(b)具有SEQ ID NO:461的氨基酸序列的轻链。
[0106] 另外，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段可包括人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段可选自由以下组成的组：scFv、骆驼抗体、纳米抗体、免疫球蛋白新抗原受体(“IgNAR”)、片段抗原结合(“Fab”)片段、Fab'片段、MetMab样抗体、单价抗体片段和F(ab')2片段。在另一个实施方案中，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗 PACAP抗体或抗体片段，可基本上或完全缺乏N-糖基化和/或O-糖基化。此外，本发明包括本发明的一个实施方案，其中本发明的抗 PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP 抗体或抗体片段，可包含人恒定结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4抗体或其片段的恒定结构域。
[0107] 本发明的一个另外的实施方案涉及抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段可包含Fc区，其可被修饰以改变效应子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中的至少一个，例如其中所述Fc区可含有可改变或消除N-糖基化和/或O-糖基化的一个或多个突变。
[0108] 在本发明的又一实施方案中，抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，可以以下结合亲和力(KD)与PACAP结合：小于或等于5x10-5M、10-5M、5x10-6 M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、 5x10-10M、10-10M、
5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13 M或10-13M，例如如通过ELISA、生物层干涉测量(“BLI”)、KINEXA 或表面等离子体共振在25℃或37℃下所测量的。此外，本发明的另一个实施方案涉及抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段可以以下结合亲和力(KD)与PACAP结合：小于或等于5x10-
10M、10-10 M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M或10-12M。另外，本发明的抗PACAP 抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，可包括抗PACAP抗体或抗体片段，其可以以下解离速率 (koff)与PACAP结合：小于或等于5x10-4s-1、10-4s-1、5x10-5s-1或10-5 s-1。
5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13 M或10-13M，例如如通过ELISA、生物层干涉测量(“BLI”)、KINEXA 或表面等离子体共振在25℃或37℃下所测量的。此外，本发明的另一个实施方案涉及抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段可以以下结合亲和力(KD)与PACAP结合：小于或等于5x10-
10M、10-10 M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M或10-12M。另外，本发明的抗PACAP 抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，可包括抗PACAP抗体或抗体片段，其可以以下解离速率 (koff)与PACAP结合：小于或等于5x10-4s-1、10-4s-1、5x10-5s-1或10-5 s-1。
[0109] 本发明的另一个实施方案涉及抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其中所述抗体和抗体片段可被直接或间接附接到可检测标记或治疗剂。本发明的一个另外的实施方案涉及抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，当其向受试者施用时，可抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应。本发明的抗 PACAP抗体及抗原结合片段，优选人、人源化或嵌合的抗PACAP 抗体或抗体片段，可结合至PACAP27和/或PACAP38并且可阻断 PACAP27和/或PACAP38结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R；可结合至PACAP27和/或PACAP38并且可阻断PACAP27和/或 PACAP38结合至PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一个；并且/或者可结合至PACAP27和/或PACAP38并且可阻断PACAP27和 /或PACAP38结合至表达PAC1-R的细胞、表达VPAC1-R的细胞和/ 或表达VPAC2-R的细胞。
[0110] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，可中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R或VPAC2-R中的至少一种的PACAP 激活；可中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的 PACAP激活；可中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；能够抑制或防止PACAP与PAC1-R、VPAC1-R或VPAC2-R中的至少一种的结合；能够抑制或防止PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的结合；能够抑制或防止PACAP与表达PAC1-R的细胞、表达 VPAC1-R的细胞和/或表达VPAC2-R的细胞的结合；可抑制或阻断 PACAP诱导的cAMP产生；当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
[0111] 在本发明的又一实施方案中，抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，可以可能小于约100nM的KD；可能小于约40nM的KD；可能小于约100pM 的KD；可能小于约50pM的KD；可能小于约25pM的KD；或可能在约10pM与约100pM之间的KD与PACAP结合。本发明还包括抗 PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP 抗体或抗体片段，其对于PACAP可具有与VIP相比更强的结合亲和力和/或其可不结合VIP，例如，其中所述抗体或其抗体片段对PACAP 的亲和力可比所述抗体或抗体片段对VIP的亲和力的强至少10倍、 30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000 倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000 倍或更多。
[0112] 在另一个实施方案中，本发明涉及抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其可被附接到至少一个效应子部分，例如，其中所述效应子部分可包含化学接头。在另一个实施方案中，本发明涉及抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其可被附接到一个或多个可检测部分，例如其中所述可检测部分可包含荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料、化学发光部分或其混合物。此外，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段，优选为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，可被附接到一个或多个功能性部分。
[0113] 本发明的另一个实施方案涉及可针对抗PACAP抗体或抗体片段产生的抗独特型抗体，其中所述抗独特型抗体任选地可中和抗 PACAP抗体可能结合的一种或多种生物学效应。本发明的所述实施方案还可涉及使用所述抗独特型抗体在受试者中监测所述抗PACAP 抗体或抗体片段的体内水平或在受试者中中和所述抗PACAP抗体的体内效应的方法。
[0114] 在又一实施方案中，本发明涉及可适用于治疗、预防或诊断用途的组合物，其中所述组合物可包含治疗、预防或诊断有效量的至少一种抗PACAP抗体或抗体片段或抗独特型抗体，例如，其中所述组合物可适于通过注射、局部、口服、吸入或经皮肤施用；可适用于皮下、静脉内、肌内、局部、口服、吸入、鼻内、颊内、经阴道、经肛门、经皮肤、腹膜内或鞘内施用；并且/或者其中所述组合物可适用于皮下静脉内或肌内施用。本发明还包括本发明的一个实施方案，其中至少一种抗PACAP抗体或抗体片段或抗独特型抗体的所述组合物可以是冻干的；并且/或者其中所述组合物可包含药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂或其混合物。本发明的所述组合物还可包含至少一种其它活性剂，例如，其中所述另一活性剂可选自由以下组成的组：化疗剂、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、细胞因子、抗增殖剂、止吐剂和/或细胞毒素。所述组合物还可以是冻干的、稳定化的，并且/或者配制用于通过注射施用。
[0115] 本发明的另一实施方案包括可编码抗PACAP抗体或抗体片段或抗独特型抗体的分离的核酸序列，并且其中所述分离的核酸序列可被包含在载体内。另外，在本发明的一个实施方案中，宿主细胞可包含所述分离的核酸序列，其中所述宿主细胞可为哺乳动物、细菌、真菌、酵母、禽类、两栖动物、植物或昆虫细胞；并且/或者所述宿主细胞可为丝状真菌或酵母。其中所述宿主细胞可为酵母细胞，所述酵母可选自以下属：阿克斯酵母属(Arxiozyma)；类盘酵母属 (Ascobotryozyma)；固囊酵母属(Citeromyces)；德巴利酵母属
(Debaryomyces)；德克酵母属(Dekkera)；假囊酵母属(Eremothecium)；伊萨酵母属
(Issatchenkia)；哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)；柯达酵母属(Kodamaea)；路德酵母属 (Lodderomyces)；管囊酵母属(Pachysolen)；毕赤酵母属；酵母属 (Saccharomyces)；土星形酵母属(Saturnispora)；四盾酵母属
(Tetrapisispora)；有孢圆酵母属(Torulaspora)；拟威尔酵母属(Williopsis) 和接合酵母属(Zygosaccharomyces)；并且/或者所述酵母可为毕赤酵母属。在本发明的一个实施方案中，所述酵母宿主细胞可选自巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母)。另外，所述宿主细胞可为丝状真菌或酵母，或者可为CHO细胞。
(Debaryomyces)；德克酵母属(Dekkera)；假囊酵母属(Eremothecium)；伊萨酵母属
(Issatchenkia)；哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)；柯达酵母属(Kodamaea)；路德酵母属 (Lodderomyces)；管囊酵母属(Pachysolen)；毕赤酵母属；酵母属 (Saccharomyces)；土星形酵母属(Saturnispora)；四盾酵母属
(Tetrapisispora)；有孢圆酵母属(Torulaspora)；拟威尔酵母属(Williopsis) 和接合酵母属(Zygosaccharomyces)；并且/或者所述酵母可为毕赤酵母属。在本发明的一个实施方案中，所述酵母宿主细胞可选自巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母)。另外，所述宿主细胞可为丝状真菌或酵母，或者可为CHO细胞。
[0116] 本发明还涉及表达抗-PACAP抗体或抗体片段的方法，所述方法可包括在可为所述抗体或抗体片段的表达提供的条件下培养任何但不限于本文公开的宿主细胞。另外，本发明涉及所述方法，其中所述宿主细胞可为可稳定表达并分泌所述抗体或抗体片段的酵母细胞或 CHO细胞。例如，所述酵母细胞可为可通过以下方法制备的多倍体酵母，所述方法可包括：(i)将至少一种含有可操作地连接到启动子和信号序列的编码所述抗体的一个或多个异源多核苷酸的表达载体引入到单倍体酵母细胞中；(ii)通过接合或原生质球融合由所述第一和/ 或第二单倍体酵母细胞产生多倍体酵母；(iii)选择稳定表达所述抗体的多倍体酵母细胞；和(iv)由所述稳定表达所述抗体的多倍体酵母细胞在培养基中产生稳定的多倍体酵母培养物；并且所述多倍体酵母可属于毕赤酵母属。另外，在另一个实施方案中，本发明包括表达抗 PACAP抗体或抗体片段的方法，所述方法可包括培养宿主细胞，其中所述宿主细胞可为哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
[0117] 另外，本发明涉及可在受试者中阻断、抑制、阻断或中和与 PACAP相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用可拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应的治疗或预防有效量的人、人源化或嵌合的抗 PACAP抗体或抗体片段。本发明的另一个方面涉及可在受试者中阻断、抑制或中和与PACAP相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用可拮抗、抑制、中和或阻断与人 PACAP相关联的至少一种生物学效应并且基本上不可与VIP相互作用(结合)的治疗或预防有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段。
[0118] 本发明的另一个方面总体涉及可在受试者中阻断、抑制或中和与 PACAP相关联的一种或多种生物学效应(例如血管舒张效应)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，其可包含以下中的一种或多种：抑制、阻断或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；中和或抑制 PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的PACAP激活；抑制、阻断或中和PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的 PACAP激活；中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；抑制PACAP与 PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的结合；抑制 PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种的结合；抑制表达PACAP与PAC1-R的细胞的结合；抑制PACAP与表达 VPAC1-R和/或VPAC2-R的细胞的结合；不抑制PACAP介导的此类抗体例如通过糖胺聚糖(“GAG”)与细胞表面的结合；
抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)与细胞表面的结合；抑制PACAP诱导的 cAMP产生；并且/或者当向受试者施用时，可减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)与细胞表面的结合；抑制PACAP诱导的 cAMP产生；并且/或者当向受试者施用时，可减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
[0119] 本发明的另一个实施方案涉及可在受试者中阻断、抑制或中和可与PACAP相关联或可由PACAP引发的血管舒张(例如硬膜动脉的血管舒张)的方法，所述方法包括向受试者施用可阻断、抑制或中和与 PACAP相关联或由PACAP引发的血管舒张的治疗或预防有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段。
[0120] 本发明的又一实施方案涉及可在受试者中治疗或预防头痛或偏头痛的发病、频率、严重性或持续时间的方法，所述头痛或偏头痛可选自先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛和紧张性头痛，所述方法包括向有需要的受试者施用可引发以下效应中的一种或多种的有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段：抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；中和或抑制 PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的PACAP激活；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP 激活；中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；抑制PACAP与PAC1-R、 VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种的结合；抑制PACAP与 PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种的结合；抑制PACAP 与表达PAC1-R的细胞的结合；抑制PACAP与表达VPAC1-R和/或 VPAC2-R的细胞的结合；抑制PACAP介导的此类抗体例如GAG与细胞表面的结合；抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)与细胞表面的结合；抑制PACAP诱导的环磷酸腺苷(“cAMP”)产生；并且/或者当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
[0121] 本发明的另一个实施方案涉及治疗可能患有可与增加的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和神经元激活中的至少一种相关联的急性、发作性或慢性病状或所述病状的组合的人类受试者的方法，所述方法可包括向有需要的受试者施用有效量的拮抗性人、人源化或嵌合的抗人PACAP抗体或抗体片段。
[0122] 在又一实施方案中，本发明涉及可在受试者中阻断、抑制或中和与PACAP相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用可拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应的有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片段。此外，本发明的一个实施方案包括可在受试者中阻断、抑制或中和与PACAP相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用可拮抗、抑制、中和或阻断与人 PACAP相关联的至少一种生物学效应并且基本上不可与VIP相互作用(结合)的有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原片段。
[0123] 在另一个实施方案中，本发明涉及在受试者中阻断、抑制或中和与PACAP相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法可包括向有需要的受试者施用有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片段，其(a)抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；(b)中和或抑制PAC1受体(“PAC1-R”)、1型血管活性肠肽受体 (“VPAC1-R”)和/或2型血管活性肠肽受体(“VPAC2-R”)中的至少一种的PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R的PACAP激活； (e)抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种；(f)抑制PACAP结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种；(g)能够抑制PACAP结合至表达PAC1-R的细胞；(h)抑制 PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)结合至细胞表面；(i)抑制PACAP 介导的所述抗体例如通过GAG结合至细胞表面；(j)抑制PACAP诱导的环磷酸腺苷(“cAMP”)产生；并且/或者(k)当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
[0124] 此外，本发明的一个实施方案涉及在受试者中治疗或预防头痛或偏头痛的发病、频率、严重性或持续时间的方法，例如其中所述头痛或偏头痛可选自先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛和紧张性头痛，所述方法可包括向有需要的受试者施用有效量的人、人源化或嵌合的抗人PACAP抗体或抗原结合片段，其(a)抑制或中和由PACAP引发的至少一种生物学效应；(b)中和或抑制PAC1受体 (“PAC1-R”)、1型血管活性肠肽受体(“VPAC1-R”)和/或2型血管活性肠肽受体(“VPAC2-R”)中的至少一种的PACAP激活；(c)中和或抑制 PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R中的每一种的PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R的PACAP激活；(e)能够抑制PACAP结合至 PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的至少一种；(f)抑制PACAP 结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R中的每一种；(g)抑制 PACAP结合至表达PAC1-R的细胞；(h)抑制PACAP例如通过糖胺聚糖(“GAG”)结合至细胞表面；(i)抑制PACAP介导的例如所述抗体通过GAG结合至细胞表面；(j)抑制PACAP诱导的环磷酸腺苷 (“cAMP”)产生；并且/或者(k)当向受试者施用时，减少PACAP诱导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。
[0125] 本发明的另一实施方案包括治疗可能患有与增加的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和神经元激活中的至少一种相关联的急性、发作性或慢性病状或上述任一种的组合的人类受试者的方法，所述方法可包括向有需要的受试者施用有效量的拮抗性人、人源化或嵌合的抗人 PACAP抗体或抗原结合片段。
[0126] 本发明还涉及可包括施用本发明的抗PACAP抗体或抗原结合片段的本文公开的任何方法，并且其中所述抗PACAP抗体可为人抗体或抗原结合片段；并且/或者其中所述抗PACAP抗体可为人源化抗体或抗原结合片段；并且/或者其中所述抗PACAP抗体可为嵌合抗体或抗原结合片段。
[0127] 本发明的另一个实施方案还涉及一种方法，其中本发明的抗 PACAP抗体或抗体片段可结合至PACAP27和/或PACAP38并且可阻断PACAP27和/或PACAP38结合至PAC1-R、VPAC1-R和/或 VPAC2-R。本发明的另一个实施方案涉及一种方法，其中所述抗 PACAP抗体或抗体片段可结合至PACAP27和/或PACAP38并且可阻断PACAP27和/或PACAP38结合至PAC1-R、VPAC1-R和 VPAC2-R中的每一个。本发明的又一实施方案涉及一种方法，其中所述抗PACAP抗体或抗体片段可结合至PACAP27和/或PACAP38 并且可阻断PACAP27和/或PACAP38结合至表达PAC1-R的细胞。另外，本发明的所述抗PACAP抗体或抗体片段对PACAP的亲和力可比所述抗体或抗体片段对VIP的亲和力强至少10倍、30倍、100 倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000 倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000倍或更多。
[0128] 本发明包括可在受试者中阻断、抑制、阻断或中和与PACAP相关联的一种或多种生物学效应的方法，所述方法可包括向所述受试者施用可拮抗、抑制、中和或阻断与人PACAP相关联的至少一种生物学效应的治疗或预防有效量的人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段，并且其中所述受试者可患有选自由以下组成的组的病状：先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、紧张性头痛、正头痛、热潮红、畏光、慢性阵发性半侧颅痛、头部潜在的结构性问题引起的继发性头痛、颈部潜在的结构性问题引起的继发性头痛、颅神经痛、窦性头痛、与鼻窦炎相关联的头痛、过敏诱导的头痛、过敏诱导的偏头痛、三叉神经痛、疱疹后神经痛、幻肢疼痛、纤维肌痛、反射交感性营养不良、疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛、手术后切口疼痛、手术后疼痛、创伤相关疼痛、下背痛、眼痛、牙痛、复杂性区域疼痛综合征、癌症疼痛、原发性或转移性骨癌疼痛、骨折疼痛、骨质疏松性骨折疼痛、烧伤引起的疼痛、痛风关节疼痛、与镰状细胞危象相关联的疼痛、与颞下颌关节紊乱相关联的疼痛、肝硬化、肝炎、神经源性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、内脏痛、月经痛、卵巢痛、骨关节炎疼痛、类风湿性关节炎疼痛、糖尿病性神经病、坐骨神经痛、消化不良、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩氏病、回肠炎、溃疡性结肠炎、肾绞痛、痛经、膀胱炎、间质性膀胱炎、月经期、分娩、绝经、胰腺炎、精神分裂症、抑郁症、创伤后应激障碍(“PTSD”)、焦虑症、自身免疫性糖尿病、舍格伦氏综合征( syndrome)、多发性硬化症、膀胱过度活动症、支气管高反应性、哮喘、中风、支气管炎、支气管扩张、肺气肿、慢性阻塞性肺病(“COPD”)、炎性皮炎、腺组织中的腺癌、器官胚胎组织中的胚细胞瘤、上皮组织中的癌、形成血细胞的组织中的白血病、淋巴组织中的淋巴瘤、骨髓中的骨髓瘤、结缔组织或支持组织中的肉瘤、肾上腺癌、AIDS相关淋巴瘤、贫血、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、化学疗法、结肠癌、血细胞减少、子宫内膜癌、食管癌、胃癌(gastric cancer)、头癌、颈癌、肝胆癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、、非霍奇金氏病、神经系统肿瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、骨髓癌、多发性骨髓瘤、转移到骨的肿瘤、浸润神经和空腔脏器的肿瘤、神经结构附近的肿瘤、寻常痤疮、特应性皮炎、荨麻疹、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和红斑痤疮、内皮功能障碍、雷诺氏综合征(Raynaud’s syndrome)、冠心病(“CHD”)、冠状动脉疾病(“CAD”)、心力衰竭、外周动脉疾病 (“PAD”)、糖尿病、肺动脉高压(“PH”)、结缔组织病、变应性皮炎、银屑病、瘙痒、神经源性皮肤发红、红斑、结节病、休克、败血症、阿片戒断综合征、吗啡耐受和癫痫。另外，所述受试者可患有选自由以下组成的组的病状：偏头痛、头痛和疼痛相关联的疾病或病状，其中所述头痛或偏头痛可选自由以下组成的组：先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛和紧张性头痛。此外，所述受试者可患有与畏光相关联的选自由以下组成的组的眼部病症：全色盲、无虹膜、由抗胆碱能药物引起的畏光、无晶状体、牛眼、白内障、视锥细胞营养不良、眼睛先天性异常、病毒性结膜炎、角膜磨损、角膜营养不良、角膜溃疡、角膜上皮破裂、晶状体异位、眼内炎、由疾病引起的眼创伤、由损伤引起的眼创伤、由感染引起的眼创伤、睑板腺囊肿、巩膜外层炎、青光眼、圆锥角膜、视神经发育不全、水眼、先天性青光眼性虹膜炎、视神经炎、色素播散综合征、瞳孔扩大、视网膜脱落、角膜瘢痕形成、巩膜瘢痕形成和葡萄膜炎。此外，所述受试者可患有与畏光相关联的选自由以下组成的组的神经系统相关或神经学病状：自闭症谱系障碍、奇阿畸形、诵读困难、脑炎、脑膜炎、蛛网膜下腔出血、颅后窝肿瘤、强直性脊柱炎、白化病、核黄素缺乏症、苯二氮 类药物、化学疗法、基孔肯雅病、胱氨酸病、埃勒斯-当洛斯综合征、宿醉、流感、感染性单核细胞增多症、镁缺乏症、汞中毒、偏头痛、狂犬病和酪氨酸血症II型。另外，所述受试者可患有畏光相关联的选自由以下组成的组的病症：先兆偏头痛、无先兆偏头痛、虹膜炎、葡萄膜炎、脑膜炎、抑郁症、躁郁症、丛集性头痛或另一种三叉神经自主性头痛(“TAC”)或眼睑痉挛、抑郁症、广场恐怖症和躁郁症。
[0129] 本发明另外包括本文公开的任何方法，其中本文公开的任何方法的抗体可为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗原结合片段；并且/或者其中所述抗PACAP抗体可为人源化抗体或抗原结合片段；并且/或者其中由本文公开的任何方法的所述抗体结合的表位可通过丙氨酸扫描来鉴定。
[0130] 本发明还包括本文公开的任何方法，其中所述方法涉及可为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段的抗体或抗体片段；并且 /或者其中所述抗体或抗体片段可为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或抗体片段；并且/或者其中所述抗体或抗体片段可为可包含与可选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体相同的CDR的抗PACAP抗体或抗体片段。
[0131] 本发明另外包括本文公开的任何方法，其中所述抗PACAP抗体或抗原结合片段可包含可选自Ab10或Ab20的抗PACAP抗体的至少 3个CDR；至少4个CDR；至少5个CDR；或全部6个CDR。
[0132] 本发明还包括本文公开的任何方法，其中根据本发明的所述抗 PACAP抗体及其抗原结合片段为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，并且包含(a)可变重链，其包含由SEQ ID NO: 404组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:406组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:408组成的CDR3序列；和/或(b)可变轻链，其包含由 SEQ ID NO:424组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:426组成的CDR2 序列；和由SEQ ID NO:428组成的CDR3序列。可替代地，抗PACAP 抗体及其抗原结合片段可以包含(a)可变重链，其包含与SEQ ID NO: 402具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或(b)可变轻链，其包含与SEQ ID NO:422 具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段包含(a)具有SEQ ID NO:402的氨基酸序列的可变重链和/或(b) 具有SEQ ID NO:422的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗PACAP 抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:401的氨基酸序列的重链和/或(b)具有SEQ ID NO:421的氨基酸序列的轻链。
[0133] 本发明还包括本文公开的任何方法，其中根据本发明的所述抗 PACAP抗体及其抗原结合片段为人、人源化或嵌合的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，并且包含(a)可变重链，其包含由SEQ ID NO: 444组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:446组成的CDR2序列；和由SEQ ID NO:448组成的CDR3序列；和/或(b)可变轻链，其包含由 SEQ ID NO:464组成的CDR1序列；由SEQ ID NO:466组成的CDR2 序列；和由SEQ ID NO:468组成的CDR3序列。可替代地，抗PACAP 抗体及其抗原结合片段可以包含(a)可变重链，其包含与SEQ ID NO: 442具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，和/或(b)可变轻链，其包含与SEQ ID NO:462 具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PACAP抗体及其抗原结合片段并且包含(a)具有SEQ ID NO:442的氨基酸序列的可变重链和/ 或(b)具有SEQ ID NO:462的氨基酸序列的可变轻链。更具体地，抗 PACAP抗体及其抗原结合片段可以包含(a)具有SEQ ID NO:441的氨基酸序列的重链和/或(b)具有SEQ ID NO:461的氨基酸序列的轻链。
[0134] 本发明还涉及本文公开的任何方法，其中所述抗PACAP抗体或抗体片段可选自由以下组成的组：scFv、骆驼抗体、纳米抗体、免疫球蛋白新抗原受体(“IgNAR”)、片段抗原结合(“Fab”)片段、Fab'片段、 MetMab样抗体、单价抗体片段和F(ab')2片段。另外，本发明涉及本文公开的任何方法，其中所述抗PACAP抗体或抗体片段可基本上或完全缺乏N-糖基化和/或O-糖基化。此外，本发明涉及本文公开的任何方法，其中所述抗PACAP抗体或抗体片段可包含人恒定结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的恒定结构域。
[0135] 本发明的另一个方面涉及本文公开的任何方法，其中所述抗 PACAP抗体或抗体片段可包含Fc区，其可被修饰以改变效应子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中的至少一个，例如其中所述Fc区可含有可改变或消除N-糖基化和/或O-糖基化的一个或多个突变。
[0136] 本发明的另一方面涉及本文公开的任何方法，其中所述抗 PACAP抗体或抗体片段可以以下结合亲和力(KD)与PACAP结合：小于或等于5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、-7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -1210 M、 5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、 10 M、5x10 M、10 M、
5x10-13M或10-13M。此外，本文公开的任何方法的所述抗PACAP抗体或抗体片段可以以下结合亲和力 (KD)与PACAP结合：小于或等于5x1010M、1010M、5x1011M、1011 M、5x1012M或1012M。本发明的另一个实施方案涉及本文公开的任何方法，其中所述抗PACAP抗体或抗体片段可以以下解离速率(koff) 与PACAP结合：小于或等于5x10-4s-1、10-4s-1、5x10-5s-1或10-5s-1。
5x10-13M或10-13M。此外，本文公开的任何方法的所述抗PACAP抗体或抗体片段可以以下结合亲和力 (KD)与PACAP结合：小于或等于5x1010M、1010M、5x1011M、1011 M、5x1012M或1012M。本发明的另一个实施方案涉及本文公开的任何方法，其中所述抗PACAP抗体或抗体片段可以以下解离速率(koff) 与PACAP结合：小于或等于5x10-4s-1、10-4s-1、5x10-5s-1或10-5s-1。
[0137] 此外，本发明包括本文公开的任何方法，其中所述抗PACAP抗体或抗体片段可被直接或间接地附接到可检测标记或治疗剂。此外，本发明涉及本文公开的任何方法，其中所述抗PACAP抗体或抗体片段可以以下KD与PACAP结合：可能小于约100nM、小于约40nM、小于约1nM、小于约100pM、小于约50pM或小于约25pM。此外，本发明包括本文公开的任何方法，其中所述抗PACAP抗体或抗体片段可以可能在约10pM与约100pM之间的KD与PACAP结合。本发明还涉及本文公开的任何方法，其中所述方法还可包括分别施用或同施用另一种药剂，例如其中所述另一试剂可选自化疗剂、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、细胞因子、抗增殖剂、止吐剂或细胞毒素。此外，本发明包括本文公开的任何方法，其中所述另一治疗剂可为止痛剂，并且所述止痛剂可为非类固醇抗炎药(“NSAID”)、阿片类止痛剂、另一种抗体或非抗体生物制剂，并且其中所述其它抗体还可为抗NGF 抗体或抗体片段；并且/或者可为抗降钙素基因相关肽(“CGRP”)抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段。本发明还涉及本文公开的任何方法，其中所述NSAID可为环氧合酶1和/或环氧合酶2 抑制剂。
[0138] 在本发明的另一个实施方案中，如本文公开的抗PACAP抗体或抗体片段或方法可抑制PACAP对血管舒张的影响；并且/或者可抑制 PACAP对cAMP产生的影响；并且/或者可抑制PACAP对导致Ca++和PLD水平降低的PLC的影响；并且/或者可抑制PACAP对腺苷酸环化酶活性的影响；并且/或者可抑制PACAP对其与任何或全部 PAC1-R、VPAC1-R或VPAC2-R的结合的影响；并且/或者可抑制 PACAP对神经发育的影响；并且/或者可抑制PACAP对神经保护的影响；并且/或者可抑制PACAP对神经调节的影响；并且/或者可抑制PACAP对神经源性炎症的影响；并且/或者可抑制PACAP对伤害感受的影响；并且/或者可调节PACAP例如通过至少一种GAG与结合细胞表面的相互作用，例如，其中至少一个所述GAG可包含肝素、软骨素、角蛋白和透明质酸中的一种或多种，并且其中所述抗体或抗体片段或方法还可阻断或抑制PACAP38和/或PACAP27的非受体依赖性细胞摄取并且/或者可抑制或可阻断细胞对PACAP38和/或 PACAP27的GAG依赖性摄取。
[0139] 本发明的另一实施方案涉及疗法或预防的方法，所述方法可包括施用本发明的抗PACAP抗体或抗体片段。另外，本发明涉及可用于人类疗法的组合物，其可含有本发明的抗PACAP抗体或抗体片段。所述组合物还可含有另一种活性剂，例如，其中所述另一药剂可选自化疗剂、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、细胞因子、抗增殖剂、止吐剂或细胞毒素。其中所述其它药剂可为止痛剂，所述止痛剂可为 NSAID、阿片类止痛剂、另一种抗体或非抗体生物制剂。其中所述其它药剂可为止痛剂，所述止痛剂可为另一种抗体，所述另一抗体可为抗NGF抗体或抗体片段，并且/或者所述另一抗体可为抗降钙素基因相关肽(“CGRP”)抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段。其中所述其它药剂可为NSAID，所述NSAID可为环氧合酶1和 /或环氧合酶2抑制剂；并且/或者所述NSAID可选自由以下组成的组： (1)丙酸衍生物，包括布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯芬酸和酮洛芬； (2)乙酸衍生物，包括托美丁和舒林酸；(3)芬那酸衍生物，包括甲芬那酸和甲氯芬那酸；(4)联苯羧酸衍生物，包括二氟尼柳和氟苯柳；和 (5)昔康类，包括吡罗昔康、舒多昔康和伊索昔康。其中所述其它药剂可为阿片类止痛剂，所述阿片类止痛剂可选自由以下组成的组：可待因、二氢可待因、二乙酰吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、左啡诺、羟吗啡酮、阿芬太尼、丁丙诺啡、布托啡诺、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、纳布啡、丙氧芬、喷他佐辛和其药学上可接受的盐；并且/ 或者所述阿片类止痛剂可为吗啡或吗啡衍生物或其药学上可接受的盐；并且/或者与单独施用阿片类止痛剂或者抗PACAP抗体或抗原结合片段相比，根据本发明的所述阿片类止痛剂和抗PACAP抗体或抗原结合片段可增加止痛效果。
[0140] 在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的抗PACAP抗体或片段或组合物，其中所述抗PACAP抗体或片段和另一种活性剂可与其组合或可组合施用，可引发对治疗或预防PACAP相关联的效应(例如偏头痛或疼痛)的协同或累加效应。本发明另外包括可用于治疗或诊断(例如偏头痛治疗或预防)的本发明的抗PACAP抗体或片段或组合物。本发明的另一实施方案涉及根据本发明的抗PACAP抗体或片段或组合物，其可用于潜在地治疗热潮红、先兆偏头痛或无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛或紧张性头痛中的一种或多种。
[0141] 本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的抗PACAP抗体或片段或组合物，其可用于缓解、控制、降低头痛的发病率或延迟头痛发展或进展，所述头痛例如先兆偏头痛或无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、慢性偏头痛、药物过度使用头痛或紧张性头痛。在本发明的一个实施方案中，所述用途可为用于可已预先接受或可正在接受抗CGRP抗体或抗体片段和/或抗 CGRP受体抗体或抗体片段的受试者；并且/或者其中所述受试者可为对抗CGRP抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段治疗不充分应答的偏头痛患者；并且/或者其中所述受试者可已预先接受至少一种抗CGRP抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段的施用，其可已引发对抗CGRP抗体或抗体片段和/或抗CGRP受体抗体或抗体片段的免疫应答。
[0143] 图1A-1B提供了通过其FR和CDR对齐的抗体Ab10、Ab20以及Ab21、Ab22和Ab23的可变重链区的多肽序列(分别为SEQ ID NO: 402；442；842；882；和922)。
[0144] 图2A-2B提供了通过其FR和CDR对齐的抗体Ab10、Ab20、 Ab21、Ab22和Ab23的可变轻链区的多肽序列(分别为SEQ ID NO: 422；462；862；902；和942)。
[0145] 图3A-3F提供了通过其FR和CDR对齐的编码抗体Ab10、Ab20、 Ab21、Ab22和Ab23的可变重链区的多核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:412；452；852；892；和932)。
[0146] 图4A-4E提供了通过其FR和CDR对齐的编码抗体Ab10、Ab20、 Ab21、Ab22和Ab23的可变轻链区的多核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:432；472；872；912；和952)。
[0147] 图5提供了某些抗体重链蛋白序列特征的多肽序列坐标，所述重链蛋白序列特征包括抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23的重链的可变区和CDR。
[0149] 图7提供了某些抗体轻链蛋白序列特征的多肽序列坐标，所述轻链蛋白序列特征包括抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23的轻链的可变区和CDR。
[0150] 图8提供了某些抗体轻链蛋白序列特征的多肽序列坐标，所述轻链蛋白序列特征包括抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23的轻链的恒定区和框架区FR。
[0151] 图9提供了某些抗体重链DNA序列特征的多核苷酸序列坐标，所述重链DNA序列特征包括抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23 的重链的可变区和CDR。
[0152] 图10供了某些抗体重链DNA序列特征的多核苷酸序列坐标，所述重链DNA序列特征包括抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23 的重链的恒定区和FR。
[0153] 图11提供了某些抗体轻链DNA序列特征的多核苷酸序列坐标，所述轻链DNA序列特征包括抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23 的轻链的可变区和CDR。
[0154] 图12提供了某些抗体轻链DNA序列特征的多核苷酸序列坐标，所述轻链DNA序列特征包括抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23 的轻链的恒定区和FR。
[0155] 图13A-F提供了按照下文的实施例1中的方案获得的Ab10(图 13A)、Ab20(图13B)、Ab21(图13C)、Ab1.H(图13D)、Ab22(图13E) 和Ab23(图13F)的代表性竞争性结合数据。
[0156] 图14A-H提供了按照下文的实施例5中的方案获得的代表性数据，其示出Ab10介导的(图14A)、Ab20介导的(图14B)、Ab21介导的(图14C)、Ab1.H介导的(图14D)、Ab10.H介导的(图14E)、Ab21.H 介导的(图14F)、Ab22介导的(图14G)和Ab23介导的(图14H)对 PACAP38与表达PAC1-R的PC-12细胞的结合的抑制。
[0157] 图15A-H提供了按照下文的实施例6中的方案获得的代表性数据，其示出在PACAP38的存在下Ab10(图15A)、Ab20(图15B)、 Ab21(图15C)、Ab1.H(图15D)、Ab10.H(图
15E)、Ab21.H(图15F)、 Ab22(图15G)和Ab23(图15H)与表达PAC1-R的PC-12细胞的结合。图
15A中的虚线代表没有PACAP并且没有抗体对照。
15E)、Ab21.H(图15F)、 Ab22(图15G)和Ab23(图15H)与表达PAC1-R的PC-12细胞的结合。图
15A中的虚线代表没有PACAP并且没有抗体对照。
[0158] 图16A-H提供了按照下文的实施例1中的方案获得的代表性数据，其示出Ab10介导的(图16A)、Ab20介导的(图16B)、Ab21介导的(图16C)、Ab1.H介导的(图16D)、Ab10.H介导的(图16E)、Ab21.H 介导的(图16F)、Ab22介导的(图16G)和Ab23介导的(图16H)对 PACAP38驱动的通过表达PAC1-R的PC-12细胞的cAMP产生的抑制。
[0159] 图17A-H提供了按照下文的实施例1中的方案获得的代表性数据，其示出Ab10介导的(图17A)、Ab20介导的(图17B)、Ab21介导的(图17C)、Ab1.H介导的(图17D)、Ab10.H介导的(图17E)、Ab21.H 介导的(图17F)、Ab22介导的(图17G)和Ab23介导的(图17H)对 PACAP27驱动的通过表达PAC1-R的PC-12细胞的cAMP产生的抑制。
[0160] 图18A-H提供了按照下文的实施例3中的方案获得的代表性数据，其示出Ab10介导的(图18A)、Ab20介导的(图18B)、Ab21介导的(图18C)、Ab1.H介导的(图18D)、Ab10.H介导的(图18E)、Ab21.H 介导的(图18F)、Ab22介导的(图18G)和Ab23介导的(图18H)对PACAP38驱动的通过表达VPAC1-R的CHO-K1细胞的cAMP产生的抑制。
[0161] 图19A-H提供了按照下文的实施例4中的方案获得的代表性数据，其示出Ab10介导的(图19A)、Ab20介导的(图19B)、Ab21介导的(图19B)、Ab1.H介导的(图19D)、Ab10.H介导的(图19E)、Ab21.H 介导的(图19F)、Ab22介导的(图19G)和Ab23介导的(图19H)对 PACAP38驱动的通过表达VPAC2-R的CHO-K1细胞的cAMP产生的抑制。
[0162] 图20提供了按照下文的实施例7中的方案获得的代表性数据，其示出通过在兔模型中施用PACAP38之后施用Ab1.H所获得的相对于媒介物对照的血管舒张的减少。
[0163] 图21提供了按照下文的实施例8中的方案获得的代表性数据，其示出通过在兔模型中施用PACAP38之后施用Ab10所获得的相对于同种型抗体对照的血管舒张的减少。
[0164] 图22A提供了根据下文的实施例9中的方案获得的标记的Ab1 和未标记的Ab10的表位分级数据。
[0165] 图22B提供了根据下文的实施例9中的方案获得的标记的Ab1 和未标记的Ab10的表位分级数据。
[0166] 图23提供了根据下文的实施例11中的方案获得的代表性数据，其示出在啮齿动物畏光模型中PACAP和抗PACAP抗体Ab1.H的施用在体内的效果，所述模型与适当的对照动物相比，每5分钟间隔检测处理的动物(小鼠)在光下度过的时间的量。
[0167] 图24提供了根据下文的实施例11中的方案获得的代表性数据，其示出在啮齿动物畏光动物模型中PACAP和抗PACAP抗体Ab1.H 的施用在体内的效果，所述模型与适当的对照动物相比，检测了处理的动物(小鼠)在光下度过的时间的平均量。
[0168] 图25提供了根据下文的实施例11中的方案获得的代表性数据，其示出在啮齿动物畏光模型中PACAP和抗PACAP抗体Ab10.H的施用在体内的效果，所述模型与适当的对照动物相比，每5分钟间隔检测处理的动物(小鼠)在光下度过的时间的量。
[0169] 图26A呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab10与PACAP丙氨酸扫描突变体19A、22A、23A和27A以及对照(包括野生型PACAP(标记为huPACAP(1-38))(阳性对照)和1x 运行缓冲液(阴性对照))的结合的表面等离子体共振结合动力学测量结果。
[0170] 图26B呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab10与PACAP丙氨酸扫描突变体1A-18A、20A、21A、24V-26A 和28A-38A以及对照(包括野生型PACAP(标记为huPACAP (1-38))(阳性对照)和1x运行缓冲液(阴性对照))的结合的表面等离子体共振结合动力学测量结果。
[0171] 图27A呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab20与PACAP丙氨酸扫描突变体19A、22A、23A、24V和27A 以及对照(包括野生型PACAP(标记为huPACAP(1-38))(阳性对照)和 1x运行缓冲液(阴性对照))的结合的表面等离子体共振结合动力学测量结果。
[0172] 图27B呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab20与PACAP丙氨酸扫描突变体1A-18A、20A、21A、25A、 26A和28A-38A以及对照(包括野生型PACAP(标记为huPACAP (1-38))(阳性对照)和1x运行缓冲液(阴性对照))的结合的表面等离子体共振结合动力学测量结果。
[0173] 图28A呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab21与PACAP丙氨酸扫描突变体19A、22A、23A和27A以及对照(包括野生型PACAP(标记为huPACAP(1-38))(阳性对照)和1x 运行缓冲液(阴性对照))的结合的表面等离子体共振结合动力学测量结果。
[0174] 图28B呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab21与PACAP丙氨酸扫描突变体1A-18A、20A、21A、24V-26A 和28A-38A以及对照(包括野生型PACAP(标记为huPACAP (1-38))(阳性对照)和1x运行缓冲液(阴性对照))的结合的结合动力学测量结果。
[0175] 图29A呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab22与PACAP丙氨酸扫描突变体22A、23A、27A、28A和31A 以及对照(包括野生型PACAP(标记为huPACAP(1-38))(阳性对照)和 1x运行缓冲液(阴性对照))的结合的表面等离子体共振结合动力学测量结果。
[0176] 图29B呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab22与PACAP丙氨酸扫描突变体1A-21A、24V-26A、29A和 30A以及对照(包括野生型PACAP(标记为huPACAP(1-38))(阳性对照)和1x运行缓冲液(阴性对照))的结合的表面等离子体共振结合动力学测量结果。
[0177] 图30A呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab23与PACAP丙氨酸扫描突变体12A、20A、23A、24V、26A、 27A和28A以及对照(包括野生型PACAP(标记为huPACAP (1-38))(阳性对照)和1x运行缓冲液(阴性对照))的结合的表面等离子体共振结合动力学测量结果。
[0178] 图30B呈现了根据下文的实施例12中的方案获得的抗PACAP 抗体Ab23与PACAP丙氨酸扫描突变体1A-11A、13A-19A、21A、 22A、25V和29A-31A以及对照(包括野生型PACAP(标记为 huPACAP(1-38))(阳性对照)和1x运行缓冲液(阴性对照))的结合的表面等离子体共振结合动力学测量结果。
[0179] 图31A呈现了PACAP丙氨酸扫描突变体对抗体结合的影响的总结。在图31A的列1中，以其沿氨基酸残基1-27的VIP一级序列的空间排列的顺序列出VIP残基。在图31A的列2中，以其沿氨基酸残基1-27的PACAP一级序列的空间排列的顺序列出PACAP残基。图31A的列3提供了VIP和PACAP二者的残基1-27中的每个对应的数字，如沿其一级序列空间排列的。在图31A的列4-8中列出了丙氨酸扫描研究期间测试的每种抗体(例如像Ab10、Ab20)和被确定有助于PACAP/抗体结合的PACAP残基(例如像5A、6A)。
[0180] 图31B呈现了PACAP丙氨酸扫描突变体对抗体结合的影响的总结。在图31B的列1中，列出了VIP残基28。在图31B的列2中，以其沿氨基酸残基28-38的PACAP一级序列的空间排列的顺序列出 PACAP残基。图31B的列3提供了VIP的残基28和PACAP的残基 28-38中的每个对应的数字，如沿其一级序列空间排列的。在图31B 的列4-8中列出了丙氨酸扫描研究期间测试的每种抗体(例如像 Ab10、Ab20)和被确定有助于PACAP/抗体结合的PACAP残基(例如像5A、6A)。
[0181] 详述
[0182] 定义
[0183] 应了解本发明不限于本身可能变化的所述特定方法、方案、细胞系、动物物种或属类和试剂。还应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，且不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求限定。除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一”和“所述”包括复数个指示物。因此，举例来说，提及“一细胞”包括复数个所述细胞且提及“所述蛋白质”包括提及一种或多种蛋白质及其本领域技术人员所知的等效物等。除非另外明确指示，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域中的普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0184] 垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)：如本文所用，除非另外说明，否则PACAP包括任何哺乳动物形式的PACAP，并且具体地包括以下智人(Homo sapiens)PACAP27和智人PACAP38氨基酸序列：
[0185] PACAP38：
[0186] HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK(SE Q ID NO:1241)，其中C末端赖氨酸被酰胺化；而且还有此序列的任何突变体、剪接变体、同种型、直向同源物、同系物和变体。
[0187] PACAP27：
[0188] HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL(SEQ ID NO:1242)，其中C末端亮氨酸被酰胺化；而且还有此序列的任何突变体、剪接变体、同种型、直向同源物、同系物和变体。
[0189] 本文中的“畏光”是指对光的视觉感知异常不耐受的症状，有时另外通过光的异常或非理性恐惧或者通过眼睛的实际物理光敏性的存在来定义。在本发明中，畏光具体地包括与偏头痛、丛集性头痛以及可以触发偏头痛或丛集性头痛的光厌恶行为的其它神经原因相关联的光厌恶。由于与眼睛或神经系统有关的若干不同的医学病状，患者 /受试者可以发展畏光。畏光可以由视觉系统中的在任何步骤开始的对光的应答反应增加引起，诸如：(i)进入眼睛的光过多，(ii)如果眼睛受到损坏(诸如角膜磨损和视网膜损坏)或瞳孔无法正常收缩(参见动眼神经损坏)，进入眼睛的光过多，(iii)视网膜中光感受器过度刺激， (iv)对视神经的过度电脉冲，和(v)中枢神经系统中的过度应答。
[0190] 本文中的“有效治疗或预防畏光”是指在有需要的受试者中抑制光厌恶行为或畏光或者抑制光厌恶行为或畏光的发病，所述受试者例如在施用有效量的根据本发明的抗PACAP抗体或其抗原结合片段之后，患有活动性偏头痛发作或丛集性头痛的受试者，或者易患偏头痛或丛集性头痛或本文鉴定的其它畏光相关联的病症之一的受试者。治疗可作为单一疗法或与另一种活性剂(诸如托吡酯或二氢麦角胺联合，以举例的方式)来实施。
[0191] 术语“偏头痛”是指复杂的和致残的神经病症，其可在四个阶段中进展：前驱症状、先兆、头痛和头痛后期。偏头痛被国际头痛学会定义为持续4-72小时的头痛，并且其特征在于以下中的至少两项：单侧定位、脉动特点、中度至重度疼痛强度；以及通过运动(诸如行走) 恶化。另外，头痛必须伴有以下中的至少一种：恶心和/或呕吐、畏光或高声恐怖。偏头痛还可伴有先兆，其通常先于预兆或前驱症状阶段期间的期限，并且常常导致视觉变化，例如跨视野移动的闪烁的暗点。前驱症状还可伴有其它症状，例如疲劳、胃肠道问题和情绪变化。偏头痛常常在长时间内无行为能力。头痛后期是最后阶段并且发生在头痛发作之后，在此期间偏头痛患者可能感到疲惫或轻度欣快。
[0192] 术语“头痛”是指头部任何区域的疼痛。头痛可发生在头部的一侧或两侧，被隔离到某一位置，从一点辐射整个头部，或者具有类似被钳住的特点。头痛可为锐痛、搏动感或钝痛。头痛可逐渐或突然出现，并且可持续不到一小时或持续几天。
[0193] 术语“疼痛相关联的疾病或病状”是指全部或部分由急性和/或慢性疼痛定义的任何疾病或病状。疼痛通常被定义为与实际或潜在的组织损坏相关联的令人不愉快的感觉和情感体验，或者在此类损坏方面进行描述。疼痛可分为神经源性、神经性、炎性或伤害性。
[0194] 本文中的术语“阿片类止痛剂”是指具有类似吗啡作用的天然的或合成的所有药物。合成和半合成的阿片类止痛剂是五种化学类别的化合物的衍生物：菲；苯庚胺；苯基哌啶；吗啡；和苯并吗啡，所有这些都在所述术语的范围内。示例性阿片类止痛剂包括可待因、二氢可待因、二乙酰吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、左啡诺、羟吗啡酮、阿芬太尼、丁丙诺啡、布托啡诺、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、纳布啡、丙氧芬和喷他佐辛或其药学上可接受的盐。
[0195] 术语“NSAID”是指非类固醇抗炎化合物。NSAID由于其抑制环氧合酶的能力而被分类。环氧合酶1和环氧合酶2是环氧合酶的两种主要同种型，并且大多数标准NSAID是两种同种型的混合抑制剂。大多数标准NSAID属于以下五种结构种类之一：(1)丙酸衍生物，诸如布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯芬酸和酮洛芬；(2)乙酸衍生物，诸如托美丁和舒林酸；(3)芬那酸衍生物，诸如甲芬那酸和甲氯芬那酸； (4)联苯羧酸衍生物，诸如二氟尼柳和氟苯柳；和(5)昔康类，诸如吡罗昔康、舒多昔康和伊索昔康。已经描述了选择性地抑制环氧合酶2 的另一种类别的NSAID。COX-2抑制剂已经描述于美国专利号 5,616,601；5,604,260；5,593,994；5,550,142；5,536,752；5,521,213； 5,475,995；5,639,780；5,604,253；5,552,422；5,
510,368；5,436,265； 5,409,944；和5,130,311中，所述专利全部以引用的方式并入本文。
某些示例性COX-2抑制剂包括塞来昔布(SC-58635)、DUP-697、氟舒胺(CGP-28238)、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸(6-MNA)、罗非昔布、 MK-966、萘丁美酮(6-MNA的前药)、尼美舒利、NS-398、SC-5766、 SC-58215、T-614；或其组合。
510,368；5,436,265； 5,409,944；和5,130,311中，所述专利全部以引用的方式并入本文。
某些示例性COX-2抑制剂包括塞来昔布(SC-58635)、DUP-697、氟舒胺(CGP-28238)、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸(6-MNA)、罗非昔布、 MK-966、萘丁美酮(6-MNA的前药)、尼美舒利、NS-398、SC-5766、 SC-58215、T-614；或其组合。
[0196] 如本文所用，“治疗”是用于获得有益或所需的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：改善PACAP相关病状(诸如偏头痛或头痛)的任何方面。例如在头痛或偏头痛治疗的情况下，这包括减轻严重性、缓和疼痛强度和其它相关症状，减少复发频率，增加头痛患者的生活质量，以及减少治疗头痛所需要的其它药物的剂量。对于偏头痛，其它相关联的症状包括但不限于恶心，呕吐以及对光、声和/或运动的敏感。对于丛集性头痛，其它相关联的症状包括但不限于眼睛下方或周围肿胀、眼泪过多、红眼、鼻漏或鼻塞以及面红。
[0197] “减少发病率”或“预防(prophylaxis)”或“预防(prevention)”意指特定疾病、病状、症状或病症(术语疾病、病状和病症在整个申请中可互换使用)的任何降低的严重性。严重性的降低包括通过例如减少对药物或疗法的需要、量和/或暴露来减少通常用于所述病状的药物和/ 或疗法。严重性的降低还包括减少特定病状、症状或病症的持续时间和/或频率(包括例如延迟或增加个体下次发作的时间)。
[0198] “缓解”头痛或偏头痛或其它PACAP相关病状的一种或多种症状意指，与不施用抗PACAP拮抗剂抗体相比，减轻或改善所述病状(例如头痛或偏头痛)的一种或多种症状。“缓解”还包括缩短或减少症状的持续时间。
[0199] 如本文所用，“控制头痛”或“控制偏头痛”或“控制”另一种PACAP 相关病状是指维持或减少所述病状(例如头痛或偏头痛)的一种或多种症状的严重性或持续时间，或者个体头痛或偏头痛发作频率(与治疗前水平相比)。例如，与治疗前的水平相比，个体中头痛的持续时间或严重性或者发作频率减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％或100％中的任一个。头痛的持续时间或严重性或者发作频率的减少可以持续任何时间长度，例如2周、4周(1个月)、8周(2个月)、16周(3个月)、4个月、5个月、6个月、9个月、 12个月等。
[0200] 如本文所用，“延迟”PACAP有关病状(诸如偏头痛或头疼)的发展是指推迟、阻碍、减缓、阻滞、稳定和/或延缓病状或疾病的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，取决于病状或疾病史和/或进行治疗的个体。如本领域技术人员显而易见的，足够的或显著的延迟实际上可以包括预防，因为个体不会发展头痛(例如偏头痛)。“延迟”症状发展的方法是与不使用该方法相比，在给定时间框架内减少发展症状的概率和/或在给定时间框架内减少症状的程度的方法。此类比较通常基于使用统计学上显著数目的受试者的临床研究。
[0201] PACAP相关病状(诸如偏头痛或头痛)的“发展”或“进展”意指病症的最初的表现和/或接着发生的进展。使用本领域中众所周知的标准临床技术可以检测并评估头痛或偏头痛的发展。然而，发展还指可能不可检测的进展。出于本发明的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发病。如本文所用，病状(诸如头痛或偏头痛)的“发病”或“发生”包括最初发病和/或复发。
[0202] 如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现有益或所需的结果的量。对于预防性用途，有益或所需的结果包括以下结果，诸如消除或降低风险、减轻严重性或延迟疾病的发病，其包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，疾病的并发症以及在疾病发展期间呈现的中间病理表型。对于治疗性用途，有益或所需的结果包括以下临床结果，诸如降低疼痛强度、持续时间或头痛发作频率，以及减少由头痛引起的一种或多种症状(生物化学、组织学和/或行为症状)(其包括疾病的并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表型)，增加患有疾病的人的生活质量，减少治疗疾病所需要的其它药物的剂量，增强另一种药物的效果和/或延迟患者疾病的进展。有效剂量可以在一次或多次施用中施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接地完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床情况中所了解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可或不可与另一种药物、化合物或药物组合物联合来实现。因此，在施用一种或多种治疗剂的情况下，可考虑“有效剂量”，并且如果与一种或多种其它药剂联合，则可考虑以有效量给予单一试剂，可实现希望的结果。
[0203] “合适的宿主细胞”或“宿主细胞”通常包括可以使用容易获得的技术和材料在其中重组产生本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段的任何细胞。例如，本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段可以根据常规技术在遗传工程改造的宿主细胞中产生。合适的宿主细胞是那些可以用外源DNA转化或转染并在培养物中生长的细胞类型，其包括细菌、真菌细胞(例如酵母)和培养的高等真核细胞(包括多细胞生物体的培养细胞)，特别是培养的哺乳动物细胞，例如人或非人哺乳动物细胞。在一个示例性实施方案中，这些抗体可在CHO细胞中表达。Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2 版,Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，以及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等编， New York,NY:Green and Wiley and Sons(1993)公开了用于操作克隆的DNA分子并将外源DNA引入到多种宿主细胞中的技术。
[0204] 在一些示例性实施方案中，抗体可在接合感受态酵母(例如可以在培养物中生长的任何单倍体、二倍体或四倍体酵母)中表达。可用于发酵表达方法的可以单倍体、二倍体或其它多倍体形式存在。给定倍数性的细胞可在适当条件下以所述形式增殖无限代数。二倍体细胞也可以生成孢子以形成单倍体细胞。连续接合可通过二倍体菌株的进一步接合或融合来产生四倍体菌株。本发明预期单倍体酵母以及例如通过接合或原生质球融合产生的二倍体或其它多倍体酵母细胞的用途。以举例的方式，此类酵母可包括酵母科(Saccharomycetaceae)的成员，所述酵母科包括阿克斯酵母属；类盘酵母属；固囊酵母属；
德巴利酵母属；德克酵母属；假囊酵母属；伊萨酵母属；哈萨克斯坦酵母属；克鲁维酵母属；
柯达酵母属；路德酵母属；管囊酵母属；毕赤酵母属；酵母属；土星形酵母属；四盾酵母属；有孢圆酵母属；拟威尔酵母属；以及接合酵母属。潜在用于本发明的其它酵母类型包括耶罗威亚酵母属(Yarrowia)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium)；假丝酵母属 (Candida)；汉逊酵母属(Hansenula)；线黑粉酵母属(Filobasium)；锁掷酵母属(Sporidiobolus)；布勒掷孢酵母属(Bullera)；白冬孢酵母属 (Leucosporidium)和拟线黑粉酵母属Filobasidella)。
德巴利酵母属；德克酵母属；假囊酵母属；伊萨酵母属；哈萨克斯坦酵母属；克鲁维酵母属；
柯达酵母属；路德酵母属；管囊酵母属；毕赤酵母属；酵母属；土星形酵母属；四盾酵母属；有孢圆酵母属；拟威尔酵母属；以及接合酵母属。潜在用于本发明的其它酵母类型包括耶罗威亚酵母属(Yarrowia)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium)；假丝酵母属 (Candida)；汉逊酵母属(Hansenula)；线黑粉酵母属(Filobasium)；锁掷酵母属(Sporidiobolus)；布勒掷孢酵母属(Bullera)；白冬孢酵母属 (Leucosporidium)和拟线黑粉酵母属Filobasidella)。
[0205] 在本发明的一个优选示例性实施方案中，用于抗体表达的接合感受态酵母可包括毕赤酵母属的成员。在本发明的另一优选示例性实施方案中，毕赤酵母属的接合感受态酵母是以下物种之一：巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母)。在本发明的一个特别优选的实施方案中，毕赤酵母属的接合感受态酵母是巴斯德毕赤酵母物种。
[0206] 本文中的“可选择标记”是指基因或基因片段，其在如例如通过转化事件接受所述基因的细胞上赋予生长表型(物理生长特征)。可选择标记允许所述细胞在未接受所述可选择标记基因的细胞不能在其中生长的条件下在选择性生长培养基中存活并生长。可选择标记基因通常属于若干类型，其包括阳性可选择标记基因，诸如赋予细胞对抗生素或其它药物、温度(当两个温度敏感性(“ts”)突变体杂交或ts突变体被转化时)的抗性的基因；阴性可选择标记基因，诸如生物合成基因，其赋予细胞在不存在不具有所述生物合成基因的所有细胞所需的特定养分的培养基中生长的能力，或诱变生物合成基因，其赋予细胞无法通过不具有野生型基因的细胞生长的能力；等。合适的标记包括但不限于：ZEO；G418；LYS3；MET1；MET3a；ADE1；ADE3；URA3；等。
[0207] 本文中的“表达载体”是指含有元件的DNA载体，所述元件促进外源蛋白在靶宿主细胞(例如细菌、昆虫、酵母、植物、两栖动物、爬行动物、禽类或哺乳动物细胞以及最通常为酵母或哺乳动物细胞，例如CHO细胞)中表达的操作。方便地，序列操作和用于转化的DNA 的产生首先在细菌宿主(例如大肠杆菌(E.coli))中执行，并且载体通常将包括促进此类操纵的序列，包括细菌复制起点和适当的细菌选择标记。选择标记编码在选择性培养基中生长的转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中将不会存活。典型的选择基因编码以下蛋白质：其(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，(b)弥补营养缺陷不足，或(c)供应不可从复合培养基获得的关键养分。用于酵母转化的示例性载体和方法例如描述于Burke,D.、Dawson,D.和Stearns,T.，Methods in yeast genetics:a Cold Spring Harbor Laboratory course manual,Plainview,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000)中。
[0208] 用于本发明的方法中的表达载体可包括酵母或哺乳动物特异性序列，其包括用于鉴定转化的宿主菌株的可选择营养缺陷或药物标记。药物标记还可用于扩增载体在酵母宿主细胞中的拷贝数。
[0209] 目标多肽编码序列可操作地连接到提供多肽在所需宿主细胞(例如，酵母或哺乳动物细胞)中的表达的转录和翻译调控序列。这些载体组件可包括但不限于以下一个或多个：增强子元件、启动子和转录终止序列。也可包括用于分泌多肽的序列，例如信号序列等。复制起点(例如酵母复制起点)是任选的，因为常常将表达载体整合到宿主细胞基因组中。
在本发明的一个实施方案中，目标多肽可操作地连接或融合到提供多肽从酵母二倍体细胞中最优分泌的序列。
在本发明的一个实施方案中，目标多肽可操作地连接或融合到提供多肽从酵母二倍体细胞中最优分泌的序列。
[0210] 核酸在放置成与另一个核酸序列呈功能性关系时是“可操作地连接”的。例如，如果信号序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它可操作地连接到所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列转录，则它可操作地连接到编码序列。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的且位于阅读框中。然而，增强子不必是连续的。通过在适宜的限制位点处进行连接或者可替代地通过本领域技术人员精通的PCR/重组方法(GATEWAYR Technology；Invitrogen，Carlsbad
California)来完成连接。如果此类位点不存在，则根据常规规范使用合成寡核苷酸衔接头或接头。
California)来完成连接。如果此类位点不存在，则根据常规规范使用合成寡核苷酸衔接头或接头。
[0211] 启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')(通常在约100至1000 bp内)的非翻译序列，其控制它们所可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。所述启动子属于若干类别：诱导型、型和阻抑型(其响应于不存在阻遏物来增加转录水平)。诱导型启动子可响应于培养条件的某一变化(例如存在或不存在某一养分或温度变化)来启动在它们的控制下来自DNA的转录水平的增加。
[0212] 启动子片段也可充当表达载体的同源重组和整合到宿主细胞(例如酵母细胞)基因组中的相同位点中的位点；或者可选择标记可用作同源重组的位点。毕赤酵母转化描述于Cregg等，Mol.Cell.Biol.， 5:3376-3385(1985)中。用于不同真核细胞和原核细胞的合适的启动子是众所周知的并且是可商购获得的。
[0213] 目标多肽不仅可直接重组产生，而且也作为异源多肽的融合多肽产生，所述异源多肽例如信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端上具有特定裂解位点的其它多肽。通常，信号序列可为载体的组件，或者其可为插入到载体中的多肽编码序列的一部分。优选选择的异源信号序列是通过宿主细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞) 内可用的标准途径之一识别并加工的信号序列。另外，这些信号肽序列可被工程改造以在表达系统中提供增强的分泌。目标分泌信号也包括哺乳动物和酵母信号序列，其可与所分泌的蛋白质异源，或可为所分泌的蛋白质的天然序列。信号序列包括前肽序列，并且在一些情况下可包括原肽序列。许多此类信号序列在本领域中是已知的，包括在免疫球蛋白链上发现的信号序列，例如K28前原毒素序列、PHA-E、 FACE、人MCP-1、人血清白蛋白信号序列、人Ig重链、人Ig轻链等。例如，参见Hashimoto等，Protein Eng.,11(2):75(1998)；和 Kobayashi等.，Therapeutic Apheresis,2(4):257(1998)。
[0214] 可通过将转录激活因子序列插入到载体中来增加转录。这些激活因子为DNA的顺式作用元件，通常为约10至300bp，其作用于启动子以增加它的转录。转录增强子相对不依赖于定向和位置，已在转录单位的5'和3'、在内含子内以及在编码序列自身内发现。增强子可拼接到表达载体中编码序列的5'或3'位置处，但优选位于启动子的5' 位点处。
[0215] 用于真核宿主细胞中的表达载体也可含有终止转录和稳定 mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA 的非翻译区域中的翻译终止密码子的3'处获得。
这些区域含有转录为 mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
这些区域含有转录为 mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
[0216] 含有上文列出的组件中的一种或多种的合适载体的构建采用标准连接技术或PCR/重组方法。对分离的质粒或DNA片段进行裂解、裁适并且以产生需要的质粒所需的形式或通过重组方法再连接。对于确认所构建质粒中的正确序列的分析，使用连接混合物来转化宿主细胞，并且适当时根据抗生素(例如氨苄青霉素或博莱霉素)抗性选择成功转化体。
由转化体制备质粒，通过限制性核酸内切酶消化进行分析，并且/或者测序。
由转化体制备质粒，通过限制性核酸内切酶消化进行分析，并且/或者测序。
[0217] 作为片段的限制和连接的一种替代方案，可使用基于特异性附着 (“att”)位点和重组酶的重组方法将DNA序列插入到载体中。此类方法例如由Landy,Ann.Rev.Biochem.,58:913-949(1989)描述；并且是本领域技术人员已知的。此类方法利用由λ和大肠杆菌编码的重组蛋白质的混合物介导的分子间DNA重组。重组发生在相互作用DNA 分子上的att位点之间。关于att位点的描述，参见Weisberg和Landy， Site-Specific Recombination in Phage Lambda,in Lambda II,211-250页, Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Press(1983)。转换侧接重组位点的DNA区段，以使得在重组之后，att位点是包含由各亲本载体贡献的序列的杂交序列。重组可发生在具有任何拓扑结构的DNA 之间。
[0218] 可通过将目标序列连接至适当载体中；通过使用特定引物产生含有att B位点的PCR产物；产生克隆到含有att位点的适当载体中的 cDNA文库等来将att位点引入目标序列中。
[0219] 如本文所用，折叠是指多肽和蛋白质的三维结构，其中氨基酸残基之间的相互作用用于使结构稳定。尽管非共价相互作用在决定结构方面是重要的，但通常目标蛋白质将具有由两个半胱氨酸残基形成的分子内和/或分子间共价二硫键。对于天然存在的蛋白质和多肽或其衍生物和变体而言，适当折叠通常是产生最优生物活性的排列，并且可以方便地通过活性测定(例如配体结合、酶活性)等来监测。
[0220] 在一些情况下，例如当所需产物是合成来源时，基于生物活性的测定的意义将较小。可基于物理性质、能量考虑、建模研究等来确定此类分子的适当折叠。
[0221] 表达宿主可通过引入编码增强折叠和二硫键形成的一种或多种酶(即折叠酶、伴侣蛋白等)的序列进行进一步修饰。可使用如本领域中已知的载体、标记等在酵母宿主细胞中组成性或诱导性表达此类序列。优选通过靶向方法将足以达成所需表达样式的序列(包括转录调控元件)稳定整合在酵母基因组中。
[0222] 例如，真核蛋白质二硫键异构酶(“PDI”)不仅是蛋白质半胱氨酸氧化和二硫键异构化的高效催化剂，而且也展现伴侣蛋白活性。共表达 PDI可促进具有多个二硫键的活性蛋白质的产生。也关注免疫球蛋白重链接合蛋白(“BIP”)；亲环蛋白等的表达。在本发明的一个实施方案中，各单倍体亲本菌株都表达不同的折叠酶，例如一种菌株可表达 BIP，而另一菌株可表达PDI或其组合。
[0223] 培养的哺乳动物细胞也是用于产生所公开的抗PACAP抗体及其抗原结合片段的优选示例性宿主。如所叙述的，CHO细胞特别适用于抗体的表达。本领域已知许多用于在哺乳动物细胞中制造单克隆抗体的程序。(参见Galfre,G.和Milstein,C.，Methods Enzym.,73:3-46， 1981；Basalp等，Turk.J.Biol.,24:189-196,2000；Wurm,F.M.,Nat. Biotechnol.,
22:1393-1398,2004；以及Li等，mAbs,2(5):466-477,2010)。如下文进一步详细叙述的，哺乳动物单克隆抗体制造路线中采用的常见的宿主细胞系包括但不限于人胚胎成视网膜细胞系PER (Crucell N.V.,Leiden,The Netherlands)、NS0鼠骨髓瘤细胞(Medical
Research Council,London,，UK)、CV1猴肾细胞系、293人胚胎肾细胞系、BHK幼仓鼠肾细胞系、VERO非洲绿猴肾细胞系、人宫颈癌细胞系HELA、MDCK犬肾细胞、BRL布法罗大鼠肝细胞、W138人肺细胞、HepG2人肝细胞、MMT小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC5 细胞、Fs4细胞、骨髓瘤或淋巴瘤细胞或灰仓鼠(Cricetulus griseus)卵巢(CHO)细胞等。本领域已知的生产重组单克隆抗体的有用且优化的 CHO细胞的许多不同的亚克隆或亚细胞系(诸如DP12(CHO K1 dhfr-) 细胞系、NS0细胞)是对氮鸟嘌呤抗性的NS-1细胞的非Ig分泌、非轻链合成的亚克隆。其它中国仓鼠和CHO细胞可商购获得(来自 ATCC等)，包括CHO-DXB11(CHO-DUKX)、CHO-pro3、CHO-DG44、CHO 1-15、CHO DP-12、Lec2、M1WT3、Lec8、pgsA-745等，其全部都经遗传改变以优化细胞系的各种参数。单克隆抗体通常使用分批补料法来制造，其中单克隆抗体链在哺乳动物细胞系中表达并分泌到生物反应器中的组织培养基中。将培养基(或料)连续供应到生物反应器以使重组蛋白质表达最大化。然后从收集的培养基中纯化重组单克隆抗体。在一些情况下，需要另外的步骤通过二硫键等的还原来重新组装抗体。此类生产方法可以在单个批次或更多个批次中扩展到 10,000L。现在常规的是通过使用此类细胞系和方法从10kL至25kL 的生物反应器中获得高达20pg/细胞/天，提供高达10g/L或更高的效价，共达15至100kg。(Li等，2010)。以下提供这种生产方法的各种细节，包括将编码抗体的多核苷酸克隆到表达载体中，用这些表达载体转染细胞，选择转染的细胞，以及从这些细胞中表达并纯化重组单克隆抗体。
22:1393-1398,2004；以及Li等，mAbs,2(5):466-477,2010)。如下文进一步详细叙述的，哺乳动物单克隆抗体制造路线中采用的常见的宿主细胞系包括但不限于人胚胎成视网膜细胞系PER (Crucell N.V.,Leiden,The Netherlands)、NS0鼠骨髓瘤细胞(Medical
Research Council,London,，UK)、CV1猴肾细胞系、293人胚胎肾细胞系、BHK幼仓鼠肾细胞系、VERO非洲绿猴肾细胞系、人宫颈癌细胞系HELA、MDCK犬肾细胞、BRL布法罗大鼠肝细胞、W138人肺细胞、HepG2人肝细胞、MMT小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC5 细胞、Fs4细胞、骨髓瘤或淋巴瘤细胞或灰仓鼠(Cricetulus griseus)卵巢(CHO)细胞等。本领域已知的生产重组单克隆抗体的有用且优化的 CHO细胞的许多不同的亚克隆或亚细胞系(诸如DP12(CHO K1 dhfr-) 细胞系、NS0细胞)是对氮鸟嘌呤抗性的NS-1细胞的非Ig分泌、非轻链合成的亚克隆。其它中国仓鼠和CHO细胞可商购获得(来自 ATCC等)，包括CHO-DXB11(CHO-DUKX)、CHO-pro3、CHO-DG44、CHO 1-15、CHO DP-12、Lec2、M1WT3、Lec8、pgsA-745等，其全部都经遗传改变以优化细胞系的各种参数。单克隆抗体通常使用分批补料法来制造，其中单克隆抗体链在哺乳动物细胞系中表达并分泌到生物反应器中的组织培养基中。将培养基(或料)连续供应到生物反应器以使重组蛋白质表达最大化。然后从收集的培养基中纯化重组单克隆抗体。在一些情况下，需要另外的步骤通过二硫键等的还原来重新组装抗体。此类生产方法可以在单个批次或更多个批次中扩展到 10,000L。现在常规的是通过使用此类细胞系和方法从10kL至25kL 的生物反应器中获得高达20pg/细胞/天，提供高达10g/L或更高的效价，共达15至100kg。(Li等，2010)。以下提供这种生产方法的各种细节，包括将编码抗体的多核苷酸克隆到表达载体中，用这些表达载体转染细胞，选择转染的细胞，以及从这些细胞中表达并纯化重组单克隆抗体。
[0224] 对于抗PACAP抗体或抗原结合片段在哺乳动物细胞中的重组生产，通常将编码抗体或其片段的核酸插入到可复制载体中用于进一步克隆(扩增DNA)或表达。编码抗体的DNA可容易地分离并且使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合到编码抗体的重链和轻链的 DNA的寡核苷酸探针)来合成。载体组件通常包括但不限于以下中的一个或多个：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。启动子、终止子、可选择标记、载体和其它元件的选择是本领域普通技术人员水平内的常规设计的问题。许多此类元件在本领域中是已知的，并且通过商业供应商可获得。
[0225] 本发明的抗体可不仅直接重组产生，而且也作为异源多肽的融合多肽产生，所述异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N 末端上具有特定裂解位点的其它多肽。优选选择的同源或异源信号序列是通过宿主细胞识别并加工(即，由信号肽酶裂解)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列 (例如单纯疱疹病毒gD信号)是可用的。
[0226] 此类表达载体和克隆载体将通常含有能够使载体在一个或多个所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，此序列是能够使载体独立于宿主染色体DNA复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。此类序列对于多种细菌、酵母和病毒是众所周知的，例如，质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2mu 质粒起点适用于酵母和各种病毒起点(猿猴病毒40(“SV40”)，多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(“VSV”)或牛乳头瘤病毒(“BPV”)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(通常可使用SV40起点，仅因为它含有早期启动子)。
[0227] 这些载体通常还将含有选择基因，也称为可选择标记。典型的选择基因编码以下蛋白质：其(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)弥补营养缺陷不足，或(c)供应不可从复合培养基获得的关键养分，例如，编码芽孢杆菌的 D-丙氨酸消旋酶的基因。
[0228] 选择路线的一个实例利用药物来停滞宿主细胞的生长。药物选择通常用于选择已插入外源DNA的培养的哺乳动物细胞。此类细胞通常被称为“转染子”。已经在选择剂存在下培养并且能够将目标基因传给其子代的细胞被称为“稳定转染子”。此类优势选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。示例性可选择标记是编码对抗生素新霉素的抗性的基因。选择在新霉素型药物(诸如G-418等)存在下进行。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予抗药性并且从而在选择方案中存活的蛋白质。
[0229] 选择系统也可用于增加目标基因的表达水平，称为“扩增”的过程。转染子的扩增通常通过以下来发生：在低水平的选择剂存在下培养细胞，并且然后增加选择剂的量以选择产生高水平的引入的基因的产物的细胞。用于哺乳动物细胞的示例性合适的可选择标记是能够识别有能力吸收抗体核酸的细胞的可选择标记，诸如二氢叶酸还原酶 (“DHFR”)、胸苷激酶、金属硫蛋白I和金属硫蛋白II(优选灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
[0230] 例如，用于哺乳动物细胞的可扩增的可选择标记为二氢叶酸还原酶，其赋予对甲氨蝶呤的抗性。还可以使用其它抗药性基因(例如潮霉素抗性、多药抗药性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。用DHFR选择基因转化的细胞首先通过在含有甲氨蝶呤(“MTX”)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定。当词语野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞系。
[0231] 可替代地，可以通过在含有可选择标记的选择剂(诸如氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G-418)的培养基中的细胞生长来选择用编码抗体、野生型DHFR蛋白和另一种选择性标记(诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(“APH”))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞 (特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)。参见美国专利号 4,965,199。
[0232] 这些载体可包含促进编码抗体的DNA的转录的增强子序列。从哺乳动物基因(例如，珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)已知许多增强子序列。常用的增强子是源自真核细胞病毒的增强子。其实例包括复制起点(bp 100-270)的后侧上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子(参见Yaniv,Nature,297:17-18,1982，关于激活真核启动子的增强元件)。增强子可拼接到载体中抗体编码序列的5'或3'位置处，但优选位于启动子的5'位点处。
[0233] 表达和克隆载体还将通常包括由宿主生物体识别并且可操作地连接到抗体核酸的启动子。启动子序列对于真核生物是已知的。几乎所有的真核基因都具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的 AT富集区域。从许多基因转录开始的上游70至80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区域，其中N可为任何核苷酸。大多数真核基因的3'末端是AATAAA序列，其可为将多聚A尾添加到编码序列的3'末端的信号。将所有这些序列合适地插入到真核表达载体中。
[0234] 哺乳动物宿主细胞中来自载体的抗体转录例如通过从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、BPV、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒)基因组中获得的启动子来控制，并且最优选来自异源哺乳动物启动子的SV40，例如来自热休克启动子的肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。
[0235] SV40病毒的早期和晚期启动子作为也含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段方便地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为HindIII E限制性片段方便地获得。美国专利号4,419,446中公开了一种使用BPV作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利号4,601,978中描述了这种系统的修改。还参见Reyes等，Nature, 297:598-601(1982)关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人β干扰素cDNA。可替代地，可以将劳斯肉瘤病毒长末端重复用作启动子。
[0236] 可以使用强转录启动子，诸如来自SV40、巨细胞病毒或骨髓增殖性肉瘤病毒的启动子。参见例如美国专利号4,956,288和美国专利公布号20030103986。其它合适的启动子包括来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利号4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。用于哺乳动物细胞的表达载体包括已经分别以检索号98669、98668 和PTA-5266保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，10801 University Blvd.，Manassas，VA.USA)的pZP-1、 pZP-9和pZMP21，以及这些载体的衍生物。
[0237] 用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体也将通常含有终止转录和稳定 mRNA必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的 5'并且偶尔3'非翻译区域获得。这些区域含有转录为编码抗体的mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组件为牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO 94/11026及其中公开的表达载体。
[0238] 用于克隆或表达本发明的抗体的合适的宿主细胞包括上述原核生物、酵母或高等真核生物细胞。然而，在脊椎动物细胞中的兴趣最大，并且脊椎动物细胞在培养物中的繁殖已经成为常规程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例为用SV40转化的猴肾CV1细胞系 (COS-1(ATCC号CRL 1650)；和COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞(ATCC号CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.,36:59-72(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK， ATCC CCL 10，ATCC号CRL 1632；BHK 570，ATCC号CRL 10314)； CHO细胞(CHO-K1，ATCC号CCL 61；CHO-DG44，Urlaub等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980))；小鼠塞尔托利细胞(TM4， Mather，Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞 (HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT
060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；
MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。另外的合适的细胞系在本领域中是已知的，并且可从公共保藏处获得，诸如美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。
060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；
MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。另外的合适的细胞系在本领域中是已知的，并且可从公共保藏处获得，诸如美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。
[0239] 将宿主细胞用上述用于抗体产生的表达或克隆载体进行转化，并且在经改良适用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中进行培养。
[0240] 用于产生本发明的抗体的哺乳动物宿主细胞可在多种培养基中培养。可商购获得的培养基，诸如Ham’s F10(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)、最小必需培养基((“MEM”(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)、Roswell Park Memorial Institute-1640培养基(“RPMI-1640”，Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)以及杜尔贝科氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(“DMEM”Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)适用于培养宿主细胞。另外，Ham等，Meth.Enz.，58:44(1979)；Barnes等， Anal.Biochem.,102:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；
4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195或美国专利复审号30,985中所述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。必要时任何这些培养基都可补充有激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或等效能量来源。还可包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需补充剂。培养条件(诸如温度、 pH等)为先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对普通技术人员将是显而易见的。培养基和培养条件的发展和优化的方法在本领域是已知的(参见
Gronemeyer等，Bioengineering, 1(4):188-212,2014)。
4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195或美国专利复审号30,985中所述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。必要时任何这些培养基都可补充有激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或等效能量来源。还可包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需补充剂。培养条件(诸如温度、 pH等)为先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对普通技术人员将是显而易见的。培养基和培养条件的发展和优化的方法在本领域是已知的(参见
Gronemeyer等，Bioengineering, 1(4):188-212,2014)。
[0241] 在优化培养条件并选择优选的细胞系克隆之后，这些细胞最通常在生物反应器(许多模型可商购获得)中以分批补料过程进行培养(粘附细胞或悬浮培养物)，所述分批补料过程涉及用针对选定的特定细胞系优化并且出于此目的选择的培养基和料连续馈送到细胞培养物。 (参见Butler,M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,68:283-291，2005；和 Kelley,B.,mAb,1(5):443-452,2009)。灌注系统也可用于将培养基和料连续供应到培养物中，同时从生物反应器中取出相同体积的培养基。 (Wurm，2004)。也可商购获得的合成培养基可用于使细胞在分批补料培养中生长，避免从外部来源(诸如使用动物组分(诸如牛血清白蛋白等))污染的可能性。然而，无动物组分的水解产物可商购获得以帮助提高细胞密度、培养活力和生产力。(Li等，2010)。已经执行了许多研究以试图优化细胞培养基，所述研究包括仔细注意滚瓶中可用的顶部空间、生长和表达阶段期间的氧化还原电位、生产期间维持二硫键的还原剂的存在等(参见，例如Hutterer等，mAbs,5(4):608-613, 2013；和Mullan等，BMC Proceed.,5(Suppl 8):P110,2011)。已经开发了各种方法来解决重组单克隆抗体生产期间有害氧化的可能性。 (参见，例如美国专利号8,574,869)。培养的细胞可通过连续地或以分别施用的量馈送营养物来生长。常常通过在细胞生长期间使用探针通过直接连接到校准分析仪在线或通过操作员的干预离线监测各种过程参数，诸如细胞浓度、pH、温度、CO2、dO2、重量摩尔渗透压浓度、代谢物(诸如葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺和谷氨酸盐)的量等。培养步骤还通常涉及确保在培养物中生长的细胞通过本领域已知的任何方法维持转染的重组基因用于细胞选择。
[0242] 在发酵后，即达到最大细胞生长和重组蛋白质表达时，培养步骤通常之后通常是收获步骤，由此从培养基中分离细胞并且从而获得收获的细胞培养基。(参见Liu等.，mAbs,2(5):480-499,2010)。培养之后通常进行各种纯化步骤(涉及柱色谱法等)，以将重组单克隆抗体从细胞组分和细胞培养基组分中分离。产生重组单克隆抗体的这个阶段需要的准确的纯化步骤取决于蛋白质的表达的位置，即在细胞本身的胞质溶胶中，或更常见的优选的分泌到细胞培养基中的蛋白质路径中。可使用本领域已知的技术分离各种细胞组分，所述技术诸如差速离心技术、基于重力的细胞沉降和/或尺寸排阻色谱/过滤技术(其可以包括切向流微过滤或深层过滤)。(参见Pollock等，Biotechnol.Bioeng., 110:206-219,2013和Liu等，2010)。可通过使用连续盘式堆叠离心机大规模地实现细胞组分的离心，然后使用深层过滤器和膜过滤器进行澄清。(参见Kelley，2009)。大多数情况下，澄清后，由于蛋白质A 对抗体的Fc结构域的高亲和力，通过蛋白质A色谱法进一步纯化重组蛋白质，并且通常使用低pH/酸化洗脱步骤进行(通常将酸化步骤与预防性病毒灭活步骤组合)。使用酸性或阳离子聚电解质的絮凝和/或沉淀步骤也可用于将悬浮培养物中的动物细胞从可溶性蛋白质中分离。(Liu等，2010)。最后，通常使用阴离子和阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱(“HIC”)、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、使用陶瓷羟基磷灰石(Ca5(PO4)3OH)2的羟基磷灰石色谱以及这些技术的组合来改进重组单克隆抗体的溶液。所需的单克隆抗体的最终制剂和浓度可通过使用超速离心技术来实现。纯化产量通常为70％至80％。(Kelley， 2009)。
[0243] 术语“所需的蛋白质”或“所需的抗体”可互换使用并且通常是指如本文所描述的对靶标(即，PACAP)具有特异性的亲本抗体或源自它们的嵌合或人源化抗体或其结合部分。术语“抗体”意图包括具有与表位配合且识别表位的特定形状的任何含多肽链分子结构，其中一种或多种非共价结合相互作用使分子结构与表位之间的复合物稳定。原型抗体分子是免疫球蛋白，并且来自所有来源(例如人、啮齿动物、兔、母牛、绵羊、猪、狗、其它哺乳动物、鸡、其它禽类等)的所有类型的免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等都视为“抗体”。用于产生可用作改进本发明的起始材料的抗体的优选来源是兔。其实例包括嵌合抗体、人抗体和其它非人哺乳动物抗体、人源化抗体、单链抗体 (诸如scFv)、骆驼抗体、纳米抗体、IgNAR(例如，源自鲨鱼的单链抗体)、小分子免疫药物(SMIP)以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2等)(参见Streltsov等，Protein Sci.,14(11):2901-9,2005；Greenberg等，
Nature,374(6518):168-73,1995；Nuttall等，Mol.Immunol.,38(4):313-26, 2001；
Hamers-Casterman等，Nature,363(6428):446-8,1993；Gill等， Curr.Opin.Biotechnol.,(6):653-8,2006)。
Nature,374(6518):168-73,1995；Nuttall等，Mol.Immunol.,38(4):313-26, 2001；
Hamers-Casterman等，Nature,363(6428):446-8,1993；Gill等， Curr.Opin.Biotechnol.,(6):653-8,2006)。
[0244] 例如，可通过遗传工程改造产生抗体或抗原结合片段。在这个技术中，如同其它方法一样，使抗体产生细胞对所需的抗原或免疫原敏感。使用从抗体产生细胞分离的信使RNA作为模板以使用PCR扩增来制备cDNA。通过将扩增的免疫球蛋白cDNA的适当部分插入到表达载体中来产生各自含有保留初始抗原特异性的一个重链基因和一个轻链基因的载体的文库。通过组合重链基因文库与轻链基因文库来构建组合文库。这产生共表达重链和轻链(类似抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)的克隆的文库。将携带这些基因的载体共转染到宿主细胞中。当在转染的宿主中诱导抗体基因合成时，重链和轻链蛋白质自组装(self-assemble)以产生可以通过用抗原或免疫原筛选进行检测的活性抗体。
[0245] 目标抗体编码序列包括由天然序列编码的序列以及由于遗传密码的简并性而在序列方面与所公开核酸不同的核酸及其变体。变体多肽可以包括氨基酸(“aa”)取代、添加或缺失。氨基酸取代可以是保守的氨基酸取代或消除非必需氨基酸的取代，诸如改变糖基化位点的取代，或者通过取代或缺失一个或多个在功能上不必需的半胱氨酸残基来使错折叠最小化的取代。变体可以设计成保留或具有蛋白质的特定区域(例如功能结构域、催化氨基酸残基等)的增强的生物活性。变体也包括本文公开的多肽的片段，特别是生物活性片段和/或对应于功能结构域的片段。所克隆基因的体外诱变技术是已知的。本发明也包括已使用普通分子生物学技术修饰以改善它们对蛋白水解降解的抗性或优化溶解度性质或使它们更适合作为治疗剂的多肽。
[0246] 嵌合抗体可通过将从一个物种的抗体产生细胞获得的VL和VH区与来自另一个物种的恒定轻链和重链区组合，通过重组手段来制备。通常嵌合抗体利用啮齿动物或兔可变区和人恒定区以产生主要具有人结构域的抗体。此类嵌合抗体的产生在本领域中是众所周知的，并且可通过标准手段(如例如以引用的方式整体并入本文的美国专利号5,624,659中所述)来实现。还预期本发明的嵌合抗体的人恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区。
[0247] 将人源化抗体工程改造以含有甚至更多的人样免疫球蛋白结构域，并且仅并入动物来源的抗体的互补决定区。这通过仔细检查单克隆抗体的可变区的高变环的序列并且使它们与人抗体链的结构配合来完成。尽管表面上复杂，但所述过程在实践中是简明的。参见例如以引用的方式整体并入本文的美国专利号6,187,287。
[0248] 除了整个免疫球蛋白(或它们的重组对应物)之外，还可以合成包含表位结合位点的免疫球蛋白片段(例如，Fab'、F(ab')2或其它片段)。可以利用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或最小的免疫球蛋白。例如，用于本发明中的“Fv”免疫球蛋白可通过合成融合可变轻链区和可变重链区来产生。也关注抗体的组合，例如包含两种不同的Fv特异性的双抗体。在本发明的另一个实施方案中，免疫球蛋白片段包括小分子免疫药物(“SMIP”)、骆驼抗体、纳米抗体和IgNAR。
[0249] 免疫球蛋白及其片段可进行翻译后修饰例如以添加可用于本发明的方法和组合物的效应子部分(诸如化学接头)、可检测部分(诸如荧光染料、酶、毒素、底物、生物发光材料、放射性材料、化学发光部分等)、或特异性结合部分(诸如链霉亲和素、抗生物素蛋白或生物素) 等。下文提供另外的效应分子的实例。
[0250] 如果多核苷酸序列根据遗传密码的翻译产生多肽序列(即多核苷酸序列“编码”多肽序列)，则所述多核苷酸序列“对应”于所述多肽序列，如果两个序列编码相同多肽序列，则一个多核苷酸序列“对应”于另一多核苷酸序列。
[0251] DNA构建体的“异源”区域或结构域是未发现与自然界中的较大分子相关联的较大DNA分子内的可鉴定的DNA区段。因此，当异源区域编码哺乳动物基因时，所述DNA侧接的基因在来源生物体的基因组中通常不侧接哺乳动物基因组DNA。异源区域的另一个实例是其中编码序列自身不存在于自然界中的构建体(例如其中基因组编码序列含有内含子的cDNA或具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生如本文所定义的异源DNA区域。
[0252] “编码序列”是对应于或编码蛋白质或肽序列的密码子的框内序列。如果序列或它们的互补序列编码相同氨基酸序列，那么两个编码序列彼此对应。与适当调控序列相关联的编码序列可转录并翻译成多肽。聚腺苷酸化信号和转录终止序列将通常位于编码序列的3'方向。“启动子序列”是能够启动下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调节区域，并且通常含有影响编码序列转录的调节分子(例如转录因子)另外的集合位点。当RNA聚合酶在细胞中结合启动子序列并将编码序列转录成mRNA，然后进而翻译成由编码序列编码的蛋白质时，编码序列在启动子序列的“控制下”或“可操作地连接”到启动子。
[0253] 脊椎动物中的抗体的一般性结构目前已充分了解(参见Edelman, G.M.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,190:5 1971)。抗体由两条相同的分子量为约23,000道尔顿的轻多肽链(“轻链”)和两条相同的分子量为 53,000-70,000的重链(“重链”)组成。四个链由二硫键联接成“Y”构型，其中轻链托住从“Y”构型的开口处起始的重链。“Y”构型的“分支”部分称为Fab区；“Y”构型的主干部分称为FC区。氨基酸序列取向从位于“Y”构型的顶部的N末端行进到位于各链的底部的C末端。N末端拥有对引发它的抗原具有特异性可变区，并且长度为约100个氨基酸，在轻链与重链之间和在各抗体之间存在微小变化。
[0254] 可变区在各链中连接到恒定区，所述恒定区延伸所述链的剩余长度并且在特定抗体类别内不随抗体的特异性(即引发它的抗原)而变化。存在决定免疫球蛋白分子的类别的五个已知主要恒定区类别(对应于γ、μ、α、δ和ε重链恒定区的IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。恒定区或类别确定抗体的后续效应子功能，包括补体的激活(参见 Kabat,E.A.,Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry，第2版，413-436页，New York,NY:Holt,Rinehart,Winston(1976)) 和其它细胞应答(参见Andrews等，Clinical Immunology,，1-18页， W.B.Sanders,Philadelphia,PA(1980)；Kohl等，Immunology,48:187 (1983))；而可变区确定与其应答的抗原。轻链分类为κ或λ。各重链类别可以与κ或λ轻链一起制备。当通过融合瘤或通过B细胞生成免疫球蛋白时，轻链和重链彼此共价键结，并且两个重链的“尾部”部分通过共价二硫键彼此键结。
[0255] 表述“可变区”或“VR”是指抗体中的各对轻链和重链内直接涉及抗体与抗原结合的结构域。各重链在一端具有可变结构域(VH)，接着是多个恒定结构域。各轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在它的另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
[0256] 表述“互补决定区”、“高变区”或“CDR”是指在抗体的轻链或重链的可变区中发现的高变区或互补决定区(CDR)中的一个或多个(参见 Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版， Bethesda,MD:U.S.Dept.of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health(1987))。这些表述包括由Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interest,NIH
Publication No. 91-3242,Bethesda,MD:U.S.Dept.of Health and Human Services, National Institutes of Health(1983))定义的高变区，或抗体3维结构中的高变环
(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917 1987)。各链中的 CDR通过框架区(“FR”)保持紧密邻近，并且与另一条链的CDR一起促进抗原结合位点的形成。在CDR内，存在已描述为选择性决定区 (“SDR”)的选择氨基酸，其代表由CDR在抗体-抗原相互作用中使用的关键接触残基(参见Kashmiri等，Methods,36(1):25-34 2005)。
Publication No. 91-3242,Bethesda,MD:U.S.Dept.of Health and Human Services, National Institutes of Health(1983))定义的高变区，或抗体3维结构中的高变环
(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917 1987)。各链中的 CDR通过框架区(“FR”)保持紧密邻近，并且与另一条链的CDR一起促进抗原结合位点的形成。在CDR内，存在已描述为选择性决定区 (“SDR”)的选择氨基酸，其代表由CDR在抗体-抗原相互作用中使用的关键接触残基(参见Kashmiri等，Methods,36(1):25-34 2005)。
[0257] “表位”或“结合位点”是抗原上的于抗原结合肽(如抗体)特异性结合的区或区域。蛋白质表位可包含直接涉及结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组件)和不直接涉及结合的其它氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的“足迹”内)。本文中的术语表位包括PACAP中特异性结合抗PACAP抗体的任何特定区域中的两种类型的氨基酸结合位点，即PACAP38和PACAP27。PACAP可包含许多不同表位，其可包括但不限于(1)线性肽抗原决定子，(2)构象抗原决定子，其由成熟PACAP构象中一个或多个彼此邻近定位的非连续氨基酸组成；和(3)翻译后抗原决定子，其完全或部分由共价附接到PACAP蛋白的分子结构(诸如碳水化合物基团)组成。具体地，术语“表位”包括蛋白质或肽(例如PACAP)中的特异性残基，其涉及如通过已知和接受的方法(诸如丙氨酸扫描技术)测定的抗体与此类蛋白质或肽的结合。此类方法在本文中例示。
[0258] 短语抗体(例如第一抗体)与另一种抗体(例如第二抗体)结合“基本上”或“至少部分”相同的表位意指第一抗体的表位结合位点包含抗原上构成第二抗体的表位结合位点的至少10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或更多的氨基酸残基。此外，第一抗体与第二抗体结合基本上或部分相同或重叠的表位意指如上所述，第一抗体和第二抗体竞争结合抗原。因此，术语与单克隆抗体“结合基本上相同的表位或决定子”意指抗体与所述抗体“竞争”。
[0259] 短语与目标抗体“结合相同或重叠的表位或决定子”意指抗体与所述目标抗体“竞争”PACAP上由所述目标抗体所特异性结合的至少一个(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个)或全部残基。与本文所述的单克隆抗体结合基本上或本质上相同的表位的一种或多种抗体的鉴定使用丙氨酸扫描可以容易地确定。另外，可以评估抗体竞争的各种免疫筛选测定中的任一种。许多此类测定是常规实施并且在本领域中是众所周知的(参见例如1997年8月26日颁发的美国专利号5,660,827，其以引用的方式明确并入本文)。应了解，鉴定与本文所述的单克隆抗体结合相同或基本上相同或重叠的表位的抗体无论如何都不需要实际确定本文所述的抗体结合的表位。
[0260] 例如，当待检查的测试抗体是从不同来源动物获得的或甚至具有不同的Ig同种型时，可采用简单竞争测定，其中将对照抗体与测试抗体混合并且然后施加到含有PACAP的样品。基于ELISA、放射免疫测定、蛋白质印迹和使用 (GE Healthcare Life Sciences， Marlborough，MA)分析的方案适用于此类简单竞争研究中。
[0261] 在某些实施方案中，在施加到PACAP38或PACAP27抗原样品之前，将对照抗PACAP抗体与不同量的测试抗体(例如以约1:1、1:2、1:10或约1:100的比率)预混合一段时间。在其它实施方案中，对照和不同量的测试抗体可以仅分开添加并在暴露于PACAP38或PACAP27抗原样品期间混合。只要可以区分结合抗体与游离抗体(例如通过使用分离或洗涤技术来消除未结合抗体)以及区分对照抗体与测试抗体(例如通过使用物种特异性或同种型特异性二级抗体或通过用可检测标记特异性标记对照抗体)，则能够确定测试抗体是否使对照抗体与PACAP38或PACAP27抗原的结合降低，从而指示测试抗体与对照抗PACAP抗体识别基本上相同的表位。(标记的)对照抗体在完全无关抗体(其不结合PACAP)存在下的结合可充当对照高值。对照低值可通过将标记的对照抗体与相同但未标记的对照抗体一起孵育来获得，其中将发生竞争并降低标记的抗体的结合。在测试测定中，标记的抗体反应性在测试抗体存在下显著降低指示测试抗体识别基本上相同的表位，即测试抗体与标记的对照抗体竞争。例如，在与测试抗体在约1:1或1:10与约1:100之间的任何比率下，使对照抗体与 PACAP38或PACAP27的结合降低至少约50％(诸如至少约60％、或更优选至少约70％(例如约65-100％))的任何测试抗体都视为与对照抗体结合基本上相同或重叠的表位或决定子的抗体。
[0262] 优选地，此类测试抗体将使对照抗体与PACAP38或PACAP27 抗原的结合降低在测试抗体不存在下观察到的对照抗体的结合的优选至少约50％、至少约60％、至少约80％或至少约90％(例如约95％)。
[0263] 也可有利地采用简单竞争测定，其中测试抗体在饱和浓度下被施加到PACAP38或PACAP27固定于其上的表面。简单竞争测定中的所述表面优选为 (GE Healthcare Life Sciences， Marlborough，MA)芯片(或适于表面等离子体共振(“SPR”)分析的其它介质)。测量结合PACAP38或PACAP27的对照抗体与PACAP包衣的表面的结合。将对照抗体单独与含有PACAP38或PACAP27的表面的这种结合与对照抗体在测试抗体存在下的结合进行比较。在测试抗体存在下，对照抗体与含有PACAP38或PACAP27的表面的结合显著降低指示测试抗体与对照抗体识别基本上相同的表位，使得测试抗体与对照抗体“竞争”。
使对照抗体的结合降低至少约20％或更多、至少约40％、至少约50％、至少约70％或更多的任何测试抗体都可视为与对照抗体结合基本上相同的表位或决定子的抗体。优选地，此类测试抗体将使对照抗体与PACAP38或PACAP27的结合降低至少约50％(例如至少约60％、至少约70％或更多)。应了解，对照抗体和测试抗体的顺序可逆转；即在竞争测定中，对照抗体可首先结合表面并且然后使测试抗体与表面接触。优选地，使用下文的实施例9中例示的“夹心式”结合测定。可替代地，首先使对PACAP38或PACAP27 抗原具有较高亲和力的抗体结合含有PACAP38或PACAP27的表面，因为希望对第二抗体(假定抗体是竞争性的)所见的结合降低将具有较大量级。此类测定的其它实例提供在例如Saunal和Regenmortel,J.
Immunol.Methods,183:33-41(1995)中，其公开内容以引用的方式并入本文。
使对照抗体的结合降低至少约20％或更多、至少约40％、至少约50％、至少约70％或更多的任何测试抗体都可视为与对照抗体结合基本上相同的表位或决定子的抗体。优选地，此类测试抗体将使对照抗体与PACAP38或PACAP27的结合降低至少约50％(例如至少约60％、至少约70％或更多)。应了解，对照抗体和测试抗体的顺序可逆转；即在竞争测定中，对照抗体可首先结合表面并且然后使测试抗体与表面接触。优选地，使用下文的实施例9中例示的“夹心式”结合测定。可替代地，首先使对PACAP38或PACAP27 抗原具有较高亲和力的抗体结合含有PACAP38或PACAP27的表面，因为希望对第二抗体(假定抗体是竞争性的)所见的结合降低将具有较大量级。此类测定的其它实例提供在例如Saunal和Regenmortel,J.
Immunol.Methods,183:33-41(1995)中，其公开内容以引用的方式并入本文。
[0264] 另外，抗体是否与另一种抗体结合PACAP上的相同或重叠的表位或者测试抗体是否结合所述表位可具体地使用基于蛋白质印迹的测定来确定。在这个测定中，制备对应于由抗体所结合的抗原(PACAP 蛋白)的肽的文库，所述肽包含蛋白质的重叠部分，长度通常为10-25、 10-20或10-15个氨基酸。合成包括PACAP序列的这些不同的重叠氨基酸肽并且使它们共价结合到PEPSPOTSTM硝酸纤维素膜(JPT Peptide Technologies，Berlin，Germany)。然后根据制造商建议制备印迹并进行探测。
[0265] 实质上，然后免疫印迹测定通过荧光测定手段来检测文库中的哪些肽结合测试抗体并且由此可以鉴定抗原(即PACAP)上的哪些残基与测试抗体相互作用。(参见以引用的方式并入本文的美国专利号 7,935,340)。
[0266] 各种表位作图技术在本领域中是已知的。以举例的方式，抗原和抗体的X射线共晶体学；NMR；SPR(例如，在25℃或37℃下)；基于阵列的寡肽扫描(或“pepscan分析”)；定点诱变(例如丙氨酸扫描)；诱变作图；氢氘交换；噬菌体展示；以及限制性蛋白水解都是本领域众所周知的表位作图技术(参见例如，Epitope Mapping Protocols:第2 版，Methods in Molecular Biology,Mike Schutkowski和Ulrich Reineke 编，第2版，New York,NY:Humana Press(2009)，和Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology,Glenn Morris编，第1版，New York,NY:Humana Press(1996)，二者都以引用的方式整体并入本文)。
[0267] 与本文所述的单克隆抗体(例如Ab10或Ab20)结合基本上或本质上相同的表位的一种或多种抗体的鉴定使用其中可以评估抗体竞争的多种免疫筛选测定中的任一种可以容易地确定。许多此类测定是常规实施并且在本领域中是众所周知的(参见例如以引用的方式并入本文的美国专利号5,660,827)。应了解，鉴定与本文所述的单克隆抗体结合相同或基本上相同的表位的抗体无论如何都不需要确定本文所述的抗体结合的表位。
[0268] 例如，当待检查的测试抗体是从不同来源动物获得的或甚至具有不同的Ig同种型时，可采用简单竞争测定，其中将对照抗体(例如 Ab10或Ab20中的一种)与测试抗体混合并且然后施加到含有 PACAP38和PACAP27(已知每一个都为Ab10或Ab20所结合)任一者或二者的样品。基于ELISA、放射免疫测定、蛋白质印迹和 (GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)分析的方案(如本文实施例章节所述)适用于此类简单竞争研究中。
[0269] 在某些实施方案中，所述方法包括在施加到PACAP抗原样品之前，将对照抗PACAP抗体与不同量的测试抗体(例如以约1:1、1:2、 1:10或约1:100的比率)预混合一段时间。在其它实施方案中，对照和不同量的测试抗体可以分开添加并在暴露于PACAP抗原样品期间混合。只要可以区分结合抗体与游离抗体(例如通过使用分离或洗涤技术来消除未结合抗体)以及区分对照抗体与测试抗体(例如通过使用物种特异性或同种型特异性二级抗体或通过用可检测标记特异性标记对照抗体)，则所述方法可以用于确定测试抗体使对照抗体与PACAP 抗原的结合降低，从而指示测试抗体与对照抗体(例如Ab10或Ab20) 识别基本上相同的表位。(标记的)对照抗体在完全无关抗体(其不结合 PACAP)存在下的结合可充当对照高值。对照低值可通过将标记的对照抗体与相同但未标记的对照抗体一起孵育来获得，其中将发生竞争并降低标记的抗体的结合。在测试测定中，标记的抗体反应性在测试抗体存在下显著降低指示测试抗体识别基本上相同的表位，即测试抗体与标记的对照抗体竞争。例如，在对照Ab10或Ab20:测试抗体或者Ab10或Ab20:测试抗体在约1:1或1:10与约1:100之间的任何比率下，使Ab10或Ab20与PACAP38和PACAP27抗原二者的结合降低至少约
50％(诸如至少约60％、或更优选至少约70％(例如约 65-100％))的任何测试抗体都视为分别与Ab10或Ab20结合基本上相同的表位或决定子的抗体。优选地，此类测试抗体将使Ab10或Ab20 与PACAP38和PACAP27抗原中的至少一种(优选每一种)的结合降低在测试抗体不存在下观察到的Ab10或Ab20的结合的优选至少约 50％、至少约60％、至少约80％或至少约90％(例如约95％)。可以调整这些方法以鉴定和/或评价与其它对照抗体竞争的抗体。
50％(诸如至少约60％、或更优选至少约70％(例如约 65-100％))的任何测试抗体都视为分别与Ab10或Ab20结合基本上相同的表位或决定子的抗体。优选地，此类测试抗体将使Ab10或Ab20 与PACAP38和PACAP27抗原中的至少一种(优选每一种)的结合降低在测试抗体不存在下观察到的Ab10或Ab20的结合的优选至少约 50％、至少约60％、至少约80％或至少约90％(例如约95％)。可以调整这些方法以鉴定和/或评价与其它对照抗体竞争的抗体。
[0270] 也可有利地采用简单竞争测定，其中测试抗体在饱和浓度下被施加到PACAP38或PACAP27或者二者固定于其上的表面。简单竞争测定中的所述表面优选具有适用于和/或 的介质。测量对照抗体(例如，Ab10或Ab20)与PACAP包衣的
表面的结合。将对照抗体单独与含有PACAP的表面的这种结合与对照抗体在测试抗体存在下的结合进行比较。在测试抗体存在下，对照抗体与含有PACAP的表面的结合显著降低指示测试抗体与对照抗体识别基本上相同的表位，使得测试抗体与对照抗体“竞争”。使对照抗体(诸如 Ab10或Ab20)与PACAP38和PACAP27抗原二者的结合降低至少约 20％或更多、至少约40％、至少约50％、至少约70％或更多的任何测试抗体都可视为与对照抗体(例如Ab10或Ab20)结合基本上相同的表位或决定子的抗体。优选地，此类测试抗体将使对照抗体(例如Ab10 或Ab20)与PACAP抗原的结合降低至少约50％(例如至少约60％、至少约70％或更多)。
应了解，对照抗体和测试抗体的顺序可逆转；即在竞争测定中，对照抗体可首先结合表面并且然后使测试抗体与表面接触。优选地，首先使对PACAP38和PACAP27具有较高亲和力的抗体结合含有PACAP的表面，因为希望对第二抗体(假定抗体是竞争性的)所见的结合降低将具有较大量级。此类测定的其它实例提供在例如Saunal和Regenmortel,
J.Immunol.Methods,183:33-41(1989)中，其公开内容以引用的方式并入本文。
表面的结合。将对照抗体单独与含有PACAP的表面的这种结合与对照抗体在测试抗体存在下的结合进行比较。在测试抗体存在下，对照抗体与含有PACAP的表面的结合显著降低指示测试抗体与对照抗体识别基本上相同的表位，使得测试抗体与对照抗体“竞争”。使对照抗体(诸如 Ab10或Ab20)与PACAP38和PACAP27抗原二者的结合降低至少约 20％或更多、至少约40％、至少约50％、至少约70％或更多的任何测试抗体都可视为与对照抗体(例如Ab10或Ab20)结合基本上相同的表位或决定子的抗体。优选地，此类测试抗体将使对照抗体(例如Ab10 或Ab20)与PACAP抗原的结合降低至少约50％(例如至少约60％、至少约70％或更多)。
应了解，对照抗体和测试抗体的顺序可逆转；即在竞争测定中，对照抗体可首先结合表面并且然后使测试抗体与表面接触。优选地，首先使对PACAP38和PACAP27具有较高亲和力的抗体结合含有PACAP的表面，因为希望对第二抗体(假定抗体是竞争性的)所见的结合降低将具有较大量级。此类测定的其它实例提供在例如Saunal和Regenmortel,
J.Immunol.Methods,183:33-41(1989)中，其公开内容以引用的方式并入本文。
[0271] 可以以本领域技术人员已知的方式来确定抗体、其抗原结合片段或抗体衍生物是否结合在上文定义的一个表位区域内。在此类作图/ 表征方法的另一个实例中，抗PACAP抗体的表位区域可通过使用 PACAP38和PACAP27蛋白中暴露的胺/羧基的化学修饰的表位“足迹法”来确定。此类足迹技术的一个具体实例是使用由质谱法检测的氢氘交换(“HXMS”)，其中发生受体和配体蛋白质酰胺质子的氢/氘交换、结合和返交换(back exchange)，其中参与蛋白质结合的主链酰胺基团被保护免于返交换并因此将保持氘化。此时可以通过消化蛋白水解、快速微孔高效液相色谱分离和/或电喷射离子化质谱法来鉴定相关区域(参见例如，Ehring H.,Anal.Biochem.,267(2):252-259(1999)和 Engen,J.R.&Smith,D.L.,Anal.Chem.,73:256A-265A(2001))。合适的表位鉴定技术的另一个实例是核磁共振表位作图(“NMR”)，其中通常将在游离抗原与和抗原结合肽(诸如抗体)复合的抗原的二维NMR 谱中的信号位置进行比较。抗原通常用15N选择性同位素标记，使得在NMR谱中仅看到对应于抗原的信号而看不到来自抗原结合肽的信号。起源于涉及与抗原结合肽的相互作用的氨基酸的抗原信号通常将移动在复合物谱中的位置(与游离抗原谱相比)，并且可以用这种方式鉴定涉及结合的氨基酸，参见例如，Ernst Schering Res.Found. Workshop,(44):149-67,
2004；Huang等,J.Mol.Biol.,281(1):61-67, 1998；以及Saito和Patterson,Methods,9(3):516-24，1996)。
2004；Huang等,J.Mol.Biol.,281(1):61-67, 1998；以及Saito和Patterson,Methods,9(3):516-24，1996)。
[0272] 也可以使用质谱(“MS”)方法执行表位作图/表征(参见例如， Downard,J.Mass Spectrom.,35(4):493-503,2000以及Kiselar和Downard,Anal.Chem.,71(9):1792-801,1999)。
[0273] 蛋白酶消化技术也可用于表位作图和鉴定的情况。抗原决定簇相关区域/序列可以通过以下来确定：蛋白酶消化，例如通过在37℃和 pH 7-8下使用与PACAP38或PACAP27的比率约1:50的胰蛋白酶过夜(“o/n”)消化，接着进行用于肽鉴定的质谱(“MS”)分析。随后，可以通过将经受胰蛋白酶消化的样品与和抗体一起孵育并经受例如胰蛋白酶的消化的样品进行比较来鉴定通过抗PACAP抗体保护免受胰蛋白酶裂解的肽(从而揭示抗体的足迹)。其它酶(如胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶)可以用于相似的表位表征方法。此外，酶促消化可以提供用于分析在PACAP结合多肽的情况下潜在的抗原决定簇序列是否在 PACAP的区域内的快速方法。如果多肽未被表面暴露，则在免疫原性/抗原性方面最有可能是不相关的(参见例如，Manca,Ann.Ist.Super. Sanità.,27(1):15-9,1991，用于讨论类似的技术)。
[0274] 定点诱变是可用于表征结合表位的另一种技术。例如，在“丙氨酸扫描”定点诱变(也称为例如丙氨酸扫描、丙氨酸扫描诱变、丙氨酸扫描突变、组合丙氨酸扫描或产生丙氨酸点突变)中，蛋白质片段内的每个残基通过以下方法用丙氨酸残基替代(或其它残基诸如缬氨酸，其中丙氨酸存在于野生型序列中)：诸如像直接肽或蛋白质合成、定点诱变、TMGENEART 诱变服务(Thermo Fisher Scientific，Waltham， MA U.S.A.)或鸟枪诱变。由此，使用这种技术生成分子的一系列单点突变体；生成的突变体的数量等于分子中的残基数，每个残基被单个丙氨酸残基一次一个地替代。丙氨酸通常用于替代天然(野生型)残基，因为丙氨酸的体积不大、化学惰性的甲基官能团可以模拟许多其它氨基酸可拥有的二级结构偏好。随后，可以使用诸如但不限于SPR结合实验的方法来测量用丙氨酸替代天然残基对丙氨酸扫描突变体与其结合配偶体的结合亲和力的影响。如果突变导致结合亲和力的显著降低，则最有可能所述突变残基涉及结合。可以将对结构表位特异性的单克隆抗体(即不结合未折叠蛋白质的抗体)用作结合亲和力实验的阳性对照，以验证丙氨酸替代不影响蛋白质的总体三级结构(因为蛋白质的总体折叠的变化可间接影响结合，并且由此产生假阳性结果)(参见例如，Clackson和Wells,Science,267:383-386,1995；Weiss 等，
Proc.Natl .Acad .Sci.USA,97(16):8950-8954,2000；以及Wells,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:1-6,1996)。在实施例12中，丙氨酸扫描方法用于鉴定与本文公开的抗PACAP抗体特异性相互作用的 PACAP的特异性表位或残基。
Proc.Natl .Acad .Sci.USA,97(16):8950-8954,2000；以及Wells,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:1-6,1996)。在实施例12中，丙氨酸扫描方法用于鉴定与本文公开的抗PACAP抗体特异性相互作用的 PACAP的特异性表位或残基。
[0275] 电子显微镜也可以用于表位“足迹法”。例如，Wang等，Nature, 355:275-278(1992)使用冷冻电子显微镜、三维图像重构和X射线晶体学的协调应用来确定Fab片段在天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的物理足迹。
[0276] 用于表位评价的其它形式的“无标记”测定包括SPR(以 系统(GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)商业出售)和反射干涉频谱(“RifS”)(参见例如，Fagerstam等，J.Mol. Recog.,3:208-14，1990；Nice等，J.Chromatogr.,646:159-
168,1993； Leipert等，Angew.Chem.Int.Ed.,37:3308-3311,1998；Kroger等， Biosensors and Bioelectronics,17:937-944,，2002)。
168,1993； Leipert等，Angew.Chem.Int.Ed.,37:3308-3311,1998；Kroger等， Biosensors and Bioelectronics,17:937-944,，2002)。
[0277] 表述“框架区”或“FR”是指抗体的轻链和重链的可变区内的一个或多个框架区(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，Bethesda,MD:U.S.Dept.of Health and Human Services,Public Health Service,National
Institutes of Health，1987)。这些表述包括插置在抗体的轻链和重链的可变区内的CDR之间的那些氨基酸序列区域。
Institutes of Health，1987)。这些表述包括插置在抗体的轻链和重链的可变区内的CDR之间的那些氨基酸序列区域。
[0278] 术语“Fc区”用于限定免疫球蛋白重链的C末端区域。“Fc区”可为天然序列Fc区或变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或Pro230位置的氨基酸残基延伸到其羧基末端。Fc区中残基的编号是Kabat的 EU指数的编号(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda,MD:U.S.Dept.of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health,1991)。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，CH2和CH3。
[0279] 术语“Fc受体”或“FcR”描述结合到抗体Fc区的受体。优选FcR 是天然序列人FcR。此外，优选的FcR为结合IgG抗体的受体(γ受体) 并且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子类的受体，包括这些受体的等位基因变体和替代性剪接形式。FcγRII受体包括主要在其细胞质域方面不同的具有相似氨基酸序列的FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)。FcR综述于Ravetch和Kinet，Ann.Rev.Immunol.,，9:457-92 (1991)；Capel等，Immunomethods,4:25-34(1994)；以及de Haas等， J.Lab.Clin.Med.,126:330-41(1995)中。“FcR”也包括新生儿受体 FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.,
117:587， 1976；以及Kim等，J.Immunol.,24:249,1994)并且其主要功能是调节和/或延长抗体在循环中的半衰期。在所公开的抗PACAP抗体被糖基化的情况下，作为表达系统和/或序列的结果，希望本发明的抗体结合FcRn受体但不结合(或最低限度地结合)Fcγ受体。
117:587， 1976；以及Kim等，J.Immunol.,24:249,1994)并且其主要功能是调节和/或延长抗体在循环中的半衰期。在所公开的抗PACAP抗体被糖基化的情况下，作为表达系统和/或序列的结果，希望本发明的抗体结合FcRn受体但不结合(或最低限度地结合)Fcγ受体。
[0280] “功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的至少一个效应子功能。示例性“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(“CDC”)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(“ADCC”)；吞噬；细胞表面受体(例如B细胞受体(“BCR”))的下调等。此类效应子功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以使用本领域已知的用于评价此类抗体效应子功能的各种测定来评估。
[0281] “天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。由于至少一个氨基酸修饰，“变异Fc区”包含与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列，而保留天然序列Fc区的至少一个效应子功能。优选地，变异Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中的约一个至约十个氨基酸取代，并且优选约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变异Fc区优选将与天然序列Fc区和 /或与亲本多肽的Fc区拥有至少约80％的序列同一性，并且最优选与其拥有至少约90％的序列同一性，更优选与其拥有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。
[0282] 抗PACAP抗体及其对PACAP具有结合活性的结合片段
[0283] PACAP是一种多功能血管扩张肽，在整个中枢神经系统(“CNS”) 和外周表达。PACAP是促胰液素/VIP/GRH家族的成员。PACAP以两种α酰胺化的活性形式存在：PACAP38(SEQ ID NO:1241)和 PACAP27(SEQ ID NO:1242)。在本文中，术语“PACAP”包括 PACAP38和PACAP27的任一者或二者，除非另有明确指示。PACAP 在物种间高度保守。
[0284] 在人类中，PACAP源自176个氨基酸的前体蛋白(preproPACAP)，并且基因位于染色体18p11上，其中PACAP38由外显子5编码(参见 Vaudry等，Pharmacol.Rev.,61:283-357，2009)。PreproPACAP包含 N-末端24个氨基酸的信号蛋白、29个氨基酸的PACAP相关肽和C 末端结构域中的PACAP。前体被激素原转化酶代谢成生物活性 PACAP38和PACAP27。
[0285] VIP(SEQ ID NO:1243)与PACAP属于相同的蛋白质家族，并且与PACAP具有高同源性(即VIP和PACAP27在氨基酸水平具有68％的序列同源性)以及相似的总体二级结构(即C-末端的长α螺旋结构)。
[0286] PACAP的作用通过三种不同的G蛋白偶联受体介导：PAC1-R、 VPAC1-R和VPAC2-R。VPAC1-R可以与所有受体相关联的膜蛋白 (“RAMPs”，参见Kaiser和Russo,Neuropeptides
47:451-461,2013)相关联。PAC1-R对于PACAP是选择性的，而VPAC1-R和VPAC2-R 以高亲和力结合VIP和PACAP。PAC1-R以比VIP高100-1000倍的亲和力与PACAP结合，即对于PACAP27/PACAP38的KD～0.5nM 对比对于VIP的KD～500nM。相反，VPAC1-R和VPAC2-R对于PACAP和VIP具有相等的亲和力(KD～1nM)，(参见Schytz等2010)。所有三种受体在外周组织和CNS中都广泛表达，其中PAC1-R主要在CNS中表达，在嗅球、丘脑、下丘脑、海马体的齿状回和小脑的颗粒细胞中最丰富(参见Hashimoto等，J.Comp.Neurol.,371:567-577, 1996；Shioda等，Neurosci.Res.,28:345-354,1997)。
47:451-461,2013)相关联。PAC1-R对于PACAP是选择性的，而VPAC1-R和VPAC2-R 以高亲和力结合VIP和PACAP。PAC1-R以比VIP高100-1000倍的亲和力与PACAP结合，即对于PACAP27/PACAP38的KD～0.5nM 对比对于VIP的KD～500nM。相反，VPAC1-R和VPAC2-R对于PACAP和VIP具有相等的亲和力(KD～1nM)，(参见Schytz等2010)。所有三种受体在外周组织和CNS中都广泛表达，其中PAC1-R主要在CNS中表达，在嗅球、丘脑、下丘脑、海马体的齿状回和小脑的颗粒细胞中最丰富(参见Hashimoto等，J.Comp.Neurol.,371:567-577, 1996；Shioda等，Neurosci.Res.,28:345-354,1997)。
[0287] PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R的激活导致腺苷酸环化酶活性增加，并且因此增加2+
cAMP产生。然而，PACAP受体还可以通过 PLC介导其效应，导致Ca 水平和PLD增加。
cAMP产生。然而，PACAP受体还可以通过 PLC介导其效应，导致Ca 水平和PLD增加。
[0288] PACAP具有广泛的生物学效应，包括在神经发育、神经保护、神经调节、神经源性炎症和伤害感受中的作用。据报道PACAP也与糖胺聚糖(“GAG”)相互作用。GAG是由重复的二糖单元(诸如肝素、软骨素、角蛋白和透明质酸)组成的长的未分支的多糖。已经表明， PACAP的细胞摄取依赖于GAG蛋白的表达，并且PACAP与硫酸化 GAG结合。具体地，确定与GAG结合的PACAP38能够诱导PACAP38 的非受体依赖性细胞摄取。本研究还证明，PACAP38中随机的卷曲到α螺旋的转变对于PACAP38的GAG依赖性摄取是必需的，因为不能经历结构转变的突变PACAP38不会如野生型PACAP38一样有效地被含有GAG的细胞系内化(Neree等，FEBS Lett., 588(24):4590-4596,2014)。在后续的研究中，确定了PACAP聚集GAG (即肝素)的能力直接与其作为细胞穿透肽(“CPP”)的功能有关。假设这种活性可归因于在促胰液素/胰高血糖素/GHRH家族成员(诸如 PACAP)中发现的肝素结合或Cardin-Weintraub的基序(Neree等，Int.J. Mol.Sci.,16:27391-27400,2015)。有趣的是，Neree等(2015)提出了证明PACAP38能够在体外聚集硫酸化GAG的数据。这些数据表明观察到的聚集效应对于GAG介导的PACAP38的细胞摄取是重要的，因为其它肽(例如胰高血糖素)对硫酸化GAG(肝素)显示出更高的结合亲和力，但是不会如PACAP38一样有效地被细胞内化。此外，据报道，在其中细胞暴露于PACAP的体外研究中，软骨形成增加，包括富含硫酸化GAG蛋白的软骨基质增加，与其在各种细胞应激应答期间表现出的假定的保护作用一致(Juhász等，PLoS ONE， 9(3):
e91541，2014)。使用在其质膜上缺乏PACAP特异性受体的细胞类型(诸如CHO-K1细胞)，Doan等提出了表明此类细胞参与各种形式的荧光标记的PACAP38和PACAP27的非受体依赖性细胞摄取的能力的数据(Doan等，Biochem.Biophys.Acta,1823:940-949,2012)。
e91541，2014)。使用在其质膜上缺乏PACAP特异性受体的细胞类型(诸如CHO-K1细胞)，Doan等提出了表明此类细胞参与各种形式的荧光标记的PACAP38和PACAP27的非受体依赖性细胞摄取的能力的数据(Doan等，Biochem.Biophys.Acta,1823:940-949,2012)。
[0289] 本发明提供结合PACAP(包括人PACAP)的示例性抗体或其抗原结合片段。可使用本说明书的公开内容并且使用本领域通常已知的方法获得结合PACAP的其它抗体或其抗原结合片段，包括具有不同 CDR和表位特异性的抗体或其抗原结合片段。此类抗体及其抗原结合片段拮抗PACAP在体内的生物学效应，并且因此可用于治疗或预防PACAP相关病状，包括例如头痛、偏头痛、疼痛、畏光、热潮红、 PTSD和焦虑症。在优选的实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含本文所述的抗PACAP抗体及其抗原结合片段的一个或多个CDR、VL链和/或VH链。
[0290] 在一些实施方案中，根据本发明的抗PACAP抗体或其抗原结合片段将干扰、阻断、降低或调节PACAP与其受体(例如PAC1-R、 VPAC1-R和VPAC2-R)之间的相互作用。在一些情况下，根据本发明的抗PACAP抗体或其抗原结合片段是“中和的”，例如，它完全防止 PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R的特异性相互作用。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段例如通过以防止PACAP 特异性结合PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R的位置和/或方式保持结合PACAP来中和PACAP。
[0291] 在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段能够抑制PACAP介导的活性(包括与表达PAC1-R的细胞的结合)。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的，诸如针对PACAP的人源化兔抗体。
[0292] 如所叙述的，根据本发明的抗PACAP抗体或其抗原结合片段具有多种用途。例如，本发明的抗体和片段可用于治疗性应用以及结合测定中的诊断。本发明的抗PACAP抗体或其抗原结合片段可用于 PACAP(特别是人PACAP或其配体)的亲和纯化以及用于鉴定 PACAP活性的其它拮抗剂的筛选测定中。一些抗体或其抗原结合片段可用于抑制PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R的结合，或者抑制PACAP介导的活性和/或生物学效应。
[0293] 如本文所用，术语“与PACAP相关联的一种或多种生物学效应是指介导、诱导或以其它方式归因于PACAP的任何生物学效应，例如结合性质、功能性质和其它生物学意义的性质。PACAP的非限制性示例性生物学效应包括PACAP与PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R 的结合；PACAP激活PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R介导的信号传导；PACAP介导的cAMP产生增加；PACAP介导的PLC活性增加；PACAP介导的PLD活性增加；PACAP介导的Ca2+水平增加；以及PACAP介导的血管舒张、畏光、肥大细胞脱颗粒和/或神经元激活。本发明的抗PACAP抗体能够抑制这些示例性PACAP生物活性的一种、组合或全部。例如，本文提供的抗PACAP抗体及其抗原结合片段能够抑制PACAP诱导的血管舒张(参见实施例7和实施例8)。
[0294] 根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以用于多种治疗性应用中。例如，在一些实施方案中，抗PACAP抗体或其抗原结合片段可用于治疗与PACAP相关联的病状，诸如但不限于偏头痛(具有或不具有先兆)、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、紧张性头痛、正头痛、热潮红、畏光、慢性阵发性半侧颅痛、头部或颈部潜在的结构性问题引起的继发性头痛、颅神经痛、窦性头痛(例如，与鼻窦炎相关联的头痛)、过敏诱导的头痛或偏头痛、疼痛、慢性疼痛、神经炎性或炎性疼痛、手术后切口疼痛、手术后疼痛、创伤相关疼痛、眼痛、牙痛、复杂性区域疼痛综合征、癌症疼痛(例如原发性或转移性骨癌疼痛)、骨折疼痛、骨质疏松性骨折疼痛、烧伤引起的疼痛、痛风关节疼痛、与镰状细胞危象相关联的疼痛、与颞下颌关节紊乱相关联的疼痛、肝硬化、肝炎、神经源性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、内脏痛、三叉神经痛、疱疹后神经痛、幻肢疼痛、纤维肌痛、月经痛、卵巢痛、反射交感性营养不良、骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛、下背痛、糖尿病性神经病、坐骨神经痛、消化不良、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩氏病、回肠炎、溃疡性结肠炎、肾绞痛、痛经、膀胱炎、间质性膀胱炎、月经期、分娩、绝经、胰腺炎、精神分裂症、抑郁症、PTSD、焦虑症、糖尿病、自身免疫性糖尿病、内皮功能障碍、局部缺血、雷诺氏综合征、冠心病(“CHD”)、冠状动脉疾病(“CAD”)、心力衰竭、外周动脉疾病(“PAD”)、肺动脉高压 (“PH”)、结缔组织病、中风、舍格伦氏综合征、多发性硬化症、支气管高反应性、哮喘、支气管炎、支气管扩张、肺气肿、慢性阻塞性肺病(“COPD”)、炎性皮炎、腺组织中的腺癌、器官胚胎组织中的胚细胞瘤、上皮组织中的癌、形成血细胞的组织中的白血病、淋巴组织中的淋巴瘤、骨髓中的骨髓瘤、结缔组织或支持组织中的肉瘤、肾上腺癌、AIDS相关淋巴瘤、贫血、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、化学疗法、结肠癌、血细胞减少、子宫内膜癌、食管癌、胃癌(gastric cancer)、头癌、颈癌、肝胆癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、神经系统肿瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、骨髓癌、多发性骨髓瘤、转移到骨的肿瘤、浸润神经和空腔脏器的肿瘤、神经结构附近的肿瘤、寻常痤疮、特应性皮炎、荨麻疹、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和红斑痤疮、变应性皮炎、银屑病、瘙痒、神经源性皮肤发红、红斑、体重减轻、厌食症、结节病、休克、败血症、阿片戒断综合征、吗啡耐受、癫痫、LUT 病症(诸如尿路感染、异常排尿、尿急、夜尿、尿失禁、膀胱过度活动症)及用于防止或缓解与此类LUT病状相关联的疼痛。
[0295] 内脏痛的具体实例，即与内脏或身体的内部器官相关联的疼痛包括影响器官(诸如心脏、肺、生殖器官、膀胱、输尿管、消化器官、肝、胰、脾和肾)的疼痛。与其相关联的病状包括例如胰腺炎、分娩、与肠梗阻相关联的腹部手术、膀胱炎、月经期或痛经。同样，肾疼痛、上腹部痛、胸膜痛和胆绞痛、阑尾炎都可被视为内脏痛。胸骨下痛或早期心肌梗塞的压力也是内脏的。胃、十二指肠或结肠的疾病可以引起内脏痛。常遭遇的引起内脏痛的胃肠道(“GI”)病症包括功能性肠障碍(“FBD”)和炎性肠病(“IBD”)。此类GI病症还可包括胃食管反流、消化不良、肠易激综合征(“IBS”)和功能性腹痛综合征(“FAPS”)，以及关于IBD、克罗恩氏病、回肠炎和溃疡性结肠炎。
[0296] 本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段可单独使用或与其它活性剂或药物(包括其它生物制剂)联合使用以治疗任何受试者，其中阻断、抑制或中和PACAP的体内效应或者阻断或抑制PACAP与其受体(PAC1-R、VPAC1-R和VPAC2-R)的相互作用在治疗上是希望的。
[0297] 在本章节中鉴定了根据本发明的示例性抗PACAP抗体及其抗原结合片段以及其特定CDR。为了方便起见，每个示例性抗体或其抗原结合片段和对应的序列通过特定的命名法分开鉴定，即Ab10或 Ab20。
[0298] 本发明包含的抗PACAP抗体及其抗原结合片段对PACAP具有结合亲和力，其中所述结合亲和力包括抗PACAP抗体或其抗原结合片段特异性结合PACAP38和PACAP27，但不结合VIP，和/或抗体或其抗原结合片段特异性结合PACAP38，但不结合PACAP27或VIP，和/或抗体或其抗原结合片段特异性结合PACAP38和/或PACAP27内的线性和/或构象表位。更具体地，根据本发明的拮抗性抗PACAP抗体或其抗原结合片段所结合的PACAP38和/或PACAP27的表位将包括在实施例12中鉴定的表位或其残基(如通过使用丙氨酸扫描和/或其它表位鉴定方法所确定的)。
[0299] 抗PACAP抗体多肽序列
[0300] 抗体Ab10
[0301] 在一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其拥有包含SEQ ID NO:401的序列的重链序列，所述重链序列由连接到SEQ ID NO:410的重链恒定区的SEQ ID NO: 402的重链可变区组成。
[0302] 在一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其含有包含下述序列的可变重链序列：
[0303]QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLNSYYMTWVRQAPGKGLEWIGFIDAGGDAYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTA TYFCARDLDLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:402)。
[0304] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其与Ab10结合相同的表位并且含有恒定重链序列，所述恒定重链序列包含SEQ ID NO:1244、1245或1246的多肽或包含下述序列：
[0305]ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:410)。
[0306] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:421的序列的轻链序列，所述轻链序列由连接到SEQ ID NO:430的轻链恒定区的SEQ ID NO:422的轻链可变区组成。
[0307] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其含有包含下述序列的可变轻链序列：
[0308]AAVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQSSESVYGNYLAWFQQKPGQPPKLLIYEASKLESGVPSRFSGSGSGTQFTLTISDLQCDDAATY YCAGGDISEGVAFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:422)。
[0309] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其与Ab10结合相同的表位并且含有包含下述序列的恒定轻链序列：
[0310]TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:430)。
[0311] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，所述抗体及抗原结合片段含有SEQ ID NO: 404；SEQ ID NO:406；和SEQ ID NO:408的多肽序列中的一个、两个或三个，其对应于SEQ ID NO:401的重链序列的CDR(高变区)或其含有SEQ ID NO:402的可变重链序列，并且/或者所述抗体及抗原结合片段还含有SEQ ID NO:424；SEQ ID NO:426；和SEQ ID NO: 428的多肽序列中的一个、两个或三个，其对应于SEQ ID NO:421 的轻链序列的CDR(高变区)或其含有SEQ ID NO:422的可变轻链序列，或者含有与这些多肽序列至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％或99％相同的序列组合的抗体或抗原结合片段。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：上述示例性可变重链和可变轻链序列、或重链和轻链序列、或与这些多肽序列至少90％或95％相同的序列中的一个或多个的组合。
[0312] 本发明还预期抗PACAP抗体及抗原结合片段，所述抗PACAP 抗体及抗原结合片段含有SEQ ID NO:403；SEQ ID NO:405；SEQ ID NO:407；和SEQ ID NO:409的多肽序列中的一个、两个、三个或四个，其对应于SEQ ID NO:401的重链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:402的可变重链序列，和/或SEQ ID NO:423；SEQ ID NO:425； SEQ ID NO:427；和SEQ ID NO:429的多肽序列中的一个、两个、三个或四个，其对应于SEQ ID NO:421的轻链序列的FR(恒定区)或 SEQ ID NO:422的可变轻链序列，或这些多肽序列的组合，或与这些多肽序列至少
80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
[0313] 在本发明的另一实施方案中，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：上述FR、CDR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的组合，包括这些序列全部或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0314] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:401或SEQ ID NO:402或与这些序列至少90％或95％相同的多肽的多肽序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:421或SEQ ID NO:422或与这些序列至少90％或95％相同的多肽的多肽序列。
[0315] 在本发明的另一实施方案中，对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:404； SEQ ID NO:406；和SEQ ID NO:408的多肽序列中的一个、两个或三个，其对应于SEQ ID NO:401的重链序列的CDR(高变区)或SEQ ID NO:402的可变重链序列，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0316] 在本发明的另一实施方案中，对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:424； SEQ ID NO:426；和SEQ ID NO:428的多肽序列中的一个、两个或三个，其对应于SEQ ID NO:421的轻链序列的CDR(高变区)或SEQ ID NO:422的可变轻链序列，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0317] 在本发明的另一实施方案中，对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:403； SEQ ID NO:405；SEQ ID NO:407；和SEQ ID NO:409的多肽序列中的一个、两个、三个或四个，其对应于SEQ ID NO:401的重链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:402的可变重链序列，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0318] 在本发明的另一实施方案中，对PACAP具有结合特异性的本发明的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:423；SEQ ID NO:425；SEQ ID NO:427；和SEQ ID NO:429的多肽序列中的一个、两个、三个或四个，其对应于SEQ ID NO:421 的轻链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:422的可变轻链序列，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0319] 本发明也预期包括本文所述的一种或多种抗体片段的抗PACAP 抗体及抗原结合片段。在本发明的一个实施方案中，对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成，包括以下全部抗体片段的一个、两个、三个或更多个：SEQ ID NO:402 的可变重链区；SEQ ID NO:422的可变轻链区域；SEQ ID NO:402 的可变重链区的互补决定区(SEQ ID NO:404；SEQ ID NO:406；和 SEQ ID NO:408)；和SEQ ID NO:422的可变轻链区域的互补决定区 (SEQ ID NO:424；SEQ ID NO:426和SEQ ID NO:428)，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。在本发明的另一个实施方案中，对 PACAP具有结合特异性的抗体的片段包含以下或可替代地由以下组成，包括以下全部抗体片段的一个、两个、三个或更多个：SEQ ID NO: 402的可变重链区；SEQ ID NO:422的可变轻链区域；SEQ ID NO:402 的可变重链区的框架区(SEQ ID NO:403；SEQ ID NO:405；SEQ ID NO:407；和SEQ ID NO:409)；和SEQ ID NO:422的可变轻链区域的框架区(SEQ ID NO:423；SEQ ID NO:425；SEQ ID NO:427和SEQ ID NO:429)，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0320] 在本发明的另一个实施方案中，抗PACAP抗体为包含以下或可替代地由以下组成的Ab10：SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:421或者 SEQ ID NO:402和SEQ ID NO:422，或包含Ab10的CDR且具有本文所述的至少一种生物活性的抗体或抗原结合片段，或者为与Ab10 竞争结合PACAP的抗PACAP抗体，优选为含有与Ab10的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的抗体或与Ab10结合PACAP上的相同或重叠表位的抗体。
[0321] 在本发明的另一的实施方案中，抗原结合片段包含以下或由以下组成：对PACAP具有结合特异性的Fab片段。关于抗体Ab10，Fab 片段优选包含SEQ ID NO:402的可变重链序列和SEQ ID NO：422 的可变轻链序列或，与这些序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。本发明的这个实施方案还包括保留对PACAP的结合特异性的含有SEQ ID NO:402和/或SEQ ID NO:422的添加、缺失和变异的Fab。
[0322] 在本文所述的本发明的一个实施方案中，Fab片段可通过Ab10 的酶促消化(例如木瓜蛋白酶)来产生。在本发明的另一实施方案中，抗PACAP抗体(诸如Ab10)或Fab片段可通过在哺乳动物细胞(诸如 CHO、NSO或HEK 293细胞)、真菌、昆虫或微生物系统(诸如酵母细胞(例如单倍体或二倍体酵母，诸如单倍体或二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株)中表达来产生。合适的毕赤酵母物种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0323] 在一个另外的实施方案中，本发明还涉及编码对PACAP具有结合特异性的抗体多肽的多核苷酸，所述抗体多肽包括Ab10的重链和 /或轻链以及上述FR、CDR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的片段，变体和组合，包括这些序列全部或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0324] 抗体Ab20
[0325] 在一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其拥有包含SEQ ID NO:441的序列的重链序列，所述重链序列由连接到SEQ ID NO:450的重链恒定区的SEQ ID NO: 442的重链可变区组成。
[0326] 在一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其含有包含下述序列的可变重链序列：
[0327]QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYYMSWVRQAPGKGLEWIGFIDTDGSAYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTA TYFCARDLDLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:442)。
[0328] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其与Ab20结合相同的表位并且含有恒定重链序列，所述恒定重链序列包含SEQ ID NO:1244、1245或1246的多肽或包含下述序列：
[0329]ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:450)。
[0330] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:461的序列的轻链序列，所述轻链序列由连接到SEQ ID NO:470的轻链恒定区的SEQ ID NO:462的轻链可变区组成。
[0331] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其含有包含下述序列的可变轻链序列：
[0332]AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSESVYSNYLAWFQQKPGQPPKFLIYEASKLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAGTYY CAGGYSSEGVAFGGGTEVVVKR(SEQ ID NO:462)。
[0333] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，其与Ab20结合相同的表位并且含有包含下述序列的恒定轻链序列：
[0334]TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:470)。
[0335] 在另一个实施方案中，本发明包括对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段，所述抗体及抗原结合片段含有SEQ ID NO: 444；SEQ ID NO:446；和SEQ ID NO:448的多肽序列中的一个、两个或三个，其对应于SEQ ID NO:441的重链序列的CDR(高变区)或其含有SEQ ID NO:442的可变重链序列，并且/或者所述抗体及抗原结合片段还含有SEQ ID NO:464；SEQ ID NO:466；和SEQ ID NO: 468的多肽序列中的一个、两个或三个，其对应于SEQ ID NO:461 的轻链序列的CDR(高变区)或其含有SEQ ID NO:462的可变轻链序列，或者含有与这些多肽序列至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％或99％相同的序列组合的抗体或抗原结合片段。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：上述示例性可变重链和可变轻链序列、或重链和轻链序列、或与这些多肽序列至少90％或95％相同的序列中的一个或多个的组合。
[0336] 本发明还预期抗PACAP抗体及抗原结合片段，所述抗PACAP 抗体及抗原结合片段含有SEQ ID NO:443；SEQ ID NO:445；SEQ ID NO:447；和SEQ ID NO:449的多肽序列中的一个、两个、三个或四个，其对应于SEQ ID NO:441的重链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:442的可变重链序列，和/或SEQ ID NO:463；SEQ ID NO:465； SEQ ID NO:467；和SEQ ID NO:469的多肽序列中的一个、两个、三个或四个，其对应于SEQ ID NO:461的轻链序列的FR(恒定区)或 SEQ ID NO:462的可变轻链序列，或这些多肽序列的组合，或与这些多肽序列至少
80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
[0337] 在本发明的另一实施方案中，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：上述FR、CDR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的组合，包括这些序列全部或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0338] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:441或SEQ ID NO:442或与这些序列至少90％或95％相同的多肽的多肽序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:461或SEQ ID NO:462或与这些序列至少90％或95％相同的多肽的多肽序列。
[0339] 在本发明的另一实施方案中，对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:444； SEQ ID NO:446；和SEQ ID NO:448的多肽序列中的一个、两个或三个，其对应于SEQ ID NO:441的重链序列的CDR(高变区)或SEQ ID NO:442的可变重链序列，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0340] 在本发明的另一实施方案中，对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:464； SEQ ID NO:466；和SEQ ID NO:468的多肽序列中的一个、两个或三个，其对应于SEQ ID NO:461的轻链序列的CDR(高变区)或SEQ ID NO:462的可变轻链序列，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0341] 在本发明的另一实施方案中，对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:443； SEQ ID NO:445；SEQ ID NO:447；和SEQ ID NO:449的多肽序列中的一个、两个、三个或四个，其对应于SEQ ID NO:441的重链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:442的可变重链序列，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0342] 在本发明的另一实施方案中，对PACAP具有结合特异性的本发明的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:463；SEQ ID NO:465；SEQ ID NO:467；和SEQ ID NO:469的多肽序列中的一个、两个、三个或四个，其对应于SEQ ID NO:461 的轻链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:462的可变轻链序列，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0343] 本发明也预期包括本文所述的一种或多种抗体片段的抗PACAP 抗体及抗原结合片段。在本发明的一个实施方案中，对PACAP具有结合特异性的抗体及抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成，包括以下全部抗体片段的一个、两个、三个或更多个：SEQ ID NO:442 的可变重链区；SEQ ID NO:462的可变轻链区域；SEQ ID NO:442 的可变重链区的互补决定区(SEQ ID NO:444；SEQ ID NO:446；和 SEQ ID NO:448)；和SEQ ID NO:462的可变轻链区域的互补决定区 (SEQ ID NO:464；SEQ ID NO:466和SEQ ID NO:468)，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。在本发明的另一个实施方案中，对 PACAP具有结合特异性的抗体的片段包含以下或可替代地由以下组成，包括以下全部抗体片段的一个、两个、三个或更多个：SEQ ID NO: 442的可变重链区；SEQ ID NO:462的可变轻链区域；SEQ ID NO:442 的可变重链区的框架区(SEQ ID NO:443；SEQ ID NO:445；SEQ ID NO:447；和SEQ ID NO:449)；和SEQ ID NO:462的可变轻链区域的框架区(SEQ ID NO:463；SEQ ID NO:465；SEQ ID NO:467和SEQ ID NO:469)，或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0344] 在本发明的另一个实施方案中，抗PACAP抗体为包含以下或可替代地由以下组成的Ab20：SEQ ID NO:441和SEQ ID NO:461或者 SEQ ID NO:442和SEQ ID NO:462，或包含Ab20的CDR且具有本文所述的至少一种生物活性的抗体或抗原结合片段，或者为与Ab20 竞争结合PACAP的抗PACAP抗体，优选为含有与Ab20的序列至少 90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的抗体或与Ab20结合PACAP上的相同或重叠表位的抗体。
[0345] 在本发明的另一的实施方案中，抗原结合片段包含以下或可替代地由以下组成：对PACAP具有结合特异性的Fab片段。关于抗体 Ab20，Fab片段优选包含SEQ ID NO:442的可变重链序列和SEQ ID NO：462的可变轻链序列或，或与这些序列至少90％、95％、96％、
97％、98％或99％相同的序列。本发明的这个实施方案还包括保留对 PACAP的结合特异性的含有SEQ ID NO:442和/或SEQ ID NO:462 的添加、缺失和变异的Fab。
97％、98％或99％相同的序列。本发明的这个实施方案还包括保留对 PACAP的结合特异性的含有SEQ ID NO:442和/或SEQ ID NO:462 的添加、缺失和变异的Fab。
[0346] 在本文所述的本发明的一个实施方案中，Fab片段可通过Ab20 的酶促消化(例如木瓜蛋白酶)来产生。在本发明的另一实施方案中，抗PACAP抗体(诸如Ab20)和Fab片段可通过在哺乳动物细胞(诸如 CHO、NSO或HEK 293细胞)、真菌、昆虫或微生物系统(诸如酵母细胞(例如单倍体或二倍体酵母，诸如单倍体或二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株)中表达来产生。合适的毕赤酵母物种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0347] 在一个另外的实施方案中，本发明还涉及编码对PACAP具有结合特异性的抗体多肽的多核苷酸，所述抗体多肽包括Ab20的重链和 /或轻链以及上述FR、CDR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的片段、变体及组合，包括这些序列全部或与这些序列至少90％或95％相同的序列。
[0348] 在另一个实施方案中，本发明预期分离的抗PACAP抗体，其包含选自SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:442或其变体的VH多肽序列；并且还包含选自SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:
462或其变体的VL多肽序列，其中所述VH或VL多肽中的框架区残基(“FR残基”)和/或CDR 残基中的一个或多个已被另一个氨基酸残基取代，从而产生特异性结合PACAP的抗PACAP抗体。本发明也包括这些抗体的人源化和嵌合形式。嵌合抗体和人源化抗体可包括源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 恒定区的Fc。
462或其变体的VL多肽序列，其中所述VH或VL多肽中的框架区残基(“FR残基”)和/或CDR 残基中的一个或多个已被另一个氨基酸残基取代，从而产生特异性结合PACAP的抗PACAP抗体。本发明也包括这些抗体的人源化和嵌合形式。嵌合抗体和人源化抗体可包括源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 恒定区的Fc。
[0349] 在本发明的一个实施方案中，嵌合抗体或人源化抗体或片段或 VH或VL多肽多肽来源于或源自一种或多种兔抗体，例如从克隆兔B 细胞群体中分离的兔抗体。
[0350] 在一些方面，本发明提供包含编码如本文所公开的抗PACAP抗体或其片段的核酸分子的载体。在一些实施方案中，本发明提供包含编码如本文所公开的抗PACAP抗体或其片段的核酸分子的载宿主细胞。
[0351] 在一些方面，本发明提供了与本文所公开的抗体或其抗原结合片段竞争结合PACAP的分离的抗体或其抗原结合片段。
[0352] 在一些方面，本发明提供编码如本文所公开的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
[0353] 在一些方面，本发明提供包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合片段的药物组合物或诊断组合物。
[0354] 在一些方面，本发明提供一种用于在受试者中治疗或预防与升高的PACAP水平相关联的病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种如本文所公开的分离的抗体或其抗原结合片段。
[0355] 在一些方面，本发明提供一种在受试者中抑制PACAP与 PAC1-R、VPAC1-R和/或VPAC2-R的结合的方法，所述方法包括施用有效量的至少一种如本文所公开的的抗体或其抗原结合片段。
[0356] 在一些方面，本发明提供了选择性结合PACAP的抗体或其抗原结合片段，其中所述-5 -5 -6 -6抗体或其抗原结合片以以下KD与PACAP结合：小于或等于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、
5x10-7M、10-7M、 5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、 10-11M、5x10-12M、
10-12M、5x10-13M或10-13M；优选地，KD小于或等于5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M或
10-12M；更优选地，KD小于约100pM、小于约50pM、小于约40pM、小于约25pM、小于约1pM、在约
10pM与约100pM之间、在约1pM 与约100pM之间或在约1pM与约10pM之间。优选地，抗PACAP 抗体或其抗原结合片段与VIP没有交叉反应性或具有最小的交叉反应性。
5x10-7M、10-7M、 5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、 10-11M、5x10-12M、
10-12M、5x10-13M或10-13M；优选地，KD小于或等于5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M或
10-12M；更优选地，KD小于约100pM、小于约50pM、小于约40pM、小于约25pM、小于约1pM、在约
10pM与约100pM之间、在约1pM 与约100pM之间或在约1pM与约10pM之间。优选地，抗PACAP 抗体或其抗原结合片段与VIP没有交叉反应性或具有最小的交叉反应性。
[0357] 本发明抗体及其抗原结合片段可进行翻译后修饰以添加效应子部分(诸如化学接头)、可检测部分(例如像荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料和化学发光部分)、或功能性部分(例如像链霉亲和素、抗生物素蛋白、生物素、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性材料)。
[0358] 抗体及其抗原结合片段也可进行化学修饰以提供另外的优势，诸如增加多肽的溶解度、稳定性和循环时间(体内半衰期)或降低免疫原性(参见美国专利号4,179,337)。用于衍生化的化学部分可选自水溶性聚合物，诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等。抗体及其片段可在分子内的随机位置上或在分子内的预定位置上进行修饰并且可包括一个、两个、三个或更多个附接的化学部分。
[0359] 所述聚合物可具有任何分子量，并且可分支或未分支。对于聚乙二醇，优选分子量在约1kDa与约100kDa之间(术语“约”指示在聚乙二醇的制剂中，一些分子的分子量将比所述分子量大，一些将比所述分子量小)以易于处理和制造。取决于所需的治疗概况(例如所需的持续释放的持续时间、对生物活性的影响(如果有)、处理的容易性、抗原性程度或抗原性的缺乏以及聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物的其它已知影响)，可使用其它大小。例如，聚乙二醇的平均分子量可为约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、 5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、 10,000、10,500、11,000、11,
500、12,000、12,500、13,000、13,500、 14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、
17,000、17,500、 18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、 40,
000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、 85,000、90,000、95,000或
100,000kDa。分支的聚乙二醇描述于，例如美国专利号5,643,575；Morpurgo等，
Appl.Biochem.Biotechnol., 56:59-72(1996)；Vorobjev等，Nucleosides and
Nucleotides, 18:2745-2750(1999)；以及Caliceti等，Bioconjug.Chem.,10:638-646 (1999)中，其各自的公开内容以引用的方式并入本文。
500、12,000、12,500、13,000、13,500、 14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、
17,000、17,500、 18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、 40,
000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、 85,000、90,000、95,000或
100,000kDa。分支的聚乙二醇描述于，例如美国专利号5,643,575；Morpurgo等，
Appl.Biochem.Biotechnol., 56:59-72(1996)；Vorobjev等，Nucleosides and
Nucleotides, 18:2745-2750(1999)；以及Caliceti等，Bioconjug.Chem.,10:638-646 (1999)中，其各自的公开内容以引用的方式并入本文。
[0360] 本领域技术人员可使用许多附接方法(参见例如，以引用的方式并入本文公开了将PEG与G-CSF偶联的方法的EP 0 401 384；以及 Malik等，Exp.Hematol.,20:1028-1035(1992)(报道了使用三氟乙烷磺酰氯(tresyl chloride)的GM-CSF的聚乙二醇化作用)。例如，聚乙二醇可通过反应性基团(诸如游离氨基或羧基)通过氨基酸残基进行共价结合。反应性基团为激活的聚乙二醇分子可结合的基团。具有游离氨基的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；具有游离羧基的氨基酸残基可包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基也可用作用于附接聚乙二醇分子的反应性基团。对于治疗目的而言优选的是在氨基上附接，诸如如在N末端或赖氨酸基团上附接。
[0361] 如以上所表明，聚乙二醇可通过键联到多种氨基酸残基中的任何残基而附接到蛋白质。例如，聚乙二醇可通过与赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸残基的共价键而连接到多肽。可采用一种或多种反应化学将聚乙二醇附接到特定氨基酸残基(例如赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸)或一种以上类型的氨基酸残基(例如赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸及其组合)。
[0362] 或者，抗体或其抗原结合片段可通过与白蛋白(包括但不限于重组人血清白蛋白或其片段或变体(参见例如，以引用的方式整体并入本文的美国专利号5,876,969、EP 0 413 622和美国专利号5,766,883)) 或其它循环血液蛋白质(诸如转铁蛋白或铁蛋白)融合而具有增加的体内半衰期。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)与人血清白蛋白的成熟形式(即如EP 0 322 094的图1 和2中所示的人血清白蛋白的氨基酸1～585)融合，所述专利以引用的方式整体并入本文。本发明也预期编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。
[0363] 关于可检测部分，其它示例性酶包括但不限于辣根过氧化酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和荧光素酶。其它示例性荧光材料包括但不限于罗丹明、荧光素、异硫氰酸荧光素、伞形酮、二氯三嗪基胺、藻红素和丹磺酰氯。其它示例性化学发光部分包括但不限于鲁米诺。其它示例性生物发光材料包括但不限于荧光素和水母素。其它示例性放射性材料包括但不限于碘125(125I)、碳14(14C)、硫35(35S)、氚(3H)和磷32(32P)。
[0364] 本领域已知用于使抗体或其抗原结合片段缀合到可检测部分等的方法，例如像Hunter等，Nature,144:945(1962)；David等， Biochemistry,13:1014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.,40:219 (1981)；和Nygren,J.,Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)所述的那些方法。
[0365] 本文所述的实施方案还包括与本文所述的抗体、抗体片段、微型双功能抗体、SMIP、骆驼抗体、纳米抗体、IgNAR、多肽、可变区和CDR基本上同源的变体和等效物。这些变体和等效物可含有例如保守取代突变(即一个或多个氨基酸由相似氨基酸取代)。例如，保守取代是指一个氨基酸被相同的一般类别内的另一种氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸被另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸被另一中性氨基酸取代。保守氨基酸取代的目的在本领域中是众所周知的。
[0366] 在另一个实施方案中，本发明预期与本文所述的抗原结合片段、可变区和CDR的多肽序列中的任何一个或多个具有至少90％或更大的序列同源性的多肽序列。更优选地，本发明预期与本文所述的抗原结合片段、可变区和CDR的多肽序列中的任何一个或多个具有至少 95％或更大的序列同源性、甚至更优选至少98％或更大的序列同源性、并且还更优选至少99％或更大的序列同源性的多肽序列。
[0367] 用于确定核酸与氨基酸序列之间的同源性的方法为本领域普通技术人员所众所周知。
[0368] 在另一个实施方案中，本发明还预期本文所述的抗原结合片段、可变区和CDR的上述多肽同源物还具有抗PACAP活性。本文阐述了抗PACAP活性的非限制性实例，例如抑制PACAP与PAC1-R、 VPAC1-R和/或VPAC2-R的结合从而导致cAMP的产生减少的能力。
[0369] 在另一个实施方案中，本发明还预期结合任何前述序列的抗体 (包括但不限于抗独特型抗体)的生成和用途。在一个示例性实施方案中，此类抗独特型抗体可向已接受抗PACAP抗体的受试者施用以调节、降低或中和抗PACAP抗体的影响。此类抗体也可用于治疗特征在于存在抗PACAP抗体的自身免疫性疾病。此类抗体(例如，抗独特型抗体)的另一示例性用途在于检测本发明的抗PACAP抗体，例如以监测受试者的血液或其它体液中存在的抗PACAP抗体的水平。例如，在一个实施方案中，本发明提供了一种使用抗独特型抗体在受试者中监测所述抗PACAP抗体或其抗原结合片段的体内水平或者在施用所述抗PACAP抗体或其抗原结合片段的受试者中中和所述抗PACAP 抗体的方法。
[0370] 本发明也预期包含被取代成本文所述的任何其它多核苷酸序列的本文所述的任何多肽或多核苷酸序列的抗PACAP抗体。例如但不加限制，本发明预期包含本文所述的任何可变轻链和可变重链序列的组合的抗体，并且还预期由本文所述的任何其它CDR序列取代本文所述的任何CDR序列所产生的抗体。
[0371] 编码抗PACAP抗体多肽的示例性多核苷酸
[0372] 本发明还涉及编码对PACAP具有结合特异性的抗体多肽的多核苷酸。
[0373] 抗体Ab10
[0374] 在一个实施方案中，本发明还涉及编码对PACAP具有结合特异性的抗体多肽的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:411的多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:401的重链序列并且其由SEQ ID NO:
412 的重链可变区编码序列和SEQ ID NO:420的重链恒定区编码序列组成。
412 的重链可变区编码序列和SEQ ID NO:420的重链恒定区编码序列组成。
[0375] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:402的可变重链多肽序列的下列多核苷酸序列：
[0376] cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgc acagtctctggaatcgacctcaatagctactacatgacctgggtccgccaggctccagggaaggggctg
gaatggatcggattcattgatgctggtggtgacgcatactacgcgagctgggcgaaaggccgattcacc
atctccaaaacctcgaccacggtggatctgaaaatcaccagtccgacaaccgaggacacggccaccta
tttctgtgccagagatcttgacttgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcgagc(SEQ ID NO:412)。
gaatggatcggattcattgatgctggtggtgacgcatactacgcgagctgggcgaaaggccgattcacc
atctccaaaacctcgaccacggtggatctgaaaatcaccagtccgacaaccgaggacacggccaccta
tttctgtgccagagatcttgacttgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcgagc(SEQ ID NO:412)。
[0377] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:410的恒定重链多肽序列的下列多核苷酸序列：
[0378] gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggca cagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggc
gccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagc
gtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccag
caacaccaaggtggacgcgagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcc
cagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgat
ctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttca
actggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgcca
gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt
gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcc
ccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctg
acctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccgga
gaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc
gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa
ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO:420)。
gccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagc
gtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccag
caacaccaaggtggacgcgagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcc
cagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgat
ctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttca
actggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgcca
gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt
gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcc
ccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctg
acctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccgga
gaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc
gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa
ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO:420)。
[0379] 在本发明的另一个实施方案中，多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:431的多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:421 的轻链多肽序列并且其由SEQ ID NO:432的轻链可变区编码序列和 SEQ ID NO:440的轻链恒定区编码序列组成。
[0380] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:422的可变轻链多肽序列的下列多核苷酸序列：
[0381] gccgccgtgctgacccagactccatctcccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatca attgccagtccagtgagagtgtttacggtaactacttagcctggtttcagcagaaaccagggcagcctcc
caagctcctgatctacgaagcatccaaactggaatctggggtcccatcgcggttcagcggcagtggatct
gggacacagttcactctcaccatcagcgacttgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtgcaggcg
gtgatattagtgaaggtgttgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgt(SEQ ID NO: 432)。
caagctcctgatctacgaagcatccaaactggaatctggggtcccatcgcggttcagcggcagtggatct
gggacacagttcactctcaccatcagcgacttgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtgcaggcg
gtgatattagtgaaggtgttgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgt(SEQ ID NO: 432)。
[0382] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:430的恒定轻链多肽序列的下列多核苷酸序列：
[0383] acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcct ctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccct ccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagc
agcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatca
gggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO:440)。
agcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatca
gggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO:440)。
[0384] 在本发明的另一实施方案中，编码对PACAP具有结合特异性的抗原结合片段的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:414；SEQ ID NO:416；和SEQ ID NO:418的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于编码SEQ ID NO:401的重链序列的CDR(高变区)或SEQ ID NO:402的可变重链序列的多核苷酸，和/或SEQ ID NO:434；SEQ ID NO:436；
和SEQ ID NO:438的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于SEQ ID NO:421的轻链序列的CDR(高变区) 或SEQ ID NO:422的可变轻链序列，或这些多核苷酸序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸包含以下或者可替代地由以下组成：编码上述CDR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的多核苷酸的组合，包括这些多核苷酸全部。
和SEQ ID NO:438的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于SEQ ID NO:421的轻链序列的CDR(高变区) 或SEQ ID NO:422的可变轻链序列，或这些多核苷酸序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸包含以下或者可替代地由以下组成：编码上述CDR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的多核苷酸的组合，包括这些多核苷酸全部。
[0385] 在本发明的另一实施方案中，编码对PACAP具有结合特异性的抗原结合片段的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:413；SEQ ID NO:415；SEQ ID NO:417；和SEQ ID NO:419的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于编码SEQ ID NO:401的重链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:402的可变重链序列的多核苷酸，和/或SEQ ID NO:433；SEQ ID NO:435；SEQ ID NO:437；和 SEQ ID NO:439的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于SEQ ID NO:421的轻链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:422的可变轻链序列，或这些多核苷酸序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸包含以下或者可替代地由以下组成：上述FR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的多核苷酸的组合，包括这些多核苷酸全部。
[0386] 本发明也预期包括编码本文所述的抗原结合片段的多核苷酸序列中的一个或多个的多核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，编码对PACAP具有结合特异性的抗原结合片段的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：包括以下全部编码抗原结合片段的多核苷酸的一个、两个、三个或更多个：编码SEQ ID NO:401的重链序列的多核苷酸SEQ ID NO:411；编码SEQ ID NO:402的可变重链序列的多核苷酸SEQ ID NO:412；编码SEQ ID NO:421的轻链序列的多核苷酸SEQ ID NO:431；编码SEQ ID NO:422的可变轻链序列的多核苷酸SEQ ID NO:432；编码SEQ ID NO:401的重链序列的CDR(SEQ ID NO:414；SEQ ID NO:416；和SEQ ID NO:418)或SEQ ID NO:402 的可变重链序列的多核苷酸；编码SEQ ID NO:421的轻链序列的 CDR(SEQ ID NO:434；SEQ ID NO:436；和SEQ ID NO:438)或SEQ ID NO:422的可变轻链序列的多核苷酸；编码SEQ ID NO:401的重链序列的FR(SEQ ID NO:413；SEQ ID NO:
415；SEQ ID NO:417；和SEQ ID NO:419)或SEQ ID NO:402的可变重链序列的多核苷酸；以及编码SEQ ID NO:421的轻链序列的FR(SEQ ID NO:433；SEQ ID NO:435；SEQ ID NO:437；
和SEQ ID NO:439)或SEQ ID NO:422 的可变轻链序列的多核苷酸。
415；SEQ ID NO:417；和SEQ ID NO:419)或SEQ ID NO:402的可变重链序列的多核苷酸；以及编码SEQ ID NO:421的轻链序列的FR(SEQ ID NO:433；SEQ ID NO:435；SEQ ID NO:437；
和SEQ ID NO:439)或SEQ ID NO:422 的可变轻链序列的多核苷酸。
[0387] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码对PACAP具有结合特异性的Fab片段的多核苷酸。关于抗体Ab10，编码全长Ab10抗体的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:401的重链序列的多核苷酸SEQ ID NO:411和编码SEQ ID NO:421的轻链序列的多核苷酸 SEQ ID NO:431。
[0388] 本发明的另一个实施方案预期并入表达载体中用于在哺乳动物细胞(诸如CHO、NSO或HEK-293)中或在真菌、昆虫或微生物系统(诸如酵母细胞(诸如毕赤酵母))中表达的这些多核苷酸。合适的毕赤酵母物种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。在本文所述的本发明的一个实施方案中，Fab片段可以通过全长多核苷酸在合适的宿主中表达之后的 Ab10的酶促消化(例如木瓜蛋白酶)来产生。在本发明的另一个实施方案中，抗PACAP抗体(诸如Ab10)或其Fab片段可以通过在哺乳动物细胞(诸如CHO、NSO或HEK 293细胞)、真菌、昆虫或微生物系统(诸如酵母细胞(例如二倍体酵母，诸如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株) 中表达Ab10多核苷酸来产生。合适的毕赤酵母物种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0389] 抗体Ab20
[0390] 在一个实施方案中，本发明还涉及编码对PACAP具有结合特异性的抗体多肽的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:451的多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:441的重链序列并且其由SEQ ID NO:
452 的重链可变区编码序列和SEQ ID NO:460的重链恒定区编码序列组成。
452 的重链可变区编码序列和SEQ ID NO:460的重链恒定区编码序列组成。
[0391] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:442的可变重链多肽序列的下列多核苷酸序列：
[0392] cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgc acagtctctggaatcgacctcagtagctactacatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggct
ggaatggatcggattcattgatactgatggtagcgcatactacgcgacctgggcgaaaggccgattcac
catctccaaaacctcgaccacggtggatctgaaaatcaccagtccgacaaccgaggacacggccacct
atttctgtgccagagatcttgacttgtggggcccgggcaccctcgtcaccgtctcgagc(SEQ ID NO:452)。
ggaatggatcggattcattgatactgatggtagcgcatactacgcgacctgggcgaaaggccgattcac
catctccaaaacctcgaccacggtggatctgaaaatcaccagtccgacaaccgaggacacggccacct
atttctgtgccagagatcttgacttgtggggcccgggcaccctcgtcaccgtctcgagc(SEQ ID NO:452)。
[0393] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:450的恒定重链多肽序列的下列多核苷酸序列：
[0394] gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggca cagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggc
gccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagc
gtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccag
caacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcc
cagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgat
ctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttca
actggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgcca
gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt
gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcc
ccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctg
acctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccgga
gaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc
gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa
ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO:460)。
gccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagc
gtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccag
caacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcc
cagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgat
ctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttca
actggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgcca
gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt
gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcc
ccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctg
acctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccgga
gaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc
gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa
ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO:460)。
[0395] 在本发明的另一个实施方案中，多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:471的多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:461 的轻链多肽序列并且其由SEQ ID NO:472的轻链可变区编码序列和 SEQ ID NO:480的轻链恒定区编码序列组成。
[0396] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:462的可变轻链多肽序列的下列多核苷酸序列：
[0397] gccgccgtgctgacccagactccatctcccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcagcatca gttgccagtccagtgagagtgtttatagtaactacttagcctggtttcagcagaaaccagggcagcctcct
aagttcttgatctacgaagcatccaaactggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctg
ggacacagttcactctcaccatcagcgacgtgcagtgtgacgatgctggcacttactactgtgcaggcg
gctatagtagtgaaggtgttgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgt(SEQ ID NO: 472)。
aagttcttgatctacgaagcatccaaactggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctg
ggacacagttcactctcaccatcagcgacgtgcagtgtgacgatgctggcacttactactgtgcaggcg
gctatagtagtgaaggtgttgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgt(SEQ ID NO: 472)。
[0398] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:470的恒定轻链多肽序列的下列多核苷酸序列：
[0399] acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcct ctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccct ccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagc
agcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatca
gggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO:480)。
agcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatca
gggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO:480)。
[0400] 在本发明的另一实施方案中，编码对PACAP具有结合特异性的抗原结合片段的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:454；SEQ ID NO:456；和SEQ ID NO:458的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于编码SEQ ID NO:441的重链序列的CDR(高变区)或SEQ ID NO:442的可变重链序列的多核苷酸，和/或SEQ ID NO:474；SEQ ID NO:476；
和SEQ ID NO:478的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于SEQ ID NO:461的轻链序列的CDR(高变区) 或SEQ ID NO:462的可变轻链序列，或这些多核苷酸序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸包含以下或者可替代地由以下组成：编码上述CDR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的多核苷酸的组合，包括这些多核苷酸全部。
和SEQ ID NO:478的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于SEQ ID NO:461的轻链序列的CDR(高变区) 或SEQ ID NO:462的可变轻链序列，或这些多核苷酸序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸包含以下或者可替代地由以下组成：编码上述CDR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的多核苷酸的组合，包括这些多核苷酸全部。
[0401] 在本发明的另一实施方案中，编码对PACAP具有结合特异性的抗原结合片段的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：SEQ ID NO:453；SEQ ID NO:455；SEQ ID NO:457；和SEQ ID NO:459的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于编码SEQ ID NO:441的重链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:442的可变重链序列的多核苷酸，和/或SEQ ID NO:473；SEQ ID NO:475；SEQ ID NO:477；和 SEQ ID NO:479的多核苷酸序列中的一个或多个，其对应于SEQ ID NO:461的轻链序列的FR(恒定区)或SEQ ID NO:462的可变轻链序列，或这些多核苷酸序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，编码根据本发明的抗体或其片段的多核苷酸包含以下或者可替代地由以下组成：上述FR、可变重链和可变轻链序列以及重链和轻链序列中的一个或多个的多核苷酸的组合，包括这些多核苷酸全部。
[0402] 本发明也预期包括编码本文所述的抗原结合片段的多核苷酸序列中的一个或多个的多核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，编码对PACAP具有结合特异性的抗原结合片段的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：包括以下全部编码抗原结合片段的多核苷酸的一个、两个、三个或更多个：编码SEQ ID NO:441的重链序列的多核苷酸SEQ ID NO:451；编码SEQ ID NO:442的可变重链序列的多核苷酸SEQ ID NO:452；编码SEQ ID NO:461的轻链序列的多核苷酸SEQ ID NO:471；编码SEQ ID NO:462的可变轻链序列的多核苷酸SEQ ID NO:472；编码SEQ ID NO:441的重链序列的CDR(SEQ ID NO:454；SEQ ID NO:456；和SEQ ID NO:458)或SEQ ID NO:442 的可变重链序列的多核苷酸；编码SEQ ID NO:461的轻链序列的 CDR(SEQ ID NO:474；SEQ ID NO:476；和SEQ ID NO:478)或SEQ ID NO:462的可变轻链序列的多核苷酸；编码SEQ ID NO:441的重链序列的FR(SEQ ID NO:453；SEQ ID NO:
455；SEQ ID NO:457；和SEQ ID NO:459)或SEQ ID NO:442的可变重链序列的多核苷酸；以及编码SEQ ID NO:461的轻链序列的FR(SEQ ID NO:473；SEQ ID NO:475；SEQ ID NO:477；
和SEQ ID NO:479)或SEQ ID NO:462 的可变轻链序列的多核苷酸。
455；SEQ ID NO:457；和SEQ ID NO:459)或SEQ ID NO:442的可变重链序列的多核苷酸；以及编码SEQ ID NO:461的轻链序列的FR(SEQ ID NO:473；SEQ ID NO:475；SEQ ID NO:477；
和SEQ ID NO:479)或SEQ ID NO:462 的可变轻链序列的多核苷酸。
[0403] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码对PACAP具有结合特异性的Fab片段的多核苷酸。关于抗体Ab20，编码全长Ab20抗体的多核苷酸包含以下或可替代地由以下组成：编码SEQ ID NO:441的重链序列的多核苷酸SEQ ID NO:451和编码SEQ ID NO:461的轻链序列的多核苷酸 SEQ ID NO:471。
[0404] 本发明的另一个实施方案预期并入表达载体中用于在哺乳动物细胞(诸如CHO、NSO或HEK-293)中或在真菌、昆虫或微生物系统(诸如酵母细胞(诸如毕赤酵母))中表达的这些多核苷酸。合适的毕赤酵母物种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。在本文所述的本发明的一个实施方案中，Fab片段可以通过全长多核苷酸在合适的宿主中表达之后的 Ab20的酶促消化(例如木瓜蛋白酶)来产生。在本发明的另一个实施方案中，抗PACAP抗体(诸如Ab20)或其Fab片段可以通过在哺乳动物细胞(诸如CHO、NSO或HEK 293细胞)、真菌、昆虫或微生物系统(诸如酵母细胞(例如二倍体酵母，诸如二倍体毕赤酵母)和其它酵母菌株) 中表达Ab20多核苷酸来产生。合适的毕赤酵母物种包括但不限于巴斯德毕赤酵母。
[0405] 也预期包含所述多核苷酸的宿主细胞和载体。
[0406] 本发明还预期包含编码如本文所述的可变重链和轻链多肽序列以及各个CDR(高变区)的多核苷酸序列的载体，以及包含所述载体序列的宿主细胞。在本发明的实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞，诸如CHO细胞。在本发明的实施方案中，宿主细胞为酵母细胞，诸如毕赤酵母属的酵母细胞
[0407] B细胞筛选和分离
[0408] 在一个实施方案中，本发明预期抗原特异性B细胞克隆群体的制备和分离，所述抗原特异性B细胞克隆群体可用于分离至少一种 PACAP抗原特异性细胞，所述PACAP抗原特异性细胞可用来产生对所需的PACAP抗原具有特异性的抗PACAP的单克隆抗体或对应于此类抗体的核酸序列。制备和分离所述抗原特异性B细胞克隆群体的方法例如教导于Carvalho-Jensen等的美国专利公布号 2007/0269868，其公开内容以引用的方式整体并入本文。制备和分离所述抗原特异性B细胞克隆群体的方法也在本文实例中进行教导。通过尺寸或密度“富集”细胞群的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5,627,052)。除通过抗原特异性使细胞群体增浓之外，也可使用这些步骤。
[0409] 使抗体人源化的方法
[0410] 在另一个实施方案中，本发明预期使抗体重链和轻链人源化的方法。可应用于抗PACAP抗体的使抗体重链和轻链人源化的方法例如教导于Olson等的美国专利公布号2009/0022659和Garcia-Martinez 等的美国专利号7,935,340中，所述专利各自的公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0411] 产生抗体及其片段的方法
[0412] 在另一个实施方案中，本发明预期用于产生抗PACAP抗体及其片段的方法。用于产生由多倍体、优选二倍体或四倍体接合感受态酵母菌株分泌的抗PACAP抗体及其片段的方法例如教导于Olson等的美国专利公布号2009/0022659和Garcia-Martinez等的美国专利号 7,935,340中，所述专利各自的公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0413] 产生抗体的其它方法为本领域普通技术人员所众所周知。例如，制备嵌合抗体的方法目前在本领域中是众所周知的(参见例如， Cabilly等的美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,81:8651-55，1984；Neuberger等，Nature,314:
268-270,1985； Boulianne，G.L.等，Nature,312:643-46,1984，所述专利和文献各自的公开内容以引用的方式整体并入本文)。
268-270,1985； Boulianne，G.L.等，Nature,312:643-46,1984，所述专利和文献各自的公开内容以引用的方式整体并入本文)。
[0414] 同样，产生人源化抗体的其它方法目前在本领域中是众所周知的 (参见例如Queen等的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和 6,180,370；Winter的美国专利号5,225,539和6,548,640；Carter等的美国专利号6,054,297、6,407,213和6,639,055；
Adair的美国专利号 6,632,927；Jones,P.T.等.，Nature,321:522-525,1986；Reichmann,L. 等，Nature,332:323-327,1988；Verhoeyen,M等，Science,239:1534-36, 1988，所述专利和文献各自的公开内容以引用的方式整体并入本文)。
Adair的美国专利号 6,632,927；Jones,P.T.等.，Nature,321:522-525,1986；Reichmann,L. 等，Nature,332:323-327,1988；Verhoeyen,M等，Science,239:1534-36, 1988，所述专利和文献各自的公开内容以引用的方式整体并入本文)。
[0415] 具有PACAP结合特异性的本发明的抗体多肽还可通过使用本领域技术人员众所周知的常规技术建构含有启动子(任选地作为真核或元和操纵子的组件)和编码抗体重链的DNA序列的表达载体而产生，在所述表达载体中，编码抗体特异性所需要的CDR的DNA序列源自非人细胞来源(优选兔B细胞来源)，而编码抗体链的其余部分的 DNA序列源自人细胞来源。
[0416] 使用本领域普通技术人员众所周知的相同常规手段产生第二表达载体，所述表达载体含有启动子(任选地作为真核或元和操纵子的组件)和编码抗体轻链的DNA序列，其中编码抗体特异性所需要的 CDR的DNA序列源自非人细胞来源(优选兔B细胞来源)，而编码抗体链的其余部分的DNA序列源自人细胞来源。
[0417] 通过本领域普通技术人员众所周知的常规技术将表达载体转染到宿主细胞中以产生转染宿主细胞，通过本领域普通技术人员众所周知的常规技术来培养所述转染宿主细胞以产生所述抗体多肽。
[0418] 宿主细胞可用上述两种表达载体共转染，其中第一表达载体含有编码启动子(任选地作为真核或元和操纵子的组件)和轻链来源的多肽的DNA，并且第二载体含有编码启动子(任选地作为真核或元和操纵子的组件)和重链来源的多肽的DNA。两种载体含有不同的可选择标记，但优选达成重链和轻链多肽的基本上相等的表达。可替代地，可使用单一载体，所述载体包括编码重链多肽与轻链多肽二者的DNA。重链和轻链的编码序列可包括cDNA、基因组DNA或二者。
[0419] 用来表达抗体多肽的宿主细胞可为细菌细胞(诸如大肠杆菌)或真核细胞(诸如巴斯德毕赤酵母)。在本发明的一个实施方案中，出于此目的，可使用明确定义类型的哺乳动物细胞，诸如骨髓瘤细胞、CHO 细胞系、NSO细胞系或HEK293细胞系。
[0420] 可借以构建载体的一般方法、产生宿主细胞所需要的转染方法以及由所述宿主细胞产生抗体多肽所需要的培养方法都包括常规技术。尽管用于产生抗体的细胞系优选是哺乳动物细胞系，但可替代地使用任何其它适合细胞系，如细菌细胞系(诸如大肠杆菌来源的细菌菌株) 或酵母细胞系。
[0421] 相似地，一经产生，抗体多肽即可根据本领域中的标准程序进行纯化，所述标准程序诸如交叉流过滤、硫酸铵沉淀、亲和管柱色谱、疏水作用色谱(“HIC”)等。
[0422] 本文所述的抗体多肽还可用于设计并合成可用于与本发明的抗体多肽相同的治疗应用的肽或非肽模拟物(参见例如Saragobi等， Science,253:792-795,1991，其公开内容以引用的方式整体并入本文)。
[0423] 筛选测定
[0424] 本文所述的筛选测定被设计用于鉴定高亲和力抗PACAP Ab，其可用于在表现出PACAP相关联的疾病或病症的症状的受试者中治疗与PACAP相关联的疾病和病症。
[0425] 在一些实施方案中，抗体用作诊断工具。抗体可以用于测定样品和/或受试者中存在的PACAP的量。如本领域技术人员将了解的，此类抗体不需要为中和抗体。在一些实施方案中，诊断抗体不为中和抗体。在一些实施方案中，诊断抗体与中和抗体结合不同的表位。在一些实施方案中，两种抗体彼此不竞争。
[0426] 在一些实施方案中，本文公开的抗体在测定试剂盒和/或方法中使用或提供，所述测定试剂盒和/或方法用于检测哺乳动物组织或细胞中的PACAP以便筛选/诊断与PACAP水平变化相关联的疾病或病症。试剂盒包括结合PACAP的抗体以及用于指示抗体与PACAP(如果存在)结合和任选PACAP蛋白质水平的手段。可以使用用于指示抗体存在的各种手段。例如，可以将荧光团、其它分子探针或酶连接到抗体并且可以以多种方式观察抗体的存在。用于筛选此类病症的方法可以涉及使用试剂盒，或者仅使用一种所公开的抗体并且确定抗体是否与样品中的PACAP结合。如本领域技术人员将了解的，PACAP 的水平较高或升高将导致较大量的抗体与样品中的PACAP结合。因此，抗体结合程度可以用于确定样品中有多少PACAP。PACAP的量大于预定量(例如未患PACAP相关病症的人将具有的量或范围)的受试者或样品可被表征为患有PACAP介导的病症，例如偏头痛、头疼、疼痛或其它病状。
[0427] 本发明还提供了一种用于检测本发明的抗PACAP抗体与 PACAP的结合的试剂盒。具体地，所述试剂盒可用来检测与本发明的抗PACAP抗体或其免疫反应性片段特异性反应的PACAP的存在。试剂盒也可包括结合到底物的抗体、与抗原反应的二级抗体以及用于检测所述二级抗体与抗原的反应的试剂。此类试剂盒可为ELISA试剂盒，并且可以包括底物、一级抗体和二级抗体(适当时)以及任何其它必要试剂(例如像如本文所述的可检测部分、酶底物和显色试剂)。诊断试剂盒也可呈免疫印迹试剂盒形式。诊断试剂盒也可呈化学发光试剂盒(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)形式。诊断试剂盒也可为基于镧系元素的检测试剂盒(PerkinElmer，San Jose，CA)。
[0428] 熟练的临床医师将了解，生物样品包括但不限于血清、血浆、尿液、唾液、粘液、胸膜液、滑液和脊髓液。
[0429] 缓解或减少PACAP相关联的疾病和病症的症状或治疗或预防 PACAP相关联的疾病和病症的方法
[0430] 在本发明的另一个实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体或其抗原结合片段可用于缓解或减少与PACAP相关联的疾病和病症的症状或者治疗或预防与PACAP相关联的疾病和病症。还可以向需要治疗与PACAP相关联的疾病和病症的患者施用治疗有效量的呈以下更详细描述的药物组合物形式的本文所述的抗PACAP抗体或其抗原结合片段以及组合。
[0431] 在本发明的另一个实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体或其抗原结合片段可(单独或与另一种药剂组合)用于缓解或减少与 PACAP相关联的疾病或病状的症状或者治疗或预防与PACAP相关联的疾病或病状。
[0432] 在本发明的另一个实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体或其抗原结合片段，在有或没有第二药剂的情况下，可用于缓解或减少以下非限制性疾病和病症的列表的症状或者治疗或预防以下非限制性疾病和病症的列表：偏头痛(具有或不具有先兆)、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、偏头痛性神经痛、慢性头痛、紧张性头痛、正头痛、热潮红、畏光、慢性阵发性半侧颅痛、头部或颈部潜在的结构性问题引起的继发性头痛、颅神经痛、窦性头痛(例如，与鼻窦炎相关联的头痛)、过敏诱导的头痛或偏头痛、疼痛、慢性疼痛、神经炎性或炎性疼痛、手术后切口疼痛、手术后疼痛、创伤相关疼痛、眼痛、牙痛、复杂性区域疼痛综合征、癌症疼痛(例如原发性或转移性骨癌疼痛)、骨折疼痛、骨质疏松性骨折疼痛、烧伤引起的疼痛、痛风关节疼痛、与镰状细胞危象相关联的疼痛、与颞下颌关节紊乱相关联的疼痛、肝硬化、肝炎、神经源性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、内脏痛、三叉神经痛、疱疹后神经痛、幻肢疼痛、纤维肌痛、月经痛、卵巢痛、反射交感性营养不良、骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛、下背痛、糖尿病性神经病、坐骨神经痛、消化不良、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩氏病、回肠炎、溃疡性结肠炎、肾绞痛、痛经、膀胱炎、间质性膀胱炎、月经期、分娩、绝经、胰腺炎、精神分裂症、抑郁症、创伤后应激障碍、焦虑症、糖尿病、自身免疫性糖尿病、内皮功能障碍、局部缺血、雷诺氏综合征、冠心病(“CHD”)、冠状动脉疾病(“CAD”)、心力衰竭、外周动脉疾病(“PAD”)、肺动脉高压(“PH”)、结缔组织病、中风、舍格伦氏综合征、多发性硬化症、支气管高反应性、哮喘、支气管炎、支气管扩张、肺气肿、慢性阻塞性肺病(“COPD”)、炎性皮炎、腺组织中的腺癌、器官胚胎组织中的胚细胞瘤、上皮组织中的癌、形成血细胞的组织中的白血病、淋巴组织中的淋巴瘤、骨髓中的骨髓瘤、结缔组织或支持组织中的肉瘤、肾上腺癌、AIDS相关淋巴瘤、贫血、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、化学疗法、结肠癌、血细胞减少、子宫内膜癌、食管癌、胃癌(gastric cancer)、头癌、颈癌、肝胆癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、神经系统肿瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、骨髓癌、多发性骨髓瘤、转移到骨的肿瘤、浸润神经和空腔脏器的肿瘤、神经结构附近的肿瘤。更优选地，癌症疼痛包括内脏痛，优选由胰腺癌和/或腹部转移引起的内脏痛。更优选地，癌症疼痛包括体躯体痛，优选由于以下的一种或多种引起的躯体痛：骨中的转移、术后疼痛、结缔组织肉瘤癌、骨组织癌、骨髓造血细胞癌、多发性骨髓瘤、白血病、原发性或继发性骨癌、寻常痤疮、特应性皮炎、荨麻疹、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和红斑痤疮、变应性皮炎、银屑病、瘙痒、神经源性皮肤发红、红斑、体重减轻、厌食症、结节病、休克、败血症、阿片戒断综合征、吗啡耐受、癫痫、下尿路(“LUT”)病症(诸如尿路感染、异常排尿、尿急、夜尿、尿失禁、膀胱过度活动症及用于防止或缓解与此类LUT病状相关联的疼痛)。优选地，本文所述的本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段可用于缓解或减少偏头痛、头痛和疼痛相关联的疾病或病状的症状，治疗或预防偏头痛、头痛和疼痛相关联的疾病或病状。
[0433] 具体地，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段还可以用于缓解或减轻与头痛和/或偏头痛一起出现的以及独立于头痛和/或偏头痛出现的畏光的症状，治疗或预防与头痛和/或偏头痛一起出现的以及独立于头痛和/或偏头痛出现的畏光。
[0434] 偏头痛通常会在暴露于光时发生恶化的疼痛和偏头痛症状，这种现象称为畏光。畏光在眼部病症(诸如虹膜炎和葡萄膜炎)和颅内病症 (诸如脑膜炎)中也很常见。在经典的视觉途径中，光激活视网膜中的视杆和视锥，所述视杆和视锥激活视网膜神经节细胞，所述视网膜神经节细胞通过视神经投影到外侧膝状体核，上丘，并且然后到视皮质。这种途径包括图像形成和非图像形成数据。新的途径(非图像形成信息)允许通过视交叉上核维持正常的昼夜节律，并且通过本身感光的视网膜神经节细胞(ipRGC)进行调节。这些ipRGC独立于视杆和视锥，并且含有视黑素(一种色素)。
[0435] Noseda,R.等，Nat.Neurosci.,13:239–245(2010)研究了患有偏头痛的盲人个体，并将这些发现与涉及追踪ipRGC到硬膜中感觉疼痛的区域的投影的大鼠模型相关联。在偏头痛的盲人患者中，6例由于严重的视神经损坏或双侧眼球摘出而无光感。这些受试者经历异常的睡眠模式和不良的瞳孔光应答。他们的偏头痛在光暴露的情况下并没有恶化。相比之下，尽管对图像的感知最小却能够检测到光的14名盲人受试者具有正常的睡眠模式和正常的瞳孔光反射。尽管广泛的视杆和视锥退化，这些患者在偏头痛发作期间在光暴露的情况下偏头痛症状恶化，表明在畏光中重要的是ipRGC而不是视杆和视锥。
[0436] 非图像形成脑部区域的这些视网膜投影投影到后丘脑的对侧背侧区域，如大鼠中的顺行追踪所证明的。这个区域的ipRGC输入调节也投影到这个区域的硬脑膜敏感的疼痛神经元。对硬脑膜疼痛和光输入双重敏感的丘脑神经元广泛投影到多个皮质区域，包括初级体感皮质、初级和次级运动皮质、顶叶联合皮质以及初级和次级视觉皮质。这些皮质投影可帮助解释除畏光之外的其它常见的偏头痛症状，诸如运动无力或不协调、视觉障碍和注意力低下。
[0437] 畏光还伴随其它较不频繁但同样致残的病状，诸如丛集性头痛和其它三叉神经自主性头痛和眼睑痉挛。畏光潜在的机制涉及三叉神经系统。盲人患者的畏光表明了非视觉途径的贡献。另外，三叉神经自主性头痛，一组较不常见的原发性头痛病症，特征在于常常与同侧畏光相关联的单侧三叉神经介导的疼痛。
[0438] 畏光的常见原因包括偏头痛、白内障或严重的眼科疾病，诸如葡萄膜炎或角膜磨损。与畏光相关联的更广泛的病症列表包括眼睛相关的原因，诸如全色盲，无虹膜，可通过使虹膜括约肌瘫痪引起畏光的抗胆碱能药物，无晶状体(眼睛的晶状体不存在)，牛眼(角膜和虹膜之间异常狭窄的角)，白内障，视锥细胞营养不良，眼睛先天性异常，病毒性结膜炎(“红眼病”)，角膜磨损，角膜营养不良，角膜溃疡，角膜上皮破裂、诸如由角膜异物或角膜炎引起的角膜上皮破裂，晶状体异位，眼内炎，由疾病、损伤或感染引起的眼创伤诸如睑板腺囊肿，巩膜外层炎，青光眼，圆锥角膜，或视神经发育不全，水眼，或先天性青光眼性虹膜炎，视神经炎，色素播散综合征，瞳孔扩大(天然或化学诱导)，视网膜脱落，角膜瘢痕形成或巩膜瘢痕形成和葡萄膜炎。
[0439] 另外，畏光具有神经系统相关或神经学原因，包括：自闭症谱系障碍、奇阿畸形、诵读困难、脑炎包括肌痛性脑脊髓炎(也称为“慢性疲乏综合征”)、脑膜炎、蛛网膜下腔出血、颅后窝肿瘤，以及其它原因诸如强直性脊柱炎、白化病、核黄素缺乏症、苯二氮 类药物(长期使用或戒断苯二氮 类药物)、化学疗法、基孔肯雅病、胱氨酸病、埃勒斯-当洛斯综合征、宿醉、流感、感染性单核细胞增多症、镁缺乏症、汞中毒、偏头痛、狂犬病和酪氨酸血症II型(也称为“里奇纳- 汉哈特综合征”)。
[0440] 另外，已知畏光在抑郁症、躁郁症和广场恐怖症中升高。
[0441] 本文所述的本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段可以有效用于在这些病状中的任一个中治疗或预防畏光，优选地，在具有创伤后应激障碍(“PTSD”)的受试者中或在具有创伤性脑损伤的受试者中治疗或预防畏光。
[0442] 头痛可按原因进行分类，如下面所讨论。
[0443] 原发性头痛。原发性头痛由头部疼痛敏感结构的问题或过度活动引起。原发性头痛通常不被认为是潜在疾病的症状。相反，在脑部、头骨外部的头部神经或血管、或头部和颈部的肌肉或这些因素的某些组合中的化学活动可在原发性头痛中起作用。一些人可能携带使他们更有可能发展此类头痛的基因。示例性的常见的原发性头痛包括但不限于丛集性头痛；紧张性头痛(或紧张型头痛)；和三叉神经性自主性头痛(“TAC”)，包括阵发性半侧颅痛。存在可被认为是原发性头痛类型的其它头痛模式，例如慢性每日头痛、咳嗽头痛、运动头痛和性爱头痛。这些头痛不常见并且具有独特的特征，诸如不寻常的持续时间或与某种活动相关联的疼痛。虽然这些头痛通常被认为是原发性的，但它们中的每一种都可能是潜在疾病的症状。另外，一些原发性头痛可以由生活方式因素触发，所述生活方式因素包括：酒精；某些食物 (例如含有硝酸盐的加工肉类)；睡眠变化或睡眠不足；姿势不良；不吃饭和压力。
[0444] 继发性头痛。继发性头痛是可以激活头部的疼痛敏感神经的疾病的症状。严重程度可以有很大差异的任何数量的病状，可导致继发性头痛。继发性头痛的示例性来源包括但不限于急性鼻窦炎；动脉撕裂 (颈动脉或椎骨解剖)；脑部中的静脉血栓形成；脑动脉瘤；脑动静脉畸形；一氧化碳中毒；奇阿畸形；脑震荡；脱水；牙科问题；耳部感染(中耳)；脑炎；
巨细胞性动脉炎；青光眼；宿醉；流行性感冒(流感)；颅内血肿；治疗其它病症的药物；脑膜炎；谷氨酸钠(“MSG”)；止痛药物过度使用；惊恐发作；脑震荡后综合征；来自紧身头帽(例如头盔或护目镜)的压力；假性脑瘤；弓形虫病；和三叉神经痛。继发性头痛的具体类型包括但不限于外部压迫性头痛(由引起压力的头帽引起)；冰淇淋头痛(常称为“脑冻结”)；反弹头痛(由止痛药物过度使用引起)；窦性头痛(由窦腔炎症和充血引起)；脊髓性头痛(由低水平脑脊液引起，所述低水平脑脊液可能由创伤、脊椎穿刺或脊髓麻醉引起)；和霹雳头痛(一组涉及突发的严重头痛的病症)。
巨细胞性动脉炎；青光眼；宿醉；流行性感冒(流感)；颅内血肿；治疗其它病症的药物；脑膜炎；谷氨酸钠(“MSG”)；止痛药物过度使用；惊恐发作；脑震荡后综合征；来自紧身头帽(例如头盔或护目镜)的压力；假性脑瘤；弓形虫病；和三叉神经痛。继发性头痛的具体类型包括但不限于外部压迫性头痛(由引起压力的头帽引起)；冰淇淋头痛(常称为“脑冻结”)；反弹头痛(由止痛药物过度使用引起)；窦性头痛(由窦腔炎症和充血引起)；脊髓性头痛(由低水平脑脊液引起，所述低水平脑脊液可能由创伤、脊椎穿刺或脊髓麻醉引起)；和霹雳头痛(一组涉及突发的严重头痛的病症)。
[0445] 可以通过施用本发明的抗PACAP抗体进行治疗和/或预防的示例性非限制性疼痛相关联的疾病和病症包括由与神经源性、神经性、炎性或伤害性疼痛相关联的任何病状引起的疼痛。优选地，疼痛相关联的病症将与疼痛部位的PACAP增加相关联。
[0446] 在某些实施方案中，待治疗的疼痛相关联的病症是由恶性肿瘤或选自以下中的一种或多种癌症引起的癌症疼痛：腺组织中的腺癌、器官胚胎组织中的胚细胞瘤、上皮组织中的癌、形成血细胞的组织中的白血病、淋巴组织中的淋巴瘤、骨髓中的骨髓瘤、结缔组织或支持组织中的肉瘤、肾上腺癌、AIDS相关淋巴瘤、贫血、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、化学疗法、结肠癌、血细胞减少、子宫内膜癌、食管癌、胃癌(gastric cancer)、头癌、颈癌、肝胆癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、神经系统肿瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、骨髓癌、多发性骨髓瘤、转移到骨的肿瘤、浸润神经和空腔脏器的肿瘤、神经结构附近的肿瘤。更优选地，癌症疼痛包括内脏痛，优选由胰腺癌和/ 或腹部转移引起的内脏痛。更优选地，癌症疼痛包括躯体痛，优选由于以下的一种或多种引起的躯体痛：骨中的转移、术后疼痛、结缔组织肉瘤癌、骨组织癌、骨髓造血细胞癌、多发性骨髓瘤、白血病、原发性或继发性骨癌。
[0447] 在其它实施方案中，待治疗的疼痛相关联的病状与神经性疼痛相关联并且包括，例如三叉神经痛、疱疹后神经痛、幻肢疼痛、纤维肌痛和反射交感性营养不良。
[0448] 另外的示例性疼痛相关联的疾病或病状包括但不限于一般疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛、手术后切口疼痛、手术后疼痛、创伤相关疼痛、下背痛、眼痛、牙痛、复杂性区域疼痛综合征、癌症疼痛(例如原发性或转移性骨癌疼痛)、骨折疼痛、骨质疏松性骨折疼痛、烧伤引起的疼痛、痛风关节疼痛、与镰状细胞危象相关联的疼痛、与颞下颌关节紊乱相关联的疼痛、肝硬化、肝炎、神经源性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、内脏痛、三叉神经痛、疱疹后神经痛、幻肢疼痛、纤维肌痛、月经痛、卵巢痛、反射交感性营养不良、骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛、下背痛、糖尿病性神经病、坐骨神经痛、消化不良、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩氏病、回肠炎、溃疡性结肠炎、肾绞痛、痛经、膀胱炎、间质性膀胱炎、月经期、分娩、绝经、胰腺炎、精神分裂症、抑郁症、创伤后应激障碍、焦虑症、糖尿病、自身免疫性糖尿病、内皮功能障碍、局部缺血、雷诺氏综合征、冠心病(“CHD”)、冠状动脉疾病(“CAD”)、心力衰竭、外周动脉疾病(“PAD”)、肺动脉高压(“PH”)、结缔组织病、中风、舍格伦氏综合征、多发性硬化症、膀胱过度活动症、支气管高反应性、哮喘、支气管炎、支气管扩张、肺气肿、慢性阻塞性肺病(“COPD”)、炎性皮炎、寻常痤疮、特应性皮炎、荨麻疹、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和红斑痤疮、变应性皮炎、银屑病、瘙痒、神经源性皮肤发红、红斑、结节病、休克、败血症和阿片戒断综合征。
[0449] 因此，本发明包括通过使用本发明的抗体及抗原结合片段来治疗、预防和/或缓解与PACAP活性或PACAP上调相关联的任何疾病或病症(包括任何上述的示例性疼痛相关联的疾病、病症和病状)的方法。
[0450] 此外，本发明的PACAP抗体及抗原结合片段可单独使用或与其它活性剂(例如阿片类和非阿片类止痛剂，诸如NSAID)联合使用以引发止痛或增强另一种止痛剂的功效。
[0451] 本发明的抗体潜在地可与任何阿片类止痛剂或NSAID或其它止痛剂组合，潜在地与另一种抗体或另一种生物制剂(例如抗NGF或抗 CGRP或抗CGRP-R抗体或抗体片段，或者NGF、CGRP或CGRP-R 多肽片段或缀合物)组合，以便增加或增强疼痛管理。这可以允许此类止痛化合物以更长的持续时间或减少的剂量进行施用，从而潜在地缓解与其相关联的不良副作用。
[0452] 特别感兴趣的是本发明的抗PACAP抗体及抗体片段与抗CGRP 抗体(例如ALD403)或者抗CGRP-R抗体或抗体片段的共同施用，并且此外，本发明的PACAP抗体及抗体片段治疗预先接受抗CGRP或抗CGRP-R抗体或抗体片段的受试者的用途。例如，预先治疗的受试者(预先接受至少一种抗CGRP或抗CGRP-R抗体或抗体片段施用) 可为偏头痛患者，其对抗CGRP或抗CGRP-R抗体治疗不充分应答 (“不良应答者”)和/或引发对抗CGRP或抗CGRP-R抗体或抗体片段的免疫应答。
[0453] 同样地，本发明的抗PACAP抗体及抗原结合片段与 (肉毒杆菌毒素)的共同施用例如在治疗偏头痛患者中也是特别感兴趣的。在一些情况下，偏头痛患者可能对预先治疗不充分应答(“不良应答者”)和/或已经引发对预先治疗的免疫应答。
[0454] 在一些实施方案中，阿司匹林和/或对乙酰氨基酚可与本发明的抗PACAP抗体或抗原结合片段联合使用。阿司匹林是另一种类型的非类固醇抗炎化合物。
[0455] 施用药物制剂的受试者可为例如需要此类治疗、预防和/或缓解的任何人或非人类动物，或者将以其它方式受益于PACAP介导的活性的抑制或衰减的任何人或非人类动物。例如，所述受试者可为被诊断患有任何上述疾病或病症或者被认为具有被任何上述疾病或病症折磨的风险的个体。本发明还包括本文公开的任何药物制剂在制备用于治疗、预防和/或缓解与PACAP活性相关联的任何疾病或病症(包括任何上述示例性疾病、病症和病状)的药物中的用途。
[0456] 施用
[0457] 在本发明的一个实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体或其 PACAP结合片段以及所述抗体或其抗原结合片段的组合以0.1mg/ml 与约0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190或
200mg/ml中的任一项之间的浓度(+/-10％误差)向受试者施用。
200mg/ml中的任一项之间的浓度(+/-10％误差)向受试者施用。
[0458] 在本发明的另一个实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体及其片段以约0.01与100.0或200.0mg/kg受体受试者体重之间的剂量向受试者施用。在某些实施方案中，取决于PACAP相关疾病的类型和严重性，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的抗体是用于向患者施用的初始候选剂量，无论例如通过一或多次分开施用或通过连续输注。在另一个实施方案中，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1 mg/kg-10mg/kg)抗体是用于向患者施用的初始候选剂量。典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内，取决于若干因素，例如正在治疗的具体哺乳动物、各个患者的临床病状、病症的原因、药剂递送部位、施用方法、施用时程和执业医师已知的其它因素。然而，其它剂量方案可能适用。
[0459] 例如，除本文讨论的相对剂量(mg/kg)之外，可以以绝对剂量(mg) 向受试者施用本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段。因此,在本发明的一个实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体及其抗原结合片段以约1微克与约1000毫克之间的剂量向受试者施用，无论施用途径如何。
[0460] 在本发明的一个优选的实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体或其抗PACAP抗原结合片段以及所述抗体或其抗原结合片段的组合以每26周或小于每26周一次(诸如每16周或小于每16周一次、每8 周或小于每8周一次、每4周或小于每4周一次、每2周或小于每2 周一次、每周或小于每周一次、或每日或小于每日一次)的频率向受体受试者施用。
[0461] 根据优选的实施方案，含有抗体的药物或药物组合物通过选自以下的一种或多种途径向受试者外周施用：口服、舌下、经颊、局部、经直肠、通过吸入、经皮肤、皮下、静脉内、动脉内或肌内、通过心内施用、骨内、皮内、腹膜内、经粘膜、经阴道、玻璃体内、表皮、关节内、关节周围或局部。
[0462] Fab片段可每2周或小于每2周、每周或小于每周、每日一次或小于每日一次、每日多次和/或每数小时一次进行施用。在本发明的一个实施方案中，患者每日接受以以有效获得所需结果的1天1至6 次的分次剂量形式或连续灌注形式给与的0.1mg/kg至40mg/kg的 Fab片段。
[0464] 本领域技术人员将能够通过常规实验来确定施用的有效剂量和频率，例如由本文的公开内容和以下的教导所指导的常规实验： Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics， Brunton,L.L.等编，第11版，New York,New York:McGraw-Hill (2006)；Howland,R.D.等，Pharmacology，第864卷，Lippincott's illustrated reviews.,Philadelphia，PA:Lippincott Williams&Wilkins (2006)；以及Golan,D.E.,Principles of pharmacology:the pathophysiologic basis of drug therapy,Philadelphia,PA:Lippincott Williams&Wilkins(2007)。
[0465] 在本发明的另一个实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体或其 PACAP抗原结合片段以及所述抗体或其抗原结合片段的组合以药物制剂的形式向受试者施用。在一个优选的实施方案中，受试者为人。
[0466] “药物组合物”或“药物”是指适用于向受试者、优选哺乳动物、更优选人施用的化学或生物组合物。此类组合物可经特定配制以用于通过许多途径中的一个或多个进行施用，所述途径包括但不限于经颊、上皮、硬膜外、吸入、动脉内、心内、脑室内、皮内、肌内、鼻内、眼内、腹膜内、脊柱内、鞘内、静脉内、口服、胃肠外、通过灌肠剂或栓剂的经直肠、皮肤下、真皮下、舌下、经皮肤和经粘膜。另外，施用可借助注射剂、粉剂、液体、凝胶剂、滴剂或其它施用手段来进行。
[0467] 在本发明的一个实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体或其 PACAP结合片段以及所述抗体或其抗原结合片段的组合可任选地与一种或多种活性剂组合施用。所述活性剂包括止痛剂、抗组胺剂、退热剂、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂和抗细胞因子剂。活性剂包括TNF-α、 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、 CXCL13、IP-10、VEGF、EPO、EGF、HRG、肝细胞生长因子(“HGF”)、铁调素(Hepcidin)、NGF、CGRP的激动剂、拮抗剂和调节剂，包括针对任何前述者具有反应性的抗体和针对任何它们的受体具有反应性的抗体。活性剂也包括但不限于2-芳基丙酸、乙酰氯芬酸、阿西美辛、乙酰水杨酸(阿司匹林)、阿氯芬酸、阿明洛芬、阿洛泼林 (amoxiprin)、氨基安替比林、芳基烷酸、阿扎丙酮、贝诺酯 (benorylate/benorilate)、苯恶洛芬、溴芬酸、卡洛芬、塞来昔布、胆碱水杨酸镁、氯非宗、COX-2抑制剂、右布洛芬、右酮洛芬、双氯芬酸、二氟尼柳、哚昔康(droxicam)、乙柳酰胺、依托度酸、依托昔布、菲斯胺(faislamine)、芬那酸、芬布芬、非诺洛芬、氟芬那酸、氟诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、异丁普生、吲哚美辛、吲哚洛芬、酮保泰松、酮洛芬、酮咯酸、氯诺昔康、氯索洛芬、罗美昔布、水杨酸镁、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、安乃近、水杨酸甲酯、莫非保松、萘普酮、萘普生、N-芳基邻胺苯甲酸、NGF、奥沙美辛、奥沙普秦、昔康类、羟保泰松、催产素、帕瑞昔布、非那宗、苯基丁氮酮、苯基丁氮酮、毗罗昔康、吡洛芬、洛芬类、丙谷美辛、吡唑啶衍生物、罗非昔布、水杨酸水杨酯、水杨酰胺、水杨酸酯、P物质、磺吡酮、舒林酸、舒洛芬、替诺昔康、噻洛芬酸、托芬那酸、托美丁和伐地昔布。例如，所选定的抗PACAP抗体或其PACAP结合片段以及这些抗体或抗原结合片段的组合可以任选地与催产素组合施用，例如以用于鼻内递送的鼻制剂来施用。
[0468] 抗组胺剂可以为对抗组胺的作用或对抗它从细胞(例如肥大细胞) 中的释放的任何化合物。抗组胺剂包括但不限于阿伐斯汀、阿司咪唑、阿扎他定、氮卓斯汀、贝他斯汀(betatastine)、溴苯那敏、布克力嗪、西替利嗪、西替利嗪类似物、氯苯那敏、氯马斯汀、CS 560、赛庚啶、地氯雷他定、右氯苯那敏、依巴斯汀、依匹斯汀、非索非那定、HSR 609、羟嗪、左卡巴斯汀、氯雷他定、甲基东莨菪碱、咪唑斯汀、诺阿司咪唑、苯茚胺、异丙嗪、吡拉明、特非那定和曲尼司特。
[0469] 抗生素包括但不限于阿米卡星、氨基糖苷类、阿莫西林、氨苄青霉素、安沙霉素类、胂凡纳明、阿奇霉素、阿洛西林、胺曲南、杆菌肽、碳头孢烯、碳青霉烯类、羧苄青霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻吩、先锋霉素、头孢羟唑、头孢唑啉、头孢地尼、头孢托仑、头孢吡肟、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢泊肟、头孢罗齐、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢吡普、头孢曲松、头孢呋辛、头孢菌素、氯霉素、西司他丁、环丙沙星、克拉霉素、克林达霉素、氯唑西林、粘菌素、复方磺胺甲恶唑、达福普丁、地美环素、双氯青霉素、地红霉素、多利培南、多西环素、依诺沙星、厄他培南、红霉素、乙胺丁醇、氟氯西林、磷霉素、呋喃唑酮、梭链孢酸、加替沙星、格尔德霉素、庆大霉素、糖肽类、除莠霉素、亚胺培南、异烟肼、卡那霉素、左氧氟沙星、洁霉素、利奈唑胺、洛美沙星、氯拉卡比、大环内酯、磺胺米隆、美罗培南、甲氧西林、甲硝哒唑、美洛西林、米诺环素、单内酰环类、莫西沙星、莫匹罗星、萘夫西林、新霉素、奈替米星、硝呋妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、氧四环素、巴龙霉素、青霉素、青霉素类、哌拉西林、平板霉素、多粘菌素B、多肽、百浪多息、吡嗪酰胺、喹诺酮、奎奴普丁、利福平(rifampicin)、利福平(rifampin)、罗红霉素、奇霉素、链霉素、乙酰磺胺、磺胺甲噻二唑、磺胺、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、磺酰胺类、替考拉宁、泰利霉素、四环素、四环素类、提卡西林、磺甲硝咪唑、妥布霉素、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、醋竹桃霉素、曲伐沙星和万古霉素。
[0470] 活性剂也包括醛固酮、倍氯米松、倍他米松、皮质类固醇、皮质醇、醋酸可的松、醋酸脱氧皮质酮、地塞米松、醋酸氟氢可的松、糖皮质激素、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、类固醇类和曲安奈德。也预期这些活性剂的任何合适的组合。
[0471] “药物赋形剂”或“药学上可接受的赋形剂”是于其中配制活性治疗剂的载体，通常是液体。在本发明的一个实施方案中，活性治疗剂是本文所述的人源化抗体或其一种或多种片段。赋形剂通常不对制剂提供任何药理学活性，但它可提供化学和/或生物稳定性和释放特性。示例性制剂可见于例如以引用的方式并入本文的Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，Philadelphia,PA:Williams and Wilkins(1995)。
[0472] 如本文所用，“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。在一个实施方案中，载体适用于胃肠外施用。可替代地，载体可以适用于静脉内、腹膜内、肌内或舌下施用。药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂都与活性化合物不相容，否则预期其在本发明的药物组合物中的用途。补充活性化合物也可以并入所述组合物中。
[0473] 药物组合物在制造和储存条件下通常必须无菌且稳定。本发明预期药物组合物以冻干形式存在。组合物可被配制为适用于高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其它有序结构。载体可以为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物。本发明还预期在药物组合物中包括稳定剂。适当的流动性可以例如通过在分散体的情况下维持需要的粒度和通过使用表面活化剂来维持。
[0474] 在很多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(诸如甘露醇和山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的吸收可以通过包括延迟吸收的药剂(例如单硬酯酸盐和明胶)来延长。此外，碱性多肽可以以延时释放制剂形式，例如以包括缓慢释放聚合物的组合物形式进行配制。活性化合物可以用将防止化合物快速释放的载体来制备，所述载体诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酯、聚乳酸、聚乳酸和聚乙醇酸共聚物(“PLG”)。制备此类制剂的许多方法是本领域技术人员已知的。
[0475] 对于各所述实施方案，化合物可以通过多种剂型进行施用。预期本领域普通技术人员已知的任何生物学上可接受的剂型及其组合。此类剂型的实例包括但不限于可复原粉剂、酏剂、液体、溶液、混悬剂、乳剂、粉剂、颗粒剂、粒子、微粒剂、可分散颗粒剂、扁囊剂、吸入剂、气雾剂吸入剂、贴片、粒子吸入剂、植入物、贮库植入物、可注射剂(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)、输注液及其组合。
[0476] 以上对本发明的各种所说明实施方案的描述不意图是详尽的或将本发明限于所公开的精确形式。尽管本文出于说明目的描述了本发明的特定实施方案和实例，但如熟习相关技术者所将认识到，在本发明的范围内，各种等效修改是可能的。本文提供的本发明的教导可以应用于除上述实例以外的其它目的。
[0477] 可根据以上详细描述对本发明作出这些和其它变化。通常，在以下权利要求中，所用术语不应解释为将本发明限于说明书和权利要求中所公开的特定实施方案。因此，本发明不受公开内容限制，但是本发明的范围将完全由以下权利要求确定。
[0478] 本发明可以除前述描述和实例中特别描述的方式之外的方式进行实施。根据以上教导，本发明的众多修改和变化形式是可能的，并且因此在随附权利要求的范围内。
[0479] 与用于获得抗原特异性B细胞克隆群体的方法相关的某些教导公开于美国专利公布号2013/0316353中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0480] 与兔来源的单克隆抗体的人源化和维持抗原结合亲和力的优选序列修饰相关的某些教导公开于2008年5月21日提交的标题为“Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies”的国际公布号WO 2008/144757中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0481] 与使用接合感受态酵母和对应方法产生抗体或其片段相关的某些教义公开于美国专利公布号US2006/0270045中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0482] 与在毕赤酵母中产生抗体或其片段和用于获得并纯化抗体的优选方法相关的某些教导也公开于美国专利公布号2014/0288272； 2014/0287952；2013/0055888；和2012/0277408中，其各自的公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0483] 与在CHO细胞中产生抗体或其片段和用于获得并纯化抗体的示例性方法相关的某些教导也公开于美国专利号和公布号7,932,087；2009/0285795；9,090,672；和2010/0221781中，其各自的公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0484] 某些抗PACAP抗体多核苷酸和多肽公开于随附于本专利申请档案的序列表中，并且所述序列表的公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0486] 提供以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和描述，并且以下实施例并非意图限制被视为本发明的事物的范围。已经努力确保关于所用数值(例如，量、温度、浓度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有指示，否则份是重量份，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度计；并且压力是大气压或接近大气压。实施例
[0487] 实施例1：选择性结合PACAP的抗体的制备
[0488] 通过使用基本上如本文所述的抗体选择方案，产生了一组对 PACAP38和PACAP27具有特异性的抗体以及仅对PACAP38具有特异性的一组抗体。
[0489] 免疫策略
[0490] 用PACAP38(American Peptide，Vista，CA)(SEQ ID NO:1241) 使兔免疫。用于免疫的肽如下进行制备。将0.15ml体积的溶解在补充至1M NaCl的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco’s phosphate buffered saline)(“DPBS”)中的10mg/ml钥孔虫戚血蓝蛋白(“KLH”)与 1.0ml的1mg/ml肽(溶解在去离子水中)合并。然后加入1.0ml的40 mM碳二亚胺，之后在室温下温和搅拌孵育12小时。通过透析到DPBS 除去过量的碳二亚胺和未缀合的肽，之后无菌过滤。接着，加入等于 KLH的初始质量的未缀合的肽，之后准备注射到兔中。可替代地，将等质量的无菌KLH和肽混合，而不进行碳二亚胺化学。
[0491] 通过用DPBS将200μg抗原稀释至0.5ml并且与等体积的完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)混合用于在第1天皮下注射1ml来执行免疫。
[0492] 在第21和42天，用不完全弗氏佐剂执行100μg的加强注射。
[0493] 抗体选择功能性效价评估
[0494] 为了鉴定中和PACAP38(SEQ ID NO:1241)诱导的通过PAC1-R 的信号传导的抗体，首先将多克隆抗体溶液通过蛋白质A进行纯化并透析到中性缓冲液中。简单来说，将抗体溶液与PACAP38(SEQ ID NO:1241)一起以4x终浓度(100pM)孵育1小时。在孵育抗体/抗原复合物的同时，将表达PAC1-R的PC-12细胞(日本研究生物资源日本保藏中心细胞库(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank))洗涤并且以2x106个细胞/ml重新悬浮在细胞培养基中。将细胞 (10μl)和抗原/抗体复合物(40μl)转移到均相时间分辨荧光(“HTRF”) 板上，并在室温下振荡30分钟。孵育后，加入在裂解缓冲液中的20 μl的(1:20稀释的)Eu3+穴状化合物(cryptate)标记的mAb抗cAMP和 20μl的(1:20稀释的)d2标记的cAMP，并将所述板在振荡的同时孵育1小时。孵育后，读取板(激发330nm，发射620/665nm)，并测定 620:665信号的比率。
[0495] 组织收获
[0496] 一旦产生可接受的效价，即将兔处死。收获脾、淋巴结和全血并且如下处理：
[0497] 通过解离组织并且用20cc注射器的柱塞将其推挤通过70μm无菌金属丝网(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)将脾和淋巴结处理成单细胞混悬液。将细胞收集在磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中。然后，通过离心将细胞洗涤两次。在末次洗涤之后，通过台盼蓝测定细胞密度。在1500RPM下将细胞离心10分钟；然后丢弃上清液。将细胞重新悬浮在适当体积的于胎牛血清(“FBS”HYCLONETM，GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)中的10％二甲基亚砜 (“DMSO”，Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)中，并且以1ml/小瓶分配。将小瓶在-70℃下在缓慢冷冻室中储存24小时并且储存在液氮中。
[0498] 通过将全血与等份的PBS混合来分离外周血单核细胞(PBMC)。将35ml全血混合物小心地分层在45ml锥形管(Corning，Corning， NY)内的8ml的兔淋巴细胞分离液(Rabbit (Cedarlane Laboratories，Burlington，Ontario))上，并且
在室温下在2500 RPM下在没有制动器的情况下离心30分钟。离心之后，使用玻璃巴斯德移液管(VWR International，Radnor，PA)小心地移出PBMC层，合并并且放置到干净的50ml小瓶中。通过在室温下在1500RPM下离心10分钟用PBS将细胞洗涤两次，并且通过台盼蓝染色测定细胞密度。在末次洗涤之后，如上所述将细胞重新悬浮在适当体积的10％ DMSO/FBS培养基中并且冷冻。
在室温下在2500 RPM下在没有制动器的情况下离心30分钟。离心之后，使用玻璃巴斯德移液管(VWR International，Radnor，PA)小心地移出PBMC层，合并并且放置到干净的50ml小瓶中。通过在室温下在1500RPM下离心10分钟用PBS将细胞洗涤两次，并且通过台盼蓝染色测定细胞密度。在末次洗涤之后，如上所述将细胞重新悬浮在适当体积的10％ DMSO/FBS培养基中并且冷冻。
[0499] B细胞选择、富集和培养条件
[0500] 在建立B细胞培养当天，将PBMC、脾细胞或淋巴结小瓶解冻以供使用。将小瓶自液氮罐移出并且放置在37℃水浴中直至解冻。将小瓶的内容物转移到15ml锥形离心管(Corning，Inc.，Corning， NY)中，并且将10ml的改良RPMI缓慢加入到所述管中。在2000RPM 下将细胞离心5分钟，并且丢弃上清液。将细胞重新悬浮在10ml的新鲜培养基中。通过台盼蓝测定细胞密度和活力。
[0501] 为了阳性选择产生抗PACAP38的B细胞，如下将生物素化的 PACAP38(SEQ ID NO:1241)预先装载到链霉亲和素珠上，如下。将 75μl的链霉亲和素珠(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)与N末端生物素化的PACAP38(终浓度10μg/ml)和补充有不含牛血清白蛋白(“BSA”) 的0.5％生物素和2mM EDTA(“PBF”)的300μl的PBS混合。将此混合物在4℃下孵育
30分钟，并且使用 分离柱(Miltenyi Biotec， Auburn，CA)除去未结合的生物素
化的PACAP38(AnaSpec，Fremont，CA)，并且以1ml冲洗来除去未结合材料。结合的材料通过与磁体脱离而被突出，并且用于以每1X107个细胞100μl从上面重新悬浮细胞。然后将混合物在4℃下孵育30分钟，并用10ml的PBF洗涤一次。在洗涤之后，将细胞重新悬浮在500μl的PBF中，并且搁置。将 MS柱(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)在磁性台架(Miltenyi
Biotec，Auburn，CA)上用500μl的PBF预先冲洗。将细胞混悬液通过预过滤器施加到柱上，并且收集未结合级分。用2.5ml的PBF缓冲液洗涤所述柱。将所述柱从磁性台架上除去并且放置在干净无菌的 1.5ml EPPENDORFTM管上。将1ml的PBF缓冲液加入到所述柱的顶部，并且收集阳性选择细胞。通过台盼蓝染色测定阳性细胞级分的产率和活力。阳性选择产生平均1％的起始细胞浓度。
30分钟，并且使用 分离柱(Miltenyi Biotec， Auburn，CA)除去未结合的生物素
化的PACAP38(AnaSpec，Fremont，CA)，并且以1ml冲洗来除去未结合材料。结合的材料通过与磁体脱离而被突出，并且用于以每1X107个细胞100μl从上面重新悬浮细胞。然后将混合物在4℃下孵育30分钟，并用10ml的PBF洗涤一次。在洗涤之后，将细胞重新悬浮在500μl的PBF中，并且搁置。将 MS柱(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)在磁性台架(Miltenyi
Biotec，Auburn，CA)上用500μl的PBF预先冲洗。将细胞混悬液通过预过滤器施加到柱上，并且收集未结合级分。用2.5ml的PBF缓冲液洗涤所述柱。将所述柱从磁性台架上除去并且放置在干净无菌的 1.5ml EPPENDORFTM管上。将1ml的PBF缓冲液加入到所述柱的顶部，并且收集阳性选择细胞。通过台盼蓝染色测定阳性细胞级分的产率和活力。阳性选择产生平均1％的起始细胞浓度。
[0502] 建立试验性细胞筛选(pilot cell screen)以提供关于培养物的接种水平的信息。以每孔5、10、25、50、100或200个富集B细胞接种各板。另外，各孔含有25-50K个细胞/孔的经辐射的EL-4.B5细胞 (5,000雷得(Rad))和以最终体积250μl/孔在高葡萄糖改良RPMI培养基中的适当水平的激活兔T细胞上清液(参见美国专利申请公布号 20070269868)(在
1-5％的范围内，取决于制品)。将培养物在37℃下在 4％CO2中孵育5至7天。
1-5％的范围内，取决于制品)。将培养物在37℃下在 4％CO2中孵育5至7天。
[0503] 通过抗原识别(ELISA)进行的B细胞培养物筛选
[0504] 为了鉴定产生抗PACAP38抗体的孔，将B细胞上清液通过抗原识别(ELISA)进行测试。简单来说，用在ELISA缓冲液(在PBS中的 0.5％鱼皮明胶，pH 7.4)中稀释的N末端或C末端生物素化的 PACAP38(AnaSpec Inc.，Fremont，CA)(50μl/孔；1μg/ml)包衣 NEUTRAVIDINTM包衣的板(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)，在室温下持续约1小时或可替代地在4℃下过夜。然后将所述板进一步在室温下用ELISA缓冲液阻断1小时并且使用PBS与0.05％吐温20(洗涤缓冲液)洗涤。将B细胞上清液样品(50μl)转移到孔上并在室温下温育1小时。在此孵育之后，用洗涤缓冲液洗涤所述板。对于显色，将抗兔特异性的Fc-辣根过氧化物酶(“Fc-HRP”)(以1:5000稀释在ELISA缓冲液中)加入到孔上并且在室温下孵育
45分钟。在用洗涤溶液进行3次洗涤步骤之后，使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(“TMB”)底物在室温下使所述板显色2分钟，并且使用0.5M HCl猝灭反应。在 450nm下读取孔吸光度。
45分钟。在用洗涤溶液进行3次洗涤步骤之后，使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(“TMB”)底物在室温下使所述板显色2分钟，并且使用0.5M HCl猝灭反应。在 450nm下读取孔吸光度。
[0505] 为了鉴定产生不识别VIP(SEQ ID NO:1243)的抗PACAP38抗体的孔，通过ELISA测试通过ELISA对PACAP38结合呈阳性的孔的上清液对VIP的结合。简单来说，将生物素化的VIP(AnaSpec Inc.， Fremont，CA)结合到NEUTRAVIDINTM包衣的板上(50μg/孔，每种肽 1μg/μl)。在不进行预先稀释的情况下测试B细胞上清液样品(50μl)。在此测定中的识别可指示与紧密相关的肽VIP的交叉反应性。
[0506] 使用一种或多种测定进行的B细胞上清液中功能活性的鉴定
[0507] 为了鉴定产生阻断通过PAC1-R的PACAP38的信号传导的抗PACAP38抗体的孔，在cAMP HTRF测定(Cisbio US，Bedford，MA) 中测试了通过ELISA对PACAP38结合呈阳性的孔的上清液。将上清液(78μl)与2μl 5nM PACAP38(American Peptide Company， Sunnyvale，CA)在37℃下预先孵育1小时。在孵育期间，如对于效价评估所述的制备PC-12细胞。将细胞(10μl)和抗原/抗体复合物(40 μl)转移到HTRF板，并在室温下振荡30分钟。孵育后，加入在裂解缓冲液中的20μl的(1:20稀释的)Eu3+穴状化合物标记的mAb抗 cAMP和20μl的(1:20稀释的)d2标记的cAMP，并将所述板在振荡的同时孵育1小时。孵育后，读取板(激发330nm，发射620/665nm)，并测定620:665信号的比率。
[0508] 抗原特异性B细胞的分离
[0509] 分离抗原特异性B细胞(一般方法参见共有的公布号WO 2014/146074，其以引用的方式整体并入本文)。将含有目标孔的板从 -70℃中移出，并且使用每孔200μl的培养基(10％RPMI完全培养基， 55μMβ巯基乙醇(“BME”))洗涤五次从每个孔中回收细胞。通过离心沉淀回收的细胞，并且小心地除去上清液。然后将来自每个孔的细胞重新悬浮在100μl的培养基中并且转移到96孔板。将细胞在37℃下孵育90分钟。孵育后，将细胞通过离心沉淀，用异硫氰酸荧光素标记(“FITC标记的”)抗兔IgG(终浓度6.25μg/ml)(Creative Diagnostics， Shirley，NY)染色，并且用高达2ml荧光激活细胞分选缓冲液(“FACS 缓冲液”)(杜尔贝科氏PBS w/2％FBS)洗涤并重新悬浮在250μl的 FACS缓冲液中。
[0510] 与汇集的目标孔的组成相似的来自相同培养物组的对照孔与靶孔一起解冻并染色。这些样品最初在FACS(BD INFLUXTM，Becton， Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ)上运行，并且对于IgG、活力和物理参数(前向散射(“FSC”)/侧向散射(“SSC”))建立区分B细胞与鼠EL4细胞的门。一旦建立了门，就运行目标样品，并将具有一致物理(FSC/SSC)群体的IgG阳性的活细胞单独分选到预先装载了 RT-PCR预混合液的96孔板的孔中。每孔分选多于8个细胞。将分选的板从分选器中移出并直接转移到热循环仪进行PCR。
[0511] 来自FACS分选的B细胞的抗体序列的扩增和序列测定
[0512] 使用基于组合的RT-PCR的方法从单细胞分选的B细胞中回收抗体序列。设计含有限制性酶的引物以在靶免疫球蛋白基因(重链和轻链)(诸如兔免疫球蛋白序列)(重链和轻链)的保守区和恒定区中退火，并且使用两步巢式PCR回收来扩增抗体序列。对每个孔的扩增子进行测序和分析。选择来自所得序列簇的代表性抗体用于重组蛋白表达。通过限制性酶消化和连接并且通过吉布森法(Gibson method)将从兔细胞中扩增的原始重链和轻链可变区克隆到人重链和轻链恒定区表达载体中。扩增含有亚克隆DNA片段的载体并纯化。在表达之前验证亚克隆的重链和轻链的序列。
[0513] 具有所需抗原特异性和/或功能性质的单克隆抗体的重组产生
[0514] 为了确定从特异性B细胞中回收的抗体的抗原特异性和功能性质，将重链和轻链质粒进行共转染以生成用于测试的兔/人嵌合抗体。简单来说，将重链和轻链嵌合质粒瞬时转染到HEK-293细胞内。允许将转染物孵育5-7天，并且在收获后，就通过离心沉淀细胞。提供上清液以通过蛋白质A进行纯化。然后在多种测定中评价所得的纯化的嵌合抗体以确认特异性和效力。
[0515] 使用上述方法，鉴定了结合PACAP38和PACAP27或仅结合 PACAP38但不结合或不明显结合至VIP的许多功能性(拮抗性)抗体。示例性拮抗性抗PACAP抗体的多肽和示例性编码序列包含在所包括的生物学序列表中。
[0516] 在这些实施例中使用的全长抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和 Ab23被表达为分别具有SEQ ID NO:401；441；881；和921的序列的重链多肽以及分别具有SEQ ID NO:421；461；861；901；和941 的轻链多肽。抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23的重链多肽分别从SEQ ID NO:411；451；851；891；和931的多核苷酸来表达。抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23的轻链多肽分别从SEQ ID NO: 431；471；871；911；和951的多核苷酸来表达。所述抗体的另外的特征由图1-12中的SEQ ID NO鉴定。
[0517] 通过竞争性HTRF结合测定的抗体的抗原结合特异性
[0518] 下面进一步描述根据本发明产生的示例性抗PACAP38和抗 PACAP27抗体的结合和功能性质。
[0519] 为了鉴定优先结合PACAP38(SEQ ID NO:1241)和PACAP27 (SEQ ID NO:1242)但不结合VIP(SEQ ID NO:1243)的抗体，或者为了鉴定特异性结合PACAP38但不明显结合地PACAP27或不明显地结合VIP等的抗体，进行竞争性HTRF结合测定。
[0520] 平行地，将10μl抗体稀释系列(最高终浓度100nM)与10μl的单独的或者与PACAP27(终浓度350nM)或VIP(终浓度350nM)(即分别10x PACAP27或10x VIP)组合的N末端或C末端3+
生物素化的 PACAP38(终浓度35nM)在HTRF板中一起孵育。将20μl的Eu 穴状化合物标记的抗hu Fc供体和20μl的d2标记的链霉亲和素受体加入到每个孔，并在室温下孵育1小时。在
620和665nm处以300μ秒的延迟测量荧光。
生物素化的 PACAP38(终浓度35nM)在HTRF板中一起孵育。将20μl的Eu 穴状化合物标记的抗hu Fc供体和20μl的d2标记的链霉亲和素受体加入到每个孔，并在室温下孵育1小时。在
620和665nm处以300μ秒的延迟测量荧光。
[0521] 图13A-D提供Ab10、Ab20、Ab21和Ab1.H对PACAP38和 PACAP27的代表性结合数据，以及VIP无法与PACAP38的结合竞争的能力。图13E和图13F提供了抗PACAP抗体Ab22和Ab23对 PACAP38的代表性结合数据，以及PACAP27或VIP无法与PACAP38 的结合竞争的能力。VIP对结合至PACAP38缺乏影响，指示VIP无法与PACAP38的结合竞争。这些结果证明Ab10、Ab20、Ab21和 Ab1.H结合至PACAP38和PACAP27，但不结合(或不明显结合)VIP。这些结果也证明Ab22和Ab23结合PACAP38，但不结合(或不明显结合)PACAP27或VIP。
[0522] 每种抗体的EC50值，即在指定时间段内在基线和最大值之间的一半处产生应答的抗体的浓度，基于抗体的结合曲线进行计算，并且示于下表1中。这些结果证明Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23 以高亲和力结合至并识别人PACAP38。抗体Ab1的人源化形式通过也以高亲和力结合PACAP38的附加的“.H”(即Ab1.H)来鉴定。
[0523] 表1
[0524] 抗PACAP抗体对PACAP38的结合(EC50)
[0525]
[0526]
[0527] 抗PACAP抗体中和PACAP38诱导的和PACAP27诱导的cAMP产生的能力
[0528] 在基于细胞的测定中测试了抗PACAP抗体中和PACAP38诱导的和PACAP27诱导的PAC1-R信号传导的能力。
[0529] 对于Ab10、Ab20、Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和 Ab23，为了鉴定中和PACAP38诱导的和PACAP27诱导的通过 PAC1-R的信号传导的抗体，将抗体溶液与PACAP38或PACAP27 在4x终浓度(100pM)下孵育1小时。在孵育抗体/抗原复合物的同时，将表达PAC1-R的PC-12细胞(日本研究生物资源日本保藏中心细胞库)洗涤并且以2x106个细胞/ml重新悬浮在细胞培养基中。将细胞(10 μl)和抗原/抗体复合物(40μl)转移到HTRF板，并在室温下振荡30分钟。孵育后，加入在裂解缓冲液中的20μl的(1:20稀释的)Eu3+穴状化合物标记的mAb抗cAMP和20μl的(1:20稀释的)d2标记的cAMP，并将所述板在振荡的同时孵育1小时。孵育后，读取板(激发330nm，发射620/665nm)，并测定620:665信号的比率。PACAP38和PACAP27 在各孔中的终浓度为0.1nM。
[0530] 图16A-H(PACAP38)和图17A-H(PACAP27)示出了(Ab10、 Ab20、Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23)的抑制曲线，其代表了用测试抗体获得的抑制曲线。对每种抗体定量抑制结果以产生IC50值，其总结于下表2中。这些结果证明，抗PACAP抗体Ab10、 Ab20、Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23在表达PAC1-R 的细胞中抑制PACAP38诱导的cAMP增加(参见图16A-H)。另外，这些结果证明，抗PACAP抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab1.H、Ab10.H 和Ab21.H但不是Ab22或Ab23，在表达PAC1-R的细胞中抑制 PACAP27诱导的cAMP增加(参见图
17A-H)。
17A-H)。
[0531] 表2
[0532] 抗PACAP抗体在表达PAC1-R的细胞中对PACAP38诱导的和 PACAP27诱导的cAMP增加的抑制(IC50)
[0533]
[0534] *n/a：无效，因为这些Ab具有PACAP38特异性
[0535] 实施例2：抗PACAP抗体的结合亲和力
[0536] 使用PROTEONTM XPR36(Bio-Rad，Hercules，CA)上的SPR估算人PACAP的单克隆抗体的结合亲和力。将抗体固定至在一般胺偶联(“GLC”或“GLM”)芯片(Bio-Rad，Hercules，CA)的表面。使用在购自Teknova(目录号P1192，Teknova，Hollister，CA)的1x PBST缓冲液(4.3mM磷酸钠、1.4mM磷酸钾、135mM NaCl、2.7mM KCl、 0.05％聚山梨醇酯-20)中制备的并且补充有0.25M精氨酸(来自J.T. )、0.2mg/ml BSA(Jackson Immuno Research Labs，West Grove，PA)和0.005％叠氮化钠(VWR International，Radnor，PA)且 pH调节至7的人PACAP38(SEQ ID NO:1241)的稀释系列来查询抗体。抗原(范围从1.23nM至100nM)通常以2-4分钟的缔合时间和 3-120分组的解离时间顺序运行，用PROTEONTM管理软件(v3.1.0.6 (Bio-Rad，Hercules，CA))进行分组并使用1:1Langmuir结合模型进行拟合。在使用0.85％磷酸的分析物查询之间再生表面。计算每个抗体的单个KD，其中缔合时间限制在接近扩散速率(1.0X 106)，并且解离时间限制到1.5X 10-5，其中没有观察到明显的解离。
[0537] 使用相同的程序来确定抗体对人VIP(SEQ ID NO:1243)和 PACAP27(SEQ ID NO:1242)的结合亲和力，但是肽浓度范围为1.23 nM至1000nM，缔合时间为200秒，并且解离时间为3-120分钟。
[0538] 测量的对于PACAP38的抗体亲和力列于表3中。
[0539] 表3
[0540] 对于PACAP38的抗体亲和力常数
[0541]抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
Ab10 2.6E+05 2.0E-05 7.5E-11
Ab20 1.2E+05 2.4E-05 2.1E-10
Ab21 3.7E+05 1.0E-05 2.7E-11
Ab22 3.7E+05 1.0E-05 2.7E-11
Ab23 5.1E+05 3.6E-05 7.1E-11
Ab1.H 4.7E+05 1.0E-05 2.1E-11
Ab10.H 3.4E+05 1.0E-05 2.9E-11
Ab21.H 4.8E+05 1.0E-05 2.1E-11
Ab10 2.6E+05 2.0E-05 7.5E-11
Ab20 1.2E+05 2.4E-05 2.1E-10
Ab21 3.7E+05 1.0E-05 2.7E-11
Ab22 3.7E+05 1.0E-05 2.7E-11
Ab23 5.1E+05 3.6E-05 7.1E-11
Ab1.H 4.7E+05 1.0E-05 2.1E-11
Ab10.H 3.4E+05 1.0E-05 2.9E-11
Ab21.H 4.8E+05 1.0E-05 2.1E-11
[0542] 对于VIP的抗体亲和力常数的实例列于表4中。
[0543] 表4
[0544] 对于VIP的抗体亲和力常数
[0545]
[0546]
[0547] 对于PACAP27的抗体亲和力常数的实例列于表5中。
[0548] 表5
[0549] 对于PACAP27的抗体亲和力常数
[0550]抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
Ab10 1.0E+06 1.0E-05 1.0E-11
Ab20 3.2E+05 2.2E-05 7.0E-11
Ab21 7.9E+05 1.0E-05 1.3E-11
Ab22 1.0E+00 1.0E-01 1.0E-01
Ab23 8.9E+05 3.1E-02 3.5E-08
Ab1.H 7.6E+05 1.0E-05 1.3E-11
Ab10.H 5.3E+05 1.8E-05 3.3E-11
Ab21.H 6.3E+05 1.0E-05 1.6E-11
Ab10 1.0E+06 1.0E-05 1.0E-11
Ab20 3.2E+05 2.2E-05 7.0E-11
Ab21 7.9E+05 1.0E-05 1.3E-11
Ab22 1.0E+00 1.0E-01 1.0E-01
Ab23 8.9E+05 3.1E-02 3.5E-08
Ab1.H 7.6E+05 1.0E-05 1.3E-11
Ab10.H 5.3E+05 1.8E-05 3.3E-11
Ab21.H 6.3E+05 1.0E-05 1.6E-11
[0551] 表3和表5的结合亲和力结果呈现了证明与Ab23对PACAP38 的结合亲和力相比，Ab23弱结合至PACAP27的数据。表3和表5 另外呈现了证明Ab22不特异性识别PACAP27，但是Ab22特异性结合至PACAP38的数据。
[0552] 实施例3：对PACAP38诱导的通过VPAC1-R的信号传导的抑制
[0553] 为了鉴定中和PACAP38诱导的通过人VPAC1-R的信号传导的抗体，在基于cAMP HTRF细胞的测定中使用表达人VPAC1-R的 CHO-K1细胞。将抗体稀释液与PACAP38一起以4x终浓度(5nM) 孵育1小时。在将抗体/抗原复合物孵育1小时的同时，将表达 VPAC1-R的CHO-K1细胞(通过用人VPAC1-R cDNA稳定转染 CHO-K1细胞(ATCC，目录号CCL-61)在Alder
Biopharmaceuticals生成；选择克隆1用于体外基于细胞的测定)用0.25％胰蛋白酶脱附4 分钟。将细胞洗涤并以1x106个细胞/ml培养基重新悬浮。将20μl的 Ab/抗原混合物与HTRF板中的20μl的细胞混合，并振荡孵育30分钟。将在裂解缓冲液中的20μl的Eu3+穴状化合物标记的抗cAMP mAb(1:20稀释的)和20μl的(1:20稀释的)d2标记的cAMP加入到每个孔，并振荡孵育1小时。PACAP38在各孔中的终浓度为5nM。孵育后，读取板(激发330nm，发射620/
665nm)，并测定620:665信号的比率。
Biopharmaceuticals生成；选择克隆1用于体外基于细胞的测定)用0.25％胰蛋白酶脱附4 分钟。将细胞洗涤并以1x106个细胞/ml培养基重新悬浮。将20μl的 Ab/抗原混合物与HTRF板中的20μl的细胞混合，并振荡孵育30分钟。将在裂解缓冲液中的20μl的Eu3+穴状化合物标记的抗cAMP mAb(1:20稀释的)和20μl的(1:20稀释的)d2标记的cAMP加入到每个孔，并振荡孵育1小时。PACAP38在各孔中的终浓度为5nM。孵育后，读取板(激发330nm，发射620/
665nm)，并测定620:665信号的比率。
[0554] 图18A-H代表了通过此方法获得的抑制曲线(示出了分别关于 Ab10、Ab20、Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23的结果)。在下表6中示出的每种抗体的计算的IC50值证明，Ab10、Ab20、 Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23在表达人VPAC1-R 的细胞中抑制PACAP38诱导的cAMP增加。
[0555] 表6
[0556] 抗PACAP抗体在表达人VPAC1-R的细胞中对PACAP38诱导的 cAMP增加的抑制(IC50)[0557]
[0558] 实施例4：对PACAP38诱导的通过VPAC2-R的信号传导的抑制
[0559] 为了鉴定中和PACAP38诱导的通过人VPAC2-R的信号传导的抗体，在基于cAMP HTRF细胞的测定中使用表达人VPAC2-R的 CHO-K1细胞。将抗体稀释液与PACAP38一起以4x终浓度(1nM) 孵育1小时。在将抗体/抗原复合物孵育1小时的同时，将表达 VPAC2-R的CHO-K1细胞(通过用人VPAC2-R cDNA稳定转染 CHO-K1细胞(ATCC，目录号CCL-61)在Alder
Biopharmaceuticals生成；选择克隆8用于体外基于细胞的测定)用0.25％胰蛋白酶脱附4 分钟。将细胞洗涤并以1x106个细胞/ml培养基重新悬浮。将20μl的 Ab/抗原混合物与HTRF板中的20μl的细胞混合，并振荡孵育30分钟。将在裂解缓冲液中的20μl的Eu3+穴状化合物标记的抗cAMP mAb(1:20稀释的)和20μl的(1:20稀释的)d2标记的cAMP加入到每个孔，并振荡孵育1小时。PACAP38在孔中的终浓度为1nM。孵育后，读取板(激发330nm，发射620/665nm)，并测定620:665信号的比率。
Biopharmaceuticals生成；选择克隆8用于体外基于细胞的测定)用0.25％胰蛋白酶脱附4 分钟。将细胞洗涤并以1x106个细胞/ml培养基重新悬浮。将20μl的 Ab/抗原混合物与HTRF板中的20μl的细胞混合，并振荡孵育30分钟。将在裂解缓冲液中的20μl的Eu3+穴状化合物标记的抗cAMP mAb(1:20稀释的)和20μl的(1:20稀释的)d2标记的cAMP加入到每个孔，并振荡孵育1小时。PACAP38在孔中的终浓度为1nM。孵育后，读取板(激发330nm，发射620/665nm)，并测定620:665信号的比率。
[0560] 图19A-H代表了通过此方法获得的抑制曲线(示出了分别关于 Ab10、Ab20、Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23的结果)。在下表7中示出的每种抗体的计算的IC50值证明，Ab10、Ab20、 Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23在表达人VPAC2-R 的细胞中抑制PACAP38诱导的cAMP增加。
[0561] 表7
[0562] 抗PACAP抗体在表达人VPAC2-R的细胞中对PACAP38诱导的 cAMP增加的抑制(IC50)[0563]
[0564]
[0565] 实施例5：对PACAP38结合至表达PAC1-R的细胞的抑制
[0566] 为了鉴定阻断PACAP38结合至表达PAC1-R的细胞的抗体，表达PAC1-R的粘附PC-12细胞(ATCC，Manassas，VA)用于基于铕的表达PAC1-R的细胞结合测定。将抗体溶液与10x终浓度(100nM或 30nM)的N末端生物素化的PACAP38一起孵育1小时，然后加入到在黑色透明底96孔板(COSTARTM，Corning Incorporated，Corning， NY)中铺板24小时的PC-12细胞中，并且再在室温下孵育1小时。三次洗涤后，将细胞与20μl铕标记的链霉亲和素(PerkinElmer， Waltham，MA)一起在室温下孵育1小时。将细胞洗涤三次，然后将 20μl增强溶液(PerkinElmer，Waltham，MA)加入到每个孔中，并温和振荡孵育15分
钟。在 (Molecular Devices， Sunnyvale，CA)读板仪上读取板(时间分
辨荧光(“TRF”))。
钟。在 (Molecular Devices， Sunnyvale，CA)读板仪上读取板(时间分
辨荧光(“TRF”))。
[0567] 图14A-H代表了通过此方法获得的抑制曲线(示出了分别关于 Ab10、Ab20、Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23的结果)，其中表达PAC1-R的细胞为PC-12细胞。在下表8中示出的每种抗体的计算的IC50值证明，Ab10、Ab20、Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23在抑制PACAP38结合至表达PAC1-R的PC-12 细胞。
[0568] 表8
[0569] 抗PACAP抗体对PACAP38结合至表达PAC1-R的PC-12细胞的抑制(IC50)
[0570]
[0571]
[0572] 实施例6：PACAP38介导的抗PACAP抗体结合至表达PAC1-R 的细胞的细胞表面
[0573] 为了鉴定通过PACAP38结合至表达PAC1-R的细胞的细胞表面的抗PACAP抗体，将表达PAC1-R的粘附PC-12细胞(日本研究生物资源日本保藏中心细胞库)用于基于细胞表面结合的测定。为了执行结合实验，首先将表达PAC1-R的PC-12细胞接种到Corning 96孔白色固体底板(Corning，Corning，NY)中。最初将细胞以1x105个细胞/ 孔接种在完全RPMI(“cRPMI”：补充有10％无菌热灭活FBS和1％无菌抗生素/抗真菌剂的RPMI培养基)+10％FBS的溶液中，并且允许所述板在37℃下孵育过夜。在结合测定当天，将初始浓度15μg/ml 的抗体以1:3的比率在 结合缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，0.1％叠氮化物，2％马
血清)(Perkin-Elmer，Waltham，MA)中稀释到在分开的96孔圆底板中的60μL总体积。用于结合测定的 PACAP38通过将其在 结合缓冲液中稀释至200nM的浓度来制备，然后
将60μl的稀释的PACAP38加入到每个含有抗体的孔中以形成抗体:抗原复合物。加入
PACAP38后，将抗体:抗原复合物在室温下在振荡器上孵育1小时。分别地，通过用
洗涤缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，0.1％叠氮化物)(Perkin-Elmer，
Waltham，MA)洗涤细胞两次来制备用于加入抗体:抗原复合物的 PC-12细胞。洗涤细胞两次并且在抗体:抗原复合物室温孵育1小时之后，将50μl的抗体:抗原复合物加入到含有细胞的每个孔中。然后将细胞和抗体:抗原复合物的混合物在室温下孵育30分钟。此30分钟的孵育之后，每种混合物用 洗涤缓冲液(Perkin-Elmer， Waltham，MA)洗涤两次。
血清)(Perkin-Elmer，Waltham，MA)中稀释到在分开的96孔圆底板中的60μL总体积。用于结合测定的 PACAP38通过将其在 结合缓冲液中稀释至200nM的浓度来制备，然后
将60μl的稀释的PACAP38加入到每个含有抗体的孔中以形成抗体:抗原复合物。加入
PACAP38后，将抗体:抗原复合物在室温下在振荡器上孵育1小时。分别地，通过用
洗涤缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，0.1％叠氮化物)(Perkin-Elmer，
Waltham，MA)洗涤细胞两次来制备用于加入抗体:抗原复合物的 PC-12细胞。洗涤细胞两次并且在抗体:抗原复合物室温孵育1小时之后，将50μl的抗体:抗原复合物加入到含有细胞的每个孔中。然后将细胞和抗体:抗原复合物的混合物在室温下孵育30分钟。此30分钟的孵育之后，每种混合物用 洗涤缓冲液(Perkin-Elmer， Waltham，MA)洗涤两次。
[0574] 将 铕标记的抗人IgG检测试剂(目录号1244-330， Perkin-Elmer，Waltham，MA)在 结合缓冲液中稀释至浓度为300ng/ml。稀释后，将50μl的抗人
IgG检测试剂加入到含有细胞的每个孔中，并且在加入此IgG检测试剂之后在室温下孵育30分钟。在30分钟室温孵育完成后，然后用 洗涤缓冲液洗涤细胞两次。接着，将50μ
l的 增强溶液(目录号1244-105， Perkin-Elmer，Waltham，MA)加入到每个含有
细胞的孔中，最后在室温下振荡孵育15分钟。然后在 (Molecular
Devices， Sunnyvale，CA)读板仪上读取板(TRF，激发330nm，发射620nm)。
IgG检测试剂加入到含有细胞的每个孔中，并且在加入此IgG检测试剂之后在室温下孵育30分钟。在30分钟室温孵育完成后，然后用 洗涤缓冲液洗涤细胞两次。接着，将50μ
l的 增强溶液(目录号1244-105， Perkin-Elmer，Waltham，MA)加入到每个含有
细胞的孔中，最后在室温下振荡孵育15分钟。然后在 (Molecular
Devices， Sunnyvale，CA)读板仪上读取板(TRF，激发330nm，发射620nm)。
[0575] 图15A-H代表了通过此方法获得的结合曲线(示出了分别关于 Ab10、Ab20、Ab21、Ab1.H、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23的结果)，其中表达PAC1-R的细胞为PC-12细胞。使用这种测定，证明了Ab1.H在PACAP38存在下结合至表达PAC1-R的细胞的表面，而 Ab20、Ab21、Ab10.H、Ab21.H、Ab22和Ab23似乎没有明显地结合至表达PAC1-R的细胞的表面。在PACAP38存在下仅观察到Ab1.H 与PAC1-R细胞的细胞表面的结合。不意图受理论约束，假设抗体与细胞表面的结合是通过PACAP38与细胞表面上存在的GAG的结合来介导的，因为PACAP38通过GAG的结合先前已被证明是 PACAP38结合和PC-12细胞内化的非PAC1-R受体依赖性机制(参见 Doan等，2012，Juhász等，2014和Neree等，2015)。
[0576] 实施例7：抗PACAP抗体Ab1.H对兔中PACAP38诱导的皮肤血管舒张的抑制
[0577] 已经表明PACAP38的皮内注射在兔和人中引发局部血管舒张 (Warren等，J.Cardio.Pharmacol.,29(1):83-87,1992；Seelinger等， Am.J.Path.,177(5):2563-
2575,2010)。进行体内功效研究以确定 Ab1.H在雄性新西兰白兔中抑制通过皮内注射
PACAP38诱导的局部皮肤血管舒张的活性。
2575,2010)。进行体内功效研究以确定 Ab1.H在雄性新西兰白兔中抑制通过皮内注射
PACAP38诱导的局部皮肤血管舒张的活性。
[0578] 向4只兔的组以90mg/kg的Ab1.H或阴性对照媒介物(25mM组氨酸，250mM山梨醇，pH 6.0)给药。通过在第0天进行静脉内(耳静脉)团注施用来执行注射。在每次兔PACAP38攻击之前，每只动物的肩胛骨区域被剪毛，并用20％(v/v)的乙醇水溶液擦拭。在第2天，将动物用氯胺酮盐酸盐预先麻醉，并用异氟烷气体维持深度麻醉。使用 永久标记，在
每只动物的背部识别出四个注射部位(目标区域(“ROI”))。使用用于激光斑点对比分析(“LASCA”)成像的 PeriCam PSI NR系统(Perimed， Sweden)，在皮内PACAP38 攻击
之前(基线)以及之后35分钟之后监测皮肤血管舒张和血液灌注。如下执行皮内PACAP38攻击：每只动物接受媒介物的单次皮内施用 (100μl/部位)(一个部位或ROI)和30pmol/部位的PACAP38(3个部位或3个ROI)。通过灌注机(“PU”)中的PeriCam PSI NR系统报道每个 ROI的血液灌注率，并使用PIMSoft(1.5版本，Perimed, Sweden)进行分析。
每只动物的背部识别出四个注射部位(目标区域(“ROI”))。使用用于激光斑点对比分析(“LASCA”)成像的 PeriCam PSI NR系统(Perimed， Sweden)，在皮内PACAP38 攻击
之前(基线)以及之后35分钟之后监测皮肤血管舒张和血液灌注。如下执行皮内PACAP38攻击：每只动物接受媒介物的单次皮内施用 (100μl/部位)(一个部位或ROI)和30pmol/部位的PACAP38(3个部位或3个ROI)。通过灌注机(“PU”)中的PeriCam PSI NR系统报道每个 ROI的血液灌注率，并使用PIMSoft(1.5版本，Perimed, Sweden)进行分析。
[0579] 对于每个处理组，针对每个ROI计算在Ab1.H或阴性对照的施用后相较于基线的相对％PU变化(每个PACAP38攻击部位的％PU变化-媒介物部位的％PU变化)。通过使用GraphPad Prism(5.0d版本，GraphPad Software，La Jolla，CA)软件执行双尾非配对t检验统计学评价，将Ab1.H组中的相对％PU变化与阴性对照组中的相对％PU变化进行比较。
[0580] 图20证明Ab1.H抑制兔中PACAP38诱导的皮肤血管舒张，指示抗体在体内中和PACAP38活性的有效性。
[0581] 实施例8：抗PACAP抗体Ab10对兔中PACAP38诱导的皮肤血管舒张的抑制
[0582] 已经表明PACAP38的皮内注射在兔和人中引发局部血管舒张 (Warren等，1992；以及Seelinger等，2010)。进行体内功效研究以确定Ab10在雄性新西兰白兔中抑制通过皮内注射PACAP38诱导的局部皮肤血管舒张的活性。
[0583] 向4只兔的组以72mg/kg的Ab10或同种型抗体对照给药。通过在第0天(耳静脉)团注静脉内施用来进行注射。在每次兔PACAP38 攻击之前，每只动物的肩胛骨区域被剪毛，并用20％(v/v)的乙醇水溶液擦拭。在第2天，将动物用氯胺酮盐酸盐预先麻醉，并用异氟烷气体维持深度麻醉。使用 永久标记，在每只动物的背部识别出四个注射部位(ROI)。使用用于LASCA成像的PeriCam PSI NR 系统(Perimed， Sweden)，在皮内
PACAP38攻击之前(基线) 以及之后35分钟监测皮肤血管舒张和血液灌注。如下执行皮内 PACAP38攻击：每只动物接受媒介物的单次皮内施用(100μl/部位) (一个部位或ROI)和
30pmol/部位的PACAP38(3个部位或3个ROI)。通过PU中的PeriCam PSI NR系统报道每个ROI的血液灌注率，并使用PIMSoft(1.5版本(Perimed， Sweden))进行分析。
PACAP38攻击之前(基线) 以及之后35分钟监测皮肤血管舒张和血液灌注。如下执行皮内 PACAP38攻击：每只动物接受媒介物的单次皮内施用(100μl/部位) (一个部位或ROI)和
30pmol/部位的PACAP38(3个部位或3个ROI)。通过PU中的PeriCam PSI NR系统报道每个ROI的血液灌注率，并使用PIMSoft(1.5版本(Perimed， Sweden))进行分析。
[0584] 对于每个处理组，针对每个ROI计算在Ab10或同种型Ab对照的施用后相较于基线的相对％PU变化(每个PACAP38攻击部位的％PU变化-媒介物部位的％PU变化)。通过使用GraphPad Prism(5.0d 版本，GraphPad Software，La Jolla，CA)软件执行双尾非配对t检验统计学评价，将Ab10组中的相对％PU变化与同种型Ab对照组中的相对％PU变化进行比较。
[0585] 图21证明Ab10抑制兔中PACAP38诱导的皮肤血管舒张，指示抗体在体内中和PACAP38活性的有效性。
[0586] 实施例9：抗PACAP抗体Ab1和Ab10的表位分级
[0587] 根据制造商指南，用生物素(Thermo Fisher Scientific，Waltham， MA)以10:1的摩尔比将Ab1生物素化。如下执行5步骤生物层干涉测量实验：在步骤1中，将链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio LLC， Menlo Park，CA)在1x动力学缓冲液(在DBS中的1:10稀释液，Pall ForteBio LLC，Menlo Park，CA，目录号18-5032)中平衡50秒。在步骤2中，将1x动力学缓冲液中的生物素化的抗体Ab1的2μg/ml 的稀释液在链霉亲和素生物传感器上固定500秒。在步骤3中，将抗体功能化的生物传感器在2μM未标记的PACAP肽(American Peptide Company，Sunnyvale，CA，目录号34-0-20)于1x动力学缓冲液中的的溶液中孵育200秒。在步骤4中，将传感器放置在67nM的未标记的抗体Ab10(图22A)或未标记的抗体Ab1作为对照(图
22B)于1x动力学缓冲液中的溶液中，进行1000秒缔合步骤。在于1x动力学缓冲液中进行
1000秒解离的步骤5期间，监测结合的稳定性。在图22A 中，通过捕获Ab1的PACAP对Ab10的“夹心式”捕获指示这两种抗体与PACAP的同时和非竞争性的结合。图22B中的对照实验示出通过Ab1-捕获的PACAP对Ab1的最小“夹心式”捕获。实验是在30℃和1000RPM下在ForteBio QK仪器(Pall ForteBio LLC， Menlo Park，CA)上进行的。
22B)于1x动力学缓冲液中的溶液中，进行1000秒缔合步骤。在于1x动力学缓冲液中进行
1000秒解离的步骤5期间，监测结合的稳定性。在图22A 中，通过捕获Ab1的PACAP对Ab10的“夹心式”捕获指示这两种抗体与PACAP的同时和非竞争性的结合。图22B中的对照实验示出通过Ab1-捕获的PACAP对Ab1的最小“夹心式”捕获。实验是在30℃和1000RPM下在ForteBio QK仪器(Pall ForteBio LLC， Menlo Park，CA)上进行的。
[0588] 实施例10：抗PACAP抗体对PACAP27结合至人PAC1-R的抑制
[0589] 为了鉴定阻断PACAP27结合至PAC1-R的抗体，将初始浓度为 30nM的抗体在孵育缓冲液(50mM Hepes pH 7.4，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.2％BSA)中稀释，并且执行连续1:3稀释。然后将抗体稀释液(30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM、0.1nM、0.03nM、0.01nM、 0.003nM和0.001nM)混合并在25℃下与0.1nM的125I标记的 PACAP27在孵育缓冲液中预先孵育30分钟。
然后将抗体:125I标记的 PACAP27混合物加入到于孵育缓冲液中的源自表达人重组PAC1-R 长同种型的Chem-1细胞的细胞膜的0.5μg等分试样中。然后将混合物在25℃下孵育1小时。
孵育后，将样品过滤并洗涤。之后，对过滤器计数以定量125I标记的PACAP27。作为实验对照，使用0.1μM 的标记的PACAP27来估算细胞膜的非特异性结合。结果指示，Ab1.H、 Ab10.H和Ab21.H能够阻断PACAP27结合至PAC1-R，从而证明由表9所呈现的测试抗体对配体-受体结合的抑制。
然后将抗体:125I标记的 PACAP27混合物加入到于孵育缓冲液中的源自表达人重组PAC1-R 长同种型的Chem-1细胞的细胞膜的0.5μg等分试样中。然后将混合物在25℃下孵育1小时。
孵育后，将样品过滤并洗涤。之后，对过滤器计数以定量125I标记的PACAP27。作为实验对照，使用0.1μM 的标记的PACAP27来估算细胞膜的非特异性结合。结果指示，Ab1.H、 Ab10.H和Ab21.H能够阻断PACAP27结合至PAC1-R，从而证明由表9所呈现的测试抗体对配体-受体结合的抑制。
[0590] 表9
[0591] 抗PACAP抗体对0.1nM 125I-PACAP27结合至PAC1-R的抑制(IC50)
[0592]抗体 IC50(nM)
Ab1.H 0.70
Ab10.H 0.22
Ab21.H 0.39
Ab1.H 0.70
Ab10.H 0.22
Ab21.H 0.39
[0593] 实施例11：抗PACAP抗体对光厌恶的影响
[0594] 为了检查抗PACAP抗体对畏光的影响，采用小鼠模型，其中向小鼠施用PACAP以触发畏光。使用如Kaiser等.，J.Neurosci., 32(44):15439-15449,2012中所述的使用光暗箱的光厌恶测定来检测畏光。然后向小鼠施用抗PACAP抗体Ab1.H或Ab10.H或不相关的对照抗体，并且定量它们对光的厌恶。结果反映在图23-25中。
[0595] 光厌恶测定
[0596] 如Kaiser等所述，测试室是一个普列克斯玻璃(plexiglas)旷场(27 cm宽×27cm深×20.3cm高)，其含有三组16光束红外阵列(两组垂直光束在1.0cm的高度处交叉以检测小鼠的位置和移动，并且第三束穿过7.3cm的高度处的室的宽度以检测垂直活动)。所述场被暗插入物分为两个相等大小的区域，所述暗插入物是一个具有顶部但没有底层的五面的黑色的普列克斯玻璃箱。使用红外光束允许在两个区域中进行跟踪。暗插入物中的开口(5.2cm×6.8cm)允许区域之间的自由运动。当暗插入物阻断直射光时，一些光仍然可以通过开口进入。每个测试室位于具有用于通风的风扇(Med Associates， St.Albans， VT)的消音隔间(56cm宽×38cm深×36cm高)内部。使用活动检测器 (Activity Monitor)
v6.02(Med Associated Inc.)的计算机来记录六个室的数据。
v6.02(Med Associated Inc.)的计算机来记录六个室的数据。
[0597] 对于每个室，将LED面板附接到消音隔间的内顶板。LED面板含有36个平行校正的1瓦特LED(5500k日光白) (LEDwholesalers.com，Burlingame，CA)。为了控制光强度，每个LED 面板连接到可调光LED驱动器( eldoLED America Inc.，San Jose，CA)，从而导致光强度的潜在范围为3.0×102至2.7×104 lx。使用放置在LED下方的透明普列克斯玻璃盘上的蜡纸将水平进一步减弱至5.5×101lx。光强度用放置在测试室底层上的可追踪双显示测光表(Control Company，Friendswood，TX)来测量。在2.7×104lx 下，LED光源在消音室产生一些热量，其中暗区域在～25℃下并且光区域在～27℃下。
[0598] 在实验当天，将小鼠从动物房中运出，并允许它们到使用标准顶置式荧光照明(在房笼内约200lx)的测试房间(～22℃)中适应至少30 至60分钟。除非另有注明，否则房间光源保持开启。另外，所有发声设备在适应期间都打开，并保持开启直到测试完成。在适应期间，房间内的人类存在最少。在0800CST和1400CST之间执行行为测试。注意任何异常的身体状况(例如，缺眼)。
[0599] 在研究中使用十周龄的雄性和雌性CD1小鼠(品种号022，Charles River，Wilmington，MA，US)。在测试之前，允许小鼠从运输中恢复一至两周。
[0600] 适应
[0601] 将所有小鼠在放置到光/暗室之前，在测试房间中适应至少30至 60分钟。室中的3
光强度最初设定到2.7x 10lx。小鼠每天暴露于光/ 暗室，在室中测试三十分钟。通过将小鼠暴露于光/暗室两次来获得每只小鼠在光下的基线时间，并且在基线和测量之间休息三天的时间段(图23和25，分别为“基线1”和“基线2”或“基线”)。
光强度最初设定到2.7x 10lx。小鼠每天暴露于光/ 暗室，在室中测试三十分钟。通过将小鼠暴露于光/暗室两次来获得每只小鼠在光下的基线时间，并且在基线和测量之间休息三天的时间段(图23和25，分别为“基线1”和“基线2”或“基线”)。
[0602] 处理
[0603] 通过腹膜内注射向小鼠施用30mg/kg的抗PACAP抗体或对照 IgG抗体(与测试抗体具有相同框架的阴性对照抗体，并且其识别地高辛)。然后在测试前使小鼠返回居住笼休息一天(24小时)。然后通过腹膜内注射向小鼠施用0.6mg/kg PACAP或媒介物并休息30分钟。然后将小鼠放置在光/暗室中30分钟(图23和图25，“处理”)。每只小鼠暴露于光/暗室之后，用杀菌擦拭物清洁光/暗室和组件并且干燥。在将小鼠置于光/暗室中约5至7分钟后，如下所述，将待测试的下一只小鼠用PACAP或媒介物注射。这个间隔大约是在实验之间清洁光/暗室所需要的时间量。
[0604] 运动性测量
[0605] 在30分钟测试时间段期间以5分钟的间隔测量运动性，如Kaiser 等，J.Neurosci.，2012所述。简单来说，通过光束测量垂直运动的次数，例如饲养、走动距离(cm，走动运动状态期间行进的总距离)、转移和休息(没有新光束打断所花费的时间百分比)。将所有运动性参数被标准化到每个区域花费的时间，以将在该区域中花费的不同的时间量考虑在内；因此，每个参数的原始值除以在5分钟间隔期间在该区域中花费的时间。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，San Diego，CA)分析每个室中花费的时间，并报道为平均值±平均值标准误差(“SEM”)。通过双向重复测量ANOVA来计算比较，并且邦费罗尼氏多重比较检验(Bonferroni’s multiple-comparison)用于事后比较分析。
[0606] 根据三个标准排除小鼠：(1)在前两次暴露于所述箱之后，分析在光下的基线时间，并且从实验中除去在基线时在光下花费的平均时间 +/-一个标准偏差的任何小鼠，并且不给予药物处理，(2)如果小鼠被鉴定为统计学异常值(盒型图，10-90％)，则将它们排除在分析之外，以及(3)如果小鼠运动小于10％的时间(合并的光和暗)，则排除它们。
[0607] 在比较施用抗体Ab1.H或Ab10.H与施用对照IgG的小鼠的应答的两个实验中，结果指示与IgG对照小鼠相比，施用PACAP抗体 Ab1.H或Ab10.H的小鼠在光下花费更多的时间。图23示出，在两个基线测量中，小鼠表现正常且相似。另一方面，图23中提供的数据示出，用对照IgG抗体和然后的PACAP处理的小鼠比施用抗PACAP 抗体Ab1.H和然后的PACAP的小鼠(圆圈)在光下花费统计学上更少的时间(正方形)。(参见图23，“处理”)。图25中提供的数据还示出，小鼠在基线测量中表现正常且相似。另一方面，图25中提供的数据示出，用对照IgG抗体和然后的PACAP处理的小鼠比施用抗PACAP 抗体Ab10.H和然后的PACAP的小鼠(倒三角)在光下花费统计学上更少的时间(三角形)。(参见图25，“处理”)。每次测量之间的时间为三天。每5分钟间隔提供平均值±SEM。施用媒介物的小鼠仅如正常对照一样行为。图24中提供的数据示出，施用抗PACAP抗体Ab1.H 或对照IgG以及媒介物(分别为“媒介物+PAC Ab”和“媒介物+对照 Ab”)不会明显改变小鼠行为。图24还示出，当施用PACAP和对照 IgG时(“PACAP+对照Ab”)小鼠在光下的平均时间减少，而施用抗 PACAP抗体Ab1.H和PACAP的小鼠表现出正常的光不敏感行为 (“PACAP+PAC Ab”)。
[0608] 实施例12：抗PACAP抗体的表位作图
[0609] 为了确定本发明的抗PACAP抗体及其抗原结合片段结合的 PACAP中所含有的表位，使用丙氨酸扫描实验。为了执行这些实验，合成具有单点突变的PACAP肽，在每个位置中用丙氨酸(“Ala”)替代天然氨基酸，并且测量了单点突变(由于其涉及PACAP和抗体的结合亲和力)的后果。由于丙氨酸残基已经占据野生型PACAP的位置18、 24和25，根据惯例，这些Ala残基被缬氨酸(“Val”)替代以确定在这些位置处去除丙氨酸对本发明的抗PACAP抗体与PACAP的结合的可能影响。根据通常惯例，这些Ala突变体根据PACAP 1-38中的位置被标记，之后是取代的氨基酸的字母代码，例如10A指示在氨基酸位置10处被丙氨酸取代的PACAP TM
1-38。使用PROTEON XRP36 (Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上的SPR检测人PACAP的单克隆抗体和每种突变肽的结合。使用标准胺偶联，将样品和样品对照以单一密度固定在PROTEONTM GLC传感器芯片(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上。用于固定的运行缓冲液是DPBS/改良(HYCLONETM，GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)，并且固定在25℃下进行。PROTEONTM GLC传感器芯片(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)根据制造商的方案(双向注射0.5％SDS、 50mM NaOH、100mM HCl)进行初始化和预处理。逐步执行固定化过程以确保PROTEONTM芯片(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA) 斑点上的独特抗体。芯片的表面用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(“EDAC/NHS”)的1:1混合物和30μL/分钟x 5分钟的流速进行激活。先前将抗体样品透析或交换到
10mM HEPES 150mM NaCl pH 7.2，并使用NANODROPTM2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)来定量抗体浓度。固定靶向2000-3000 个应答单位(“RU”)。使
10mM乙酸钠(pH 5.5)中的抗体样品(5μg/ml) 以30μL/分钟x 4分钟流动。使用0.3M乙醇胺以30μL/分钟的流速持续5分钟实现失活，同时进行下一次激活。
1-38。使用PROTEON XRP36 (Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上的SPR检测人PACAP的单克隆抗体和每种突变肽的结合。使用标准胺偶联，将样品和样品对照以单一密度固定在PROTEONTM GLC传感器芯片(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上。用于固定的运行缓冲液是DPBS/改良(HYCLONETM，GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)，并且固定在25℃下进行。PROTEONTM GLC传感器芯片(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)根据制造商的方案(双向注射0.5％SDS、 50mM NaOH、100mM HCl)进行初始化和预处理。逐步执行固定化过程以确保PROTEONTM芯片(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA) 斑点上的独特抗体。芯片的表面用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(“EDAC/NHS”)的1:1混合物和30μL/分钟x 5分钟的流速进行激活。先前将抗体样品透析或交换到
10mM HEPES 150mM NaCl pH 7.2，并使用NANODROPTM2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)来定量抗体浓度。固定靶向2000-3000 个应答单位(“RU”)。使
10mM乙酸钠(pH 5.5)中的抗体样品(5μg/ml) 以30μL/分钟x 4分钟流动。使用0.3M乙醇胺以30μL/分钟的流速持续5分钟实现失活，同时进行下一次激活。
[0610] 固定化后，将运行缓冲液变成1×PBST(4.3mM磷酸钠，1.4mM 磷酸钾，135mM NaCl，2.7mM KCl，0.05％ )与0.2M精氨酸HCl(以减少非特异性结合)、BSA(0.2mg/ml，
作为载体)和 (0.005％，作为防腐剂，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)，并
且允许芯片表面与新的运行缓冲液的注射重新平衡。将浓度为1 mg/ml的人PACAP肽(1-38)和丙氨酸/缬氨酸突变体肽(分子量：4.5kD) 的储备溶液加入到运行缓冲液中至终浓度为
0.45μg/ml(100nM)。然后这些混合物被用于以100μL/分钟x 2分钟的流速来查询芯片表面上的各个斑点，并允许这些混合物离解600秒。通过加入0.85％磷酸，在分析物之间再生芯片表面。如本文所述，在相同条件下检查抗体 Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23的每一个。
作为载体)和 (0.005％，作为防腐剂，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)，并
且允许芯片表面与新的运行缓冲液的注射重新平衡。将浓度为1 mg/ml的人PACAP肽(1-38)和丙氨酸/缬氨酸突变体肽(分子量：4.5kD) 的储备溶液加入到运行缓冲液中至终浓度为
0.45μg/ml(100nM)。然后这些混合物被用于以100μL/分钟x 2分钟的流速来查询芯片表面上的各个斑点，并允许这些混合物离解600秒。通过加入0.85％磷酸，在分析物之间再生芯片表面。如本文所述，在相同条件下检查抗体 Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23的每一个。
[0611] 使用多个参数来评估代表突变肽与一组抗体的结合的亲和力数据的传感图。首先对每个传感器图执行视觉检查，以评估相对于野生型PACAP肽(1-38)的表观最大应答(“Rmax”)。其次，执行解离相的视觉检查，强调相对于野生型PACAP肽的曲线形状。计算野生型 PACAP肽和每个突变肽与抗体组的结合的解离速率(Off-rate)(解离速率
(dissociation rate))。最后，作为确认每个肽变体(野生型或突变体) 的完整性的对照实验，对已知结合野生型PACAP的一组抗体的每个成员单独确定肽文库的每个成员的结合亲和力，以确保每个Ala突变体PACAP肽显示出与野生型PACAP肽的结合亲和力相似的结合亲和力。所有描述的参数的集体评估鉴定了对PACAP/抗体结合重要的 PACAP氨基酸残基。
(dissociation rate))。最后，作为确认每个肽变体(野生型或突变体) 的完整性的对照实验，对已知结合野生型PACAP的一组抗体的每个成员单独确定肽文库的每个成员的结合亲和力，以确保每个Ala突变体PACAP肽显示出与野生型PACAP肽的结合亲和力相似的结合亲和力。所有描述的参数的集体评估鉴定了对PACAP/抗体结合重要的 PACAP氨基酸残基。
[0612] 抗体Ab10、Ab20、Ab21、Ab22和Ab23与野生型PACAP和 PACAP突变体结合的结合和解离数据在图26A-30B中示出。每个图中的上图含有PACAP中似乎对抗体结合重要的残基的结合数据(标记在图标的右端，例如“10A”指示在PACAP的位置10处含有丙氨酸的突变体的结合数据)。下图提供了代表与野生型PACAP相似的剩余 PACAP丙氨酸突变体(即，与测试抗体结合的PACAP丙氨酸突变体) 的结合程度的数据点。基于此，确定残基对抗体结合可能不重要。作为阳性对照，每个图的上图和下图也公开了使用野生型PACAP(标记为huPACAP(1-38))获得的结合数据。
[0613] 图31A-B总结了基于在这些丙氨酸扫描研究中获得的数据来确定有助于抗体结合亲和力的PACAP残基位置。每列中列出的位置识别PACAP丙氨酸扫描突变体，其突变导致PACAP/抗体结合亲和力降低。根据沿着PACAP一级序列(从氨基酸残基1-38)的残基的空间排列，残基位置列于图31A-B的第3列中。对抗体结合贡献最大的 PACAP残基位置被解释为共同包含每种抗体结合的表位。基于在这些丙氨酸扫描研究中获得的数据，每个抗体结合的表位被推断为包含以下残基：
[0614] (i)Ab10：人PACAP的残基19、22、23和27。
[0615] (ii)Ab20：人PACAP的残基19、22、23、24和27。
[0616] (iii)Ab21：人PACAP的残基19、22、23和27。
[0617] (iv)Ab22：人PACAP的残基22、23、27、28和31。
[0618] (v)Ab23：人PACAP的残基12、20、23、24、26、27和28。
[0619] 还注意到，基于丙氨酸扫描实验结果，抗体Ab10、Ab20、Ab21、 Ab22和Ab23的每一个对于PACAP的亲和力涉及或取决于人PACAP 的残基19、22、23和/或27。
[0620] 另外，观察到抗体Ab22和Ab23的每一种对于PACAP的亲和力涉及或需要存在于人野生型PACAP38中但不存在于人野生型 PACAP27中的特定氨基酸残基，例如PACAP38的残基28和31。
[0621] 关于前述丙氨酸扫描结果，本发明的抗PACAP抗体的人源化变体应与人PACAP的相同或基本相同的残基相互作用，因为与亲本(非人源化)抗体相比，人源化不应显著影响人源化抗PACAP抗体与人 PACAP结合的特异性。具体地，Ab10.H应与人PACAP上与Ab10 相同的残基相互作用，并且Ab21.H应与人PACAP上与Ab21相同的残基相互作用。
[0622] 可以使用本文所述的方法产生和鉴定结合至与本发明的抗体相同的或重叠的人PACAP上的表位的抗体。可以合理地期望，结合至与本文中鉴定的任何抗体相同的或重叠的表位的抗体可能拥有相似的生物活性，而没有结合动力学上有意义的差异。具体地，此类抗体应拮抗由PACAP引发的一种或多种生物学效应，类似于结合这些表位的示例性抗PACAP抗体。另外，期望结合至这些相同的或重叠的表位或其残基的亚类的抗体可模拟本发明的抗体的结合特征。例如，希望此类抗体选择性地结合至PACAP，并且不结合或者以小得多的 (较弱的)亲和力结合至VIP或这种神经肽家族内的其它肽。
[0623] 已充分描述和实现了本发明，本发明由下面的权利要求进一步描述。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 螺-噁唑酮 | 2020-05-19 | 42 |
| 乙炔基衍生物 | 2020-05-23 | 457 |
| 7,8-二羟黄酮和7,8-取代的黄酮衍生物、组合物及其相关方法 | 2020-05-26 | 368 |
| 7,8-二羟黄酮和7,8-取代的黄酮衍生物、组合物及其相关方法 | 2020-05-26 | 331 |
| 含镁催产素制剂和应用方法 | 2020-05-15 | 432 |
| 一种自闭症谱系障碍诊断试剂盒 | 2020-05-11 | 178 |
| 19-去甲C3,3-二取代的C21-N-吡唑基类固醇及其使用方法 | 2020-05-17 | 789 |
| 用于诊断自闭症谱系障碍的组合物和方法 | 2020-05-13 | 330 |
| 螺-噁唑酮 | 2020-05-19 | 932 |
| 一种用于自闭症谱系障碍的监察耳机 | 2020-05-14 | 834 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈