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治疗脆性X综合征及相关疾病的方法

阅读：46发布：2020-05-15

专利汇可以提供治疗脆性X综合征及相关疾病的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了缓解脆性X综合征及相关疾病 (例如自闭症谱系障碍 )的体征或症状的方法。，下面是治疗脆性X综合征及相关疾病的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.治疗或缓解脆性X综合征或相关疾病的症状的方法，其包括向有此需要的对象施用包含美他多辛的组合物。
2.权利要求1所述的方法，其包括施用100mg至3000mg的每日总剂量的美他多辛。
3.权利要求1所述的方法，其中所述美他多辛每天、每隔一天或每周施用。
4.权利要求1所述的方法，其中所述美他多辛以每天1、2或3个剂量形式施用。
5.权利要求1所述的方法，其中所述美他多辛以持续释放经口剂型施用，其中所述美他多辛配制为缓慢释放形式和立即释放形式的组合。
6.权利要求5所述的方法，其中：
(a)所述缓慢释放形式提供所述美他多辛的至少8小时的持续释放，并且(b)其中缓慢释放美他多辛与立即释放美他多辛的相对比例为约60∶40至80∶20。
7.权利要求6所述的方法，其中缓慢释放美他多辛与立即释放美他多辛的相对比例为约65∶35。
8.权利要求1所述的方法，其中所述症状为学习受损或社交能力受损。
9.权利要求1所述的方法，其中所述对象患有脆性X综合征或自闭症谱系障碍。
10.权利要求1所述的方法，其中所述相关疾病为自闭症谱系障碍。

说明书全文

治疗脆性X综合征及相关疾病的方法

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求于2013年9月9日提交的临时申请USSN 61/875,384、于2013年9月26日提交的USSN 14/038258和于2014年5月9日提交的临时申请USSN 61/991,351的优先权和权
益，其内容分别在此通过引用整体并入本文。

技术领域

[0003] 本发明一般性地涉及治疗或缓解脆性X综合征及相关疾病的症状的方法。

背景技术

[0004] 如其名称所暗示的，脆性X综合征(Fragile X Syndrome，FXS)与中期染色体中在图谱位置Xq 27.3处表达为等色裂隙的脆性部位相关。脆性X综合征是一种遗传性疾病，其
由位于X染色体上的脆性X智力低下1(fragile X mental retardation 1，FMR1)基因的5’-非翻译区中的突变引起。引起FXS的突变与脆性X智力低下基因FMR1中的CGG重复相关。在大多数的健康个体中，CGG重复的总数量为小于10至40，平均为约29。在脆性X综合征中，CGG序列重复200次至超过1,000次。当对象具有超过约200个CGG重复时，脆性X基因变得超甲基
化，这使该基因沉默。结果，不产生或者以降低的水平产生脆性X智力低下蛋自(fragile X mental retardation protein，FMRP)，并且该对象表现出FXS的表现。

[0005] FMR1基因的前突变扩增(55至200个CGG重复)在普通群体中较为频繁，其中估计流行率为女性1/259和男性1/812。前突变的携带者通常具有正常的IQ，但是情感问题例如焦
虑较为常见。年长的男性前突变携带者(50岁及以上)发生进行性意向性震颤和共济失调。
这些运动障碍频繁地伴随着进行性认知和行为困难，包括记忆丧失、焦虑以及执行功能缺
陷、独处或应激性行为，和痴呆。这一疾病已认定为脆性X相关性震颤/共济失调综合征
(fragile X-associated tremor/ataxia syndrome，FXTAS)。对患有FXTAS的对象的磁共振成像揭示小脑中脚和邻近小脑白质中的T2加权信号强度增强。

[0006] FXS作为外显率降低的X连锁显性疾病而分离。携带脆性X突变的任何性别均可表现出不同严重程度的智力障碍。患有FXS的儿童和成人具有不同程度的智力障碍或学习障
碍以及行为和情绪问题，包括自闭样特征和倾向。患有FXS的幼儿通常具有发育重要事件
(例如学习如何坐、行走和说话)的延迟。受侵袭的儿童可具有频繁发怒、注意力难以集中、频繁癫痫发作(例如，颞叶癫痫发作)，常常高度焦虑、易于不知所措，可具有感觉性觉醒过度紊乱、胃肠道紊乱，并且可具有说话问题和异常行为，例如挥舞手和咬手。

[0007] FXS可通过对来自对象的样品(例如，血样、口腔样品)进行建立的遗传测试来诊断。所述测试基于CGG重复的数量来确定该对象的FMR1基因中是否存在突变或前突变。

[0008] 患有FXS的对象还可具有自闭症。经诊断患有自闭症的所有儿童中约5％具有FMR1基因的突变并且还具有脆性X综合征(FXS)。自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)见于约30％患有FXS的男性和20％患有FXS的女性中，并且另外的30％FXS个体表现出
自闭症症状但不诊断具有ASD。虽然智力障碍是FXS的标志性特征，但是患有FXS的对象常常表现出自闭症特征，范围从轻度病例中的羞怯、缺乏眼神接触和社交焦虑到重度受侵袭者
中的挥舞手、咬手和持续言语。患有FXS的对象表现出与自闭症相关的其他症状，例如注意力不足和多动、癫痫发作、对感觉刺激过敏、强迫性行为以及胃肠道功能改变。FMR1突变阻止或者极大地降低了单一蛋白质(FMRP)的表达。认为在不存在FMRP情况下的脑发育导致
FXS的主要症状。

[0009] 除核心症状之外，患有FXS的儿童还频繁地具有严重的行为紊乱，例如易怒、攻击和自伤行为等。在对患有FXS之男性(8至24岁)的最近研究中，报道在两个月的观察期内，
79％的对象中有自伤行为且75％的对象中有攻击行为。

[0010] 目前，针对患有FXS的人的可用治疗方案包括例如行为矫正和用多种药物(未经FDA批准用于治疗FXS)进行治疗，所述药物包括抗抑郁和抗精神病药物。已经使用认知行为治疗来在患有FXS和自闭症的个体中改善语言和社交。近年来，已在患有自闭症的个体的治疗中普遍利用使用非典型抗精神病药利培酮的药理学治疗来增强非药理学方法。在自闭症
儿童中进行利培酮的随机化安慰剂对照试验证明临床总体印象改善(Clinical Global
Impressions-Improvement)和异常行为量表(Aberrant Behavior Checklist)的易怒分量
表显著改善(McCracken，J.T.，等，N.Engl.J.Med.347：314-321(2002))。然而，不良事件包括体重增加、食欲增加、疲劳、嗜睡、眩晕和流涎。通过施用利培酮并未改善社交隔离和交流，并且不良副作用(例如锥体束外症状和运动障碍)已与自闭症儿童中的利培酮使用有
关。由于当前的治疗方案频繁地失效或者可在长期使用时产生不期望的副作用(特别是在
抗精神病药物的情况下)，因此需要开发新的治疗。

[0011] 发明概述

[0012] 在多个方面，本发明提供了治疗或者缓解脆性X综合征或相关疾病的症状的方法，其通过向有此需要的个体施用包含美他多辛(metadoxine)的组合物来进行。所述症状为例
如学习受损或社交能力受损。所述对象患有脆性X综合征或自闭症谱系障碍。所述相关疾病为自闭症谱系障碍。

[0013] 在一些方面，施用100mg至3000mg的每日总剂量的美他多辛，并且每天、每隔一天或每周施用美他多辛。

[0014] 任选地，美他多辛以每天1、2或3个剂量形式施用。在一些实施方案中，美他多辛以持续释放经口剂型施用，其中美他多辛被配制为缓慢释放形式和立即释放形式的组合。

[0015] 例如，缓慢释放形式提供美他多辛的至少8小时的持续释放。缓慢释放美他多辛与立即释放美他多辛的相对比例为约60∶40至80∶20。优选地，缓慢释放美他多辛与立即释放美他多辛的相对比例为约65∶35。

[0016] 除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在实施本发明中可使用与本文中所述那些类
似或等同的方法和材料，下面仍对合适的方法和材料进行了描述。本文中提及的所有公开、专利申请、专利以及其他参考文献均明确地通过引用以其整体并入。如有冲突，将以本说明书(包括定义)为准。另外，本文中所述的材料、方法和实施例仅是示例性的并非旨在限制。

[0017] 本发明的其他特征和优点将由以下详细描述和权利要求书而变得明显并且涵盖在其中。

[0018] 附图简述

[0019] 图1示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中进行7天载剂(V)或美他多辛(M)(100、150或200mg/kg)的每天一次腹膜内(ip)施用对场景恐惧条件反射的作用。特别地，图A示出了载剂或150mg/kg美他多辛的作用。图B示出了载剂或100mg/kg美他多辛的作
用。图C示出了载剂或200mg/kg美他多辛的作用。所示数据为平均值±平均值标准误差
(sem)，N＝10只小鼠/组。＊p＜0.05、＊＊＊＊p＜0.0001并且NS＝不显著。

[0020] 图2示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次腹膜内施用对社交接近行为的作用。所示数据为平均值±sem，N
＊＊＊＊＊
＝10只小鼠/组。p＜0.05和 p＜0.0001。

[0021] 图3示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次腹膜内施用对Y形迷宫自发交替(Y-maze spontaneous
alternation)(图A)、Y形迷宫奖励性交替(Y-maze rewarded alternation)(图B)或Y形迷
宫水迷宫空间辨别(Y-maze water maze spatial discrimination)(图C)的作用。所示数
据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001并且NS＝不显著。

[0022] 图4示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次腹膜内施用对T形迷宫奖励性交替的作用。所示数据为平均值±
＊＊＊＊
sem，N＝10只小鼠/组。 p＜0.0001。

[0023] 图5示出了在N＝10野生型(WT)或Fmr1敲除(KO)2月龄小鼠的组中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次处理对在连续通道任务(successive alley task)中
的行为的作用。设备的连续通道呈现出愈加致焦虑的环境以对小鼠进行研究。因此，从通道往下移动评估为焦虑。此外，还可在该设备中对整体活动水平进行量化。

[0024] 图6示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次腹膜内施用对ERK(指示ERK活性)(图A)和Akt(指示Akt活性)(图
B)的整体脑磷酸化水平的作用。所示数据为平均值±sem，N＝5只小鼠/组。＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001和NS＝不显著。

[0025] 图7示出了在6月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip施用载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)7天对场景恐惧条件反射的作用。所示数据为平均值±sem，N＝10
只小鼠/组。＊＊＊＊p＜0.0001并且ns＝不显著。

[0026] 图8示出了如通过嗅探回合次数或嗅探持续时间所测量的，在6月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip施用载剂(v)或150mg/kg美他多辛(M)7天对社交接近
(图A和C)和社交记忆(图B和D)行为的作用。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊p＜0.05、＊＊＊＊p＜0.0001并且ns＝不显著。

[0027] 图9示出了在6月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip施用载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)7天对ERK(图A)和Akt(图B)的整体脑磷酸化水平的作用。所示数据
为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊＊p＜0.0001并且ns＝不显著。

[0028] 图10示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip或经口施用(PO)载剂(V)或150mg/kg和300mg/kg美他多辛(M)7天对场景恐惧条件反射的作用。所示数
据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。具体地，图A示出了Fmr1敲除和野生型小鼠中使用载剂的ip或经口处理。图B示出了野生型小鼠中使用美他多辛的ip和经口处理。图C示出了Fmr1
敲除小鼠中使用美他多辛的ip和经口处理。＊＊p＜0.01、＊＊＊＊p＜0.0001并且ns＝不显著。

[0029] 图11示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip或经口施用(PO)载剂(V)或者150mg/kg或300mg/kg美他多辛(M)7天对社交接近(图A)和社交记忆(图B)
的作用。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊＊p＜0.01、＊＊＊＊p＜0.0001并且ns＝不显著。

[0030] 图12示出了如使用流式细胞术所评估的，在2月龄Fmr1敲除(KO)和野生型(WT)小鼠中每天一次地ip或经口施用(PO)载剂(V)或者150或300mg/kg美他多辛(M)7天对淋巴细
胞生物标志物的作用。所示生物标志物为Fmr1敲除或野生型小鼠中的pAkt(图A)和pERK(图
＊＊＊＊
B)。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。 p＜0.0001并且ns＝不显著。

[0031] 图13示出了每天一次地ip施用载剂(V)或者150mg/kg美他多辛(M)7天对2月龄野生型(WT)和Fmr1敲除(KO)小鼠脑区域中的pERK水平的作用。所分析区域为Fmr1敲除或野生
型小鼠中的海马(图A)、前额皮质(图B)和纹状体(图C)。所示数据为平均值±sem，N＝10只
＊＊＊＊
小鼠/组。 p＜0.0001并且ns＝不显著。

[0032] 图14示出了每天一次地ip施用载剂(V)或者150mg/kg美他多辛(M)7天对2月龄野生型(WT)和Fmr1敲除(KO)小鼠脑区域中的pAkt水平的作用。所分析区域为Fmr1敲除或野生
型小鼠中的海马(图A)、前额皮质(图B)和纹状体(图C)。所示数据为平均值±sem，N＝10只
＊＊＊＊
小鼠/组。 p＜0.0001并且ns＝不显著。

[0033] 图15示出了用载剂(V)或300μM美他多辛(M)进行5小时体外处理对来自Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠的海马神经元培养物中的丝足密度(图A)、长度(图B)和宽度(图C)
的作用。所示数据为平均值±sem(野生型，N＝20个神经元；Fmr1敲除小鼠，N＝20个神经
元)。＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001并且ns＝不显著。

[0034] 图16示出了用载剂(V)或300μM美他多辛(M)进行体外处理对来自Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠之400μM海马切片中的蛋白质基础从头合成的作用。所示数据为平均值±
sem，N＝6个切片/组。＊p＜0.001并且＊＊＊＊p＜0.0001。

[0035] 发明详述

[0036] 本发明涉及以下发现：美他多辛在脆性X综合征的有效动物模型中显著改善认知和社交功能。

[0037] 特别地，美他多辛在场景恐惧模式期间以剂量依赖性方式显著地改善记忆和学习，并且两个最高剂量水平(150mg/kg和200mg/kg)将Fmr1KO小鼠的学习和记忆缺陷充分补
救至WT小鼠水平的类似程度。另外，在行为测试(例如T形迷宫)中发现经150mg/kg美他多辛处理的Fmr1KO小鼠在记忆方面显著改善，表明认知结果显著改善。经150mg/kg美他多辛处
理的KO小鼠的社交相互作用改善补充了这些发现。重要的是，有效小鼠脆性X模型中在用美他多辛处理之后认知执行功能、工作记忆和社交相互作用改善与反映神经元信号传导途径
和氧化应激的生化标志物的正常化有关。

[0038] 脆性X综合征是男孩中自闭症的最普遍的单基因原因和智力低下的遗传性原因。具有FMR1基因突变的任何人都可将其遗传给其子女。根据疾病控制和预防中心(Center
for Disease Control and Prevention，CDC)，约1/4,000男性和1/8,000女性患有脆性X综合征。并非具有该突变的所有人都将表现出脆性X的体征或症状，并且障碍范围从轻度到重度，以及身体特征例如面部细长、大耳或前突耳、大睾丸(巨睾丸症)，和行为特征，例如刻板运动(例如挥舞手)和社交焦虑。脆性X由X染色体上存在的脆性X智力低下1(FMR1)基因中的
改变或突变引起。所述基因一般产生称为脆性X智力低下蛋白或FMRP的蛋白质。该蛋白质对产生和维持脑和神经系统中细胞之间的联系具有重要意义。所述突变导致机体仅产生一点
或者不产生该蛋白质，这常常引起脆性X的症状。

[0039] 脆性X综合征(FXS)的发生常常伴随着其他病症，例如自闭症谱系障碍。自闭症谱系障碍(ASD)是可引起显著社交、交流和行为困难的一组发育障碍。患有ASD的人在其脑中
以不同于其他人的方式处理信息。

[0040] ASD为“谱系障碍”。这意味着ASD以不同的方式作用每个人并且范围可从非常轻微至重度。患有ASD的人共有一些类似的症状，例如社交相互作用的问题。但是在症状开始时，其严重程度和症状的确切性质存在差异。ASD包括自闭障碍(也称为“典型”自闭症)、阿斯波哥尔综合征(Asperger Syndrome)和广泛性发育障碍(Pervasive Developmental Disorder)。

[0041] 目前，食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)尚未批准任何特别地用于治疗脆性X或其症状的药物。存在标示外使用以治疗脆性X综合征的某些症状的药
物，但是结果因患者而极大不同并且这些药物中有一些携带严重风险、可一开始就使症状
恶化或者需要几周才能起效。本发明提供了对治疗脆性X或其症状的药物的尚未满足的需
求。

[0042] 相应地，本发明提供了治疗、预防或缓解脆性X综合征和/或自闭症谱系障碍的体征或症状的方法，其通过向对象施用包含美他多辛的组合物来进行。

[0043] 一般来说，脆性X的体征和症状分为五类：智力和学习；身体，社交和情感，说话和语言以及感觉障碍，其通常与脆性X相关或者与脆性X具有共有特征。包括例如，患有脆性X的个体具有受损的智力功能、社交焦虑、语言困难并且对某些感觉敏感。使用美他多辛的治疗在患有脆性X综合征的对象中改善学习并且提高社交能力。

[0044] 自闭症谱系障碍通常与患有脆性X综合征的个体相关。自闭症的体征和症状包括显著语言延迟，社交和交流困难，以及异常的行为和兴趣。患有自闭症性疾病的很多人还具有智力障碍。患有阿斯波哥尔综合征的个体通常具有自闭障碍的一些轻度症状。例如，他们可具有社交困难以及异常的行为和兴趣。患有广泛性发育障碍(PDD-NOS)的个体：满足自闭症障碍或阿斯波哥尔综合征的一些标准而并非所有标准的人可诊断为患有PDD-NOS。与患
有自闭障碍的那些相比，患有PDD-NOS的人通常具有较少且轻度的症状。所述症状可仅引起社交和交流困难。用美他多辛进行治疗改善自闭症的症状。

[0045] 美他多辛是吡咯烷酮羧酸酯(pyrrolidone carboxylate，PCA)与吡哆醇(维生素B6)的离子对，其中这两种化合物通过成盐作用在单一产物中连接。与PCA的配对协同地提
高吡哆醇的药理活性(参见，例如美国专利4,313,952)。美他多辛在水和胃液中可自由溶
解。该药物可经口快速吸收并且具有高生物利用率(60％至80％)。美他多辛在人血清中的
半衰期较短(40至60分钟)，并且在经口和静脉内施用之间并无明显差异(Addolorato等，同上；Lu Yuan等，Chin.Med.1 2007 120(2)160-168)。

[0046] 在一些国家中，美他多辛以500mg片剂和300mg注射剂的形式作为处方药物市售。片剂包含500mg美他多辛、微晶纤维素和硬脂酸镁。安瓿包含300mg美他多辛、焦亚硫酸钠、EDTA钠、对羟基苯甲酸甲酯和水。

[0047] 在某些实施方案中，本发明的美他多辛组合物(例如，整体或部分配制成用于持续或受控释放的美他多辛组合物)能够使美他多辛更高效地用于治疗、预防和/或缓解脆性X
综合征及其相关病症/疾病(例如自闭症谱系障碍)的体征或症状。

[0048] 在本发明的上述某些方法中，美他多辛或其可接受的衍生物可配制成在施用于对象之后立即释放。在本发明的上述某些方法中，美他多辛或其可接受的衍生物配可制成在
施用于对象之后持续和/或受控释放，并且可任选地配制成在施用于对象之后同时具有立
即释放和持续和/或受控释放特征。在某些实施方案中，美他多辛或其药理学上可接受的衍生物被配制成用于非长期施用。可用于本发明方法的美他多辛制剂在下文进行了更详细的
描述。

[0049] 在某些实施方案中，本发明提供了包含配制成当施用于对象时持续和/或受控释放的美他多辛或其衍生物的组合物，其用于改善、治疗、预防和/或缓解脆性X综合征和/或其相关病症/疾病(例如自闭症谱系障碍)的体征或症状。

[0050] 在某些实施方案中，本发明提供了包含美他多辛或其衍生物的这样的组合物，其中一部分的美他多辛或衍生物配制成当施用于对象时持续和/或受控释放并且一部分的美
他多辛或衍生物配制成用于立即释放，所述组合物用于改善、治疗、预防和/或缓解脆性X综合征和/或其相关病症/疾病(例如自闭症谱系障碍)的体征或症状。

[0051] 在某些实施方案中，在施用美他多辛或美他多辛衍生物后约10分钟至约20分钟或30分钟或40分钟或50分钟或60分钟、90分钟、2小时3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时内达到活性成分的有效血清水平。在某些实施方案中，在施用美他多辛或美他多辛衍生物后约5分钟至约20分钟或30分钟或40分钟或50分钟或60分钟、90分钟、2小
时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时内在所述对象中达到活性成分的有效血清水平。在某些实施方案中，在施用美他多辛或美他多辛衍生物后约20分钟至约
20分钟或30分钟或40分钟或50分钟或60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时内达到活性成分的有效血清水平。在某些实施方案中，在约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时内达到活性成分的有效血清水平。

[0052] 本发明人已开发了基于肠内(经消化道)和/或肠胃外(除消化道之外的其他途径)途径来施用美他多辛或美他多辛衍生物的创新方法(WO2009/004629，其内容通过引用整体
并入)。这些方法基于对用于目的递送系统之载体的谨慎选择提供了具有期望特性的递送
系统的合理设计，所述载体例如合适的表面活性剂/助表面活性剂组合物或者捕获活性成
分的微米/纳米颗粒(例如脂质体或纳米脂质体)，或者其他添加剂或赋形剂。肠内递送系统可设计成用于经口施用(片剂、袋剂(sachet)、锭剂、胶囊剂、胶丸(gelcap)、滴剂、或其他可接受形式)或经直肠施用(栓剂或(微型)灌肠剂形式)。此外，所述目的递送系统可以为液体形式，例如滴液剂、糖浆剂。此外，所述目的递送系统可以为饮料或食品形式。因此，本发明所使用的活性成分可包含在饮料中，特别是软性饮料例如果汁、花蜜、水、起泡水
(sparkling water)及其他起泡饮料、混合饮料(shake)、奶昔和其他基于乳液的饮料等。液体制剂还可以为浓缩糖浆剂的形式，用水或起泡水进行稀释。或者，活性成分可以包含在食品中，例如点心棒、健康棒、饼干、曲奇、甜食、糖果制品、冰淇淋、冰棒等。

[0053] 再者，所述递送系统可以是包含生理活性吡哆醇衍生物(特别是吡哆醇L，2-吡咯烷酮-5羧酸酯(美他多辛))的食品或饮料。在某些实施方案中，食用本发明的食品或饮料制品可导致在其食用后约10分钟至约40-60分钟内达到活性成分的血清水平。实例可以是甜
食、巧克力、糖果及糖果棒、能量棒、冰淇淋、糕点制品等。

[0054] 肠胃外施用方式包括皮下、透皮(通过完整的皮肤扩散)、透粘膜(通过粘膜扩散)、舌下、经颊(通过牙龈线附近的面颊吸收)施用，或通过吸入施用。在某些实施方案中，本发明所使用的组合物不通过侵入性治疗方式施用(即，是非侵入性的)。在某些实施方案中，美他多辛或美他多辛衍生物组合物不通过静脉内注射施用。

[0055] 在某些实施方案中，本发明所使用的组合物作为适合雾化的微晶粉末或溶液递送；对于阴道内或直肠内施用来说，作为阴道栓剂、栓剂、霜剂或泡沫剂递送。优选的制剂是用于经口施用的制剂。另一优选制剂用于局部施用。另一优选制剂用于透粘膜施用、舌下施用、经颊施用(通过牙龈线附近的面颊吸收)、通过吸入施用或经眼施用(例如，在滴眼剂
中)。

[0056] 出于医疗用途来施用美他多辛或美他多辛衍生物需要安全且有效的递送系统。本发明提供了这样的递送系统，其由于其特殊的物化特性(特别是直接吸收)而可通过非侵入
性方式安全地递送多种物质，从而避免副作用。所述递送系统基于其独特的物化特性显著
地增强美他多辛或美他多辛衍生物吸收的效率和质量，这使得能够以生物活性形式向对象
递送较低浓度或量的活性物质。本发明的递送系统使活性物质直接到达组织，并由此向所
治疗的对象提供美他多辛或美他多辛衍生物的立即或接近立即的作用。因此，在某些实施
方案中，本发明使用用于改善生理活性吡哆醇(特别是吡哆醇L，2-吡咯烷酮-5羧酸盐(美他多辛))或其生理学上可接受的衍生物的施用的非侵入性药物递送系统，其包含作为活性成
分的在合适载体中的所述生理活性吡哆醇。在某些实施方案中，在施用后约10分钟至约40-
60分钟内达到所述活性成分的血清水平。在另一个实施方案中，本发明采用用于改善生理
活性吡哆醇衍生物(特别是吡哆醇L，2-吡咯烷酮-5羧酸酯(美他多辛))的施用的非侵入性
药物递送系统，其用于在有此需要的对象中改善认知行为，所述系统包含作为活性成分的
在合适载体中的所述吡哆醇衍生物。在某些实施方案中，在施用后约10分钟至约40-60分钟内达到所述活性成分的血清水平。

[0057] 在某些实施方案中，本发明所采用的药物递送系统可设计成用于经口、经鼻、经眼、经直肠、皮下、转移、透粘膜、舌下、经颊或吸入施用。所述药物递送系统可以以受控释放模式提供活性物质。在某些实施方案中，本发明的药物递送系统还可包含至少一种另外的
药物活性剂。本发明所使用的递送系统一般可包含缓冲剂(即调节其渗量浓度的试剂)并任
选地包含一种或更多种本领域中已知的可药用载体、赋形剂和/或添加剂。还可将补充的可药用活性成分掺入所述组合物中。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物以及植物油的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过维持所需的颗粒尺寸(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来
维持适当的流动性。本文中使用的“可药用载体”包括任何及所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂等。此类介质和试剂针对药物活性物质的使用在本领域中是公知的。
除非由于任何常规介质或试剂与所述活性成分不相容，否则可考虑将其用于治疗性组合物
中。可以考虑，可以通过任何药学上可接受的途径以及以任何药学上可接受的剂型来递送
活性剂。经口形式包括但不限于片剂、胶囊剂、丸剂、袋剂、锭剂、滴剂、散剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂。还包括经口迅速释放、控时释放和延迟释放的药物剂型。活性药物组分可以以单一剂型施用或者以单独剂型同时或独立施用。活性药物组分可以在与合
适的药物稀释剂、赋形剂或载体(本文中统称为“载体”)、针对目标施用形式而适当选择的材料的混合物中施用。当所述递送系统用于经口施用并且为片剂或胶囊剂等的形式时，可
将活性药物组分与无毒的可药用惰性载体组合，所述惰性载体例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、改性糖、改性淀粉、甲基纤维素及其衍生物、磷酸氢钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇及其他还原糖和非还原糖、硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂富马酸钠、甘油山嵛酸酯、硬脂酸钙等。对于液体形式的经口施用，可将活性药物组分与无毒的可药用惰性载体例如乙醇、甘油、水等组合。
当期望或需要时，还可向混合物中掺入合适的黏合剂、润滑剂、崩解剂以及着色剂和调味
剂。还可添加稳定剂例如抗氧化剂、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、柠檬酸、焦亚硫酸钙、氢醌和7-羟基香豆素以稳定剂型。其他合适的化合物可包括明胶、甜味剂、天然及合成胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻酸盐)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。

[0058] 可用于这些药物组合物中的其他合适的可药用载体包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、硬脂酸镁、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁)、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。在一些实施方案中，所述可药用载体是硬脂酸镁。普遍接受且使用的另一些药物赋形剂见于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences
(Gennaro，A.编辑，Mack Pub.，1990)中。

[0059] 出于肠胃外施用的目的，可使用在合适油(例如芝麻油或花生油)或水性丙二醇中的溶液剂，以及对应水溶性盐的无菌水溶液剂。如有必要，可对这样的水溶液剂进行适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射的目的。在这方面，所使用的无菌水性介质均可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。使用一定量的活性成分制备各种药物组合物的方法对于本领
域技术人员而言是已知的，或者根据本公开内容将是明显的。美他多辛在人血清中的半衰
期很短。Lu Yuan等(Chin.Med.J 2007 120(2)160-168)显示平均半衰期约为0.8小时。延长活性部分血清水平的方式是通过施用在持续释放制剂中的物质来进行。由于美他多辛可自
由地溶解于水和多种生物流体中，因此难以维持其释放和延长其吸收时间。因此，预料不到可实现持续释放。美他多辛或美他多辛衍生物的控制释放剂型可基于活性成分在生物流体
中的预定逐渐释放，从而产生在长时间内血浆水平小幅波动的持续作用。

[0060] 在某些实施方案中，本发明所使用的递送系统可以以受控释放制剂施用。在某些实施方案中，施用方法将由主治医师或本领域其他技术人员在对对象的情况和要求进行评
价后确定。本发明方法的一个实施方案是以持续释放形式施用本文中所述的治疗性化合
物。本领域普通技术人员已知的任何受控或持续释放方法均可与本发明的组合物和方法一
起使用，例如Langer， Science 249(4976)：1527-33(1990)中所述的那些。这样的方法包括施用持续释放组合物、栓剂或经包被的可植入医疗装置，从而向该方法的对象连续递送治
疗有效剂量的本发明组合物。还可使用设计并配制成用于所述目的的贴剂(patch)来实现
持续释放。本发明的组合物可通过胶囊来递送，其允许药剂一段时间内持续释放。受控释放或持续释放组合物包括在亲脂性库(例如，脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明还包括经聚合物包被的颗粒组合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)。持续释放配方或装置，或者任何局部用
制剂可附加地包含稳定所述组合物或渗透生理屏障(例如皮肤或粘膜)的组分。示例性的附
加组分可包括任何生理学上可接受的去污剂或溶剂例如，如二甲基亚砜(DMSO)。

[0061] 在本发明的所有实施方案中，本发明的方法和用途均可采用配制为单剂量的包含如本发明所限定的盐加合物的组合物。所述单剂量制剂可以是立即释放制剂、爆发式
(burst)制剂、延长释放试剂、持续释放制剂或本领域技术人员已知的任何其他受控释放制剂。

[0062] 在本发明方法和用途的另一些实施方案中，包含本发明限定的盐加合物的组合物可以是其中向对象施用不同类型的制剂的组合剂量制剂，即立即释放制剂、爆发式制剂、延长释放试剂、持续释放试剂或本领域技术人员已知的任何其他受控释放制剂的任意组合，
其以单剂量给予或者以单独剂量独立、伴随或依次给予，其中施用单独剂量之间的时间间
隔基于对象疾病或障碍的病症和严重程度以及所述对象的身体状况确定。

[0063] 在一些实施方案中，本发明方法所使用的组合物配制为组合剂型，其中本发明限定的盐加合物的至少一种剂型为立即释放形式，并且本发明限定的盐加合物(与配制在立
即释放制剂中的盐加合物相同或不同)的至少一种剂型配制为受控(缓慢和/或持续)释放
制剂。在另一些实施方案中，本发明限定的盐加合物在所述至少一种立即释放制剂和至少
一种受控释放制剂中的重量比可以为1∶1、1∶2、2∶1、3∶2、2∶3、1∶3、3∶1、4∶1、1∶4、5∶2、2∶5、1∶5、5∶1。当在本发明的方法或用途中采用这样的组合剂型时，可将上文限定的盐加合物的所述至少一种立即释放形式和至少一种受控释放形式单独、伴随、依次、同时、相继等施用于对象。在一些实施方案中，所述至少一种立即释放形式最先施用。在另一些实施方案中，所述至少一种受控释放制剂最先施用。

[0064] 在某些实施方案中，本发明组合物中的美他多辛或美他多辛衍生物可配制成用于在至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时的时间内持续或受控释放。在某些实施方案中，本发明所使用组合物中的美
他多辛或美他多辛衍生物可配制成用于在约0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时的时间内持续或受控释放。在某些实施方案中，本发明所使用组合物中的美他多辛或美他多辛衍生物可配制成用于在约0.5小时
或1小时或2小时或3小时或4小时至约5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或
12小时的时间内持续或受控释放。在某些实施方案中，本发明所使用组合物中的美他多辛
或美他多辛衍生物可配制成用于在约5小时或6小时或7小时或8小时至约9小时、10小时、11小时或12小时的时间内持续或受控释放。

[0065] 在某些实施方案中，本说明所使用组合物中的美他多辛或美他多辛衍生物可以为立即释放、快速释放或爆发释放形式。

[0066] 在某些实施方案中，本发明所使用组合物中的美他多辛或美他多辛衍生物可配制成在约0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时内释放高达全部美他多辛或美他多辛衍生物的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。在某些实施方案中，本发明所使用组合物中的美他多辛或美他多辛衍生物可配制成在约0.5小时、1小时、
2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时内释放不少于全部美他多辛或美他多辛衍生物的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。

[0067] 在某些实施方案中，本发明所使用组合物中的美他多辛或美他多辛衍生物可以是持续或缓慢释放形式与立即或快速释放形式的组合。在某些实施方案中，持续或缓慢释放
美他多辛或美他多辛衍生物与立即或快速释放美他多辛或美他多辛衍生物的相对比例为
例如1∶99、5∶95、10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶
40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10、95∶5或99∶1。

[0068] 在某些实施方案中，使用聚合物材料来持续或控制美他多辛或美他多辛衍生物的释放。在某些实施方案中，聚合物材料的类型及用量对美他多辛或美他多辛衍生物从本发
明产品释放的速率具有强烈作用。聚合物的实例包括疏水性和亲水性聚合物二者。疏水性
聚合物的实例包括但不限于乙基纤维素及其他纤维素衍生物、脂肪(例如硬脂酸棕榈酸甘
油酯、蜂蜡、糖蜡(glycowax)、蓖麻蜡、棕榈蜡、单硬脂酸甘油酯或硬脂醇)、疏水性聚丙烯酰胺衍生物和疏水性甲基丙烯酸衍生物，以及这些聚合物的混合物。亲水性聚合物包括但不
仅限于亲水性纤维素衍生物例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟乙基甲基纤维素聚乙烯醇)、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚丙烯酸酯、聚氨酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯，以及这些聚合物的混合物。此外，可任选地使用一种或更多种疏水性聚合物与一种或更多种亲水性聚合物的任意混合物。

[0069] 在某些实施方案中，用于本发明组合物中或本发明所使用的聚合物材料为微晶纤维素，例如由FMC BioPolymer生产的“AVICEL PH 101”。

[0070] 在某些实施方案中，用于本发明组合物中或本发明所使用的聚合物材料为羟丙基甲基纤维素，例如由Shin-Etsu Chemical Co生产的“METHOLOSE”。

[0071] 在某些实施方案中，用于本发明组合物中或本发明所使用的聚合物材料为乙基纤维素，例如由Dow Chemical Company生产的“ETHOCELTM”。

[0072] 在某些实施方案中，用于本发明组合物中或本发明所使用的聚合物材料为丙烯酸类聚合物，例如由Rohm GmbH生产的“EUDRAGIT RSTM”。

[0073] 在某些实施方案中，用于本发明组合物中或本发明所使用的聚合物材料为二氧化硅胶体，例如由Degussa生产的“AEROSILTM”。

[0074] 在某些实施方案中，用于本发明组合物中或本发明所使用的聚合物材料为聚乙酸乙烯酯，例如由BASF生产的“KOLLICOAT SR”。

[0075] 在某些实施方案中，用于本发明组合物中或本发明所使用的聚合物材料为乙酸乙酯和乙酸乙烯酯溶液，例如由Delasco Dermatologic Lab&Supply，Inc.生产的“DURO-
TAK”。

[0076] 在某些实施方案中，本发明组合物或本发明所使用的组合物包含约50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg或900mg至约1000mg、
1500mg、2000mg、2500mg或3000mg美他多辛或美他多辛衍生物，或者基本由其组成。在某些实施方案中，本发明组合物或本发明所使用的组合物包含约5mg、100mg、500mg或1000mg至约2000mg、4000mg、10,000mg、15,000mg或20,000mg AVICEL PH 101TM，或者基本由其组成。
在某些实施方案中，本发明组合物或本发明所使用的组合物包含约25mg、50mg、100mg、
150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg或600mg至约650mg、700mg、
750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、5000mg、10,000mg、15,000mg或20000mg聚合物材料，或者基本由其组成。在某些实施方案中，所述聚合物材料为METHOLOSE、ETHOCEL E10TM或EUDRAGIT RSTM。在某些实施方案中，METHOLOSE占或基本上占制剂的1％至90％，优选5％至70％。在某些实施方案中，ETHOCELTM占或基本上占制剂的1％至30％，优选2％至20％。在某些实施方案中，EUDRAGITTM占或基本上占制剂的1％至90％，优选5％至70％。

[0077] 在某些实施方案中，本发明的递送系统或本发明所使用的递送系统包含递送装置。在某些实施方案中，通过渗透方法(例如通过渗透泵)以受控的速率来递送本发明组合
物或本发明所使用的组合物。所述系统可以通过用控速半透膜包被渗透活性剂来构建。这
种膜可包含通过其递送药剂的临界尺寸的孔。该剂型在与水性流体接触之后以由膜的流体
渗透性和核心制剂的渗透压决定的速率吸入水。这种水的渗透吸入导致在核心中形成活性
材料的饱和溶液，其以受控速率从膜中的递送孔分配。

[0078] 在某些实施方案中，使用可降解的微粒来递送本发明组合物或本发明所使用的组合物。在某些实施方案中，制备微粒的体系由以下组成：乳化于水相中的由具有溶解聚合物和待包封材料的挥发性溶剂构成的有机相。在某些实施方案中，可用于微粒基质的可降解
聚合物包括聚乳酸(PLA)或乳酸和乙醇酸的共聚物(PLAGA)。PLAGA聚合物随时间以水解方
式降解为其单体组分，所述单体组分容易通过自然代谢从机体除去。

[0079] 本发明制剂或本发明所使用的制剂还可包含吸收增强剂以及其他任选的组分。吸收增强剂的实例包括但不限于环糊精、磷脂、壳聚糖、DMSO、吐温、Brij、甘胆酸盐、皂苷、梭链孢酸盐和基于能量的吸收增强设备。

[0080] 存在于剂型中的任选组分包括但不限于稀释剂、黏合剂、润滑剂、表面活性剂、着色剂、调味剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂等。

[0081] 稀释剂(也称为“填料”)包括例如：磷酸氢钙二水合物、硫酸钙、乳糖、纤维素、高岭土、甘露醇、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、二氧化硅、胶体二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、滑石、微晶纤维素和糖粉。对于以液体形式施用，稀释剂包括例如乙醇、山梨醇、甘油、水等。

[0082] 黏合剂用于赋予制剂以黏着性能。合适的黏合剂材料包括但不限于淀粉(包括玉米淀粉和预胶凝化淀粉)、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨醇)、聚乙二醇、蜡、天然及合成胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶、藻酸钠、纤维素和硅酸铝镁(Veegum))，以及合成聚合物(例如聚甲基丙烯酸酯和聚乙烯吡咯烷酮)。

[0083] 润滑剂用于促进生产；合适润滑剂的实例包括例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、甘油山嵛酸酯和聚乙二醇。

[0084] 表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子型表面活性剂，其中优选阴离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于与阳离子(例如钠、钾和铵离子)缔合的含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的表面活性剂。特别优选的表面活性剂包括但不限于：
长烷基链磺酸盐和烷基芳基磺酸盐，例如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸盐，例如
二-(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠；以及烷基硫酸盐例如月桂基硫酸钠。

[0085] 稳定剂(例如抗氧化剂)包括但不限于：没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、柠檬酸、焦亚硫酸钙、氢醌和7-羟基香豆素。

[0086] 如果期望的话，本发明组合物或本发明所使用的组合物还可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂等。

[0087] 本发明的任意组合物或本发明所使用的任意组合物可单独使用或者与一种或更多种另外的治疗剂组合使用以用于改善认知行为。另外治疗剂的实例为：安非他命、盐酸哌甲酯、盐酸右哌甲酯、阿托莫西汀、瑞波西汀、氟西汀(fluoxatine)、舍曲林、帕罗西汀、fluoroxamine、西酞普兰、文拉法辛、安非他酮(bupropion)、萘法唑酮和米氮平。

[0088] 可与载体物质组合以产生单一剂型的化合物和另外治疗剂两者的量将根据所治疗的主体和具体施用模式而改变。优选地，本发明的组合物应配制成使得可施用0.1至1g/
kg体重/天，优选0.1至300mg/kg体重的剂量。化合物的剂量取决于患者的病症和病情以及
期望的日剂量。在人治疗中，经口日剂量为10mg至3000mg，或优选100mg至3000mg。例如，所述日剂量为10mg、25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、
600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg、1500mg、1600mg、
1700mg、1800mg、1900mg、2000mg、2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、
2800mg、2900mg或3000mg。这些剂量以单位剂量形式施用，其可以以单日剂量施用或者在某些情况下可每天分为2至3份较小的剂量。

[0089] 在某些实施方案中，本发明的组合物可彼此组合协同作用并且还可在另外治疗剂存在下协同作用。因此，此类组合物中化合物和另外治疗剂的量将小于在仅利用所述治疗
剂的单一治疗中所需的量。在这样的组合物中，可施用0.1至1g/kg体重/天的剂量的另外治疗剂。

[0090] 定义

[0091] 为了方便起见，在此收录了本说明书、实施例和所附实施方案中使用的某些术语。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术
人员通常所理解的相同的含义。

[0092] 本文中使用的没有数量词修饰的名词是指该名词的一个或一个以上(即，至少一个)。例如，“要素”是指一个或一个以上的要素。

[0093] 本文中使用的术语“包括”意指短语“包括但不限于”，并可与其互换使用。

[0094] 除非上下文另有明确指出，否则本文中使用的术语“或/或者”意指术语“和/或”，并可与其互换使用。

[0095] 本文中使用的术语“例如/如”意指短语“例如/如但不限于”，并可与其互换使用。

[0096] 术语“预防性”或“治疗性”治疗是指向对象施用本发明的一种或更多种组合物。如果在不期望的病症(例如宿主动物的临床或其他不期望状态)在临床上显现之前施用所述组合物，则其是预防性的，即其有助于预防(即保护)该对象免于发生不期望的病症；而如果在不期望的病症显现后施用，则该治疗是治疗性的(即其旨在减弱、改善或阻止不期望病症的进展或由此的副作用)。

[0097] 术语“治疗效果”是指动物((特别是哺乳动物，并且更特别是人)中由药理活性物质引起的的局部或全身效应。因此，该术语意指目的是用于在动物或人中诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或者增强期望的身体或智力发展和状况的任何物质。术语“治疗有效量”是指所述物质以适用于任何治疗的合理利益/风险比产生一定期望的局部或全身效应的量。
在某些实施方案中，化合物或组合物的治疗有效量将取决于其治疗指数、溶解度等。例如，本发明的某些美他多辛或美他多辛衍生物制剂可以以足以产生适用于所选治疗的合理利
益/风险比的量来施用，如本领域技术人员可确定的。

[0098] 术语“有效量”是指当以合适的剂量和方案施用于对象时产生至少一种期望结果的治疗剂的量。

[0099] 待通过本发明方法治疗的“对象”或“患者”可意指人或非人动物，优选哺乳动物。本文中使用的术语“对象”可指健康个体或者患有脆性X综合征或自闭症谱系障碍的对象。
在一些替选实施方案中，本文中使用的术语“对象”和“健康个体”以及“有需要的对象”和“有需要的患者”不包括在任意形式的饮酒之后受酒精作用的对象，即酗酒者(嗜酒者)和戒酒的酗酒者。

[0100] 本文中使用的术语“盐加合物”意指涵盖直接加合两个或更多个不同离子的盐产物，其中盐加合物的整体电荷为0。在某些实施方案中，盐加合物包含一个具有单个正电荷官能团的带正电荷部分(即，带正电部分携带有+1净电荷)和一个具有单个负电荷官能团的
带负电荷部分(即，带负电部分携带有-1净电荷)。在某些实施方案中，盐加合物包含一个具有两个带正电荷官能团(其可以是相同或不同的)的带正电荷部分(即，带正电部分携带有+
2净电荷)和两个带负电荷部分，所述负电荷部分可以是相同或不同的并且各自具有单个带
负电荷官能团(即，每个带负电荷部分携带有-1净电荷)。在某些实施方案中，盐加合物包含两个各自具有一个带正电荷官能团(其可以是相同或不同的)的带正电荷部分(即，每个带
正电荷部分携带有+1净电荷)和一个具有两个相同或不同的带负电荷官能团的带负电荷部
分(即，带负电荷部分携带有-2净电荷)。在某些实施方案中，盐加合物包含具有+n净电荷
(来源于一个或更多个带正电荷官能团，其可以是相同或不同的)的带正电荷部分和具有-n
净电荷的带负电荷部分(来源于一个或更多个带负电荷官能团，其可以是相同或不同的)，
其中n是整数，其可等于1、2、3、4、5或6。

[0101] 如本文中所使用的，本发明的“盐加合物的带正电荷部分”为吡哆醇的相应酸，或其衍生物。在某些实施方案中，所述带正电荷部分的正电荷来源于吡哆醇(如例如化合物(2)中)或其任何衍生物(例如式(I)的化合物)的质子化碱性氮原子。在某些实施方案中，带正电荷的吡哆醇衍生物是经例如以下的带正电荷官能团取代的：例如-NH3+、-CH2NH3+、NH2R+、-NHR2+(其中R各自独立地是C1-C6烷基)，在一些实施方案中，所述官能团可与带正电荷的质子化碱性芳族氮原子一起存在于吡啶环中。

[0102] 应理解，本发明盐加合物的部分可各自包含至少一个手性中心，并且因此可以以其任意立体异构体存在并且可作为其任意立体异构体分离，所述立体异构体包括对映体、
非对映体或其任意混合物，包括但不限于外消旋混合物。本发明包括本发明盐加合物的任
何单独部分的任何可能立体异构体(例如对映体、非对映体)、其任意混合物，包括但不限于外消旋混合物。当本文中所述的用于制备本发明盐加合物的各个部分的方法产生立体异构
体的混合物时，可通过常规技术(例如制备型色谱)将这些异构体分离。本发明盐加合物的
部分各自可以以其可能立体异构体的任意混合物(包括但不限于其外消旋混合物)来制备，
或者可通过对映体特异性合成或通过对外消旋物进行手性色谱分离来制备单独的立体异
构体(例如对映体、非对映体)。每当提及氨基酸时，本发明应理解为涵盖天然和非天然氨基酸或其任意衍生物。

[0103] 在本说明书通篇，词语“包含/包括”或变化形式应理解为暗指包括所述整体或整体的组，但不排除任何其他整体或整体的组。

[0104] 术语“生物可利用的”意指体循环中至少存在一定量的特定化合物。经口生物利用率的正规计算根据F值来描述(″Fundamentals of Clinical Pharmacokinetics，″John G.Wegner，Drug Intelligence Publications；Hamilton，Ill.1975)。F值由在静脉内施用之后体循环(例如，血浆)中的母体药物浓度与在通过非静脉内途径(例如经口)施用之后体
循环中的母体药物浓度的比值推导出。因此，在本发明范围内的经口生物利用率涉及在经
口施用之后血浆中可检测的母体药物量相比较于静脉内施用的比值或F值。

[0105] 术语“治疗”是指在哺乳动物(例如人)中缓和、改善、减轻或缓解病症、疾病或障碍的至少一种症状，或者改善与病症、疾病或障碍相关的可确定量度。本文中使用的治疗还涵盖对健康个体的治疗。

[0106] 与美他多辛或美他多辛衍生物有关的术语“可接受的衍生物”指美他多辛的任何盐、缀合物、酯、络合物或其他化学衍生物或者任何包含其的部分，其在施用于对象之后能够(直接或间接地)提供美他多辛或其代谢物或功能性残基，或可测量的美他多辛活性。术
语“生理学上相容的美他多辛衍生物”可在本文中与术语“可接受的衍生物”互换使用，并且指美他多辛的功能性、活性、可药用衍生物。

[0107] 术语“赋形剂”是指在制剂中用作活性成分的载体的无活性物质。

[0108] 术语“受控释放”是指在长时间内以受控速率递送药剂并且设计成获得期望的药剂水平特征的任何制剂。

[0109] 术语“持续释放”以其常规含义使用，指提供在长时间内提供活性物质的逐步释放的制剂，在某些实施方案中，其还可在长时间内产生基本恒定的血液水平，即受控释放。

[0110] 术语“立即释放”以其常规含义使用，指在施用之后提供活性物质的非延迟或受控释放的制剂。

[0111] 术语物质的“半衰期”是指物质失去其一半药理活性、生理活性或其他活性所需的时间。生物学半衰期是重要的药代动力学参数，并且通常用缩写tin.表示。

[0112] 术语“非侵入性”是指不穿刺皮肤的治疗模式。

[0113] 术语“非长期施用”在本文中可与术语“急性施用”互换使用，并且指不定期地向对象给予测量或非测量之量或部分的药物。非长期施用可以是单剂量治疗或多剂量治疗，并且可任选地随时间给予。通常(但不总是)，给予非长期施用来治疗或预防非慢性病症。某些慢性病症也可以受益于本文中所述的美他多辛或美他多辛衍生物组合物的非长期施用。

[0114] 术语“长期施用”是指定期地向对象给予测量之量的药物。在一些实施方案中，长期施用是为了治疗或预防一种或更多种慢性病症、问题或疾病。慢性疾病具有以下一个或更多个特征：它们是持久性的、残留下残疾、由不可逆的病理变化引起、需要对患者进行特殊训练以便康复或者可预期需要长期监护、观察或护理。

[0115] 术语“单剂量治疗”是指一次性给予所需的测量之量的药物。根据个人需求，不定期地给予单剂量治疗以治疗非慢性病症。

[0116] 术语“tmax”是指达到峰值浓度的时间。根据下式计算在单剂量施用之后出现最高浓度时的时间：

[0117]

[0118] 其中λa和λz分别为表观吸收常数和消除速率常数。实施例

[0119] 实施例1：一般性方法

[0120] 本文中所述的实施例是使用下文一般性描述的试剂和方法进行的。

[0121] 实验动物

[0122] Fmr1敲除小鼠(KO2)(The Dutch-Belgium Fragile X Consortium，1994)最初从Jackson Laboratory获得，野生型(WT)同窝小鼠基于C57BL/6J背景产生并且在C57BL/6J背
景上反复回交超过八代。将Fmr1敲除小鼠以相同基因型为组圈养在具有12小时照明/黑暗
循环的温度和湿度受控室内(照明为7am至7pm；测试在照明期进行)。连续记录容纳室内的
室温和湿度，同时食物和水可自由获取。在行为实验期间，对2或6月龄的健康Fmr1敲除小鼠及其野生型同窝小鼠(N＝10小鼠/处理组)进行测试。将小鼠圈养在市售的塑料笼中并根据
UK Animals(Scientific Procedures)Act，1986的要求进行实验。所有实验均由对基因型
和药物处理盲态的实验员进行。在进行任何实验之前，均允许动物具有最短一周的适应期。
在适应期内不施用预防性或治疗性处理。

[0123] 药物

[0124] 对于研究1(实施例2)，将美他多辛溶解于盐水中并以100、150或200mg/kg的剂量每天一次地腹膜内施用7天。对于研究2(实施例3)，在体内测试中，将美他多辛溶解于盐水中并以150mg/kg/天的腹膜内剂量，或者以150或300mg/kg/天(以0.1ml的体积)的经口剂量
每天一次地施用7天。对于研究2，在体外测试中，将美他多辛以300μM的浓度施用5小时。在所有情况下，均使用盐水作为载剂(对照)。

[0125] 行为测试

[0126] 社交相互作用和社交识别记忆：小鼠是社交性物种，其参与容易评分的社交行为，包括接近、跟随、嗅探、梳理、侵略性接触(aggressive encounter)、性互动(sexual interaction)、亲性行为(parental behavior)、筑巢和成群蜷缩睡觉(sleeping in a
group of huddle)。小鼠中的社交接近通过针对新小鼠的嗅探持续时间进行评价。

[0127] 将小鼠置于尺寸与成年小鼠居住笼具有相同数量级并且地面上具有新鲜木屑的测试场地/笼中(40×23×12cm笼，具有有机玻璃盖以有利于观察小鼠)。背景小鼠气味通过
在测试之前在设备中放入一些非实验小鼠产生。在测试前10至15分钟，将小鼠转移至实验
室。将受试对象和幼仔同时置于测试笼中。评估社交研究的总持续时间和回合(bout)数3分钟，其限定为在受试小鼠对刺激幼仔的嗅探和亲密跟随(距离尾部＜2cm)。30分钟之后，使用相同的刺激幼仔来重复测试。收集的数据参数为用于获取和识别的嗅探回合的总持续时
间和总次数。推导出社交记忆率(social memory ratio)，其定义为试验2/试验1+2。因此，无记忆(例如，20/(20+20)＝0.5，记忆(例如，10/(20+10)＝＜0.5。

[0128] Y形迷宫交替：进行两个任务。第一个任务是对臂进入之间的自发交替进行非学习性评估。第二个任务是空间参考记忆任务，其中动物必须学习记住两个臂中哪一个装有食
物奖励诱饵。在开始训练前的当天，允许动物自由探索迷宫5分钟。接着，使其接受两个试验，在一个试验中，将食物放置在左臂，在一个试验中将食物定位在右臂。该操作防止发生偏向一个臂。

[0129] Y形迷宫水迷宫：透明的有机玻璃Y形迷宫填充有2cm的20℃水。这促使小鼠在趟水至一个臂远端的出口管后离开迷宫。将迷宫放置在突出视觉提示围绕的室的中间。

[0130] 奖励性T形迷宫交替：使用T形式(水平放置时)的升高或封闭设备。将小鼠放置在T的底部并允许其选择邻接主干臂(stem)另一端的一个目标臂。快速连续地进行两个试验，
第二个试验要求小鼠选择之前未访问过的臂，反映对第一次选择的记忆(自发交替)。如果
其交替选择的话，则通过使动物饥饿并用偏爱的食物对其进行奖励来增强这一倾向。特别
地，在T形迷宫上的4天适应期之后，训练小鼠交替臂选择以接受甜炼乳作为奖励。

[0131] 连续通道：该设备由4个连续的、线性排列的、致焦虑作用递增的通道组成(每个后面的通道均涂成较浅的颜色、具有较低的壁和/或比前面的通道窄)，所述通道由涂漆的木材制成。每个部分或通道的长度为25cm。通道1具有25cm高的壁，宽度为8.5cm并且涂成黑
色。0.5cm的步降(step down)导向通道2，其宽度也为8.5cm但是具有1.3cm高的壁并且为灰色。1.0cm的步降导向通道3，其宽度为3.5cm、具有0.8cm高的壁并且为白色。0.4cm的步降导向通道4，其也为白色但是宽度为1.2cm，并且具有0.2cm高的壁。通过将通道1的背面锚定至
50cm高的台子升高设备。在臂3和4下方提供有垫料以防小鼠跌落。将每只小鼠放置在通道1的封闭端，面向壁。针对以下启动计时器：1)测试的总时长(5分钟)+进入每个壁的潜伏期，和2)在通道1中花费的时间。当小鼠将四肢全部放到下一个通道时，认为其已进入该通道。
记录在每个通道中(四肢全部)花费的总时间。

[0132] 场景恐惧条件反射：在恐惧条件反射实验中，将小鼠放置在新环境(暗室)中并使其接受成对的暗示和足电击(0.2mA持续1秒(研究1)或者0.7mA持续0.5秒(研究2))。随后，
当在初始训练情境中测试时，小鼠表现出称为凝滞(freezing)(Blanchard，1969)的自然防御反应或场景恐惧条件反射。凝滞时间限定为小鼠在除呼吸之外的不活动行为中花费的时
间。数据表示为测试时间的百分比。在训练期后24小时，在不提供电击下在训练室内对小鼠测试5分钟，并且观察凝滞行为。

[0133] 绕计学：采用多元方差分析来评估数据上的组差异。对行为数据进行重复测量ANOVA。在每个ANOVA中的统计学显著性作用之后使用Newman-Keuls检验(研究1)或Tukey检
验(研究2)进行事后比较。认为小于0.05的p值是显著的。

[0134] 生化测试：

[0135] 磷酸化ERK和Akt：Ras-Mek-ERK和PI3K-Akt-mToR信号传导途径参与介导突触可塑性潜在变化的基因转录的活性依赖性改变(Klann和Dever，2004)。如Lopez Verrilli
(Lopez Verrilli等，2009)先前所述通过western印迹分析测量磷酸化ERK和Akt蛋白的表
达。所采用的抗体为针对Akt(1/1000)和激酶(ERK)1/2(1/2000)的抗磷酸特异性抗体(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)。针对磷酸-ERK的抗体检测磷酸-ERK1/2的磷酸化(Thr202/Tyr204)而针对磷酸-Akt的抗体检测磷酸-Akt的磷酸化(Thr308)。Akt和ERK 1/
2蛋白总含量以及磷酸化的ERK和Akt通过具有抗磷酸-Akt(1/1000)和抗磷酸-ERK抗体(1/
2000)(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)的印迹膜进行评价。Akt或ERK磷酸化根据同一样品中的蛋白质含量进行归一化并表示为相对于基础条件的变化％，认为基础
水平为100％。如下评价蛋白质负载：剥离膜并用β-肌动蛋白抗体(1/1000)(Sigma-
Aldrich，St.Louis，MO，USA)重新印迹膜。血液淋巴细胞中的磷酸化ERK和Akt蛋白表达通过流式细胞术测量。对于淋巴细胞生物标志物测定，使用激发激光调节在488nm的FACStar
plus(Becton Dickinson)，并通过515nm至545nm的带通滤波器收集来自FITC的绿色荧光
(GST)。平均FITC荧光强度相对于参照细胞的荧光进行计算。平均细胞荧光强度(mean
cellular fluorescence intensity，MFI)与每个细胞所结合的Ab分子的平均数量成正比。

[0136] 神经元形态：海马细胞培养物由在妊娠17.5的胚胎日(E17.5)的野生型和Fmr1KO胎儿小鼠制备。通过颈脱位处死小鼠并将经解离的海马细胞铺在15mm的多孔容器(Falcon
Primaria)中。在体外5天后，转染绿色荧光蛋白(GFP)以有利于在药物处理之后监测树突棘形态发生(Ethell和Yamaguchi，1999；Ethell等，2001；Henkemeyer等，2003)。在体外约16天(DIV)时形成树突棘。在第17天，用300μM浓度的美他多辛体外处理培养物5小时。

[0137] 经GFP转染的神经元的丝足密度通过对叠加蔡司透镜(Zeiss)的共焦生成图像(40×物镜，20×0.2μm的叠加)进行Sholl分析来量化。使用Metamorph 软件，在每个神经元的细胞体周围画等距的同心圆(每20μm)，随后对每个圆的丝足数量进行计数。使用未配对的双尾Student T检验对计数的平均值进行比较。

[0138] 经GFP转染的神经元的棘成熟度使用Metamorph软件(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)进行分析。每个神经元选择两个70μm至100μm的远端树突节段以用于进行棘形态测定分析。对于每个棘，对长度和宽度进行测量。将长度定义为从突出底部到突出末端的距离；而将宽度定义为垂直于棘长轴的最大距离。用已校正为用于多重比较的未配对的
双尾Student T检验和ANOVA对测量结果进行比较。

[0139] 海马蛋白从头合成：横向海马切片(400μm)获自6周大的Fmr1敲除和WT小鼠。蛋白质合成测定如先前所述使用基于非放射性荧光激活细胞分选的测定(翻译的表面感测
(surface sensing of translation，SUnSET)方法)进行，其允许在单独哺乳动物细胞和异质细胞群中监测并量化整体蛋白质合成(Hoeffer，2011)。本研究中所使用的美他多辛浓度为300μM。

[0140] 实施例2：在脆性X综合征的Fmr1敲除小鼠模型中，美他多辛(100至200mg/kg)处理对学习和记忆缺陷以及生化异常的作用(研究1)

[0141] 行为分析

[0142] 场景恐惧条件反射：初始实验在N＝10WT和Fmr1敲除小鼠的组中测试每天一次地腹膜内施用载剂或150mg/kg美他多辛7天对场景恐惧条件反射的作用。如在测试期期间凝
滞降低所反映的，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠在场景恐惧条件反射模式中表现出学习方面
的缺陷(图1，图A(p＜0.0001))。美他多辛施用在Fmr1敲除小鼠中逆转学习缺陷作用，这种逆转是部分的，使得经美他多辛处理的动物与经美他多辛处理的WT动物具有差异(p＜
0.05)。在N＝10WT和Fmr1敲除小鼠的组中重复该实验来研究每天一次地腹膜内施用载剂、
100或200mg/kg美他多辛7天对场景恐惧条件反射的剂量依赖性作用(图1，图B和图C)。在该实验中，与经载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出学习缺陷(p＜
0.0001)，复现第一实验。100mg/kg美他多辛在Fmr1敲除小鼠中产生缺陷逆转(P＜0.05)，但是这是部分逆转，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的野生型小鼠具
有差异(p＜0.0001)。在用200mg/kg i.p.美他多辛处理之后，在Fmr1敲除小鼠中观察到的
学习缺陷完全逆转(经处理的Fmr1小鼠与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠具有差异(P＜
0.0001)，但是与经美他多辛处理的WT小鼠并无差异)。在任一实验中，美他多辛处理对WT小鼠均无作用(图1，图A-C)。

[0143] 社交接近：如嗅探回合所指示的，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出较差的社交接近(图2(p＜0.0001))。用150mg/kg美他多辛每天一次地腹膜内处理7天在Fmr1敲除小鼠
中提高社交接近(p＜0.0001，相比较于经载剂处理的Fmr1敲除小鼠)。经美他多辛处理的
Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠具有差异(p＜0.05)，但是具有接近WT小鼠的效
应的趋势。美他多辛处理对WT小鼠无作用。

[0144] Y形迷宫自发交替：图3，图A中示出了在N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对自发交替的作用。与经载剂处理的WT小鼠相
比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出较差的自发交替(p＜0.0001)。在Fmr1敲除小鼠中，与载剂处理相比，美他多辛处理提高自发交替(p＜0.0001)，但是相比较于经美他多辛处理的WT小鼠，经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠仍表现出缺陷(p＜0.01)。因此，美他多辛产生在Fmr1敲除小鼠中观察到的缺陷部分逆转。

[0145] Y形迷宫参考记忆任务：图3，图B中示出了在N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对奖励性参考记忆学习的作用。与经载剂
处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出较不适当的臂进入(p＜0.0001)。与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠相比，美他多辛处理降低这一缺陷(p＜0.0001)，使得经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠并无差异。美他多辛处理对WT小鼠无作
用。

[0146] Y形迷宫水迷宫左右辨别：图3，图C中示出了在N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对厌恶性激发空间辨别学习的作用。与
经载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠显示出较高的不正确臂进入次数。
通过用美他多辛处理，这一缺陷得到降低。

[0147] T形迷宫奖励性交替任务：图4中示出了在N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对奖励性交替工作记忆的作用。与经载剂处
理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出较长的到达正确臂的潜伏期(p＜
0.0001)。在Fmr1敲除小鼠中，与载剂处理相比，美他多辛处理降低这一缺陷(p＜0.0001)，这种逆转是部分的，因为相比较于WT小鼠，经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠响应较慢(p＜
0.0001)。

[0148] 连续通道：N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对在连续通道任务中的表现的作用示于图5中，并且在下文进行了进一步描
述。

[0149] 连续通道测试有效地测量焦虑(进入通道1的潜伏期)和活动过度(通道2至4)。从通道1到通道2、3和4的进展与对颜色逐渐明亮的环境暴露有关，所述环境具有越来越低的
壁和越来越窄的更加暴露的开放臂。时间花费在开放臂上并且进入开放臂指示焦虑；反之，在更多的开放臂中花费更久的时间反映活动过度。这些因素允许进行涵盖一系列焦虑样表
现以及活动过度的敏感性测试。

[0150] 通道1：与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠表现得较为焦虑(p＜0.001)。与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠相比，经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠表现出焦虑方面的改善(p＜
0.001)，使得发生完全正常化。经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小
鼠之间不存在差异。此外，美他多辛处理对WT小鼠并无作用。

[0151] 通道2：当与Fmr1敲除小鼠相比时，WT小鼠在通道2中表现得较不活跃(p＜0.0001)。在Fmr1敲除小鼠中，美他多辛处理降低活动过度(p＜0.001)，但是活动过度的这种逆转是部分的，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠和WT小鼠具有差异(p＜0.001)。美
他多辛处理对WT小鼠并无作用。

[0152] 通道3：与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠表现出活动过度(p＜0.0001)。这种活动过度不能通过美他多辛逆转，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠并无差异。美他多辛处理对WT小鼠并无作用。

[0153] 通道4：与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠表现出活动过度(p＜0.01)。美他多辛处理逆转这种活动过度，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠相比较于与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现得较不活跃。该作用反应了正常化，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美
他多辛处理的WT小鼠并无差异。美他多辛处理对WT小鼠并无作用。

[0154] 总之，不期望受理论的限制，连续通道测试显示，与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠的焦虑和活动过度增加。美他多辛处理在Fmr1敲除小鼠中降低这种焦虑和活动过度，而对WT小鼠并无作用。

[0155] 生化分析

[0156] ERK和Akt的磷酸化：图6中示出了在N＝5Fmr1敲除或WT小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次腹膜内处理对脑中ERK和Akt的整体脑磷酸化的作
用。磷酸化水平以磷酸化ERK与总ERK的比率进行评估。该比率增加表示ERK被活化。与载剂对照相比，在经载剂处理的Fmr1敲除中ERK的磷酸化增加(p＜0.001)，这一效应复现在患有脆性X综合征的人对象中观察到的异常ERK活化(Wang等，2012)。美他多辛处理降低了这一
效应(p＜0.01)，使得相比较于经美他多辛处理的WT小鼠并无差异。美他多辛对WT小鼠中的ERK磷酸化或任何小鼠中的总ERK水平无作用。与经载剂处理的WT小鼠相比，在经载剂处理
的Fmr1敲除小鼠中磷酸化Akt与总AKT的比率也增加(p＜0.0001)。在Fmr1敲除小鼠中，用美他多辛处理降低磷酸化Akt的相对水平(p＜0.01)，使得Fmr1敲除小鼠与对照并无差异。美
他多辛处理对WT小鼠或任何小鼠的总Akt水平并无作用。

[0157] 实施例3.在Fmr1敲除脆性X小鼠模型中对美他多辛的评价(研究2)美他多辛在6月龄Fmr1敲除小鼠中的行为作用

[0158] 场景恐惧条件反射：初始实验在N＝10WT和Fmr1敲除6月龄小鼠的组中测试每天一次地腹膜内施用载剂或150mg/kg美他多辛7天对场景恐惧条件反射的作用。如在测试期期
间凝滞降低所反映的，与经载剂处理的WT小鼠(WT-V)相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠
(KO-V)在场景恐惧条件反射模式中表现出学习方面的缺陷(图7(p＜0.0001))。在Fmr1敲除
小鼠中，美他多辛施用逆转学习缺陷效应(p＜0.0001，KO-M-150相对于KO-V)。这是完全逆转，使得经美他多辛处理的KO小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。

[0159] 社交接近和社交记忆：社交接近数据(初始试验1)示于图8，图A(嗅探回合次数)和图C(嗅探持续时间)中。社交记忆数据(试验2，试验1后24小时)示于图8，图B(嗅探回合次
数)和图D(嗅探持续时间)中。这些结果在下文进一步讨论。

[0160] 在试验1期间，与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠显示嗅探回合次数增加(p＜0.0001)(参见图8，图A)而嗅探持续时间降低(p＜0.0001)(参见图8，图C)。这些社交相互作用缺陷与其他研究者对Fmr1敲除小鼠的报道的那些(Thomas等，2011)一致。对于嗅探回合次数和
持续时间两者，使用美他多辛进行处理产生Fmr1敲除小鼠中的异常的逆转(均为p＜
0.0001，KO-M-150相对于KO-V)，使得经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠在嗅探回合次数量度方面没有差异。同时，显示嗅探持续时间量度有所补救，但是这种效应是部分的，因为Fmr1敲除小鼠在美他多辛处理之后与WT小鼠相比仍具有差异(p＜
0.05)。美他多辛对WT小鼠并无作用。这些数据表明，美他多辛补救Fmr1敲除小鼠中的异常社交接近行为。

[0161] 在试验2期间，与野生型小鼠相比，Fmr1敲除小鼠显示嗅探回合次数增加并且嗅探持续时间增加(对于每个量度而言，p＜0.0001；分别为图8，图B和图D)。这反映适应失败，并且因此反映出社交记忆缺陷。美他多辛处理降低了这些差异(p＜0.0001，KO-M-150相对于
KO-V)。对嗅探回合次数的逆转是部分的，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠和经美他多辛处理的WT小鼠之间仍存在差异(p＜0.05)。通过美他多辛的逆转对嗅探持续时间而言是
完全的，因为在经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠和经美他多辛处理的WT小鼠之间并未观察
到差异。美他多辛对WT小鼠没有作用。这些数据表明，美他多辛在Fmr1敲除小鼠中降低社交记忆受损。下面通过社交记忆率(在实施例1中进行了描述)的计算来对社交记忆缺陷的这
种降低进行举例说明：

[0162] 社交记忆率定义为嗅探回合的持续时间：试验2/试验1+2。因此，无记忆的一个实例为(例如20/(20+20)＝0.5，而记忆的一个实例为(例如10/(20+10)＝＜0.5。

[0163] 计算的社交记忆率如下：

[0164] WT-V试验2/试验1+试验2：12.4/12.4+26.8＝0.3，＜0.5记忆

[0165] KO-V试验2/试验1+试验2：325/325+24.1＝0.9，无记忆

[0166] WT-M试验2/试验1+试验2：12.5/38.5+12.5＝0.2，＜0.5无记忆

[0167] KO-M试验2/试验1+试验2：12.7/28.4+12.7＝0.3，＜0.5记忆。

[0168] 美他多辛在6月龄Fmr1敲除小鼠中的生化作用

[0169] 继上述行为测试之后，图9中示出了在N＝10Fmr1敲除或WT小鼠中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次ip处理对脑中的整体脑pERK(图9，图A)和pAkt(图9，图B)的作用。具体地，图9，图A示出了pAkt的脑水平，如在之前的实验中所观察到的，相比较于WT小鼠，在Fmr1敲除小鼠中pAkt的脑水平增加(P＜0.0001)。使用美他多辛进行处理逆转了脑
pAkt的这一增加(p＜0.0001，KO-M-150相对于KO-V)，使得经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。图9，图B示出了pERK的脑水平，如在之前实验中所观察到的，相比较于WT小鼠，在Fmr1敲除小鼠中pERK的脑水平增加(p＜0.0001，KO-M-150相对于KO-V)。美他多辛处理逆转了这一增加(p＜0.0001)，使得经美他多辛处理的Fmr1敲除小
鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。

[0170] 美他多辛在腹膜内或经口施用之后对2月龄小鼠的行为的作用

[0171] 图10示出了在2月龄Fmr1敲除和WT小鼠中以150mg/kg ip或者150和300mg/kg经口的剂量每日一次地施用美他多辛7天对场景恐惧条件反射的作用。具体地，图10，图A示出了来自用载剂ip和经口处理后的Fmr1敲除和WT小鼠的场景恐惧条件反射数据。对于载剂的施
用途径来说，不存在差异。在通过ip和经口途径进行载剂处理之后，相比较于WT小鼠，Fmr1敲除小鼠显示了凝滞行为的降低(在任一情况下，p＜0.0001)。图10，图B示出了通过两种施用途径进行美他多辛处理在WT小鼠中的作用。未观察到作用。图10，图C显示，Fmr1敲除小鼠中的ip 150mg/kg以及经口150和300mg/kg美他多辛处理逆转了在Fmr1敲除小鼠中所观察
到的凝滞行为减轻(分别为p＜0.01、p＜0.0001和p＜0.0001，针对KO-M-ip、KO-M-po150和KO-M-po 300相对于KO-V-ip和KO-V po)。施用150mg po美他多辛的作用与施用300mg/kg
po美他多辛的作用没有差异。在Fmr1敲除小鼠中，150和300mg/kg经口美他多辛的作用与
150mg/kg ip美他多辛的作用没有差异。在任一情况下，逆转都是完全的，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。

[0172] 图11示出了在Fmr1敲除和WT小鼠中以150mg/kg ip或者150和300mg/kg经口的剂量每日一次地施用美他多辛7天对社交接近和社交记忆的作用。具体地，图11，图A示出了
Fmr1敲除或WT小鼠中载剂或者150mg/kg ip或150和300mg/kg经口的美他多辛对社交接近
行为的作用。在用载剂进行ip或经口处理之后，与WT小鼠相比，在Fmr1敲除小鼠中嗅探行为的持续时间缩短(均为p＜0.0001)。任意剂量的美他多辛处理对WT小鼠均无作用。然而，
150mg/kg ip、150mg/kg和300mg/kg经口的美他多辛处理产生Fmr1敲除小鼠中所观察到的
社交接近缺陷逆转(分别为p＜0.0001，针对KO-M-po 150和KO-M-po 300相对于KO-V po)。
经口美他多辛的作用在150mg/kg和300mg/kg之间不是剂量依赖性的。这种逆转是完全的，
因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。在Fmr1敲除小
鼠中，150mg/kg ip美他多辛的作用与150mg/kg经口或300mg/kg经口美他多辛的作用没有
差异。图11，图B示出了Fmr1敲除或WT小鼠中载剂或者150mg/kg ip或150和300mg/kg经口的美他多辛对社交记忆的作用。在用载剂进行ip或经口处理之后，与WT小鼠相比，在Fmr1敲除小鼠中嗅探行为的持续时间延长(均为p＜0.0001)。任意剂量的美他多辛处理对WT小鼠均
无作用。然而，150mg/kg ip、150mg/kg经口和300mg/kg经口的美他多辛处理产生Fmr1敲除小鼠中所观察到的社交接近缺陷逆转(分别为p＜0.0001、＜0.05和p＜0.01，针对KO-M-ip
150、O-M-po 50和KO-M-po 300相对于KO-V-ip和KO-V po)。这种逆转是完全的，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。在Fmr1敲除小鼠中，
150mg/kg ip美他多辛的作用与150mg/kg经口或300mg/kg经口美他多辛的作用没有差异。
此外，经口美他多辛处理的作用在150mg/kg和300mg/kg之间不存在剂量依赖性。

[0173] 在2月龄小鼠中美他多辛在腹膜内或经口施用之后对生化标志物的作用

[0174] 外周淋巴细胞：图12示出了如通过流式细胞术所测量的，在2月龄Fmr1敲除和WT小鼠中以150mg/kg ip或150mg/kg和300mg/kg经口的剂量每天一次地施用美他多辛7天对淋
巴细胞pAkt(图12，图A)和pERK(图12，图B)的作用。具体地，图12，图A显示：与接受等量载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出增加的淋巴细胞Akt磷酸化(p＜
0.0001，针对ip和经口施用两者)。用美他多辛以150mg/kg ip或者150mg/kg或300mg/kg的
经口剂量每天一次地处理7天使过度活化的Akt正常化，使得pAkt水平在经美他多辛处理的
Fmr1敲除小鼠和接受相同处理的WT小鼠之间没有差异。图12，图B显示：与接受等量载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出增加的淋巴细胞ERK磷酸化(p＜
0.0001，针对ip和经口施用两者)。用美他多辛以150mg/kg ip或者150mg/kg或300mg/kg的
经口剂量每天一次地处理7天使过度活化的ERK正常化，使得pERK水平在经美他多辛处理的
Fmr1敲除小鼠和接受相同处理的WT小鼠之间没有差异。

[0175] 脑区域：图13示出了施用150mg/kg美他多辛7天对海马、前额皮质和纹状体中的pERK水平的作用。在所有三个脑区域中，相比较于WT小鼠，在Fmr1敲除小鼠中pERK水平均提高(在所有情况下，p＜0.0001)。与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠相比，在经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠中pERK水平降低(在所有情况下，p＜0.0001)。KO-M和WT-M组之间在海马和纹状体中没有差异，表明ERK活化的完全逆转。在前额皮质中的作用是部分的，KO-V和KO-M组保持不同(p＜0.05)。美他多辛对WT小鼠并无作用。

[0176] 图14示出了施用150mg/kg美他多辛7天对海马、前额皮质和纹状体中的pAkt水平的作用。在所有三个脑区域中，相比较于WT小鼠，在Fmr1敲除小鼠中pAkt水平均提高(在所有情况下，p＜0.0001)。在所有三个脑区域中，与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠相比，在经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠中pAkt水平均降低(在所有情况下，p＜0.0001)。在所有情况
下，KO-M和WT-M组之间均没有差异，表明Akt活化的完全逆转。美他多辛对WT小鼠并无作用。
脑和血液高水平的磷酸化ERT和Akt的降低与Fmr1敲除小鼠的行为改善结果有关，表明磷酸
化水平是美他多辛处理响应的生物标志。

[0177] 美他多辛对来自Fmr1敲除小鼠之原代海马神经元中的树突丝足密度和成熟的体外作用。

[0178] 图15(图A至C)示出了用300μM美他多辛处理5小时的作用。将树突分成10个10μm的节段，每个均基于离胞体的距离(近端至远端，从左到右)。在节段3中，与来自WT小鼠的神经元相比，在来自Fmr1敲除小鼠的神经元中棘密度增加。具体地，图15，图A示出了神经元丝足的密度。来自Fmr1敲除小鼠的原代海马神经元显示丝足密度增加(p＜0.001)。用300μM美他多辛处理在Fmr1敲除小鼠中降低了神经元丝足密度的异常增加(p＜0.001)。来自Fmr1敲除小鼠的神经元示出具有不成熟特征的较长(图15，图B(p＜0.01))和较窄(图15，图C(p＜
0.01))的丝足。用美他多辛处理逆转丝足长度的这种增加(图15，图B(p＜0.01))并且逆转
宽度的减小(图15，图C(p＜0.01))。

[0179] 美他多辛对Fmr1敲除小鼠中的海马蛋白质从头合成的体外作用

[0180] 图16示出了来自Fmr1敲除或WT小鼠的400μM海马切片中用载剂或300μM美他多辛处理对蛋白质基础从头合成的作用。与经载剂处理的WT对照海马相比，在经载剂处理的来
自Fmr1敲除小鼠的海马中蛋白质合成较高(p＜0.0001)。在Fmr1敲除小鼠的海马中，美他多辛处理降低了蛋白质合成速率。这种作用是部分的，因为来自Fmr1敲除小鼠的海马相比较
于经美他多辛处理之来自WT小鼠的海马保持较高的蛋白质合成速率(p＜0.001)。

[0181]

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