新旋素:抗微生物肽
专利汇可以提供新旋素:抗微生物肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且新旋素肽是一类抗 微 生物 剂，它们具有有效的抗革兰氏阴性菌活性。这些肽是非溶血性的，与其它抗微生物肽相比，在体外具有减少的细胞毒性，并且在体内在静脉注射后具有很好的耐受性。新旋素还结合脂多糖(LPS)，这是个可减轻与革兰氏阴性菌感染相关的症状的特征。将含有作为活性剂的新旋素的药物组合物给予受到或者易受微生物感染(尤其是革兰氏阴性菌感染)的患者。，下面是新旋素:抗微生物肽专利的具体信息内容。
1.一种抗微生物多肽，其特征在于，它包含SEQ ID NO：1的序列 KNLRRX1X2RKX3X4HIIKKYG，
其中，X1、X2、X3和X4独立选自D或L型的甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸和异 亮氨酸，条件是不超过3个X残基是异亮氨酸。
2.如权利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4 独立选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸和异亮氨酸，条件是不超过3个X残基是异亮 氨酸。
3.如权利要求2所述的抗微生物肽，其特征在于，X1、X2、X3和X4中仅有 一个选自甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
4.如权利要求3所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含SEQ ID NO：3 到SEQ ID NO：37中任一条的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽主要由SEQ ID NO：3 到SEQ ID NO：37中任一条的氨基酸序列组成。
6.如权利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽的羧基末端被酰 胺化。
7.一种抗微生物制剂，其特征在于，它含有：
一种抗微生物肽，该肽包含SEQ ID NO：1的序列 KNLRRX1X2RKX3X4HIIKKYG；
其中，X1、X2、X3和X4独立选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬 氨酸、异亮氨酸、D-丙氨酸和D-异亮氨酸，条件是不超过3个X残基是异亮氨 酸；
一种药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的抗微生物制剂，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4 独立选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸和异亮氨酸，条件是不超过3个X残基是异亮 氨酸。
9.如权利要求8所述的抗微生物制剂，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4 中仅有一个选自甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
10.如权利要求9所述的抗微生物制剂，其特征在于，所述肽包含SEQ ID NO：3 到SEQ ID NO：37中任一条的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽主要由SEQ ID NO：3到SEQ ID NO：37中任一条的氨基酸序列组成。
12.如权利要求7所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽的羧基末端被酰 胺化。
13.如权利要求7所述的抗微生物制剂，其特征在于，所述药学上可接受的 载体包含螯合剂。
14.如权利要求13所述的抗微生物制剂，其特征在于，所述螯合剂是柠檬 酸。
15.如权利要求7所述的抗微生物制剂，其特征在于，所述制剂还含有第二 抗微生物剂。
16.如权利要求15所述的抗微生物制剂，其特征在于，所述第二抗微生物 剂是抗生素。
17.如权利要求7所述的抗微生物制剂，其特征在于，所述制剂适合用于以 气溶胶方式传送所述抗微生物肽。
18.一种治疗微生物传染的方法，其特征在于，该方法包括：
使微生物种群与包含序列SEQ ID NO：1的抗微生物多肽结合，SEQ ID NO：1 的序列为KNLRRX1X2RKX3X4HIIKKYG；
其中，X1、X2、X3和X4独立选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬 氨酸、异亮氨酸、D-丙氨酸和D-异亮氨酸，条件是不超过3个X残基是异亮氨 酸。
19.如权利要求18所述的抗微生物肽，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4 独立选自甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸和异亮氨酸，条件是不超过3个X残基是异亮 氨酸。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4中仅 有一个选自甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
21.如权利要求20所述的抗微生物制剂，其特征在于，所述肽包含SEQ ID NO：3到SEQ ID NO：37中任一条的氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽主要由SEQ ID NO：3到SEQ ID NO：37中任一条的氨基酸序列组成。
23.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述微生物种群包含革兰氏 阴性菌。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阴性菌选自绿脓 杆菌、砂眼衣原体、大肠杆菌和金黄色葡糖球菌。
25.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述肽的羧基末端被酰胺化。
26.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述肽在含有螯合剂的药学 上可接受的载体中配制。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述螯合剂是柠檬酸。
背景
有效的抗微生物剂的发展一度是治疗细菌疾病的决定性因素。但是，即使在 开发出第一种抗生素之前，就已证明细菌具有适应环境压力、从而发展抗性的能 力。近年来，随着已产生抗性的致病微生物的增加，各种抗微生物剂也大量增加。 现在认识到，抗性是针对所有临床上使用的抗微生物剂而产生的。医学界对抗生 物素抗性的反应是，使用先前未使用的新的或者别的抗生素来抵抗已产生抗性的 细菌。这些方法需要不断地开发出新的抗生素，而不管这种新的抗生素是对目前 存在的化合物的修饰而得到，还是这些新抗生素是那些可抑制或者回避细菌抗性 机制的化合物的组合。
已在许多不同的动物和昆虫种类中发现天然的多阳离子抗生素肽，并且这些 肽已显示出广谱抗微生物活性。在哺乳动物中，这些抗微生物肽主要由两类代表， 一类是防卫素，另一类是卡瑟利次定(cathelicidins)。几乎所有的这些肽都具有膜 亲和力，并可渗透细菌膜，使其产生渗透性，结果导致该微生物损伤、裂解和/或 死亡。例如，人的称为α-防卫素的肽由嗜中性白细胞和肠帕内特细胞产生。在其 三维结构中，防卫素是两性分子，大部分是β-折叠结构，具有一个极性表面，该 表面主要由它的精氨酸形成，其N末端和C末端残基在防御抗微生物能力和领域 中起重要的作用〔参见Gudmundsson等(1999)，《免疫方法杂志》(J Immunol Methods)，232(1-)：45-54〕。Hancock和Lehrer在《生物技术发展趋势》(Trends in Biotechnology，1998，16：82)中综合阐述了抗微生物肽。
囊性纤维化(Cystic fibrosis，CF)是一种遗传病，美国每3,300个新生儿中就 有1个患有这种疾病。现在它使大约30,000人受到影响。CF患者的平均寿命仅 为31.3岁，因而是美国最常见的使寿命缩短的遗传病。大多数CF患者死于呼吸 衰竭，这种肺衰竭产生于长期的、渐进性的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)感 染；绿脓杆菌是一种革兰氏阴性菌，广泛分布在环境之中。绿脓杆菌感染正常个 体的能力有限，但是它可在免疫妥协的、严重烧伤的或者经抗生素处理的人中成 为摧毁性的次级入侵者。由于绿脓杆菌染色对于常规的抗生素常常是耐药的，或 者常常产生耐药性，所有由它们引起的感染一般都难以消除。
已测试了许多抗微生物肽抗绿脓杆菌的临床分离物的体外活性，这些抗微生 物肽包括天蚕抗菌肽P1(cecropin P1)、吲哚里茨啶(indolicidin)、马加宁II、乳链 菌肽和兰那雷辛(ranalexin)。已发现，这些肽的抑制值的范围不同，当它们与常规 抗生素组合时，显示出一定的协同效果〔Giacometti等(1999)，《抗微生物化学治 疗剂杂志》(J Antimicrob Chemother.)，44(5)：641-5〕。
临床上仍需要新颖的抗生素制剂，这些制剂对具有药物抗性的革兰氏阴性菌 有效，并对哺乳动物细胞的毒性低。本发明满足这些要求。
发明概要
提供使用新旋素(novispirin)肽的方法和组合物。新旋素肽是小的抗微生物剂， 它们具有抵抗包括沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、绿脓杆菌、大肠杆菌 (Escherichia coli)和嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)在内的革兰 氏阴性菌的潜在活性。这些肽是非溶血性的，与其它抗微生物肽相比，其体外的 细胞毒性减少，并且在体内在静脉注射后具有很好的耐受性。新旋素对生长期和 稳定期的绿脓杆菌非常有效，它们在高盐浓度或者人的血清中保留着活性。新旋 素还与脂多糖(LPS)结合，这是一种可减缓革兰氏阴性菌感染相关的症状的特性。
将含有作为活性剂的新旋素的药物组合物给予受微生物感染(尤其是细菌感染) 的患者。该蛋白质在体外也有效地杀死各种微生物体。可单独给予新旋素，或者 使其与其它杀菌剂(如抗生素)组合，作为有效肽的混合物给予，等等。也可将新 旋素介导的微生物的杀伤用于建模和筛选新颖抗生素。
附图的简短说明
图1A和1B显示卵旋素(ovispirin)和代表性的新旋素抗两种革兰氏阴性菌的 相对活性。
图2显示抗微生物肽抗绿脓杆菌的动力学。
图3显示抗微生物肽抗人红细胞的溶血活性。
图4A、4B和4C显示抗微生物肽抗人细胞的相对细胞毒性。
图5显示新旋素对LPS的结合。
图6A和6B显示新旋素对细菌膜的渗透性。
特殊实施例的描述
提供将新旋素用作抗微生物剂的方法。这些肽在体外和体内通过直接的杀菌 活性而有效地杀死各种微生物体。将新旋素单独给予受到感染或易受感染的患者， 或者使其与其它活性剂联合给予，在一定的剂量和持续时间，应足以减少这类微 生物病原体的患者人数。
对新的抗微生物剂的需求不断增长，尤其是有效杀死对常规抗生素产生耐药 性的病原体(如绿脓杆菌)的抗微生物剂。感兴趣的特殊治疗包括但不限于：以气 溶胶方式向囊性纤维化患者的肺给药，以治疗由例如绿脓杆菌、嗜麦芽糖寡养单 胞菌引起的感染，同时防止针对吸入的其它抗生素产生耐药性；用留置插管滴注 患者的膀胱，以预防感染；施涂于严重烧伤的患者的皮肤；直接滴到眼睛中，或 者成滴眼液形式滴到眼睛中，以治疗或预防感染；阴道内给药，以治疗细菌性阴 道病和/或预防性传播疾病，如通过预防沙眼衣原体的感染。新旋素还可用于治疗 使植物致病的假单胞菌类，以及设计预防食用谷物中的疾病和谷物腐烂的农业应 用中。
新旋素的肽形式为进一步的治疗开发提供了基础，通过修饰其多肽结构，可 产生修饰形式，该修饰形式具有改变的生物学和化学特性。在生理学上可接受的 载体中其天然形式或修饰形式，以用于治疗用途，或者用作抗微生物剂。
新旋素组合物
对于本方法，可使用所提供的任何新旋素、其修饰形式或者一种或多种形式 的组合。新旋素包括具有如下式子的肽：
SEQ ID NO：1 KNLRRX1X2RKX3X4HIIKKYG
其中，X1、X2、X3和X4独立选自D或L型的甘氨酸、苏氨酸和异亮氨酸， 较佳是甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、D-丙氨酸和D- 异亮氨酸，条件是不超过3个X残基是异亮氨酸。对于非异亮氨酸残基，优选的 氨基酸是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。优选的肽是X1、X2、X3和X4中仅有1个选 自甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的肽。
进行这些取代时不想被任何理论所限制，可以认为抗微生物肽卵旋素(SEQ ID NO：2)的细胞毒性与其高度的刚性和两性分子性(amphipathicity)有关。用甘氨酸、 苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、D-丙氨酸或D-异亮氨酸取代卵 旋素第6、7、10或11位之中的一个异亮氨酸残基，会增加该卵旋素的柔韧性(甘 氨酸)、破坏α-螺旋〔D丙氨酸(D)或D-异亮氨酸(DI)〕或者增加一个极性残基而 破坏了极度疏水的区域。
表I显示卵旋素和示范性新旋素肽的基本序列。黑体字母表示新旋素中与卵 旋素不同的残基。 SEQ ID NO： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 卵旋素 2 K N L R R I I R K I I H I I K K Y G G6-新旋素 3 K N L R R G I R K I I H I I K K Y G T6-新旋素 4 K N L R R T I R K I I H I I K K Y G S6-新旋素 5 K N L R R S I R K I I H I I K K Y G E6-新旋素 6 K N L R R E I R K I I H I I K K Y G D6-新旋素 7 K N L R R D I R K I I H I I K K Y G DA6-新旋素 8 K N L R R dA I R K I I H I I K K Y G DI6-新旋素 9 K N L R R dI I R K I I H I I K K Y G G7-新旋素 10 K N L R R I G R K I I H I I K K Y G T7-新旋素 11 K N L R R I T R K I I H I I K K Y G S7-新旋素 12 K N L R R I S R K I I H I I K K Y G E7-新旋素 13 K N L R R I E R K I I H I I K K Y G D7-新旋素 14 K N L R R I D R K I I H I I K K Y G DA7-新旋素 15 K N L R R I dA R K I I H I I K K Y G DI7-新旋素 16 K N L R R I dI R K I I H I I K K Y G G10-新旋素 17 K N L R R I I R K G I H I I K K Y G T10-新旋素 18 K N L R R I I R K T I H I I K K Y G S10-新旋素 19 K N L R R I I R K S I H I I K K Y G E10-新旋素 20 K N L R R I I R K E I H I I K K Y G D10-新旋素 21 K N L R R I I R K D I H I I K K Y G DA10-新旋素 22 K N L R R I I R K dA I H I I K K Y G DI10-新旋素 23 K N L R R I I R K dI I H I I K K Y G G11-新旋素 24 K N L R R I I R K I G H I I K K Y G T11-新旋素 25 K N L R R I I R K I T H I I K K Y G S11-新旋素 26 K N L R R I I R K I S H I I K K Y G E11-新旋素 27 K N L R R I I R K I E H I I K K Y G D11-新旋素 28 K N L R R I I R K I D H I I K K Y G DA11-新旋素 29 K N L R R I I R K I dA H I I K K Y G DI11-新旋素 30 K N L R R I I R K I dI H I I K K Y G G10-新旋素酰胺 31 K N L R R I I R K G I H I I K K Y G-CONH2 G10，R12- 新旋素 32 K N L R R I I R K G I R I I K K Y G G10，R12- 新旋素 33 K N L R R I I R K G I R I I K K Y G-CONH2 R2，G10- 新旋素 34 K R L R R I I R K G I H I I K K Y G R2，G10- 新旋素酰胺 35 K R L R R I I R K G I H I I K K Y G-CONH2 R1.R2.G10- 新旋素 36 R R L R R I I R K G I R I I K K Y G R1，R2，G10- 新旋素酰胺 37 R R L R R I I R K G I R I I K K Y G-CONH2
可采用本领域已知的各种方法改变新旋素多肽的序列，以在序列中产生 目标变化。该多肽通常与本文提供的序列基本上类似，即它们将有1个氨基 酸的差异，可能有两个氨基酸的差异。所述的序列变化可以是取代、插入或 删除。
出于各种目的，该蛋白质可连接于各种各样的其它寡肽或蛋白质。通过 使本发明肽表达，可获得各种翻译后的修饰。例如，使用适当的编码序列可 产生法呢基化作用或异戊二烯化作用。在这种情况下，肽将结合于末端的脂 基，以便能结合于脂质膜，如脂质体。在另一例子中，肽的羧基末端被酰胺 化，从而增加该肽的正电荷。
可采用重组方法从真核细胞或原核细胞生产用于本发明的新旋素，或者 如本领域已知的在体外合成。
在本发明的一个实施例中，抗微生物肽主要由选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3到SEQ ID NO：30的多肽序列组成。在本文中，“主要由……组成”是 指多肽由序列表中给出的序列构成，该序列可以侧接一个或多个氨基酸，或 实质上不影响该多肽的基本特性的其它残基。
使用方法
将新旋素的制剂给予受到微生物感染或易受微生物感染的宿主。给药可以是 表面的(topical)、局部的(localized)或全身的，这要视具体的而定，优选局部给药。 通常，新旋素的剂量足以将微生物数量减少至少约50％，其杀伤一般至少1个对 数，还可以是2个或多个对数。以减少微生物数量同时使任何副作用减到最少的 剂量给予本发明的化合物。考虑可以获得该组合物，并在医生的指导下在体内使 用。新旋素特别可用于杀死革兰氏阴性菌，包括绿脓杆菌和沙眼衣原体。
新旋素还可用于配制体外杀死微生物的制剂，尤其是对于不想采用大量的常 规抗生素的人。例如，可将新旋素加到动物和/或人的食品中。新旋素可以作为细 胞的体外培养物的添加剂，以防止组织培养物中微生物过量生长。
如试验部分所述，可通过体外测试确定具体的微生物被新旋素杀死的易感 性。通常，将微生物的培养物与各种浓度的新旋素培育一段足以使该蛋白质起作 用的时间，这段时间通常约为1个小时到1天。然后计算活微生物的数量，测定 杀死水平。
感兴趣的微生物包括但不限于革兰氏阴性菌，例如：柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)；肠杆菌属(Enterobacter sp.)；大肠杆菌属(Escherichia sp.)，如大肠杆菌；克 雷伯杆菌属(Klebsiella sp.)；摩氏变形杆菌属(Morganella sp.)；变形杆菌属(Proteus sp.)；普罗威登斯菌属(Providencia sp.)；沙门氏菌属(Salmonella sp.)，如伤寒沙 门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia sp.)； 志贺菌属(Shigella sp.)；假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)；耶尔森氏菌属(Yersinia sp.)，如鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核 耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)； 弗朗西丝氏菌属(Franciscella sp.)；巴斯德氏菌属(Pasturella sp.)；弧菌属(Vibrio sp.)，如霍乱弧菌(V.cholearae)。副溶血弧菌(V.parahemolyticus)；弯曲杆菌属 (Campylobacter sp.)，如空肠弯曲杆菌(C.jejuni)；嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)， 如流感嗜血杆菌(H.influenzae)、杜氏嗜血杆菌(H.ducreyo)；博德特氏菌属 (Bordetella sp.)，如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、支气管炎博德特氏菌(B. bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)；布鲁氏菌属(Brucella sp.)；奈瑟氏菌属(Neisseria sp.)，如淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟 氏菌(N.meningitidis)；等等。其它感兴趣的细菌包括军团菌属(Legionella sp.)， 如侵肺军团菌(L.pneumophila)；李斯特菌属(Listeria sp.)，如单核细胞增生李斯 特菌属(L.monocytogenes)；枝原体属(Mycoplasma sp.)，如人型枝原体(M. hominis)、肺炎枝原体(M.pneumoniae)；分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)，如结 核分枝杆菌(M.tuberulosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)；密螺旋体属(Treponema sp.)，如苍白密螺旋体属(T.pallidum)；疏螺旋体属(Borrelia sp.)，如布氏疏螺旋 体(B.burgdorferi)；钩端螺旋体(Leptospirae sp.)；立克次氏体属(Rickettsia sp.)， 如立氏立克次氏体(R.rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)；衣原体属 (Chlamydia sp.)、如砂眼衣原体(C.trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、 鹦鹉衣原体(C.psittaci)；螺杆菌属(Helicobacter sp.)，如幽门螺杆菌(H.pylori)； 等等。
感兴趣的非细菌病原体包括真菌和寄生虫病原体，如疟原虫属(Plasmodia sp.)，如恶性疟原虫(P.falciparum)；锥体虫属(Trypanosoma sp.)，如布氏锥体 虫(T.brucei)；血吸虫(shistosomes)；内阿尔巴虫属(Entaemoeba sp.)；酵母属 (Cryptococcus sp.)；假丝酵母属(Candida sp.)，如白假丝酵母(C.albicans)；等 等。
可采用各种给药方法。可口服多肽制剂，或者可静脉内注射、皮下注射、腹 膜注射，可以气溶胶方式、眼内、膀胱内、局部等方式给予。例如，吸入给药的 方法在本领域中已知的。治疗剂的剂量可以根据所给的具体的新旋素、疾病的性 质、给药的频率、给药的方式、该药剂从宿主中的清除等等而改变。最初的剂量 可以较大，接着给予较小的维持剂量。可每周或每两周给予该剂量，或者分成多 份较小的剂量，每天、每半周等给予一次或几次，以维持有效的剂量水平。在许 多例子中，口服所需的剂量比静脉注射的要大。对于口服给药，可修饰酰胺键以 及氨基和羧基末端，以获得更大的稳定性。例如，可将羧基末端酰胺化。
制剂
可将本发明的化合物掺入各种制剂中，用于治疗给药。更具体而言，通过将 本发明的化合物与适当的药学上可接受的载体或赋形剂组合，而将它们配制成药 物组合物，并可将它们配制成固体、半固体、液体或气体形式，如片剂、胶囊、 粉末、软膏、霜、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球体、洗剂和 气溶胶。这样，可以各种方式给予这些化合物，包括口服、口腔、直肠、肠胃外、 腹膜内、皮下、气管内等给药。新旋素在给药后可以遍布全身，或者通过使用植 入管或将活性药剂保留在植入点的其它制剂使新旋素局部化。
在一个实施例中，用于局部的制剂包含螯合剂，该螯合剂使二价阳离子(尤其 是钙和镁)的浓度下降。例如，可包括制剂如柠檬酸、EGTA或EDTA，其中优选 柠檬酸。柠檬酸的浓度通常约为1-10μM。
可单独给予本发明的化合物，或者将本发明的各种化合物相互组合给予，或 者使它们与其它已知的化合物〔如培服林(perforin)、抗炎剂、抗生素等〕组合给 予。关于药物的剂型，这些化合物可以以它们的药学上可接受的盐的形式给予。 下面的方法和赋形剂仅仅是示范性的，而非限制性。
对于口服制剂，这些化合物可单独使用，或者与适当的添加剂组合，配制成 片剂、粉末、粒剂或者胶囊；例如，与常规的添加剂组合，如乳糖、甘露糖、玉 米淀粉或马铃薯淀粉；与结合剂组合，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树 胶、玉米淀粉或者明胶；与崩解剂组合，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或者羧甲基纤 维素钠；与润滑剂组合，如滑石粉或硬脂酸镁；如果需要，还可以与稀释剂组合， 如缓冲剂、增湿剂、防腐剂和增香剂。
可将这些化合物配制成注射用的制剂，通过在水性或非水性溶剂中溶解、悬 浮或者乳化而给予，所述溶剂如植物油或者其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、 高级脂肪酸酯或者丙二醇；如果需要，可与常规的添加剂配制，如增溶剂、等渗 剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂以及防腐剂。
这些化合物可以用于吸入给药的气溶胶形式使用。可将本发明的化合物配制 到增压的、可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等。
这些化合物可与常规的添加剂(如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂 和防腐剂)配制，用作洗剂，如用于防止烧伤的感染。
此外，可将这些化合物与各种碱(如乳化用的碱或水溶性碱)混合而配制成栓 剂。本发明的化合物可以栓剂形式而从直肠给予。栓剂可包含载体，如可可油、 聚乙二醇(carbowax)和聚乙二醇(polyethylene glycol)，这些载体在体温下熔化，而 在室温则固化。
可提供口服或直肠给药的各种剂型，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中，各剂量 单位如一茶匙、一汤匙的片剂或栓剂含有预定量的组合物，该组合物含有本发明 一种或多种化合物。类似地，注射或静脉内给药的单位剂型可包括成组合物形式 的本发明的化合物，如在无菌水、生理盐水或其它药学上可接受的载体中的溶液。
用于缓释制剂的植入物在本领域是熟知的。可将植入物与生物可降解的或非 生物和降解的聚合物配制成微球体、片状等形式。例如，乳酸和/或乙醛酸的聚合 物形成可腐蚀的聚合物，宿主对该聚合物具有很好的耐受性。将含有新旋素的植 入物放在感染位点的附近，这样活性剂的局部浓度相对于身体的其它部位而增加。
术语“单位剂型”在本文中指物理上分散的、适合于人和动物用的单一剂型； 含有预定量的本发明化合物的各单位，是以与药学上可接受的稀释剂、载体或媒 介一起足以产生所需的效果的量计。本发明单位剂型的规格根据所使用的具体化 合物、要达到的效果以及该化合物在宿主中的药物动力学而定。
公众易于获得药学上可接受的赋形剂，如媒介、佐剂、载体或稀释剂。此外， 公众也易于获得药学上可接受的佐剂，如pH调节剂、缓冲剂、张力调节剂、稳 定剂、增湿剂等等。
全身性给药的典型剂量范围是每次给药0.1微克到100毫克/千克对象体重。 典型的剂量可以是每天给予2-6次的一片药剂；或者是每天给予一次的随时间而 释放的胶囊或片剂，它们含有其含量相对较高的的活性成分。随时间释放效果可 由在不同的pH值溶解的胶囊材料获得、由根据渗透压而缓慢释放的胶囊获得、 或者由任何已知的控制释放方法获得。
熟练的技术人员将很容易理解，剂量水平可作为具体的化合物、症状的严重 性以及对象对副作用的易感性的函数而改变。一些特殊的化合物以另外一些更有 效。本领域熟练的技术人员采用各种方法，可容易地确定给定化合物的优选剂量。 优选的方法是测量给定化合物的生理效力。
将脂质体用作传送载体是一种感兴趣的方法。脂质体与细胞的靶位点融合， 然后细胞内传送其内腔的内容物。使脂质体维持与细胞接触足够长的时间，以使 它们融合；采用各种方法维持接触，如隔离、结合剂等等。在本发明的一个方面， 将脂质体设计成气溶胶的形式，以用于肺给药。可将脂质体与介导膜融合的纯化 蛋白质或肽一起制备，如仙台病毒或流感病毒等。脂质可以是已知的脂质体形成 脂质的任何有用的组合，包括阳离子或两性离子脂质，如磷脂酰胆碱。余下的脂 质通常是中性的或酸性的脂质，如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。
可采用Kato等所述的方法〔1991，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，266： 3361〕制备脂质体。简言之，在适当水性介质中将脂质和含有肽的内腔混合，该 水性介质通常是盐水介质，总的固体的范围约为1-10重量％。在短时间(约5-60 秒)的剧烈搅拌后，将试管放到约25-40℃的温水浴中，重复这种循环约5-10次。 然后用超声波处理该组合物一段合适的时间，通常约为1-10秒，并可通过涡流进 行搅拌。然后加入水性介质增大体积，通常将体积增加约1-2倍，接着摇动和冷 却。这种方法使高分子量的分子掺入内腔中。
与其它活性剂配制
在本方法的使用中，可将新旋素与其它药学上活跃的制剂一起配制，尤其是 其它抗微生物剂。感兴趣的其它制剂包括各种各样的抗生素，如本领域已知的。 抗生素的类别包括，例如青霉素G、青霉素V、二甲氧基苯青霉素、苯唑青霉 素、羧苄青霉素、乙氧萘青霉素、氨苄青霉素等；青霉素与β-内酰胺酶抑制剂头 孢菌素的组合，如头孢克洛、头孢唑林、头孢呋辛、拉氧头孢等；卡巴苯宁 (carbapenem)；单菌霉素；氨基糖苷；四环素；大环内酯物；林可霉素；多粘菌素； 磺胺；可洛兰芬尼卡尔(cloramphenical)；甲硝唑；大观霉素；甲氧苄啶；万古霉 素；等等。
也可使用抗真菌剂，包括多烯类，如两性霉素B、制霉素；5-氟鲁构辛(5- flucosyn)；和吡咯类，如咪康唑、酮康唑、衣康唑(itraconazol)和氟康唑。抗结核 病药物包括异烟肼、乙胺丁醇、链霉素和利福平。在新旋素制剂中还可包含细胞 因子，如γ干扰素、肿瘤坏死因子α、白介素12等等。
新旋素的合成
本发明的肽可采用本领域已知的常规方法在体外合成而制得。可获得各种市 售的合成装置，如应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA， Beckman)的自动合成仪等等。使用合成仪，可用天然的氨基酸取代非天然的氨基 酸，具体是D异构体，如D-丙氨酸和D-异亮氨酸；非对映异构体、长度不同的 侧链或官能度；等等。具体的序列和制备的方法将依方便、节约、所需的纯度等 而确定。
可向各种肽或蛋白质提供化学连接，这些肽或蛋白质包含用于结合的方便的 官能度，例如提供氨基用于酰胺或取代的胺的形成，如还原性的胺化；提供巯基 用于硫酯或二硫键的形成；提供羧基用于酰胺的形成；等等。
如果需要，在合成期间或在表达期间，可将各种基团引入肽中，这些基团使 得该肽得以与其它分子或表面连接。因此，可使用半胱氨酸来制备硫酯，用组氨 酸来连接于金属离子复合物，用羧基来形成酰胺或酯，用氨基来形成酰胺，等等。
可根据重组合成的方法还可分离和纯化多肽。由表达宿主制得裂解物，采用 HPLC、排阻色谱法、凝胶电泳、亲和层析或者其它纯化技术纯化该裂解物。最 重要的是，与该产物的制备和纯化方法有关的污染物相比，所使用的组合物将含 有至少20重量％的所需产物，更一般是至少约75重量％，较佳至少约95重量％； 对于治疗目的，通常至少约99.5重量％。通常，该百分比是以总蛋白质为基础。
实施例
给出下述实施例，以给本领域熟练的技术人员提供关于怎样制备和使用本发 明的一个完整的公开和描述，这些实施例并不限制本发明的范围。已作出努力以 确保所使用的数据(如数量、温度、浓度等)的准确，但是，实验误差和偏差总归 存在。除非另有说明，份是重量份，分子量是平均分子量，温度是℃，压力是大 气压或接近大气压。
实施例1
方法
抗微生物活性：采用几种不同的方法检测新旋素的抗微生物活性，包括：a)两 阶段径向扩散试验(two-stage radial diffusion assay)；b)集落计数试验(colony counting assay)；c)标准少量肉汤稀释试验(standard microbroth dilution assay)。
在低盐度、正常盐度或高盐度的培养基中检测抗微生物活性。在径向扩散试 验中，使用低盐“基本培养基”进行检测，该基本培养基含有0.3毫克胰胨豆胨 粉末/毫升10mM磷酸钠缓冲液，pH为7.4。在该基本培养基中补充100mM NaCl获得正常培养基，或者补充175-200mM NaCl获得高盐培养基。高盐培养基对于 绿脓杆菌活性的保持是重要的，因为据报道，从囊性纤维化患者得到的气道液体 显示出高盐性，而其它位点，包括皮肤表面和膀胱，也可能在局部具有高盐浓度。
用于此研究的微生物包括13种不同的绿脓杆菌菌株。AML-654和LZ-1株是 UCLA微生物实验室最近得到的临床分离物。9种菌株是最近的CF分离物，由Lisa Saiman博士提供。除了PAO-1株外，所有的绿脓杆菌菌株都对多种常规抗生素 产生耐药性，所有9种(5种类粘蛋白，4种非类粘蛋白)CF分离物都对250μg/ml 的托普霉素具有耐药性。我们还已测试了从CF患者得到的嗜麦芽糖寡养单胞菌 和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia capacia)各自的5种菌株(也由Lisa Saiman提 供)、大肠杆菌的两种菌株(ML-35p和DH-5a)、金黄色葡糖球菌(Staphylococcus aureus)〔MRSA(具有甲氧苯青霉素抗性的金黄色葡萄糖菌)〕和白假丝酵母。
细胞毒性：采用四唑还原试验(Boehringer-Mannheim，Indianapolis IN)研究细 胞毒性。使ME-180人颈上皮细胞(ATCC HTB-33)和A549人肺上皮细胞(ATCC CCL-185)在RPMI培养基(Me-180)或含有2mM L-谷氨酰胺的Ham F12K培养基 (A-549)中生长至铺满，该Ham F12K培养基中含有10％胎牛血清、2mM L-谷氨 酰胺和50μg/ml庆大霉素(“培养基”)。用胰蛋白酶-EDTA收集细胞，用“培养 基”冲洗，测定(锥虫蓝排染法)它们的浓度和存活力后，将细胞稀释成5×104细 胞/毫升。将100微升的等分分散在96孔组织培养平板(Costar)上，37℃在含有5 ％CO2的室内空气中培育5小时。然后，加入系列稀释的肽，加入肽20小时后， 加入10微升MTT溶液。4小时后，加入100微升增溶缓冲液，放置过夜。第二 天，使用Spectramax 250 Spectrophotometer〔分子设备(Molecular Devices)， Sunnyvale，CA〕在600nm和650nm测量光密度，测定MTT还原。
溶血活性：通过将各种浓度的肽与洗涤的人、鼠、绵羊或牛红细胞的PBS溶 液的悬浮液(2.8％v/v)一起培育，从而测试溶血活性。37℃培育30分钟后，将试 管离心，测量释放到上清液中的总血红蛋白的百分比。
结果
抗微生物特性：卵旋素和新旋素证明对革兰氏阴性菌具有有效的抗微生物活 性，包括绿脓杆菌的全部13种菌株。这些菌株中的11种，包括从CF患者得到 的9种(5种类粘蛋白，4种非类粘蛋白)都是最近的临床分离物。所有的CF菌株 都对250μg/ml的托普霉素具有耐药性，大多数对多种其它的抗生素具有高度耐药 性。新旋素对嗜麦芽糖寡养单胞菌的所有5种菌株也有活性，嗜麦芽糖寡养单胞 菌是囊性纤维化中出现的病原体，它们对常规的抗生素通常具有耐药性。与其它 许多抗生素和抗微生物肽一样，新旋素对洋葱伯克霍尔德氏菌无活性。
新旋素介导的杀菌活性在5-15分钟内产生，最有可能是对细菌的内膜和外膜 产生渗透化作用。抗微生物活性在高盐(175-200mM NaCl)条件下维持，在20％血 清的存在下受到的影响最小。新旋素对生长期或休眠期的绿脓杆菌相当有效。
图1显示卵旋素和新旋素对两种微生物——大肠杆菌和绿脓杆菌的多抗性菌 株的相对活性。在低盐、正常盐浓度和高盐条件下(在X轴上分别表示为0、100 和100mM NaCl)进行径向扩散试验，获得MIC。柱显示平均的MIC值±SEM(n＝3)。 可以看出，在低盐和正常盐浓度下测量时，新旋素比卵旋素更有活性，而高盐条 件下它们的活性大致相等。
表1对新旋素针对这些革兰氏阴性菌的活性与它针对单核细胞增生李斯特 菌、金黄色葡糖球菌和白假丝酵母的活性进行了比较。表中的数据由径向扩散试 验获得，这些数据由平均MIC±SEM显示，n＝3。注意到当在生理盐浓度(100mM NaCl)测试时，新旋素显示出抗这些革兰氏阴性菌的活性，并且新旋素G10对白 假丝酵母也具有相当的活性。虽然在非常高的盐浓度条件下(200mM NaCl)，卵旋 素和新旋素都没有维持着针对白假丝酵母或革兰氏阳性菌的活性，但是它们在这 些条件下维持了针对革兰氏阴性菌的活性。结果，即使CF患者中气管的NaCl浓 度特别地高，这种因素也不会削弱卵旋素或新旋素杀死绿脓杆菌的能力。
表1.针对5种不同微生物的MIC(μg/ml)，〔平均值±SEM，n＝3〕
肽 大肠杆菌 绿脓杆菌 单核细胞增生 金黄色葡糖球 白假丝酵母
ML 35P MR 3007 李斯特菌EGD 菌930918-3 820
低盐 (+0mM NaCl)
卵旋素 0.7±0.0 2.7±1.1 2.0±0.5 2.1±0.3 2.2±0.2
G7新旋素 0.2±0.0 0.6±0.2 0.4±0.1 0.6±0.2 0.5±0.1
G10新旋素 0.1±0.0 0.3±0.0 0.2±0.0 0.3±0.0 0.2±0.1
T7新旋素 0.3±0.1 1.3±0.6 0.5±0.2 0.7±0.3 0.5±0.2
T10新旋素 0.5±0.2 1.5±0.9 0.6±0.3 1.0±0.6 0.8±0.4
正常盐浓度 (+100mM NaCl)
卵旋素 0.7±0.1 1.7±0.6 1.5±0.3 1.0±0.1 29.9±15.4
G7新旋素 0.2±0.0 0.4±0.1 2.3±0.5 5.1±1.1 9.3±4.9
G10新旋素 0.1±0.0 0.2±0.0 1.4±0.4 4.6±1.7 4.6±1.9
T7新旋素 0.2±0.1 0.5±0.3 2.4±1.5 3.3±1.5 18.6±5.9
T10新旋素 0.3±0.2 0.9±0.5 5.5±4.0 9.7±4.6 23.0±3.9
非常高的盐浓度 (+200mM NaCl)
卵旋素 1.5±0.6 2.7±0.1 3.3±0.1 2.9±0.7 ＞250
G7新旋素 1.5±0.4 4.5±1.9 28.2±0.7 39.6±9.2 ＞250
G10新旋素 1.8±0.8 2.5±0.5 9.3±1.3 75.0±51.5 205±22.6
T7新旋素 1.4±0.5 2.7±1.3 21.5±2.0 14.9±2.9 ＞250
T10新旋素 2.7±1.1 3.9±2.1 26.8±1.6 75.3±56.2 ＞250
表2.绿脓杆菌PAO1的少量肉汤稀释试验(μg/ml，平均值，n＝3)
肽 MIC MBC
mM NaCl 0 100 175 0 100 175
卵旋素 3.1 3.1 4.7 4.7 7.1 9.4
G7新旋素 1.6 6.8 4.4 2.6 14.1 8.3
G10新旋素 2.6 16.1 11.3 6.8 16.7 29.2
T7新旋素 2.1 3.9 5.7 7.3 6.3 12.5
T10新旋素 2.8 5.7 2.8 6.8 9.4 9.4
Protegrin PG1 2.1 2.6 2.6 3.2 2.7 3.5
囊性纤维化患者气管中的绿脓杆菌可能在许多方面与活动无拘束的漂浮种类 生物不同。这些不同点是：它们在富含藻酸盐的生物膜中被捕获；选择营养缺陷 型和抗生素耐药性；对它们的脂质和LPS结构进行各种修饰；高密度的代谢特征； 营养限制性的培养物。许多常规的抗生素(如细胞壁或蛋白质合成的抑制剂)和许 多抗微生物肽优先针对快速生长着的微生物，因而可能对量大/更新慢的细菌种群 相对无活性。因此，我们测试了卵旋素和新旋素针对绿脓杆菌的3种菌株PAO-1、 Liz-1和AML654的活性，以观察这些肽是否能杀死稳定期或缺乏营养的微生物 以及快速生长的微生物。所有这三类菌株都获得相等的结果。表3显示PAO-1和 Liz-1的数据。注意到不论是生长期还是营养的存在或缺乏都没有影响到绿脓杆菌 对新旋素的易感性。
表3.肽针对生长期和稳定期的绿脓杆菌(2类菌株)的活性，在
铺垫的凝胶下存在或缺乏营养(TSB)的情况下测试
MIC(μg/mL)
绿脓杆菌PAO1/绿脓杆菌Liz-1
肽 对数生长期中期 对数生长期中期 稳定期 稳定期
1％TSB 无TSB 1％TSB 无TSB
低盐
卵旋素 0.6/1.8 1.3/1.1 1.8/1.9 0.9/2.0
G7新旋素 0.4/0.4 0.3/0.6 0.4/0.3 0.3/0.6
G10新旋素 0.3/0.3 0.1/0.4 0.3/0.1 0.2/0.4
T7新旋素 0.4/0.6 0.5/0.6 0.6/0.4 0.5/0.7
T10新旋素 0.6/0.7 0.6/1.0 0.9/0.9 0.6/0.9
100mM NaCl
卵旋素 0.9/1.6 0.9/1.4 1.5/1.5 0.9/2.1
G7新旋素 0.2/0.2 0.5/0.6 0.1/0.2 0.5/1.2
G10新旋素 0.1 /0.2 0.8/1.3 0.1/0.1 0.5/2.0
T7新旋素 0.3/0.3 0.6/0.4 0.4/0.4 0.5/0.7
T10新旋素 0.3/0.5 0.9/0.6 0.5/0.5 0.8/1.4
175mM NaCl
卵旋素 1.2/0.9 0.9/0.7 1.1/1.2 0.8/0.8
G7新旋素 1.2/2.1 0.2/0.1 1.0/2.9 0.1/0.1
G10新旋素 3.6/5.9 0.1/0.1 4.7/5.9 0.1/2.3
T7新旋素 0.8/2.0 0.3/0.1 0.8/2.0 0.2/0.6
T10新旋素 2.3/3.4 0.3/0.2 1.9/3.0 0.4/0.8
血清的作用：人防卫素和LL-37(一种α-螺旋的人卡瑟利次定肽)可大量地结 合血清分子。结果，如果血清存在的话，它们的抗微生物活性被极大地减少。因 为血清可以存在于炎症部分或者流出物，所以在血清的存在下还能发挥作用的能 力是需要的特性。我们最近发现，SMAP-29(在绵羊中发现的一种α-螺旋的卡瑟 利次定)在血清的存在下保持着其抗微生物活性，这证明了血清的抑制作用不是不 可避免的，而是一个设计上的问题。表4显示血清对新旋素、LL-37、SMAP-29 和其它抗绿脓杆菌MR3007(一种具有血清耐药性的菌株)和大肠杆菌ML-35P(对 ＞5％的血清敏感)的肽的作用。在血清的存在下，卵旋素和新旋素丧失了一部分抗 绿脓杆菌的活性，但LL-37受到的影响要小得多。
表4.正常人的血清对抗微生物活性的作用
MIC(μg/mL)
肽 大肠杆菌ML35P 绿脓杆菌MR3007
0％NHS 2.5％NHS 0％NHS 2.5％NHS 20％NHS
卵旋素 1.7 1.7 5.6 20.1 17.6
G7新旋素 0.5 0.4 7.5 21.5 17.7
G10新旋素 0.9 0.7 7.6 22.1 21.7
T7新旋素 1.0 0.7 7.5 25.2 22.0
T10新旋素 1.0 0.7 8.6 28.6 17.6
PG-1(protegrin) 0.5 0.3 1.6 0.91 1.6
PGG 1.8 0.9 5.8 7.41 8.6
SMAP-29 0.6 0.3 1.4 1.5 1.2
LL-37 5.8 21.0 12.7 23.7 141
在这些试验中，铺垫的凝胶含有60％RPMI-1640、±2.5-20％正常人血清 (NHS)。剩余的溶液是磷酸缓冲盐溶液。
杀微生物活性的动力学：在绿脓杆菌MR3007暴露于5μg/ml的卵旋素或新 旋素中后，我们在一定的时间间隔内对存活的绿脓杆菌MR3007进行了测定，该 卵旋素或新旋素存在于含有1％v/v的胰胨豆胨培养液的PBS培养基中。图2显 示快速的2至3的对数的落差，到30分钟时以及之后再也没发现存活的细菌。
图3显示裂解的红细胞中的卵旋素或新旋素的作用。虽然卵旋素对人红细胞 的溶血作用与protegrin PG-1的大致相同，但是新旋素是非溶血性的。使用鼠红细 胞也获得类似的结果。相反，这些肽中没有一条对绵羊或牛红细胞具有明显的溶 血性。
细胞毒性特性：新旋素，尤其是新旋素G10，对人上皮细胞或成纤维细胞的 毒性明显少于卵旋素和先前研究的其它抗微生物肽(如protegrin PG-1、爪蟾抗菌 肽MSI-78或者PGG)对这两种细胞的毒性。针对ME-180人颈上皮细胞和A-549 肺上皮细胞的毒性的代表性检测显示在图4中。
图5比较了这些肽对MRC-5人肺成纤维细胞的细胞毒性。G10和T10新旋 素实际上没有细胞毒性，这证明它们不可能延迟组织的修复或伤口的愈合。
体内毒性：在小鼠中进行急性毒性研究。给3只小鼠静脉使用10毫克新旋 素G10/千克体重的量，3只都存活，1只在20毫克/千克的剂量时仍活着。如果小 鼠的血液体积占其质量的5％，那么10毫克/千克的剂量将产生大约200微克/毫 升的峰值水平——高于其MIC浓度的20-50倍。
LPS结合：我们在两个试验中测量了卵旋素和新旋素结合LPS的能力。一个 试验是分光光度计测量，使用到定量的Limulus生色试验。另一个试验是物理的， 它测量表面等离子体共振变化。
卵旋素对LPS的表观结合常数大约为6.7×10-6M。当结合试验在低盐(0mM NaCl)条件下进行时新旋素的亲和力下降了4-5倍，即在2.5-3.3×10-5M。当我们 测试生理NaCL浓度下的结合时，新旋素对LPS的亲和力增加。
新旋素对细菌膜的作用：所有的新旋素，当以5μl/mg的量进行测试时，它 们都能快速地渗透大肠杆菌M-35p的外膜和内膜。膜渗透性的起始是快速的，在 2分钟之内发生，并在5分钟之内达到最大程度。这个试验使用悬浮在PBS(100mM NaCl)中的稳定期的大肠杆菌进行。通过监控PADAC(一种头孢菌素)的水解而测 量外膜的渗透性，通过监控ONPG(这种大肠杆菌株没有lac通透酶)的水解而测量 内膜的渗透性。
表5显示新旋素抗嗜麦芽糖寡养单胞菌的活性。
表5
新旋素：嗜麦芽糖寡养单胞菌 低盐条件 51Cl 47CG 18CP 42CK 36CN Protegrin PG-1 0.42 0.09 0.52 0.32 0.27 PGG 1.31 0.73 0.86 1.51 1.10 多粘菌素B 0.02 0.16 0.04 0.05 0.06 卵旋素 1.60 0.07 1.46 1.73 1.01 G7新旋素 0.54 0.25 0.61 0.42 0.17 G10新旋素 0.45 0.08 0.40 0.43 0.15 T7新旋素 0.88 0.18 0.74 0.56 0.21 T10新旋素 0.97 0.21 0.88 0.77 0.32 +100mM NaCl 51Cl 47CG 18CP 42CK 36CN Protegrin PG-1 0.92 0.53 0.58 0.50 0.46 PGG 2.20 1.08 1.63 2.67 1.05 多粘菌素B 0.04 0.08 0.04 0.02 0.02 卵旋素 2.20 0.54 0.88 1.24 0.93 G7新旋素 0.89 0.39 0.38 0.92 0.31 G10新旋素 3.57 0.68 0.70 0.67 0.29 T7新旋素 1.75 0.47 0.58 0.73 0.32 T10新旋素 5.02 0.75 0.88 1.27 0.48 +175mM NaCl 51Cl 47CG 18CP 42CK 36CN Protegrin PG-1 1.08 0.74 0.70 0.79 0.57 PGG 2.85 1.64 2.34 7.10 1.11 多粘菌素B 0.05 0.05 0.002 0.01 0.02 卵旋素 1.67 0.77 0.91 2.03 0.91 G7新旋素 1.94 0.29 0.70 2.85 0.29 G10新旋素 8.18 0.63 1.30 10.0 0.36 T7新旋素 2.74 0.48 0.62 1.92 0.52 T10新旋素 15.5 0.70 2.08 1.25 0.53
Protegrin PG-1、多粘菌素B和PGG为对照。PGG是α-螺旋肽，其序列是 GLLRRLRKKIGEIFKKYG。它由Tossi，A.、Tarantino，C.和Romeo，D.(1997)设计 和报道的。合成的抗微生物肽的设计是以序列模拟和两性分子性为基础的，《欧 洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)，250：549-58。
实施例2
砂眼衣原体血清型L2、D和E对G-10新旋素的易感性
本研究检测砂眼衣原体的三种血清型(L2、D和E)对新旋素(G-10)(一种新颖 的18残基α-螺旋肽)的易感性。G-10是非溶血性的，并且当在体外针对上皮细胞 进行测试时，G-10具有最小的细胞毒性。它对革兰氏阴性微生物具有相对选择性。
砂眼衣原体血清型L2引起侵入性LGV，而血清型D和E代表典型的生殖菌 株。使用标准的和改良的McCoy细胞壳形小瓶试验(standard and modified McCoy cell shell vial assay)和各浓度的肽，测定G-10对砂眼衣原体血清型(L2、D和E)的 作用。在标准试验中，先将砂眼衣原体/肽混合物预先培育2小时，然后在进行48 小时的培育之前将它们从宿主单层中移出。在改良的试验中，将预先培育的混合 物放在单层细胞上进行48小时的培育。在第三试验中，混合G10和砂眼衣原体， 然后在没有预先培育的情况下，用它们感染细胞单层，在48小时测量。记录下包 涵体形成单位(IFU)，以测量肽的抑制作用。
在预先培育试验中，100μg/ml的G-10完全抑制了砂眼衣原体血清型E。在 100mg/ml，血清型L2的IFU减少了92.7-99.1％，血清型D的IFU减少了99.4-100 ％。通常，不进行预培育步骤会减少砂眼衣原体对新旋素的易感性。没有移走砂 眼衣原体/肽混合物并没有显著增加或减少对G-10的易感性。G-10比protegrin更 有效，protegrin是在猪淋巴细胞中发现的抗微生物肽，它们具有优异的抗砂眼衣 原体活性。此外，所有3种测试的血清型都对G-10有易感性。因此，新旋素具 有作为化学预防剂的用途，可用于预防砂眼的传染。
实施例3
二价阳离子对新旋素活性的作用
G10新旋素抗某些细菌的活性被1mM浓度的钙和镁所抑制。加入含有柠檬 酸的缓冲液可缓解这种抑制。在这种发现的基础上，用于局部的新旋素制剂应含 有柠檬酸或者另一种二价阳离子结合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)。含有柠檬酸 的制剂对G10新旋素的有益效果显示在表6中。
导致这种发现的试验涉及径向扩散试验。所有铺垫的凝胶都含有100mM NaCl和5mM HEPES缓冲液(pH7.4)。此外，一些铺垫的凝胶补充了5mM柠檬酸钠缓 冲液(pH7.4)，而其它的含有1mM CaCl2或1mM MgCl2。数据以MIC值表示(μg/ml)。 注意到与对金黄色葡糖球菌的增强作用相比，柠檬酸对革兰氏阴性微生物的增强 作用更占优。EDTA是一种更有效的钙和镁的螯合剂，被认为具有与柠檬酸一样 的作用。
表6 微生物 柠檬酸 无Ca/Mg +1mM Ca +1mM Mg 肺炎克雷伯氏菌 无 0.12 116.0 8.37 肺炎克雷伯氏菌 5mM 0.23 3.1 0.56 绿脓杆菌 无 0.18 22.7 1.35 绿脓杆菌 5mM 0.13 0.14 0.14 大肠杆菌 无 0.16 9.3 2.56 大肠杆菌 5mM 0.11 0.12 0.14 金黄色葡糖球菌 无 0.46 250.0 7.7 金黄色葡糖球菌 5mM 8.04 27.0 21.4
实施例4
制备新旋素G10的三种新的变体，并对它们进行测试，以确定增加肽的净正 电荷是否会使该肽在二价阳离子的存在下更有效。将一些新旋素G10变体的羧基 末端酰胺化(-NH2)，以增加总的正电荷。这些肽的序列和它们的净电荷显示在表7 中。在这个计算中忽略组氨酸12上的分散电荷(和pH依赖性电荷)。
表7 肽 净电荷 SEQ ID NO 序列 G10新旋素 +7 17 KNLRRIIRKG IHIIKKYG-COOH G10新旋素 酰胺 +8 31 KNLRRIIRKG IHIIKKYG-CONH2 G10，R12新旋素 +8 32 KNLRRIIRKG IRIIKKYG-COOH G10R12新旋素酰胺 +9 33 KNLRRIIRKG IRIIKKYG-CONH2
结果：MIC，平均值±SEM，n＝3，阴影框表示p＜0.01，与G-10相比，采用 t-试验。
表8 微生物 肽 无Ca/Mg +1mM Ca +1mM Mg 金黄色葡糖球菌 卵旋素 0.49±0.05 6.15±0.12 5.93±0.19 新旋速G10 22.7±2.1 99.0±5.7 ＞79 新旋素G10酰胺 2.72±0.14 ＞79 29.9±0.35 新旋素G10，R12 23.0±0.13 ＞79 87.0±5.7 新旋素G10、R12酰胺 2.48±0.03 25.4±0.6 27.8±0.43 绿脓杆菌 卵旋素 2.31±0.21 22.1±1.78 7.18±0.51 新旋素G10 0.17±0.04 ＞250 ＞250 新旋素G10酰胺 0.12±0.01 83.5±6.4 ＞250 新旋素G10、R12 0.10±0.01 22.9±1.2 26.9±0.78 新旋素G10、R12酰胺 0.15±0.04 24.3±0.15 27.4±0.21 大肠杆菌 卵旋素 0.8±0.14 6.97±0.42 6.99±0.11 新旋素G10 0.0g±0.02 21.2±0.36 20.3±0.1 新旋素G10酰胺 0.06±0.00 7.26±0.02 17.2±3.9 新旋素G10、R12 0.05±0.0 1.71±0.02 2.54±0.13 新旋素G10、R12酰胺 0.06±0.01 1.69±0.15 2.91±0.29 肺炎克雷伯氏菌 卵旋素 2.31±0.02 22.1±1.8 7.18±0.5 新旋素G10 0.17±0.03 ＞250 ＞250 新旋素G10酰胺 0.12±0.01 83.5±6.4 ＞250 新旋素G10、R12 0.10±0.1 22.9±1.20 26.9±0.8 新旋素G10、R12酰胺 0.15±0.04 24.3±0.15 2.73±0.29
在表8中，MIC表示最小抑制浓度，采用两阶段径向扩散试验测得。这些试 验在标准条件下进行，但使用10mM HEPES缓冲液代替10mM磷酸盐，以避免 存在钙时产生的溶解问题。黑体字显示的结果表示：与新旋素G10相比，活性有 明显地提高(p＜0.01，采用t-试验)。注意到G10、R10新旋素酰胺显示，在钙和镁 的存在下，针对所有四种测试微生物的活性增加，G10、R10新旋素针对三种革 兰氏阴性微生物〔绿脓杆菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)〕具有 更大的活性，但并不对金黄色葡糖球菌更有效。上述G10新旋素衍生物中没有一 种引起人红细胞的任何溶血，即使当以80μg/ml的浓度进行测试。其它阳离子氨 基酸(如赖氨酸、鸟氨酸等)有可能也可以用于位置12上，以在钙和镁离子存在的 情况下获得更好的活性。
实施例5
分析G10新旋素的4种变体，以观察增加N末端的正电荷是否也会增加对 钙和镁的抗性。这些G10变体的氨基酸序列以及它们各自的净电荷显示在表9中。
表9 肽 净电荷 SEQ ID NO： 序列 R2、G10新旋素 +8 34 KRLRRIIRKG IHIIKKYG-COOH R2、G10新旋素酰胺 +9 35 KRLRRIIRKG IHIIKKYG-CONH2 R1、R2、G10新旋素 +8 36 RRLRRIIRKG IRIIKKYG-COOH R1、R2、G10新旋素 酰胺 +8 37 RRLRRIIRKG IRIIKKYG-CONH2
本说明书中所引用的所有出版物和专利申请都被纳入本文作为参考，就像各 单独的出版物或专利申请被明确且单独地指出给纳入作为参考那样。任何出版物 的引用都是它们在本申请日前的公开内容，不应认为本发明者承认本发明由于这 些出版物的缘故而不能在它们之前授权。
虽然为了清除地理解的目的，已采用阐述和实施例的方式描述了前述发明， 但是本领域熟练的技术人员在参考本发明的内容后将易于理解，在不偏离附带的 权利要求的精神和范围的情况下，可对本发明作出某些改变和修改。
关于联邦资助的研究的声明
本发明在政府支持下进行，有国立卫生研究院(National Institute of Health)资 助，授权号为A143934。政府在本发明中拥有一定的权益。
前言
相关文献
Saiman等在《小儿科肺科学》(Pediatr Pulmonol，1999，17：320)的增刊中 报道，CF患者的耐药性微生物被卡瑟利次定肽抑制；Brogden等在《小儿科肺科 学》(Pediatr Pulmonol，1999，17：320)的增刊中报道了SMAP29在肺感染的绵羊 模型中的效果，以及SMAP29在治疗囊性纤维化(CF)患者的绿脓杆菌感染中的潜 力。
序列表
<110>R.I.莱雷尔(Lehrer，Robert，I.)
A.J.韦林(Waring，Alan，J.)
B.F.塔克(Tack，Brian，F.)
<120>新旋素：抗微生物剂
<130>06510-195WO
<140>未授权
<141>
<150>US 09/606,858
<151>2000-06-28
<160>37
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
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<220>
<223>合成的抗微生物肽
<221>变体
<222>(1)…(18)
<223>Xaa＝甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、D-丙氨酸、D-异亮氨酸
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Arg Arg Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile Arg Ile Ile Lys Lys
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