猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用
阅读：1018发布：2020-06-04
专利汇可以提供猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及猪伪狂犬病毒技术领域，特别涉及一种猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G，保藏号为CGMCCNo.7957。其在制备 疫苗 中的应用。将106.0TCID50重组病毒接种新西兰大白兔，未引起 瘙痒 等临床症状。制成 水 包油型灭活疫苗，仔猪免疫后4周gBELISA 抗体 阳性，但gE抗体阴性，免疫保护效率100%；母猪免疫后其后代可以获得免疫保护，对PRV变异毒和传统毒免疫保护效率100%；证明ZJ011G重组病毒具有较好免疫原性，可用于疫苗制备。，下面是猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用专利的具体信息内容。
1.一种猪伪狂犬病高毒力抗原变异株gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G，其保藏号为CGMCC No.7957。
2.一种权利要求1所述的猪伪狂犬病gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G在制备疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于疫苗为水包油型灭活疫苗。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于疫苗的制备过程为：取含有PRV-ZJ011G病毒的病毒液，甲醛灭活，加入佐剂乳化即得。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于病毒液与佐剂的重量比为4:1。
7.0
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于病毒液中病毒含量为10 TCID50/mL。
7.根据权利要求2-5中任一项所述的应用，其特征在于疫苗中病毒抗原含量大于
6.0
10 TCID50/mL。
猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用
[0001] 技术领域本发明涉及猪伪狂犬病毒技术领域，特别涉及一种猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株，还涉及所述病毒株的应用。
[0002] 背景技术猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科成员，可引起新生仔猪中枢神经系统紊乱，生长猪呼吸道症状，并能导致妊娠母猪流产、死胎与弱仔。美国与部分欧洲国家已宣布消灭和根除该病。我国广泛使用该病基因缺失弱毒疫苗有效控制并逐步净化。
[0003] 华中农业大学在2005年申请了一个公开号为CN1940063A，名称为“一种伪狂犬病- -E/gI 基因缺失毒株、含有该毒株的灭活疫苗及应用”，公开了保藏号为CCTCC-V200511的伪狂犬病毒基因工程株WKQ-001，该毒株缺失了PrV的糖蛋白基因gI、gE，作为标志基因，用于鉴别和诊断人工免疫猪及自然感染猪，还可用于制备灭活疫苗，其疫苗的免疫保护效果，尚待提高。
[0005] 本发明还提供了所述的猪伪狂犬病gE和gI基因缺失病毒株在制备免疫力高的疫苗中的应用。
[0007] 所述的猪伪狂犬病gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G在制备疫苗中的应用。 [0008] 所述的应用中，疫苗为水包油型灭活疫苗。
[0009] 所述的应用中，疫苗的制备过程为：取含有PRV-ZJ011G病毒的病毒液，甲醛灭活，加入佐剂乳化即得。
[0010] 所述的应用中，病毒液与佐剂的重量比为4:1。
[0011] 所述的应用，病毒液中病毒含量为107.0TCID50/mL。
[0012] 所述的应用，疫苗中病毒抗原含量大于106.0TCID50/mL。
[0013] 本发明的有益效果：从我国发病猪群分离的猪伪狂犬病毒（PRV）毒株PRV-ZJ01，通过DNA同源重组将携带细菌人工染色体（BAC）载体和gfp 表达盒pHA2质粒插入到ZJ01毒株的US7与US8基因内，获得了gE与gI基因缺失的重组病毒PRV-ZJ011G（以下也简称为ZJ011G）。提取该重组病毒的环状基因组DNA，电转化至大肠杆菌DH10B，筛选获得病毒感染性克隆PRV BAC（pZJ01/G-7）。将pZJ01/G-7转染BHK-21细胞可以重新启动病毒的生产性感染。重组病毒PRV-ZJ011G引起的细胞病变、病毒生长曲线和体外增殖特性与ZJ01毒株一致。
[0014] 将106.0 TCID50重组病毒接种新西兰大白兔，未引起瘙痒等临床症状。采用6.0
PRV-ZJ011G株病毒液（10 TCID50/mL）灭活处理制成水包油型灭活疫苗，与Bartha-K61活疫苗进行猪体免疫保护试验，结果表明，PRV-ZJ011G毒株灭活疫苗安全性较好，免疫后4周
6.0
可产生gB抗体，但gE抗体阴性。采用ZJ01病毒液（10 TCID50）攻击，PRV-ZJ011G灭活疫苗组免疫保护效率100%，Bartha-K61活疫苗组保护效率40%，证明PRV-ZJ011G重组病毒具有较好免疫原性，可用于疫苗制备。
PRV-ZJ011G株病毒液（10 TCID50/mL）灭活处理制成水包油型灭活疫苗，与Bartha-K61活疫苗进行猪体免疫保护试验，结果表明，PRV-ZJ011G毒株灭活疫苗安全性较好，免疫后4周
6.0
可产生gB抗体，但gE抗体阴性。采用ZJ01病毒液（10 TCID50）攻击，PRV-ZJ011G灭活疫苗组免疫保护效率100%，Bartha-K61活疫苗组保护效率40%，证明PRV-ZJ011G重组病毒具有较好免疫原性，可用于疫苗制备。
[0015] 菌株保藏信息保藏时间：2013年9月18日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），
保藏编号：CGMCC No.7957，
保藏单位地址：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus）。
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），
保藏编号：CGMCC No.7957，
保藏单位地址：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus）。
[0016] 附图说明图1. pHA2质粒经同源重组插入PRV-ZJ01病毒基因组示意图，其中（A）PRV-ZJ01基因组示意图（大小为145Kb）及US7与US8所在区域；（B）转移载体构建示意图；（C）重组病毒PRV-ZJ01/G基因组构成的示意图；
图2. 转移载体的构建与鉴定；其中（A）.中间载体pUC19-H1-H2质粒经PacⅠ线性化；
（B）.转移载体pUC19-H1-H2/HA转染BHK-21细胞后16h在荧光显微镜下可见gfp 表达；
图3. 重组病毒PRV-ZJ011G的噬斑纯化；
图4. 病毒rZJ01/G的基因组DNA与pZJ01/G-7质粒RFLP指纹图谱；其中泳道1：病毒rZJ01/G的基因组DNA RFLP指纹图谱；泳道2：pZJ01/G-7质粒DNA RFLP指纹图谱；M：
Quick-load 1Kb Extend DNA Ladder Marker；
图5. 荧光显微镜下ZJ011G（A）与rZJ01/G（B）的噬斑（48h，100×）；
图6. ZJ011G在BHK-21细胞上的一步生长曲线。
图2. 转移载体的构建与鉴定；其中（A）.中间载体pUC19-H1-H2质粒经PacⅠ线性化；
（B）.转移载体pUC19-H1-H2/HA转染BHK-21细胞后16h在荧光显微镜下可见gfp 表达；
图3. 重组病毒PRV-ZJ011G的噬斑纯化；
图4. 病毒rZJ01/G的基因组DNA与pZJ01/G-7质粒RFLP指纹图谱；其中泳道1：病毒rZJ01/G的基因组DNA RFLP指纹图谱；泳道2：pZJ01/G-7质粒DNA RFLP指纹图谱；M：
Quick-load 1Kb Extend DNA Ladder Marker；
图5. 荧光显微镜下ZJ011G（A）与rZJ01/G（B）的噬斑（48h，100×）；
图6. ZJ011G在BHK-21细胞上的一步生长曲线。
具体实施方式
[0017] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：实施例1：重组病毒的获得
1.1 病毒与细胞
PRV-ZJ01株病毒（经鉴定属于高毒力抗原变异株），由本实验室于2011年分离自我国某发病猪群患病仔猪，为BHK-21细胞F5代适应毒；BHK-21细胞由本实验室保存，细胞生长液为含10%胎牛血清（Gibco）的DMEM（Gibco），维持液为含2%胎牛血清的DMEM。
1.1 病毒与细胞
PRV-ZJ01株病毒（经鉴定属于高毒力抗原变异株），由本实验室于2011年分离自我国某发病猪群患病仔猪，为BHK-21细胞F5代适应毒；BHK-21细胞由本实验室保存，细胞生长液为含10%胎牛血清（Gibco）的DMEM（Gibco），维持液为含2%胎牛血清的DMEM。
[0018] 质粒与菌株pHA2质粒（包含BAC载体序列、真核细胞中表达gfp 表达盒、大肠杆菌中表达氯霉素抗性基因与大肠杆菌F质粒）由国家兽用生物制品工程技术研究中心王继春博士惠赠；pUC19载体购自Invitrogen公司；大肠杆菌TOPO10感受态细胞（由本实验室保存）；电转化感受态细胞ElectroMax DH 10B T1购自Invitrogen公司。
[0019] 工具酶与试剂TM
本研究中所用的限制性内切酶，T4 DNA连接酶购自NEB公司；AccuPrime pfx DNA Polymerase购自Invitrogen公司；AxyPrep DNA片段回收试剂盒购自AxyGEN公司；平末端TM
克隆载体pEASY -Blunt Zero购自TransGen公司；质粒提取试剂盒Miniprep购自Qiagen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit；酚氯仿、蛋白酶K、RNase与低熔点琼脂糖购自Sigma公司；转染试剂Lipofactamine 2000购自Invitrogen公司；DMEM细胞营养液与胎牛血清购自Gibco公司。
本研究中所用的限制性内切酶，T4 DNA连接酶购自NEB公司；AccuPrime pfx DNA Polymerase购自Invitrogen公司；AxyPrep DNA片段回收试剂盒购自AxyGEN公司；平末端TM
克隆载体pEASY -Blunt Zero购自TransGen公司；质粒提取试剂盒Miniprep购自Qiagen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit；酚氯仿、蛋白酶K、RNase与低熔点琼脂糖购自Sigma公司；转染试剂Lipofactamine 2000购自Invitrogen公司；DMEM细胞营养液与胎牛血清购自Gibco公司。
[0020] 引物设计与同源重组臂的PCR扩增根据GeneBank公布的PRV-Becker株基因组序列（GenBank收录号为JF797219），在US7(gI)与US8(gE)位置设计2对引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R，引物序列见表
1，斜体划线部分为酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。
1，斜体划线部分为酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。
[0021] 表1：本研究所用引物（Table 1: Primers used in this research）
转移载体的构建
准备1L PRV-ZJ01 F5代病毒液，反复冻融3次，8000rpm离心30min除去细胞碎片，40000rpm超速离心2h，所得沉淀经适量灭菌PBS重悬，用酚氯仿法在重悬液中提取PRV-ZJ01 gDNA。
转移载体的构建
准备1L PRV-ZJ01 F5代病毒液，反复冻融3次，8000rpm离心30min除去细胞碎片，40000rpm超速离心2h，所得沉淀经适量灭菌PBS重悬，用酚氯仿法在重悬液中提取PRV-ZJ01 gDNA。
[0022] 分别以PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R，PRV-ZJ01 gDNA为模板，PCR扩增同源臂H1与H2，PCR反应体系：1 U AccuPrimeTM pfx DNA Polymerase 与2.5μL10×AccuPrimeTM pfx Mix (Invitrogen)，上下游引物各10 pmol，PRV-ZJ01 gDNA模板
100ng，灭菌双蒸水补足50μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性45s，62℃退火
45s，68℃延伸90s，上述3步骤进行32个循环；68℃后延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析，按AxyPrep DNA Gel Extraction Kit说明书回收目的片段。回收PCR扩增产物连接pEASYTM-Blunt Zero载体，挑取阳性菌株进行测序分析。提取测序正确的重组H1与H2质粒分别用EcoRⅠ/Sac Ⅰ与PstⅠ/Hind Ⅲ酶切，回收酶切H1片段与pUC19线性化片段连接，构建重组质粒pUC19-H1，回收酶切H2片段与pUC19-H1酶切线性化片段连接构建重组质粒pUC19-H1-H2。pHA2与pUC19-H1-H2均以PacⅠ线性化，线性化片段经碱性磷酸酶处理后用T4连接酶连接。连接产物转化TOPO10感受态细胞，最后在含氨苄与氯霉素抗性的平板上筛选。挑取的单克隆经引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R鉴定，选取阳性克隆Miniprep方法提取质粒，获得转移载体pUC19-H1-H2/HA。图1显示了携有大肠杆菌F（Mini-F）质粒的BAC载体pHA2通过同源重组插入PRV-ZJ01 US7与US8（gI与gE）基因内的示意图。
取2ug转移载体，采用Lipofactamine 2000（按说明说方法操作）转染BHK-21细胞，转染16小时后在荧光显微镜下观察所构建的转移载体中gfp 表达盒是否表达。中间载体pUC19-H1-H2质粒经PacⅠ线性化大小约为5Kb（图2A），构建的重组病毒转移载体经PCR与测序鉴定，结果表明：发挥同源重组的两个同源臂H1与H2的核苷酸组成与参考序列一致，即转移载体构建成功。用Miniprep方法提取转移载体pUC19-H1-H2/HA的质粒DNA，以Lipofactamine 2000介导转染BHK-21细胞，16小时后在荧光显微镜下可见转染细胞表达gfp（图2B），转染效率可达50%以上。故pUC19-H1-H2/HA作为转移载体可以进行下一步重组病毒的构建。
100ng，灭菌双蒸水补足50μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性45s，62℃退火
45s，68℃延伸90s，上述3步骤进行32个循环；68℃后延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析，按AxyPrep DNA Gel Extraction Kit说明书回收目的片段。回收PCR扩增产物连接pEASYTM-Blunt Zero载体，挑取阳性菌株进行测序分析。提取测序正确的重组H1与H2质粒分别用EcoRⅠ/Sac Ⅰ与PstⅠ/Hind Ⅲ酶切，回收酶切H1片段与pUC19线性化片段连接，构建重组质粒pUC19-H1，回收酶切H2片段与pUC19-H1酶切线性化片段连接构建重组质粒pUC19-H1-H2。pHA2与pUC19-H1-H2均以PacⅠ线性化，线性化片段经碱性磷酸酶处理后用T4连接酶连接。连接产物转化TOPO10感受态细胞，最后在含氨苄与氯霉素抗性的平板上筛选。挑取的单克隆经引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R鉴定，选取阳性克隆Miniprep方法提取质粒，获得转移载体pUC19-H1-H2/HA。图1显示了携有大肠杆菌F（Mini-F）质粒的BAC载体pHA2通过同源重组插入PRV-ZJ01 US7与US8（gI与gE）基因内的示意图。
取2ug转移载体，采用Lipofactamine 2000（按说明说方法操作）转染BHK-21细胞，转染16小时后在荧光显微镜下观察所构建的转移载体中gfp 表达盒是否表达。中间载体pUC19-H1-H2质粒经PacⅠ线性化大小约为5Kb（图2A），构建的重组病毒转移载体经PCR与测序鉴定，结果表明：发挥同源重组的两个同源臂H1与H2的核苷酸组成与参考序列一致，即转移载体构建成功。用Miniprep方法提取转移载体pUC19-H1-H2/HA的质粒DNA，以Lipofactamine 2000介导转染BHK-21细胞，16小时后在荧光显微镜下可见转染细胞表达gfp（图2B），转染效率可达50%以上。故pUC19-H1-H2/HA作为转移载体可以进行下一步重组病毒的构建。
[0023] 重组病毒的构建与噬斑纯化取转移载体pUC19-H1-H2/HA与PRV-ZJ01 gDNA各1.5微克采用Lipofactamine 2000（按Invitrogen公司提供的说明书操作）共转染BHK-21细胞，共转染48小时后，弃去维持液，覆盖含有1%低熔点琼脂糖、10%胎牛血清的DMEM，37℃，5%CO2继续培养24小时，在荧光显微镜下可见绿色荧光的蚀斑（为重组病毒噬斑），挑取显示绿色荧光的单个噬斑，在BHK-21细胞上进行噬斑纯化。经6轮纯化后，获得重组病毒命名为PRV-ZJ011G（以下也简称为ZJ011G）（图3）。
[0024] 重组病毒PRV-ZJ01/G株BAC的克隆与拯救3.0 2
PRV-ZJ011G病毒以10 TCID50/mL接种25cm BHK-21细胞，37℃培养12小时后，在荧光显微镜下观察病变达到70%左右用预冷的PBS洗涤1次，4000rpm离心5 min，沉淀以100微升 TE分散重悬后，经酚氯仿法提取重组病毒基因组环状中间体。取2微升PRV-ZJ011G株病毒基因组DNA与50微升E.coli DH 10B感受态细胞混合后置于预冷的0.1 cm电转化杯中，在1500V 200Ω 25uF的条件下进行电击。电击后迅速加入1 mL预热至37℃的SOC液体培养基，置于37℃摇床复苏3小时后，涂布于含34 微克/毫升氯霉素的LB平板，
37℃培养72小时，挑取单菌落至液体培养基后培养48小时，用引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R进行PCR鉴定。选取10个PCR阳性的克隆，Miniprep方法提取质粒命名为pZJ01/G1-10，提取的质粒DNA用BamHⅠ酶切以进行RFLP分析，获得的阳性克隆采用Lipofactamine 2000转染BHK-21细胞，待细胞病变达到80%时，将细胞培养物冻融3次以收获重组病毒，即为拯救的重组毒，命名为rZJ01/G。
PRV-ZJ011G病毒以10 TCID50/mL接种25cm BHK-21细胞，37℃培养12小时后，在荧光显微镜下观察病变达到70%左右用预冷的PBS洗涤1次，4000rpm离心5 min，沉淀以100微升 TE分散重悬后，经酚氯仿法提取重组病毒基因组环状中间体。取2微升PRV-ZJ011G株病毒基因组DNA与50微升E.coli DH 10B感受态细胞混合后置于预冷的0.1 cm电转化杯中，在1500V 200Ω 25uF的条件下进行电击。电击后迅速加入1 mL预热至37℃的SOC液体培养基，置于37℃摇床复苏3小时后，涂布于含34 微克/毫升氯霉素的LB平板，
37℃培养72小时，挑取单菌落至液体培养基后培养48小时，用引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R进行PCR鉴定。选取10个PCR阳性的克隆，Miniprep方法提取质粒命名为pZJ01/G1-10，提取的质粒DNA用BamHⅠ酶切以进行RFLP分析，获得的阳性克隆采用Lipofactamine 2000转染BHK-21细胞，待细胞病变达到80%时，将细胞培养物冻融3次以收获重组病毒，即为拯救的重组毒，命名为rZJ01/G。
[0025] PRV-ZJ01的感染性BAC克隆命名为pZJ01/G-7。提取病毒rZJ01/G的基因组DNA与pZJ01/G-7质粒DNA，经限制性内切酶BamHⅠ酶切，其脉冲场凝胶电泳图谱见图4。 [0026] 重组病毒噬斑形态观察将重组病毒PRV-ZJ011G与拯救的重组病毒rZJ01/G分别接种BHK-21单层细胞，病毒经吸附1h、PBS（pH7.2）洗涤后，覆盖含有1%低熔点琼脂糖、10%胎牛血清的DMEM，37℃，
5%CO2继续培养48小时，比较病变细胞形态，并在荧光显微镜下拍摄各100个噬斑，测量噬斑面积取其平均值。重组病毒ZJ011G与rZJ01/G的噬斑形成时间相同、噬斑形态相似且噬斑面积相近（图5）。
5%CO2继续培养48小时，比较病变细胞形态，并在荧光显微镜下拍摄各100个噬斑，测量噬斑面积取其平均值。重组病毒ZJ011G与rZJ01/G的噬斑形成时间相同、噬斑形态相似且噬斑面积相近（图5）。
[0027] 重组病毒体外增殖特征按照常规病毒学方法测定wtPRV-ZJ01、ZJ011G与rZJ01/G病毒的体外增殖特征。
BHK-21细胞单层接种0.1 MOI病毒后，吸附90 min，PBS（pH7.2）洗涤2次，加入2%DMEM培养液。在接种后0、4、8、12、16、24、36、48与72h收集培养物，于-70℃冻存，每个时间点设置三个重复。收集完全后，将上述病毒培养物以10倍比梯度稀释后，接种于刚长满BHK-21细胞单层的24孔板，每个稀释度设置四个重复，计算上述各时间点收获病毒培养物的TCID50，绘制病毒在体外培养条件下的一步生长曲线。
BHK-21细胞单层接种0.1 MOI病毒后，吸附90 min，PBS（pH7.2）洗涤2次，加入2%DMEM培养液。在接种后0、4、8、12、16、24、36、48与72h收集培养物，于-70℃冻存，每个时间点设置三个重复。收集完全后，将上述病毒培养物以10倍比梯度稀释后，接种于刚长满BHK-21细胞单层的24孔板，每个稀释度设置四个重复，计算上述各时间点收获病毒培养物的TCID50，绘制病毒在体外培养条件下的一步生长曲线。
[0028] 测定野生型ZJ01（wtPRV-ZJ01）、ZJ011G与rZJ01/G三个毒株在BHK-21细胞上的7.90
一步生长曲线，结果见图6。wtPRV-ZJ01接毒后36h滴度达10 TCID50/mL，ZJ011G接种后
7.53
48h滴度达10 TCID50/mL。
一步生长曲线，结果见图6。wtPRV-ZJ01接毒后36h滴度达10 TCID50/mL，ZJ011G接种后
7.53
48h滴度达10 TCID50/mL。
[0029] 实施例22.1 兔体试验
取9只新西兰大白兔（江苏省农科院实验动物中心），随机分为3组，每组3只，隔离饲
6.0
养，第1、2组分别接种F5 PRV-ZJ01和ZJ011G，背部皮下接种，10 TCID50/mL，第3组作空白对照，每隔8h观察是否出现瘙痒等临床症状。PRV-ZJ01接种后3-5天，3只兔均出现明显瘙痒症状并死亡，脑组织检测均存在PRV，而ZJ011G和空白对照组兔没有明显症状，证明ZJ011G毒力明显降低。
取9只新西兰大白兔（江苏省农科院实验动物中心），随机分为3组，每组3只，隔离饲
6.0
养，第1、2组分别接种F5 PRV-ZJ01和ZJ011G，背部皮下接种，10 TCID50/mL，第3组作空白对照，每隔8h观察是否出现瘙痒等临床症状。PRV-ZJ01接种后3-5天，3只兔均出现明显瘙痒症状并死亡，脑组织检测均存在PRV，而ZJ011G和空白对照组兔没有明显症状，证明ZJ011G毒力明显降低。
[0030] 灭活疫苗制备与猪免疫保护试验2.2.1 疫苗制备
7.0
取ZJ011G病毒液（10 TCID50/mL），采用0.1%甲醛37℃灭活24h，加入ISA15A佐剂（法国Seppic公司），病毒液与佐剂重量比为4:1，乳化呈水包油剂型，无菌检验合格；3000rpm离心10min，不发生分层，剂型稳定。4℃保存。
7.0
取ZJ011G病毒液（10 TCID50/mL），采用0.1%甲醛37℃灭活24h，加入ISA15A佐剂（法国Seppic公司），病毒液与佐剂重量比为4:1，乳化呈水包油剂型，无菌检验合格；3000rpm离心10min，不发生分层，剂型稳定。4℃保存。
[0031] 2.2.2 免疫保护试验1取15头45日龄健康仔猪（PRV、PRRSV和PRV抗原与抗体检测阴性），随机分为3组，每组5头，隔离饲养，第1组接种ZJ011G灭活疫苗，肌肉注射，1mL/头，第2组接种Bartha-K61
6.0
活疫苗，肌肉注射10 TCID50/头。接种后4周，采血分离血清，采用IDEXX PRV gB-ELISA和
6.0
gE-ELISA抗体检测试剂盒检测gB和gE抗体，并采用PRV-ZJ01细胞毒（10 TCID50/mL）攻击，滴鼻1mL/头。攻毒后观察临床表现，死亡猪和明显发病猪采集脑组织冷冻保存，用PCR方法检测PRV核酸，判定疫苗免疫保护效率。
6.0
活疫苗，肌肉注射10 TCID50/头。接种后4周，采血分离血清，采用IDEXX PRV gB-ELISA和
6.0
gE-ELISA抗体检测试剂盒检测gB和gE抗体，并采用PRV-ZJ01细胞毒（10 TCID50/mL）攻击，滴鼻1mL/头。攻毒后观察临床表现，死亡猪和明显发病猪采集脑组织冷冻保存，用PCR方法检测PRV核酸，判定疫苗免疫保护效率。
[0032] ZJ011G灭活疫苗和Bartha-K61活疫苗免疫后4周，PRV gB-ELISA抗体均为阳性，而gE-ELISA抗体均为阴性，PRV-ZJ01攻击后3-5天，对照组逐渐发病，至第14天全部死亡，Bartha-K61活疫苗免疫组3头猪出现精神沉郁，不吃，而ZJ011G灭活疫苗组均无明显临床症状，发病猪和病死猪脑组织用PCR方法检测PRV均为阳性（表2），证明ZJ011G灭活疫苗具有较好免疫保护作用，免疫效力明显高于Bartha-K61活疫苗。
[0033] 表2 ZJ011G灭活疫苗仔猪免疫保护试验结果2.2.3 免疫保护试验2
取6头怀孕80~90天母猪（PRVgB和gE抗体阴性），分成3组，每组2头，每组2头，第1组接种ZJ011G灭活疫苗，肌肉注射，2mL/头，间隔3周后相同方法加强免疫一次，第2组接
6.0
种Bartha-K61活疫苗，肌肉注射10 TCID50/头，第3组不免疫对照，隔离饲养，观察母猪健康和产仔情况。取各组母猪后代21~28日龄健康仔猪10头，采血分离血清，采用IDEXX PRV gB-ELISA和gE-ELISA抗体检测试剂盒检测gB和gE抗体，并将各组仔猪10头再随机分为
2组，共计6个组，即ZJ011G灭活疫苗免疫组1-1和1-2、Bartha-K61活疫苗组2-1和2-2，非免疫对照组3-1和3-2，每组5头，隔离饲养，第1-1、2-1和3-1组采用PRV变异株 ZJ01
6.0
细胞毒（10 TCID50/mL）攻击，滴鼻1mL/头。第1-2、2-2和3-2组采用PRV传统株LA细胞
6.0
毒（10 TCID50/mL）攻击，滴鼻1mL/头。攻毒后观察临床表现，死亡猪和明显发病猪采集脑组织冷冻保存，用PCR方法检测PRV核酸，判定疫苗免疫保护效率。
取6头怀孕80~90天母猪（PRVgB和gE抗体阴性），分成3组，每组2头，每组2头，第1组接种ZJ011G灭活疫苗，肌肉注射，2mL/头，间隔3周后相同方法加强免疫一次，第2组接
6.0
种Bartha-K61活疫苗，肌肉注射10 TCID50/头，第3组不免疫对照，隔离饲养，观察母猪健康和产仔情况。取各组母猪后代21~28日龄健康仔猪10头，采血分离血清，采用IDEXX PRV gB-ELISA和gE-ELISA抗体检测试剂盒检测gB和gE抗体，并将各组仔猪10头再随机分为
2组，共计6个组，即ZJ011G灭活疫苗免疫组1-1和1-2、Bartha-K61活疫苗组2-1和2-2，非免疫对照组3-1和3-2，每组5头，隔离饲养，第1-1、2-1和3-1组采用PRV变异株 ZJ01
6.0
细胞毒（10 TCID50/mL）攻击，滴鼻1mL/头。第1-2、2-2和3-2组采用PRV传统株LA细胞
6.0
毒（10 TCID50/mL）攻击，滴鼻1mL/头。攻毒后观察临床表现，死亡猪和明显发病猪采集脑组织冷冻保存，用PCR方法检测PRV核酸，判定疫苗免疫保护效率。
[0034] 结果为：母猪接种ZJ011G灭活疫苗和Bartha-K61活疫苗后，没有任何异常反应，产仔正常，健仔数与非免疫母猪组相似，分别为21/23、22/24和22/24（健仔数/总仔数）。两种疫苗免疫母猪的后代21~28日龄时PRV gB抗体均为阳性，gE抗体均为阴性。PRV-ZJ01攻击后3-10天，对照组出现呕吐和神经症状等明显临床症状，并全部死亡，Bartha-K61活疫苗免疫组3头猪出现精神沉郁、呕吐和神经症状，ZJ011G灭活疫苗组无明显临床症状。
PRV传统毒株LA攻击后4-14天，对照组均出现明显临床症状，死亡2头，Bartha-K61活疫苗和ZJ011G灭活疫苗免疫组仔猪均无明显异常。所有发病猪和病死猪脑组织用PCR方法检测PRV均为阳性（表3），证明ZJ011G灭活疫苗对PRV变异株和传统毒株均有较好免疫保护作用。
PRV传统毒株LA攻击后4-14天，对照组均出现明显临床症状，死亡2头，Bartha-K61活疫苗和ZJ011G灭活疫苗免疫组仔猪均无明显异常。所有发病猪和病死猪脑组织用PCR方法检测PRV均为阳性（表3），证明ZJ011G灭活疫苗对PRV变异株和传统毒株均有较好免疫保护作用。
[0035] 表3 ZJ011G灭活疫苗对PRV传统毒株攻毒保护试验结果本专利中灭活疫苗免疫保护效率试验中，采用PRV ZJ01株攻击73日龄猪，非免疫对照猪全部发病死亡，证明PRV ZJ01变异株毒力明显强于传统的PRV毒株（传统的PRV毒株不会引起60日龄以上猪死亡）；PRV Bartha-K61疫苗免疫猪不能完全抵抗PRV ZJ01株攻击，而以PRV ZJ01株为基础构建的gE和gI基因缺失毒株PRV ZJ011G株灭活疫苗免疫组猪可以完全抵抗PRV ZJ01株攻击，也再次证明PRV ZJ01株抗原性相比传统的PRV毒株发生了较大变化。本研究以PRV高毒力抗原变异株ZJ01为基础，首次构建成功PRV高毒力抗原变异株ZJ01的gE和gI基因缺失毒株PRV ZJ011G株，并可用于该病疫苗研制，经过试验验证，其对两种PRV强毒株免疫保护率都能达到100%，是一种通用性极强的免疫疫苗。
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