重组人源III型胶原蛋白α1链及其应用
阅读：1051发布：2020-06-25
专利汇可以提供重组人源III型胶原蛋白α1链及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种重组人源III型 胶原蛋白 α1链及其应用，编码该所述重组人源III型胶原蛋白α1链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组人源III型胶原蛋白α1链从 氨 基端依次包含：氨基端亲和纯化标签、人源III型胶原成熟肽链以及羧基端亲和纯化标签。根据本发明 实施例 的重组人源III型胶原蛋白，通过在人源III型胶原成熟肽链的两端都设计有特异性亲和纯化标签，有利于全长蛋白的纯化，也可用于胶原蛋白的鉴定，并且根据本发明实施例的所述重组人源III型胶原蛋白采用的是III型胶原蛋白的成熟肽链，去除了两端的前肽，表达量远高于包含前肽的基因。，下面是重组人源III型胶原蛋白α1链及其应用专利的具体信息内容。
1.一种重组人源III型胶原蛋白α1链，其特征在于，编码该所述重组人源III型胶原蛋白α1链的核苷酸序列如SEQ ID N0：1所示，所述重组人源III型胶原蛋白α1链从氨基端依次包含：氨基端亲和纯化标签、人源III型胶原成熟肽链以及羧基端亲和纯化标签。
2.根据权利要求1所述的重组人源III型胶原蛋白α1链，其特征在于，所述氨基端亲和纯化标签为6His标签，所述羧基端亲和纯化标签为Strep标签。
3.根据权利要求1所述的重组人源III型胶原蛋白α1链，其特征在于，所述人源III型胶原成熟肽链包括人III型胶原N端肽、人III型胶原成螺旋区、人III型胶原C端肽，所述人源III型胶原成熟肽链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求3所述的重组人源III型胶原蛋白α1链，其特征在于，所述人源III型胶原成熟肽链的核苷酸序列由天然胶原基因序列将其密码子按照宿主密码子的使用频率进行调整得到。
5.根据权利要求4所述的重组人源III型胶原蛋白α1链，其特征在于，所述宿主为毕赤酵母，所述调整为将所述天然胶原基因序列中毕赤酵母中的罕见密码子优化为其偏好密码子。
6.根据权利要求3所述的重组人源III型胶原蛋白α1链，其特征在于，所述人源III型胶原成熟肽链的核苷酸序列的扩增引物F(SEQ ID NO：3)和R(SEQ ID N0：4)如下所示：
F：CGGAATTCCATCATCATCATCATCATCAATACGACTCTTATGACGTGA，酶切位点为EcoR I；
R：CGGAATTCTTACTTCTCGAATTGTGGGTGAGACCATCCATAATATGGTGCGAATCCAC，酶切位点EcoR I。
7.根据权利要求6所述的重组人源III型胶原蛋白α1链，其特征在于，所述扩增引物的N端增加能够表达6His的核苷酸序列，C端增加能够表达Strep的核苷酸序列后进行扩增。
8.一种重组人源III型胶原蛋白α1链的应用，其特征在于，所述重组人源III型胶原蛋白应用于医用敷料，所述医用敷料各组分的质量分数为：
根据权利要求1-7中任一项所述的重组人源III型胶原蛋白0.1％～0.5％；
保湿剂1％～10％；
卡波姆0.1％～1％；
三乙醇胺0.1％～10％；
其余为纯化水。
9.一种重组人源III型胶原蛋白α1链的应用，其特征在于，所述重组人源III型胶原蛋白应用于胶原蛋白敷料贴，所述胶原蛋白敷料贴由无纺布基材和设在所述无纺布基材上的胶原蛋白敷料组成，所述胶原蛋白敷料各组分的质量分数为：
根据权利要求1-7中任一项所述的重组人源III型胶原蛋白0.1％～0.5％；
保湿剂1％～10％；
增稠剂0.1％～2％；
其余为纯化水。
10.一种重组人源III型胶原蛋白α 1链的应用，其特征在于，所述重组人源III型胶原蛋白应用于微整形的皮肤黏膜保护剂，所述皮肤黏膜保护基各组分的质量分数为：
根据权利要求1-7中任一项所述的重组人源III型胶原蛋白0.1％～1％；
透明质酸钠0.1％～1％；
保湿剂0～40％；
其余为纯化水。
11.一种重组人源III型胶原蛋白α1链的应用，其特征在于，所述重组人源III型胶原蛋白应用于外用护肤品，所述外用护肤品各组分的质量分数为：
根据权利要求1-7中任一项所述的重组人源III型胶原蛋白0.01％～0.1％；
保湿剂1％～5％；
丁二醇1％～5％；
透明质酸钠0.01％～0.1％；
卡波姆0.1％～1％；
甜菜碱1％～5％；
丝肽0.01％～0.1％；
β-葡聚糖0.1％～1％；
霍霍巴酯0.01％～0.1％；
甘草酸二钾0.1％～0.5％；
三乙醇胺0.1％～1％；
其余为纯化水。
12.一种重组人源III型胶原蛋白α1链的应用，其特征在于，所述重组人源III型胶原蛋白应用于导入性护肤品，所述导入性护肤品各组分的质量分数为：
根据权利要求1-7中任一项所述的重组人源III型胶原蛋白0.1％～0.5％；
保湿剂1％～10％；
透明质酸钠0.1％～0.5％；
小分子透明质酸钠0.01％～0.05％；
氯化钠0.8％～1％；
六胜肽0.0005％～0.002％；
其余为纯化水。
重组人源III型胶原蛋白α1链及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种重组人源III型胶原蛋白α1链及其应用。
背景技术
[0002] 胶原是包括皮肤、骨骼、肌腱和软骨在内的所有结缔组织中的主要蛋白质。例如，它在皮肤中形成大的纤维束，每个纤维束又包含许多单个的胶原原纤维，使得皮肤结构强壮且灵活。成熟的三螺旋的胶原蛋白在人体中含量非常丰富，对一系列工业和医学应用非常有价值。胶原蛋白已被广泛应用于临床应用领域，其在包括软性组织扩张、创口和烧伤的修复、骨科和心血管等方面被证明安全有效。
[0003] 人类III型胶原蛋白(hCOL3A1)属于形成纤维的胶原蛋白，广泛分布于皮肤，内脏器官或血管系统等可伸展的结缔组织中。它在人体伤口愈合，胶原纤维形成和心血管正常发育中起着关键作用。
[0004] 胶原蛋白的获得主要有两种种途径，包括来源于动物组织的传统方法和异源蛋白表达。传统方法主要通过酸、碱或酶解法来处理动物来源的组织，这些方法获得的均为长度不等的混合胶原肽段，给纯化带来不便；由于异源胶原蛋白在临床上表现出的排异反应，限制了其作为生物医学材料和药物载体方面的应用。目前异源蛋白表达采用的宿主主要包括哺乳动物细胞、动物体、植物和微生物，微生物表达相比其他技术有着产量高、生产周期短、培养简单、成本低、易获取高密度发酵等优点。目前用于重组表达人胶原蛋白或明胶的宿主菌有毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母、大肠杆菌与短杆菌。毕赤酵母发酵表达产率高、培养基简单、表达蛋白稳定且易于纯化，蛋白具有后修饰如糖基化等能力。使用毕赤酵母异源表达胶原蛋白具有较大优势。
[0005] 现有技术中用于工业生产的多为明胶，未见胶原蛋白成熟肽链大规模生产。David R.Olsen等的研究表明I型胶原的基因中不含两端前肽基因时，表达量分别为原胶原的18倍、缺乏N前肽基因的4.6倍和缺乏C前肽基因的3倍。且用于生产的重组表达人源胶原，通常不添加或只在一端添加亲和标签，而表达出的成熟肽链较易降解，经传统非特异性纯化方法或单一亲和标签纯化获得的蛋白纯度不够，难以去除部分降解产物，无法满足对纯度要求高的应用。现有技术中利用微生物获得胶原蛋白还存在以下不足之处：表达胶原的DNA序列均为人基因组中的天然编码序列(一般通过反转录方法获得)，但微生物与人在基因的转录、翻译过程中有着一定的差别，尤其是密码子的偏好性上有所不同，使用人胶原的天然编码DNA序列在微生物中表达，会因密码子偏好性、mRNA的结构等造成翻译表达效率低下。
发明内容
[0006] 本发明旨在至少解决上述技术问题之一。
[0007] 为此，本发明提出一种重组人源III型胶原蛋白α1链，该重组人源III型胶原蛋白α1链纯化和鉴定方便。
[0008] 本发明还提出一种重组人源III型胶原蛋白α1链的应用。
[0009] 根据本发明第一方面实施例的重组人源III型胶原蛋白α1链，编码该所述重组人源III型胶原蛋白α1链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组人源III型胶原蛋白α1链从氨基端依次包含：氨基端亲和纯化标签、人源III型胶原成熟肽链以及羧基端亲和纯化标签。
[0010] 根据本发明上述实施例的重组人源III型胶原蛋白α1链，还可以具有如下的附加技术特征
[0011] 根据本发明的一个实施例，所述氨基端亲和纯化标签为6His标签，所述羧基端亲和纯化标签为Strep标签。
[0012] 根据本发明的一个实施例，所述人源III型胶原成熟肽链包括人III型胶原N端肽、人III型胶原成螺旋区、人III型胶原C端肽，所述人源III型胶原成熟肽链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0013] 根据本发明的一个实施例，所述人源III型胶原成熟肽链的核苷酸序列由天然胶原基因序列将其密码子按照宿主密码子的使用频率进行调整得到。
[0014] 根据本发明的一个实施例，所述宿主为毕赤酵母，所述调整为将所述天然胶原基因序列中毕赤酵母中的罕见密码子优化为其偏好密码子。
[0015] 根据本发明的一个实施例，所述人源III型胶原成熟肽链的核苷酸序列的扩增引物F(SEQ ID NO：3)和R(SEQ ID NO：4)如下所示：
[0016] F：CGGAATTCCATCATCATCATCATCATCAATACGACTCTTATGACGTGA，酶切位点为EcoRI；
[0017] R：CGGAATTCTTACTTCTCGAATTGTGGGTGAGACCATCCATAATATGGTGCGAATCCAC，酶切位点EcoRI。
[0018] 根据本发明的一个实施例，所述扩增引物的N端增加能够表达6His的核苷酸序列，C端增加能够表达Strep的核苷酸序列后进行扩增。
[0019] 根据本发明第二方面实施例的重组人源III型胶原蛋白α1链的应用，所述重组人源III型胶原蛋白应用于医用敷料，所述医用敷料各组分的质量分数为：根据上述实施例所述的重组人源III型胶原蛋白0.1％～0.5％；保湿剂1％～10％；卡波姆0.1％～1％；三乙醇胺0.1％～10％；其余为纯化水。
[0020] 根据本发明的一个实施例，所述重组人源III型胶原蛋白应用于胶原蛋白敷料贴，所述胶原蛋白敷料贴由无纺布基材和设在所述无纺布基材上的胶原蛋白敷料组成，所述胶原蛋白敷料各组分的质量分数为：根据上述实施例所述的重组人源III型胶原蛋白0.1％～0.5％；保湿剂1％～10％；增稠剂0.1％～2％；其余为纯化水。
[0021] 根据本发明的一个实施例，所述重组人源III型胶原蛋白应用于微整形的皮肤黏膜保护剂，所述皮肤黏膜保护基各组分的质量分数为：根据上述实施例所述的重组人源III型胶原蛋白0.1％～1％；透明质酸钠0.1％～1％；保湿剂0～40％；其余为纯化水。
[0022] 根据本发明的一个实施例，所述重组人源III型胶原蛋白应用于外用护肤品，所述外用护肤品各组分的质量分数为：根据上述实施例所述的重组人源III型胶原蛋白0.01％～0.1％；保湿剂1％～5％；丁二醇1％～5％；透明质酸钠0.01％～0.1％；卡波姆0.1％～1％；甜菜碱1％～5％；丝肽0.01％～0.1％；β-葡聚糖0.1％～1％；霍霍巴酯0.01％～
0.1％；甘草酸二钾0.1％～0.5％；三乙醇胺0.1％～1％；其余为纯化水。
0.1％；甘草酸二钾0.1％～0.5％；三乙醇胺0.1％～1％；其余为纯化水。
[0023] 根据本发明的一个实施例，所述重组人源III型胶原蛋白应用于导入性护肤品，所述导入性护肤品各组分的质量分数为：根据上述实施例所述的重组人源III型胶原蛋白0.1％～0.5％；保湿剂1％～10％；透明质酸钠0.1％～0.5％；小分子透明质酸钠0.01％～
0.05％；氯化钠0.8％～1％；六胜肽0.0005％～0.002％；其余为纯化水。
0.05％；氯化钠0.8％～1％；六胜肽0.0005％～0.002％；其余为纯化水。
[0024] 根据本发明实施例的重组人源III型胶原蛋白α1链至少具有以下技术效果：
[0025] (1)根据本发明实施例的重组人源III型胶原蛋白α1链在胶原蛋白的两端设计有不同的特异性亲和纯化标签，有利于全长蛋白的纯化，也可用于胶原蛋白的鉴定；
[0026] (2)根据本发明实施例的重组人源III型胶原蛋白α1链采用的是III型胶原蛋白的成熟肽链，去除了两端的前肽，表达量远高于包含前肽的基因；
[0027] (3)根据本发明实施例的重组人源III型胶原蛋白α1链根据毕赤酵母密码子偏好性，对III型胶原基因进行了密码子优化，消除了毕赤酵母中的罕见密码子及发夹结构，通过同义转换，优化mRNA的二级结构，避免了密码子利用限制导致的翻译效率低下，使其更适于在毕赤酵母中表达。
[0029] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0030] 图1为根据本发明实施例的重组人源III型胶原蛋白在制备过程中所采用的载体pPIC9K-His-COL3-Strep的构建技术路线图；
[0031] 图2为重组毕赤酵母工程菌表达根据本发明实施例的重组人源III型胶原蛋白的SDS-PAGE分析图；
[0032] 图3为根据本发明实施例的重组人源III型胶原蛋白的Western Blot检测图；图3a为抗Srtep-tagII抗体的WB图，图3b为抗His抗体的WB图；
[0033] 图4a和图4b为图2中116KDa处条带的质谱分析结果图。
具体实施方式
[0034] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0035] 下面首先描述根据本发明实施例的所述重组人源III型胶原蛋白α1链。
[0036] 编码根据本发明实施例的所述重组人源III型胶原蛋白α1链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组人源III型胶原蛋白α1链从氨基端依次包含：氨基端亲和纯化标签、人源III型胶原成熟肽链以及羧基端亲和纯化标签。
[0037] 换言之，根据本发明实施例的所述重组人源III型胶原蛋白是一种在人源III型胶原成熟肽链的基础上，在氨基酸和羧基端分别带有亲和纯化标签的胶原蛋白。由此，通过在人源III型胶原成熟肽链的两端都设计有特异性亲和纯化标签，有利于全长蛋白的纯化，也可用于胶原蛋白的鉴定，并且根据本发明实施例的所述重组人源III型胶原蛋白采用的是III型胶原蛋白的成熟肽链，去除了两端的前肽，表达量远高于包含前肽的基因。
[0038] 可选地，根据本发明的一个实施例，所述氨基端亲和纯化标签为6His标签，所述羧基端亲和纯化标签为Strep标签。采用两端双亲和标签纯化，可以获得单一的、完整无降解的III型胶原成熟肽链，可适用于医药领域等对产品均一度有要求的领域。这两种标签序列很小，不影响胶原的生物学功能；同时两种标签可作为III型胶原蛋白检测、鉴定的特异性标记序列。
[0039] 在本发明的一些具体实施方式中，所述人源III型胶原成熟肽链包括人III型胶原N端肽、人III型胶原成螺旋区、人III型胶原C端肽，所述人源III型胶原成熟肽链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。优选地，所述人源III型胶原成熟肽链的核苷酸序列由天然胶原基因序列将其密码子按照宿主密码子的使用频率进行调整得到。进一步地，所述宿主为毕赤酵母，所述调整为将所述天然胶原基因序列中毕赤酵母中的罕见密码子优化为其偏好密码子。
[0040] 也就是说，根据本发明实施例的人源III型胶原成熟肽链主要由人III型胶原N端肽、人III型胶原成螺旋区、人III型胶原C端肽组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该基因为优化后的基因，优化的III型胶原成熟肽链的基因序列是将天然胶原基因中的密码子按宿主密码子使用频率进行调整，不改变天然胶原的氨基酸序列；通过从头合成的方法合成该序列，表达所用的宿主为毕赤酵母。
[0041] 本发明表达的人III型胶原成熟肽链具有完整的蛋白质序列，包含具有细胞粘附活性的肽段及其他有生物活性的序列，能使其完成生物学功能；使用毕赤酵母来表达生产胶原蛋白，无内毒素，且可对胶原蛋白进行多种翻译后修饰，以其生产的胶原蛋白具有更好的生物学功能。
[0042] 下面具体描述表达上述基因的重组工程菌及蛋白制备方法。
[0043] 步骤一、构建重组表达载体
[0044] 首先，提供一种优化了的人源III型胶原蛋白成熟肽链的基因序列。其中，本发明在不改变胶原蛋白原始氨基酸序列的前提下优化其对应的基因序列，其优化处理是根据毕赤酵母偏好密码子进行，将胶原蛋白基因序列中毕赤酵母中的罕见密码子agg、cgt、ggg、ggc、gca等优化为其偏好密码子aga、ggt、gct等，使其更利于在毕赤酵母中表达。其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0045] 接着，通过基因合成的方获得上述基因序列。设计人源III型胶原成熟肽链的核苷酸序列的扩增引物F(SEQ ID NO：3)和R(SEQ ID NO：4)如下所示：
[0046] F：CGGAATTCCATCATCATCATCATCATCAATACGACTCTTATGACGTGA，酶切位点为EcoRI；
[0047] R：CGGAATTCTTACTTCTCGAATTGTGGGTGAGACCATCCATAATATGGTGCGAATCCAC，酶切位点EcoRI。
[0048] 所述扩增引物的N端增加能够表达6His的核苷酸序列，C端增加能够表达Strep的核苷酸序列后进行扩增。以从头合成的基因序列为模板扩增优化的III型胶原成熟肽链的基因，产物长度为3262bp。将扩增产物His-3A1-Strep和载体pPIC9K分别经EcoRI单酶切，质粒经碱性磷酸酶处理，以SolutionI连接试剂(购自大连TaKaRa公司)连接构建表达质粒pPIC9K-His-3A1-Strep。
[0049] 步骤二、构建基因重组毕赤酵母工程菌
[0050] 将重组表达质粒pPIC9K-His-3A1-Strep用限制性内切酶SalI线性化，并电转入毕赤酵母感受态细胞中，以组氨酸缺陷型标记和G418抗性标记筛选高拷贝阳性重组子，得到重组毕赤酵母工程菌。
[0051] 步骤三、制备重组人源III型胶原蛋白
[0052] 用BMGY培养基于30℃、220rpm培养毕赤酵母工程菌16h-～18h，至OD600达到2～6；室温下1500g～3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600为1～2，于30℃、220rpm培养3天；每24h向培养基中添加甲醇至终浓度为1％；发酵结束后，离心收集上清，在非变性条件下用Ni-NTA树脂吸附重组人源III型胶原蛋白，穿透出杂质，洗脱重组人源III型胶原蛋白，收集洗脱液；Strep-Tactin树脂吸附重组人源III型胶原蛋白，穿透出杂质，洗脱重组人源III型胶原蛋白，收集洗脱液，洗脱液经过超滤系统脱盐、浓缩，浓缩液经冷冻干燥得到重组人源III型胶原蛋白。
[0053] 由此，本发明根据毕赤酵母密码子偏好性，对III型胶原基因进行了密码子优化，消除了毕赤酵母中的罕见密码子及发夹结构，通过同义转换，优化mRNA的二级结构，避免了密码子利用限制导致的翻译效率低下，使其更适于在毕赤酵母中表达。
[0054] 总而言之，根据本发明实施例的所述重组人源III型胶原蛋白提供了一种两端均带有亲和纯化标签的III型胶原成熟肽链，解决了现有技术中降解产物导致的纯化困难问题，方便纯化得到全长的、无降解蛋白的人源III型胶原蛋白成熟肽段。并且根据氨基酸序列和毕赤酵母的密码子使用频率优化基因序列，可以提高重组酵母中胶原蛋白的翻译效率。
[0055] 下面具体描述根据本发明实施例的所述重组人源III型胶原蛋白的应用。
[0056] 根据本发明实施例的所述重组人源III型胶原蛋白可以应用于多种领域，例如医用辅料、用于微整形的胶原蛋白敷料贴、皮肤黏膜保护剂、化妆品和导入性美容产品等。
[0057] 具体地，当所述重组人源III型胶原蛋白应用于医用敷料时，所述医用敷料各组分的质量分数为：重组人源III型胶原蛋白0.1％～0.5％；保湿剂1％～10％；卡波姆0.1％～1％；三乙醇胺0.1％～10％；其余为纯化水。其中，保湿剂可以为甘油。
[0058] 当所述重组人源III型胶原蛋白应用于胶原蛋白敷料贴时，所述胶原蛋白敷料贴由无纺布基材和设在所述无纺布基材上的胶原蛋白敷料组成，所述胶原蛋白敷料各组分的质量分数为：重组人源III型胶原蛋白0.1％～0.5％；保湿剂1％～10％；增稠剂0.1％～2％；其余为纯化水。其中，保湿剂可以为甘油，增稠剂可以为黄原胶。
[0059] 当所述重组人源III型胶原蛋白应用于微整形的皮肤黏膜保护剂时，所述皮肤黏膜保护基各组分的质量分数为：重组人源III型胶原蛋白0.1％～1％；透明质酸钠0.1％～1％；保湿剂0～40％；其余为纯化水。其中，保湿剂可以为甘油。所制得的制备液灭菌后，无菌灌装。
[0060] 当所述重组人源III型胶原蛋白应用于制备化妆品，例如外用护肤品时，所述外用护肤品各组分的质量分数为：重组人源III型胶原蛋白0.01％～0.1％；保湿剂1％～5％；丁二醇1％～5％；透明质酸钠0.01％～0.1％；卡波姆0.1％～1％；甜菜碱1％～5％；丝肽0.01％～0.1％；β-葡聚糖0.1％～1％；霍霍巴酯0.01％～0.1％；甘草酸二钾0.1％～
0.5％；三乙醇胺0.1％～1％；其余为纯化水。其中，保湿剂可以为甘油。
0.5％；三乙醇胺0.1％～1％；其余为纯化水。其中，保湿剂可以为甘油。
[0061] 当所述重组人源III型胶原蛋白应用于导入性美容产品，例如导入性护肤品时，所述导入性护肤品各组分的质量分数为：重组人源III型胶原蛋白0.1％～0.5％；保湿剂1％～10％；透明质酸钠0.1％～0.5％；小分子透明质酸钠0.01％～0.05％；氯化钠0.8％～1％；六胜肽0.0005％～0.002％；其余为纯化水。其中，保湿剂可以为甘油。
[0062] 由此，根据本发明实施例的所述重组人源III型胶原蛋白可以应用于多种领域，由于本发明表达的人III型胶原成熟肽链具有完整的蛋白质序列，包含具有细胞粘附活性的肽段及其他有生物活性的序列，能使其完成生物学功能，因此，采用了该重组人源III型胶原蛋白的相关产品也具有相应的生物学功能。
[0063] 下面结合具体实施例描述本发明的所述重组人源III型胶原蛋白的制备过程以及应用。
[0064] 一、本发明所选用的毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168菌株、表达载体pPIC9K均购自美国Invitrogen公司。
[0065] 二、培养基配方如下：
[0066] 1)YPD完全培养基：
[0067] 酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含2％琼脂)；
[0068] 2)MD培养基(选择培养基)：
[0069] 配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4g/L)，10×葡萄糖10mL(20g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)；
[0070] 3)BMGY培养基(酵母生长培养基)：
[0071] 完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，3g K2HPO4，11.8g KH2PO4，定容到890mL。121℃蒸汽高压灭菌20min，冷却至60℃以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL；
[0072] 4)BMMY培养基(酵母诱导培养基)：
[0073] 完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，3g K2HPO4，11.8g KH2PO4，定容到895mL。121℃蒸汽高压灭菌20min，冷却至60℃以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL。
[0074] 实施例1
[0075] 基因重组人源III型胶原蛋白的全长为1082个氨基酸，其氨基端为6His标签，羧基端为Strep标签，该基因重组人源III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0076] 制备方法如下：
[0077] 1、构建重组表达载体(如图1所示)
[0078] 1.1合成优化基因
[0079] 根据Genebank登录的III型胶原的基因序列NM_000090.3，根据毕赤酵母密码子使用频率来优化基因密码子，消除使用率低的密码子，同时利用同义转化法消除序列中EcoRI(GAATTC)、NotI(GCGGCCGC)等酶切位点，去除了2个GGTAAG剪接位点和4个GGTGAT剪接位点，优化后的III型胶原基因序列见SEQ ID NO.2，优化后的III型胶原基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。
[0080] 1.2扩增His-3A1-Strep基因
[0081] 根据优化的III型胶原的基因序列，按照引物设计原则，利用Primer Primer 5.0软件设计PCR扩增引物，并在两条引物上分别添加6His和Strep标签的基因，5’端均加上EcoRI酶切位点。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
[0082] F：CGGAATTCCATCATCATCATCATCATCAATACGACTCTTATGACGTGA(SEQ ID NO.3)[0083] R：CGGAATTCTTACTTCTCGAATTGTGGGTGAGACCATCCATAATATGGTGCGAATCCAC(SEQ ID NO.4)
[0084] 以上述引物扩增目的基因，PCR使用的高保真酶为NEB的Q5 2×Master Mix。其中，PCR条件为98℃预变性，2min，一个热循环；98℃热变性10s，55℃退火30s，72℃延伸90s，40个热循环；72℃延伸2min。
[0085] 1.3 PCR产物单酶切
[0086] 用EcolRI单酶切消化步骤1.2中的PCR产物，回收目的片段His-3A1-Strep，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TaKaRa公司)
[0087] PCR产物3μg
[0088] 10×H缓冲液5μL
[0089] EcolRI 10U
[0090] 无菌水至50μL
[0091] 1.4质粒pPIC9K单酶切
[0092] 用EcolRI单酶切消化质粒pPIC9K，回收线性化载体，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TaKaRa公司)
[0093] 质粒pPIC9K 5μg
[0094] 10×H缓冲液10μL
[0095] EcolRI 50U
[0096] 无菌水至100μL
[0098] 1.6由步骤1.5步回收得到的载体pPIC9K经CIAP处理，去除载体DNA片段的5’-末端的磷酸基团。反应体系如下(所用的试剂盒购自大连TaKaRa公司，具体操作按试剂盒说明书进行)
[0099] 质粒pPIC9K载体片段20μL
[0100] 10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL
[0101] CIAP(30U/μL)1μL
[0102] 无菌水至50μL
[0103] 1.7将步骤1.5回收得到的目的片段His-3A1-Strep和步骤1.6处理后得到的载体pPIC9K用SolutionI连接试剂(购自大连TaKaRa公司)进行连接反应，目的片段准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：
[0104] 质粒pPIC9K线性化片段2μL
[0105] His-3A1-Strep 3μL
[0106] SolutionI连接试剂5μL
[0107] 得重组表达载体pPIC9K-His-3A1-Strep，构建示意图如图1所示。
[0108] 将连接产物转化进入感受态大肠杆菌DH5α，在含有Amp的LB抗性平板筛选阳性克隆，利用引物F和通用引物3’AOX1进行菌落PCR验证，有大小为3381bp的片段的为阳性克隆。提取质粒酶切鉴定正确后，将重组质粒进行测序鉴定。
[0109] 2、构建重组毕赤酵母工程菌
[0110] 2.1表达载体pPIC9K-His-3A1-Strep的线性化
[0111] 用限制性内切酶SalI于37℃进行酶切消化过夜，反应体系如下：
[0112] 质粒pPIC9K-His-3A1-Strep 10μg
[0113] 10×H缓冲液5μL
[0114] SalI 50U
[0115] 无菌水至200μL
[0116] 然后以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测是否完全切开，待完全切开后，用PCR产物纯化试剂盒对酶切液进行处理，回收线性化质粒，使体积控制在10μL左右。
[0117] 2.2制备毕赤酵母SMD1168感受态细胞
[0118] 1)挑取酵母SMD1168单菌落，接种至含有5mL的YPD液体培养基的试管中，30℃、220rpm振荡培养过夜；
[0119] 2)取50μL的过夜培养物接种至含有50mL新鲜YPD液体培养基的500mL三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养过夜，至OD600值达到1.1～1.3；
[0120] 3)将培养物于4℃，1500×g离心5min，用50mL冰预冷的无菌双蒸水重悬菌体；
[0121] 4)按步骤3)离心，用25mL冰预冷的无菌双蒸水重悬菌体；
[0122] 5)按步骤3)离心，用20mL冰预冷的1M的山梨醇溶液重悬菌体；
[0123] 6)按步骤3)离心，用0.3mL冰预冷的1M的山梨醇溶液重悬菌体，其终体积约为0.5mL；
[0124] 7)分装成每80μL一份，于-70℃保存备用。
[0125] 2.3毕赤酵母的电转化
[0126] 1)将一个0.2cm的电转杯置于冰中预冷10min；
[0127] 2)将新鲜制备的毕赤酵母感受态细胞中加入约10μL的线性化的pPIC9K-His-3A1-Strep质粒，轻轻混匀，转至0.2cm冰预冷的电转杯中，继续于冰上预冷5min；
[0129] 4)电击结束，迅速加入1mL冰预冷的1M的山梨醇溶液，轻轻吹打混匀，并转至1.5mL离心管中，30℃孵育1h；
[0130] 5)将菌悬液涂布于MD平板上，每100μL～200μL涂布一块平板，室温静置10min，于30℃倒置培养2-5天，直至有单菌落出现。
[0131] 2.4多拷贝插入重组子的筛选
[0132] 1)在生长有转化子的MD平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子，并转移到50mL离心管中；
[0133] 2)加入20mL无菌双蒸水稀释，混匀后测定其OD600值(10D600＝5×107cells/mL)；
[0134] 3)取108个细胞涂布于含有0.5mg/mLG418的YPD平板上，倒置，30℃培养3～4d；
[0135] 4)在无菌96孔板中每孔加入200μL YPD液体培养基；
[0136] 5)用无菌牙签往步骤4)的96孔板中分别接入在含有0.5mg/mL G418的YPD平板上获得的转化子，混匀，于30℃培养48h；
[0137] 6)48h后，取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第一块96孔板所得的培养物，于30℃培养24h；
[0138] 7)24h后，再取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第二块96孔板所得的培养物，于30℃培养24h；
[0139] 8)24h后，从第三块96孔板中取出1μL分别点在含有1.0mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上，于30℃继续培养96h～120h。毕赤酵母转化子若能在含高浓度G418的平板上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因，即有多个pPIC9K-His-3A1-Strep片段进入了酵母体内并通过同源重组整合到酵母的染色体上。经过这一步筛选得到的高拷贝的重组酵母将更有可能实现目的蛋白的高效表达。
[0140] 2.5重组子的PCR鉴定
[0141] 挑选重组子单菌落接种YPD液体培养基，30℃、220rpm过夜培养，取1ml菌液提取基因组，酵母基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，具体操作步骤参考试剂盒说明书。
[0142] 以基因组DNA为模板，5’AOX1、3’AOX1通用引物为扩增引物进行PCR，所用的酶为Ex Taq，购自大连TaKaRa公司。其中，PCR条件为98℃预变性，2min，一个热循环；98℃热变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，25个热循环；72℃延伸2min。扩增产物有两个条带，一条
2.2kb的为SMD1168基因组自身的AOX1基因，另一条3968bp的为目的基因。
2.2kb的为SMD1168基因组自身的AOX1基因，另一条3968bp的为目的基因。
[0143] 2.6重组酵母的诱导表达
[0144] 1)分别挑选单菌落，置于装有10mL BMGY培养基的100mL三角瓶中，于28-30℃、220rpm培养至OD600为2-6(16-18h).
[0145] 2)室温下1500～3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600为1左右。
[0146] 3)将步骤2)所得的菌液置于250mL的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃、220rpm的摇床上继续生长3天。
[0147] 4)每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％。
[0148] 5)按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mL EP管中，最大转速离心2-3min，收集上清。分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：12h、24h、
36h、48h、60h和72h。
36h、48h、60h和72h。
[0149] 6)待检测样品于-80℃保存备用。
[0150] 2.7重组人源III型胶原蛋白的鉴定
[0151] 1)将步骤2.6中收取的上清进行SDS-PAGE检测，结果如图2所示。
[0152] 2)目的蛋白N端有6His标签，C端有Srtep-tagII标签，分别以购自南京金斯瑞生物科技有限公司的抗Srtep-tagII抗体(A01736)、圣克鲁斯生物技术有限公司的抗His抗体(sc-8036)进行检测，结果如图3所示(3a为抗Srtep-tagII抗体的WB图，3b为抗His抗体的WB图)120kDa左右的条带可被两种抗体识别，可证明其为带有6His、Srtep-tagII双标签的完整重组蛋白。
[0153] 3)将步骤1)SDS-PAGE上116KDa处的条带割下，经Nano-LC-ESI-MS/MS蛋白鉴定，该条带为人源III型胶原α1链，结果如图4a和图4b所示。图4a为特征肽段与数据库中人源III型胶原α1链的序列对比结果，图4b中结果表明116KDa处的条带含有两种主要蛋白，匹配记录1中检测的110个肽段中有38个为人源III型胶原α1链特征肽段，该条带中人III型胶原α1链相对丰度为94.8％，确认为人源III型胶原α1链。
[0154] 其中，验证正确的重组毕赤酵母工程菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.17148，保藏日期：2019年1月10日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
[0155] 3、制备基因重组人源III型胶原蛋白
[0156] 1)按步骤2.6方法发酵结束后，4℃下3000g离心20min，收集上清。
[0157] 2)上清中加入10倍的体积的纯化水，再经超滤浓缩透析后到原体积的20％。
[0158] 3)取1mL浓缩液中加入100μL1×Ni-NTA结合缓冲液，4℃充分混合。
[0159] 4)加入20μL 50％Ni-NTAHis·Bands树脂悬液轻柔混匀，结合30min。
[0160] 5)15000×g离心10秒沉淀树脂，弃上清。
[0161] 6)用100μL 1×Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗树脂，15000×g离心10秒，小心吸去上清，再重复一次。
[0162] 7)用200μL 1×Ni-NTA洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，15000×g离心10秒，小心将上清转移至干净小管中，再重复2次。
[0163] 8)收集上清，使用Strep结合缓冲液4℃透析过夜。
[0164] 9)取上述透析液加入100μL Strep-Tactin树脂悬液轻柔混匀，结合30min。
[0165] 10)15000×g离心10秒沉淀树脂，弃上清。
[0166] 11)用200μL 1×Strep-Tactin漂洗缓冲液漂洗树脂，15000×g离心10秒，小心吸去上清，再重复一次。
[0167] 12)用200μL 1×Strep-Tactin洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，15000×g离心10秒，小心将上清转移至干净小管中，再重复2次。
[0168] 13)将得到的洗脱液经脱盐、浓缩，所制得的浓缩液经真空冷冻干燥制得重组人源III型胶原蛋白。
[0170] 15)冻干结束后，小心打开放气阀，直至内外气压平衡。取出烧杯，得到白色海绵状重组人源III型胶原蛋白。
[0171] 实施例2胶原蛋白外用护肤品制备例
[0172] 按以下质量配比，用水溶解各原料，并充分搅拌均匀即成一款无色无味透明的保湿护肤精华液。
[0173] 例1、本发明实施例1制备的重组人源III型胶原蛋白0.1％；甘油1％；丁二醇1％；透明质酸钠0.1％；卡波姆0.5％；甜菜碱1％；丝肽0.05％；β-葡聚糖0.2％；霍霍巴酯0.1％；
甘草酸二钾0.3％；三乙醇胺0.1％；其余为纯化水。
甘草酸二钾0.3％；三乙醇胺0.1％；其余为纯化水。
[0174] 例2、本发明实施例1制备的重组人源III型胶原蛋白0.01％；甘油5％；丁二醇5％；透明质酸钠0.01％；卡波姆0.1％；甜菜碱5％；丝肽0.01％；β-葡聚糖0.1％；霍霍巴酯
0.01％；甘草酸二钾0.1％；三乙醇胺1％；其余为纯化水。
0.01％；甘草酸二钾0.1％；三乙醇胺1％；其余为纯化水。
[0175] 例3、本发明实施例1制备的重组人源III型胶原蛋白0.1％；甘油3％；丁二醇3％；透明质酸钠0.05％；卡波姆1％；甜菜碱3％；丝肽0.1％；β-葡聚糖1％；霍霍巴酯0.05％；甘草酸二钾0.5％；三乙醇胺0.5％；其余为纯化水。
[0176] 使用方法：早晚洁面后，直接涂抹于面部，轻轻拍打至完全吸收。
[0177] 实施例3胶原蛋白凝胶敷料制备例
[0178] 例1、所述胶原蛋白凝胶以纯化水为溶剂，其组分还包括重组人源III型胶原蛋白、凝胶剂、保湿剂；所述凝胶剂为卡波姆；所述保湿剂为甘油；各组分的质量配比为：重组人源III型胶原蛋白0.1％、甘油5％，卡波姆0.4％、三乙醇胺5％，其余为纯化水。
[0179] 制备步骤如下所示：
[0180] ①称取50.0g甘油，加入4.0g卡波姆，搅拌1h；
[0181] ②称取重组人源III型胶原蛋白1.0g，用100mL纯化水溶解；
[0182] ③将步骤②所得物料全部转入步骤①所得物料中，补足纯化水至总质量为990.0g，搅拌1h；
[0183] ④加入10.0g的三乙醇胺搅拌1h，制得的制备液辐照灭菌后，无菌灌装，即得胶原蛋白凝胶敷料产品。
[0184] 例2、所述胶原蛋白凝胶以纯化水为溶剂，其组分还包括重组人源III型胶原蛋白、凝胶剂、保湿剂；所述凝胶剂为卡波姆；所述保湿剂为甘油；各组分的质量配比为：重组人源III型胶原蛋白0.5％、甘油1％，卡波姆0.1％、三乙醇胺0.1％，其余为纯化水。
[0185] 制备步骤如下所示：
[0186] ①称取10.0g甘油，加入1.0g卡波姆，搅拌1h；
[0187] ②称取重组人源III型胶原蛋白5.0g，用100mL纯化水溶解；
[0188] ③将步骤②所得物料全部转入步骤①所得物料中，补足纯化水至总质量为990.0g，搅拌1h；
[0189] ④加入0.2g的三乙醇胺搅拌1h，制得的制备液辐照灭菌后，无菌灌装，即得胶原蛋白凝胶敷料产品。
[0190] 例3、所述胶原蛋白凝胶以纯化水为溶剂，其组分还包括重组人源III型胶原蛋白、凝胶剂、保湿剂；所述凝胶剂为卡波姆；所述保湿剂为甘油；各组分的质量配比为：重组人源III型胶原蛋白0.1％、甘油10％，卡波姆1％、三乙醇胺10％，其余为纯化水。
[0191] 制备步骤如下所示：
[0192] ①称取100.0g甘油，加入10.0g卡波姆，搅拌1h；
[0193] ②称取重组人源III型胶原蛋白1.0g，用100mL纯化水溶解；
[0194] ③将步骤②所得物料全部转入步骤①所得物料中，补足纯化水至总质量为990.0g，搅拌1h；
[0195] ④加入20.0g的三乙醇胺搅拌1h，制得的制备液辐照灭菌后，无菌灌装，即得胶原蛋白凝胶敷料产品。
[0196] 实施例4胶原蛋白贴敷料制备例
[0197] 重组人源III型胶原蛋白制备胶原蛋白贴敷料产品的应用实施例：
[0198] 所述胶原蛋白贴敷料由重组人源III型胶原蛋白、保湿剂、医用增稠剂和无纺布基材组成；所述保湿剂为甘油；所述增稠剂为黄原胶。
[0199] 例1、各组分的质量配比为：重组人源III型胶原蛋白0.5％；甘油1％；黄原胶1％；其余为纯化水。
[0200] 制备步骤如下所示：
[0201] ①精确称取各组分，溶于纯化水中，充分搅拌、混匀；
[0203] 例2、各组分的质量配比为：重组人源III型胶原蛋白0.1％；甘油10％；黄原胶2％；其余为纯化水。
[0204] 制备步骤如下所示：
[0205] ①精确称取各组分，溶于纯化水中，充分搅拌、混匀；
[0206] ②按25mL灌装到含无纺布基材的医用铝箔袋中，辐照灭菌处理，封口，即得胶原蛋白贴敷料产品。
[0207] 例3、各组分的质量配比为：重组人源III型胶原蛋白0.1％；甘油5％；黄原胶1％；其余为纯化水。
[0208] 制备步骤如下所示：
[0209] ①精确称取各组分，溶于纯化水中，充分搅拌、混匀；
[0210] ②按25mL灌装到含无纺布基材的医用铝箔袋中，辐照灭菌处理，封口，即得胶原蛋白贴敷料产品。
[0211] 实施例5胶原蛋白基皮肤黏膜保护剂敷料制备例
[0212] 例1、皮肤黏膜保护剂由以下质量配比的原料组成：重组人源III型胶原蛋白1％、透明质酸钠0.5％，甘油10％，其余为纯化水；所制得的制备液灭菌后，无菌灌装。
[0213] 制备步骤如下所示：
[0214] ①称取100.0g甘油，溶于200mL纯化水中，加入重组人源III型胶原蛋白10g和透明质酸钠5g，充分搅拌溶解；
[0215] ②加入纯化水至1000g，搅拌1h；
[0216] ③辐照灭菌后，无菌灌装，即得胶原蛋白基皮肤黏膜保护剂敷料，应用于微整形后的皮肤黏膜保护等。
[0217] 例2、皮肤黏膜保护剂由以下质量配比的原料组成：重组人源III型胶原蛋白0.1％、透明质酸钠1％，甘油40％，其余为纯化水；所制得的制备液灭菌后，无菌灌装。
[0218] 制备步骤如下所示：
[0219] ①称取400.0g甘油，溶于200mL纯化水中，加入重组人源III型胶原蛋白1g和透明质酸钠10g，充分搅拌溶解；
[0220] ②加入纯化水至1000g，搅拌1h；
[0221] ③辐照灭菌后，无菌灌装，即得胶原蛋白基皮肤黏膜保护剂敷料，应用于微整形后的皮肤黏膜保护等。
[0222] 例3、皮肤黏膜保护剂由以下质量配比的原料组成：重组人源III型胶原蛋白1％、透明质酸钠0.1％，其余为纯化水；所制得的制备液灭菌后，无菌灌装。
[0223] 制备步骤如下所示：
[0224] ①称取200mL纯化水，加入重组人源III型胶原蛋白10g和透明质酸钠1g，充分搅拌溶解；
[0225] ②加入纯化水至1000g，搅拌1h；
[0226] ③辐照灭菌后，无菌灌装，即得胶原蛋白基皮肤黏膜保护剂敷料，应用于微整形后的皮肤黏膜保护等。
[0227] 本实施例提供的敷料具有很好的保湿作用，能促使成纤维细胞的移动和增生，抑制其分化，抑制胶原过度沉积所造成疤痕增生。对烧伤、烫伤、擦伤等皮肤黏膜创面有覆盖、促愈合、润滑、保湿、抑制疤痕的作用。
[0228] 实施例6胶原蛋白导入性美容产品制备例
[0229] 重组人源III型胶原蛋白在高档微创美容产品中的应用实施例：
[0230] 用于微创美容的导入性产品水光针，其溶液由以纯化水为溶剂溶解各原料通过无菌方法制备而成，其步骤为：
[0231] 例1、①按照以下质量配比，精确称取各组分，并充分搅拌混匀、定容；其中重组人源III型胶原蛋白0.5％、甘油3％、透明质酸钠0.3％、小分子透明质酸钠0.03％、氯化钠0.9％，六胜肽0.01‰。
[0232] ②用0.22um微孔滤膜过滤除菌；
[0234] ④使用时，直接取出配合导入仪器使用。
[0235] 例2、①按照以下质量配比，精确称取各组分，并充分搅拌混匀、定容；其中重组人源III型胶原蛋白0.1％、甘油1％、透明质酸钠0.5％、小分子透明质酸钠0.05％、氯化钠0.8％，六胜肽0.005‰。
[0236] ②用0.22um微孔滤膜过滤除菌；
[0237] ③无菌条件下，分装到一次性无菌注射器，每支灌装3ml，并进行无菌包装。
[0238] ④使用时，直接取出配合导入仪器使用。
[0239] 例3、①按照以下质量配比，精确称取各组分，并充分搅拌混匀、定容；其中重组人源III型胶原蛋白0.3％、甘油10％、透明质酸钠0.1％、小分子透明质酸钠0.01％、氯化钠1％，六胜肽0.02‰。
[0240] ②用0.22um微孔滤膜过滤除菌；
[0241] ③无菌条件下，分装到一次性无菌注射器，每支灌装3ml，并进行无菌包装。
[0242] ④使用时，直接取出配合导入仪器使用。
[0243] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
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