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基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统

阅读：926发布：2023-02-28

专利汇可以提供基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，涉及微观粒子超分辨成像技术领域，解决现有活体细胞在单分子尺度下的成像问题。包括扫描光学系统；Z轴扫描探测系统；倒置荧光显微成像系统以及自动定焦和锁焦系统。由纳米孔—微透镜产生的超衍射极限聚焦光斑激发样品的荧光信号，根据纳米孔—微透镜Z轴扫描探测系统确定纳米孔—微透镜聚焦光斑和样品之间距离，控制三维压电陶瓷位移台实现对样品的三维方向扫描，自动定焦和锁焦系统确定显微镜和样品的焦面以及锁定该焦面，最后利用倒置荧光显微镜对样品的超分辨成像。本发明所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微镜可以应用于活体细胞内部的单分子成像。，下面是基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统专利的具体信息内容。

权利要求

1.基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，包括扫描光学系统、Z轴扫描控制系统、倒置荧光显微成像系统以及自动定焦和锁焦系统，其特征是；所述纳米孔—微透镜产生的超衍射极限聚焦光斑激发样品的荧光信号，根据纳米孔—微透镜Z轴扫描控制系统确定纳米孔—微透镜聚焦光斑和样品之间距离，控制三维压电陶瓷位移台实现对样品的三维方向扫描，自动定焦和锁焦系统确定显微物镜和样品的焦面并锁定该焦面，最后采用倒置荧光显微镜对样品的超分辨成像；
所述扫描光学系统包括激光器(4)、偏振片(5)、第一聚焦透镜(6)、第一光纤耦合器(7)、扫描探针(8)和三维压电陶瓷位移台(9)；
所述Z轴扫描控制系统包括近红外激光器(10)、衰减片(11)、第二聚焦透镜(12)、第一光纤环形器端口(13)、第二光纤环形器端口(14)、第三光纤环形器端口(15)和雪崩二极管(16)；
所述倒置荧光显微成像系统包括显微物镜(18)、Z轴压电陶瓷(19)、二向色镜(20)、发射滤光片(21)、第三聚焦透镜(22)和传感器(23)；
所述自动定焦和锁焦系统包括激光二极管(24)、空间滤波器(25)、准直器(26)、半透半反滤光片(27)、长波通滤光片(28)、第四聚焦透镜(29)和线阵CCD(30)；
调整激光器(4)发出可见单色激光经偏振片(5)和第一聚焦透镜(6)后通过光纤耦合器(7)传输至扫描探针(8)；
所述激光经过扫描探针(8)照射样品(17)，由样品(17)产生的荧光通过显微物镜(18)汇聚，然后经过二向色镜(20)透射，发射滤光片(21)滤光以及经第三聚焦透镜(22)聚焦后由传感器(23)接收；
所述三维压电陶瓷位移台(9)对样品扫描过程中，每移动一个点发送一个数字触发信号，所述数据采集卡根据接收的触发信号向传感器(23)发送采集数据控制信号；
所述扫描探针(8)固定在三维压电陶瓷位移台(9)上，显微物镜(18)固定在Z轴压电陶瓷(19)上；
近红外激光器(10)出射激光经过衰减片(11)和第二聚焦透镜(12)进入第一光纤环形器端口(13)，第一光纤环形器端口(13)将激光传输至第二光纤环形器端口(14)，第二光纤环形器端口(14)探测样品(17)的后向散射光，所述后向散射光经第三光纤环形器端口(15)后由雪崩二极管(16)探测接收；
所述雪崩二极管(16)根据接收的光强信号转换为电信号发送至数据采集卡，根据对电信号的处理和分析控制三维压电陶瓷位移台(9)，实现对样品的三维方向扫描，并确定纳米孔—微透镜聚焦光斑和样品之间距离；
所述激光二极管(24)产生的近红外激光经过空间滤波器(25)变成高斯点光源，所述点光源入射到准直器(26)变成平行光，所述平行光经过半透半反滤光片(27)和长波通滤光片(28)后由二向色镜(20)反射至显微物镜(18)，并到达样品(17)表面，所述样品(17)被激发后产生的发射激光由显微物镜(18)接收并到达焦面，经焦面反射的光经长波通滤光片(28)和半透半反滤光片(27)后经第四聚焦透镜(29)反射进入线阵CCD(30)；
所述线阵CCD(30)接收焦面反射的光信号并传至数据采集卡，根据信号特征进行数据分析和处理，并发送控制信号至Z轴压电陶瓷(19)，所述Z轴压电陶瓷(19)控制显微物镜(18)的Z轴方向移动，实现自动对焦和锁焦。
2.根据权利要求1所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：
还包括制备纳米孔-微透镜；
首先建立模型和数值仿真，优化纳米孔—微透镜参数；
然后采用真空离子溅射镀膜机在微透镜(1)表面镀金属薄膜(2)，采用聚焦离子束刻蚀技术在镀有金属薄膜的微透镜表面刻蚀纳米孔，最终形成纳米孔—微透镜。
3.根据权利要求1所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：
由光纤(8-1)、准直器(8-2)以及纳米孔—微透镜(8-3)组成扫描探针，光源经准直器(8-2)准直后通过微透镜的纳米孔照射至样品表面；所述扫描探针(8)作为负载固定在三维压电陶瓷位移台(9)上，完成对样品的扫描。
4.根据权利要求1所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：
在位于微透镜中心的金属薄膜(2)上刻蚀直径为10～300nm的纳米孔，所述纳米孔—微透镜后的聚焦光斑直径约5～100nm。
5.根据权利要求1所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：
显微物镜数值孔径为1.30～1.49，放大倍率为100倍。
6.根据权利要求1所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：
激光二极管(24)产生的近红外激光以全内反射形式入射到显微物镜(18)中。
7.根据权利要求1所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：
所述激光器(4)发出的单色激光的波长范围包括可见波段和近红外波段，偏振方向为径向。
8.根据权利要求1所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：
纳米孔—微透镜为纳米孔—单个微透镜或纳米孔—微透镜阵列。
9.根据权利要求1所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：
样品中的被测物包括细胞膜，人工磷脂膜，细胞内部单个生物分子。
10.根据权利要求1所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，其特征在于，所述传感器包括单点光电探测器和成像CCD，来实现对出射激光的探测；其中单点光电探测器是针对纳米孔—单个微透镜构成的扫描探针系统；成像CCD是针对纳米孔—微透镜阵列构成的扫描探针系统。

说明书全文

基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统

技术领域

[0001] 本发明涉及微观粒子超分辨成像技术领域，具体涉及纳米孔—微透镜的三维扫描与荧光显微成像技术相结合实现活细胞内部的快速超分辨成像的方法。

背景技术

[0002] 传统光学显微镜由于受远场衍射极限的影响，根据瑞利判据，其分辨率一般不会超过波长的一半。而波长低于400nm的光通常会损伤活细胞，无法应用于活细胞观测。因此，传统光学显微镜横向分辨率一般仅为230nm左右。而对于生命科学追求的是在小分子尺度对单个活体细胞的动态成像，因此围绕活体细胞的超分辨成像一直是仪器开发的热点。其中扫描电子显微镜(SEM)可以达到0.1nm的超高分辨率，但由于生物样品无法存活于高真空环境，无法应用于活细胞。原子力显微镜(AFM)分辨率可达原子尺度，但是原子力显微镜只能通过形貌图得到少数特殊结构或化学信息。此外，由于缺乏尖端样本交互力的特异性，很难区分样品中共存的不同蛋白质。

发明内容

[0003] 本发明公开一种基于纳米孔—微透镜扫描超分辨成像系统，横向分辨率可以达到5～100nm，解决了活体细胞在单分子尺度下的成像问题。

[0004] 基于纳米孔—微透镜扫描超分辨成像系统，包括扫描光学系统、Z轴扫描控制系统、倒置荧光显微成像系统以及自动定焦和锁焦系统，其特征是；所述纳米孔—微透镜产生的超衍射极限聚焦光斑激发样品的荧光信号，根据纳米孔—微透镜Z轴扫描控制系统确定纳米孔—微透镜聚焦光斑和样品之间距离，控制三维压电陶瓷位移台实现对样品的三维方向扫描，自动定焦和锁焦系统确定显微物镜和样品的焦面并锁定该焦面，最后采用倒置荧光显微镜对样品的超分辨成像；

[0005] 所述扫描光学系统包括激光器、偏振片、第一聚焦透镜、第一光纤耦合器、扫描探针和三维压电陶瓷位移台；

[0006] 所述Z轴扫描控制系统包括近红外激光器、衰减片、第二聚焦透镜、第一光纤环形器端口、第二光纤环形器端口、第三光纤环形器端口和雪崩二极管；

[0007] 所述倒置荧光显微成像系统包括显微物镜、Z轴压电陶瓷、二向色镜、发射滤光片、第三聚焦透镜和传感器；

[0008] 所述自动定焦和锁焦系统包括激光二极管、空间滤波器、准直器、半透半反滤光片、长波通滤光片、第四聚焦透镜和线阵CCD；

[0009] 调整激光器发出可见单色激光经偏振片和第一聚焦透镜后通过光纤耦合器传输至扫描探针；

[0010] 所述激光经过扫描探针照射样品，由样品产生的荧光通过显微物镜汇聚，然后经过二向色镜透射，发射滤光片滤光以及经第三聚焦透镜聚焦后由传感器接收；

[0011] 所述三维压电陶瓷位移台对样品扫描过程中，每移动一个点发送一个数字触发信号，所述数据采集卡根据接收的触发信号向传感器发送采集数据控制信号；

[0012] 所述扫描探针固定在三维压电陶瓷位移台上，显微物镜固定在Z轴压电陶瓷上；

[0013] 近红外激光器出射激光经过衰减片和第二聚焦透镜进入第一光纤环形器端口，第一光纤环形器端口将激光传输至第二光纤环形器端口，第二光纤环形器端口探测样品的后向散射光，所述后向散射光经第三光纤环形器端口后由雪崩二极管探测接收；

[0014] 所述雪崩二极管根据接收的光强信号转换为电信号发送至数据采集卡，根据对电信号的处理和分析控制三维压电陶瓷位移台，实现对样品的三维方向扫描，并确定纳米孔—微透镜聚焦光斑和样品之间距离；

[0015] 所述激光二极管产生的近红外激光经过空间滤波器变成高斯点光源，所述点光源入射到准直器变成平行光，所述平行光经过半透半反滤光片和长波通滤光片后由二向色镜反射至显微物镜，并到达样品表面，所述样品被激发后产生的发射激光由显微物镜接收并到达焦面，经焦面反射的光经长波通滤光片和半透半反滤光片后经第四聚焦透镜反射进入线阵CCD；

[0016] 所述线阵CCD接收焦面反射的光信号并传至数据采集卡，根据信号特征进行数据分析和处理，并发送控制信号至Z轴压电陶瓷，所述Z轴压电陶瓷控制显微物镜的Z轴方向移动，实现自动对焦和锁焦。

[0017] 本发明的有益效果：通过搭建一套纳米孔—微透镜扫描显微成像系统，使该系统具有5～100nm的分辨率，可以实现对细胞内部的单分子成像。

[0018] 本发明的纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统能用于细胞膜结构、活细胞内分子的动态过程以及纳米细胞相互作用及生物效应等研究方向。附图说明

[0019] 图1为本发明所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统中纳米孔—微透镜结构图；

[0020] 图2为本发明所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统中扫描光学系统示意图；

[0021] 图3为扫描探针的结构图；

[0022] 图4为本发明所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统中Z轴扫描控制系统示意图；

[0023] 图5为本发明所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统中倒置荧光显微成像系统示意图；

[0024] 图6为本发明所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统中自动定焦和锁焦系统示意图；

[0025] 图7为本发明所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统示意图。

[0026] 图中，1、微透镜，2、金属薄膜，3、纳米孔，4、激光器，5、偏振片，6 第一聚焦透镜，7、光纤耦合器，8、扫描探针，9、三维压电陶瓷位移台，10、近红外激光器，11、衰减片，12、第二聚焦透镜，13、第一光纤环形器端口， 14、第二光纤环形器端口，15、第三光纤环形器端口，16雪崩二极管，17、样品，18、显微物镜，19、Z轴压电陶瓷，20、二向色镜，21、发射滤光片，22、第三聚焦透镜，23、传感器，24、激光二极管，25、空间滤波器，26、准直器， 27、半透半反滤光片，28、长波通滤光片，29第四聚焦透镜，30、线阵CCD。

具体实施方式

[0027] 具体实施方式一、结合图1至图7说明本实施方式，基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，包括扫描光学系统、Z轴扫描控制系统、倒置荧光显微成像系统以及自动定焦和锁焦系统，

[0028] 所述扫描光学系统用于激光经过微透镜后产生聚焦光斑，利用该聚焦光斑激发样品，产生荧光信号。所述扫描光学系统包括激光器4、偏振片5、第一聚焦透镜6、第一光纤耦合器7、扫描探针8和三维压电陶瓷位移台9；

[0029] 可见单色激发光由激光器4发出，先后经过偏振片5、第一聚焦透镜6到达光纤耦合器7，激光通过光纤传输到扫描探针8。图3为扫描探针的结构图，其中8-1表示光纤，8-2表示准直器，8-3的前端粘附纳米孔—微透镜。扫描探针8 作为负载固定在三维压电陶瓷位移台9上面。

[0030] 所述Z轴扫描控制系统用于对纳米孔—微透镜Z轴位置探测，进而实现对纳米孔—微透镜Z轴闭环控制。所述Z轴扫描控制系统包括近红外激光器10、衰减片11、第二聚焦透镜12、第一光纤环形器端口13、第二光纤环形器端口 14、第三光纤环形器端口15和雪崩二极管16；

[0031] 近红外激光器10出射激光经过衰减片11和第二聚焦透镜12进入第一光纤环形器端口13，第一光纤环形器端口13将激光传输到第二光纤环形器端口14，第二光纤环形器端口14探测样品的后向散射光，并将从第三光纤环形器端口15 出来，被雪崩二极管16探测。所述雪崩二极管16采集的光强信号转换成电信号，发送给数据采集卡，根据数据处理和分析，数据采集卡发送控制信号控制三维压电陶瓷位移台9的Z轴，实现聚焦距离闭环控制。

[0032] 本实施方式中，采用光纤环形器实现对对纳米孔—微透镜Z轴位置探测。

[0033] 所述倒置荧光显微成像系统用于实现对发射荧光信号的收集，进而实现快速扫描成像。所述倒置荧光显微成像系统包括显微物镜18、Z轴压电陶瓷19、二向色镜20、发射滤光片21、第三聚焦透镜22和传感器23；

[0034] 激光器4发出的激光经过扫描探针8照射到样品17，由样品17产生的荧光通过显微物镜18被汇聚，显微物镜18固定在Z轴压电陶瓷19上，经过二向色镜20、发射滤光片21和第三聚焦透镜22被传感器23收集。

[0035] 所述传感器23通过数据线与数据采集卡连接，三维压电陶瓷位移台9在扫描过程中，每移动一个点发送一个数字触发信号，数据采集卡接收触发信号后，向传感器23发送采集数据控制信号。

[0036] 所述的自动定焦和锁焦系统来用于实现自动快速确定物镜焦面，以及避免在扫描过程中受环境振动因素影响，焦面发生漂移现象。所述自动定焦和锁焦系统包括激光二极管24、空间滤波器25、准直器26、半透半反滤光片27、长波通滤光片28、第四聚焦透镜29和线阵CCD30；

[0037] 激光二极管24发出近红外激光经过空间滤波器25变成理想的高斯点光源，入射到准直器26变成平行光，透射经过半透半反滤光片27，经过长波通滤光片 28被二向色镜20反射进入显微物镜18，并到达样品17表面，样品17被激发后产生的出射激光后向散射被显微物镜18收集，然后原路返回至半透半反滤光片27，经过第四聚焦透镜29反射进入线阵CCD30。

[0038] 本实施方式中，所述激光二极管24发出的近红外激光以全内反射方式入射显微物镜18到达焦面，线阵CCD30接收由焦面反射回来的光。并转化成电信号传输给数据采集卡，根据信号特征进行数据分析和处理，发送控制信号给Z 轴压电陶瓷19控制显微物镜18在Z轴方向移动，实现自动对焦和锁焦功能。

[0039] 结合图1说明本实施方式，本实施方式还包括设计并制备纳米孔—微透镜。

[0040] 首先利用时域有限差分法(FDTD)软件建立模型和数值仿真，通过优化纳米孔—微透镜参数，主要包括金属材料、孔径直径、孔径间距、薄膜厚度、孔径形状，实现超强透过率；以及设置入射光特性：空间频率、时间频率、偏振方向，获得满足聚焦光斑在5～100nm之间的纳米孔—微透镜。

[0041] 然后利用真空离子溅射镀膜机在微透镜1表面镀金属薄膜2，利用聚焦离子束刻蚀技术在镀有金属薄膜2的微透镜1表面刻蚀纳米孔3，最终形成纳米孔—微透镜。激发光照射金属薄膜2，利用衍射效应透过纳米孔3到达微透镜1，微透镜1将激光汇聚。

[0042] 本实施方式中也可以采用微纳加工技术实现单个纳米孔—微透镜或纳米孔—微透镜阵列的制备。

[0043] 本实施方式中，制备金属薄膜时，选择遮光度>90％且厚度最薄的金属膜作为本发明的遮光膜。

[0044] 本实施方式中，通过调节偏振片5，实现径向偏振方向照明方式，使光束横截面上任意一点电场矢量方向始终与径向平行，即通过圆心的各个方向，使扫描探针处获得质量较好聚焦焦点。

[0045] 本实施方式中，使用单色激光作为激发光，波长范围包括可见波段和近红外波段，偏振方向为径向。

[0046] 本实施方式所述的倒置荧光显微成像系统中的显微物镜数值孔径为1.30～1.49，放大倍率为100倍。倒置荧光显微成像系统中的传感器包括单点光电探测器和成像CCD，来实现对出射激光的探测。

[0047] 本实施方式中，样品中的被测物包括细胞膜，人工磷脂膜，细胞内部单个生物分子。

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