光片显微镜以及用于运行光片显微镜的方法
阅读：496发布：2020-05-13
专利汇可以提供光片显微镜以及用于运行光片显微镜的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及光片 显微镜 以及用于运行光片显微镜的方法。尤其涉及一种显微镜，包括：带有第一光轴的形成为用于产生光片的照明物镜，和带有第二光轴的形成为用于检测从样本平面发出的光的检测物镜。照明物镜和检测物镜相互且相对于样本平面定向为使得第一光轴和第二光轴在样本平面内相交且相互形成基本上直 角 。光轴和与和样本平面 正交 地指向的参考轴形成不同于零的角度。此外，存在形成为用于样本平面的远场照明的概览照明设备，其具有带有第三光轴的照明光学器件，使得检测物镜提供且形成为用于检测光片的光以及照明光学器件的光。本发明此外涉及用于运行光片显微镜的方法。，下面是光片显微镜以及用于运行光片显微镜的方法专利的具体信息内容。
1.一种显微镜(1)，包括：
带有第一光轴(A1)的形成为用于产生光片(6)的照明物镜(2)，其中光片(6)至少部分地产生或可产生在样本平面(4)内，和带有第二光轴(A2)的形成为用于检测从样本平面(4)发出的光的检测物镜(3)，其中：
照明物镜(2)和检测物镜(3)相互且相对于样本平面(4)定向为使得第一光轴(A1)和第二光轴(A2)在样本平面内(4)相交且相互形成基本上直角，和
第一光轴(A1)和第二光轴(A2)分别与和样本平面(4)正交地指向的参考轴(B)形成不同于零的角度，
和
形成为用于样本平面(4)的远场照明的概览照明设备，其具有带有第三光轴(A3)的照明光学器件(9)，
其特征在于，
检测物镜(3)提供且形成为用于检测光片(6)的光以及照明光学器件(9)的光。
2.根据权利要求1所述的显微镜(1)，其特征在于，照明光学器件(9)的第三光轴(A3)基本上沿参考轴(B)指向。
3.根据前述权利要求中任一项所述的显微镜(1)，其特征在于，在照明光学器件(9)的光瞳内布置蒙片(11)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的显微镜(1)，其特征在于，在照明光学器件(9)的光程内和检测物镜(3)的光程内分别布置偏振器、Hoffmann光学器件和/或DIC棱镜(14)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的显微镜(1)，其特征在于，在检测物镜(3)和照明光学器件(9)之间布置扩散片(12)。
6.根据权利要求5所述的显微镜(1)，其特征在于，扩散片(12)形成为带有布置在其后的对焦屏的LED和/或OLED。
7.根据前述权利要求中任一项所述的显微镜(1)，其特征在于，在照明光学器件(9)的光程内存在蒙片(11)，通过所述蒙片将重叠区域调暗，使得在样本平面(4)内产生或可产生暗场照明。
8.根据前述权利要求中任一项所述的显微镜(1)，其特征在于，在照明光学器件(9)的光瞳内存在可运动的蒙片(11)，通过所述蒙片(11)精确地半侧覆盖或可覆盖光瞳。
9.一种用于运行光片显微镜(1)的方法，所述方法包括如下步骤：
-以概览照明设备的光沿基本上与样本平面(4)正交地指向的参考轴(B)照亮处在样本平面(4)内的样本(5)，
-通过具有光轴(A2)的检测物镜(3)检测作为透射光的概览照明设备的光，其中检测物镜(3)的该光轴(A2)与参考轴(B)形成与零不同的角度，
-取决于通过检测物镜(3)记录的概览照明设备的光产生样本(5)的概览图像，和-为记录概览照明设备的光通过检测物镜(3)记录在样本平面(4)内产生的光片(6)的光。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，概览图像通过TIE(transport of intensity equation)产生。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，
-记录X-Y平面的Z堆栈，其中X-Y平面在具有优选方向时被变换到标准化的Z堆栈中，所述标准化的Z堆栈的X-Y平面不具有优选方向，这通过如下方式进行：
以具有相互正交地走向的X轴、Y轴和Z轴(X、Y、Z)的网格虚拟地包围所记录的Z堆栈(偏斜)，其中X轴(X)和Y轴(Y)平行于样本平面(4)定向，且Z轴垂直于样本平面(4)定向，标准化的Z堆栈的X-Y平面在Z轴(Z)方向上的距离选择为使得所述距离对应于所记录的Z堆栈的侧向分辨率的一个，使得满足：
Δx’＝Δx
Δy’＝Δy，和
Δz’＝Δx或Δy，
-计算新的网格点(Px,y,z)，和
-通过所记录的Z堆栈的相邻的网格点(Px’,y’,z’)的三个加权插值计算各新的网格点(Px,y,z)上的强度。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，
-记录X-Y平面的Z堆栈，其中X-Y平面在具有优选方向时被变换到标准化的Z堆栈中，所述标准化的Z堆栈的X-Y平面不具有优选方向，这通过如下方式进行：
以具有相互正交地走向的X轴、Y轴和Z轴(X、Y、Z)的网格虚拟地包围所记录的Z堆栈，其中X轴(X)和Y轴(Y)平行于样本平面(4)定向，且Z轴(Z)垂直于样本平面(4)定向，标准化的Z堆栈的X-Y平面在Z轴(Z)方向上的距离选择为使得所述距离对应于所记录的Z堆栈的侧向分辨率的一个，使得满足：
Δx‘＝Δx
Δy‘＝Δy
Δz‘＝Δy*sin(α1)，
其中角度α1由第一光轴(A1)和第三光轴(A3)形成，
-计算新的网格点(Px,y,z)，和
-通过所记录的Z堆栈的相邻的网格点(Px’,y’,z’)的三个加权插值计算各新的网格点(Px,y,z)上的强度。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其特征在于，通过如下方式调节X-Y平面的记录的拍摄速度：
a)调节两个待记录的X-Y平面之间的步长Δz’，或
b)以第一步长(Δz’)记录Z堆栈，选择关注区域且以第二步长(Δz’)记录所选择的关注区域，其中第二步长(Δz’)小于第一步长(Δz’)，或
c)分别计算和显示仅一个平行于样本平面(4)的X-Y平面。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其特征在于，在X轴(X)或Y轴(Y)的方向上选择单行的关注区域，且在Z轴(Z)的方向上对于每个X-Y平面分别记录单行的关注区域。
15.根据权利要求13的选项c)或根据权利要求14所述的方法，其特征在于，各X-Y平面相对于先前的X-Y平面移动Δ＝Δz’/tan(α1)的量。
光片显微镜以及用于运行光片显微镜的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及光片显微镜以及用于运行光片显微镜的方法。
背景技术
[0002] 光片显微镜主要用于其尺寸从数百微米至数毫米的中等尺寸的例如有机体的样本的成像。通常，这些样本嵌入到琼脂内且布置在玻璃毛细管内。为检查样本，将玻璃毛细管放置到填充以水的样本室内且将琼脂与样本成块地从玻璃毛细管压出。样本以光片照亮且以垂直于光片且因此也垂直于光片光学器件的的检测物镜将从样本发出的荧光成像到照相机上。
[0003] 用于光片显微镜(SPIM结构，单平面照明显微镜Single Plane Illumination Microscopy)的显微镜结构根据现有技术包括照明光学器件2和检测光学器件3(在后文中也称为SPIM物镜)，所述照明光学器件2和检测光学器件3与样本平面4成45°角度且相互垂直地从上方指向到样本平面4 上(见图1a)。布置在样本平面4内的样本5例如处在形成为培养皿的样本保持部7的底部上。样本保持部7以例如水的液体8填充且两个SPIM物镜 2、3在光片显微镜使用期间浸入到液体8内。样本平面4在通过笛卡尔坐标系的X轴X和Y轴Y张成的平面X-Y内延伸。第一光轴A1和第二光轴 A2在通过笛卡尔坐标系的X轴X和Y轴Y张成的平面X-Y内走向。
[0005] 根据现有技术，平行于样本平面4和样本保持部7产生概览图像，这通过以处于样本5下方的远场物镜20垂直地通过样本保持部7的透明底部拍摄远场图像来实现。样本5的透射光照明和对于透射光的记录在此不可进行，因为两个SPIM物镜2、3相互太靠近并排布置。
[0006] 为实现在例如多波板的标准样本保持器内的更简单的样本准备，可尽管保持45°构造但将两个SPIM物镜2、3以相反的布置从下方通过样本保持部7的透明的底部指向到样本平面4内(见图1b)。在此布置中，通过相对于光轴A1和A2倾斜的且以盖玻片的形式存在的样本保持部7所产生的像差必需通过特殊的光学元件修正(DE 10 2013 107 297 A1，DE 10 2013 112 596 A1)。通过样本保持部7的底部将布置在样本平面4内的样本5照亮且检测样本的被激励的荧光。可使用样本保持器7，例如多波板、培养皿和/ 或物体载体，且可避免特别地在高通过率扫描时的样本的污染。
[0007] 在竖立的且相反的构造中存在的问题是通过远场物镜通过样本必需将关注的区域作为概览图像成像。对于竖立布置，这意味着通常远场物镜必需通过数毫米的液体观察，所述液体例如为如缓冲液的水溶液。如果例如使用多波板，则在所述多波板的各个凹陷内在液体表面上形成产生棱镜效应的明显的弯月面，使得此成像主要地仅以很低的NA可进行。另外的解决方法建议，将照明和/或检测物镜移动、旋转和/或倾斜，以可将远场物镜定位。
[0009] 近来开发了对比差的物镜(相位物镜)的对比强化的另外的可能性，其以另外的方式提供了与“经典方法”相同的或类似的信息含量。其示例为半光瞳对比、倾斜照明(oblique illumination)和TIE(Transport of Intensity Equation)。
[0010] 从WO 2012/110488 A2中已知了一种显微镜，所述显微镜具有用于照亮样本的光程和至少一个检测光程。所述显微镜包括处在照明光程内的聚焦单元以用于聚焦照明辐射。聚焦单元限定了基本上二维的照明区域，所述照明区域在照明光程的方向上且横向于照明光程延伸。此外，将界定元件布置在照明光程内，所述界定元件形成为用于选择地照亮照明区域的部分。通过 WO 2012/110488 A2此外公开了显微镜方法。
[0011] 所有这些对比方法在很大程度上透明的样本5的情况下要求透射照明，所述投射照明由于以上所述的原因可能不容易整合到带有45°SPIM布置的显微镜1内。
发明内容
[0012] 本发明的任务在于建议由于光片显微镜的可能性，通过所述光片显微镜的可能性实现平行于样本平面的概览图像的拍摄，其中概览图像具有高的信息含量，特别是具有高的对比。
[0014] 显微镜包括带有第一光轴的形成为用于产生光片的照明物镜，其中光片至少部分地产生或可产生在样本平面内，且包括带有第二光轴的形成为用于检测从样本平面发出的光的检测物镜，其中照明物镜和检测物镜相互且相对于样本平面布置为使得第一光轴和第二光轴在样本平面内相交且相互形成直角，且使得第一光轴和第二光轴与和样本平面正交地指向的参考轴形成不同于零的角度。此外，存在形成为用于样本平面的远场照明的概览照明设备，其具有带有第三光轴的照明光学器件。
[0015] 根据本发明，检测物镜提供且形成为用于检测光片的光以及概览照明设备的光。
[0016] 样本平面在下文中用作参考平面。
[0017] 显微镜可形成为竖立式显微镜。显微镜可在另外的构造中形成为相反的显微镜。
[0018] 因为照明光学器件的第三光轴与检测物镜的第二光轴以不同于0°的角度定向，所以强制地导致了倾斜概览照明或远场照明(在下文中简称为：照明)，而不必如在常规的三角架(Stativ)和设备中通常的情况在照明光学器件的光程内引入遮光器。
[0019] 倾斜照明实现了(与平行于检测物镜的光轴进行的照明情况相比)带有更强的对比的概览图像或远场图像的拍摄。根据本发明的显微镜的照明光学器件不必强制地但可以浸入到样本保持部的液体内(所谓的水浸)。
[0020] 而是可以以(空气)聚光器将样本通过空气-水界面照亮。这可实现是因为在此所出现的在照明中的像差对于成像是不严重的。
[0021] 在有利的构造中，第三光轴与参考平面重合。照明因此基本上垂直于参考平面进行。
[0022] 根据显微镜的几何形状例如将聚光器垂直于样本保持部布置，使得样本的处在检测物镜的视野(Field of View)内的区域被照亮或可被照亮。
[0023] 第一光轴和第二光轴相互基本上成直角。与直角的偏差有利地至多为使得在视野内在检测物镜的光轴的方向上出现的角度偏移所导致的第一和第二光轴的偏差不再超过检测物镜的景深。第一光轴或第二光轴都不处在样本平面内。
[0024] 第一光轴或第二光轴与参考平面形成的角度基本上凑成90°。
[0025] 根据本发明的显微镜有利地不要求用于拍摄概览图像的附加的远场物镜，以此与根据现有技术的显微镜相比，此显微镜要求更小的空间、构造更简单且可更廉价地制造。
[0026] 概览照明设备的光的检测提供在透射光内。
[0027] 在显微镜的可能的构造中，照明光学器件形成为聚光器、物镜或棱镜。
[0028] 为实现概览图像的高对比，在显微镜的可能的构造中可导致散射的倾斜照明。
[0029] 检测物镜和照明光学器件的数值孔径(NA)在另外的构造中相互匹配使得二者重叠，且存在数值孔径的重叠区域。数值孔径的重叠可例如以二维或三维图形方式确定和/或虚拟地图示，这通过将显微镜的各数值孔径以其实际位置和定向图示和/或仿真来进行。被共同地使用的平面或空间表示了数值孔径的重叠区域。
[0030] 为根据偏振对比、微分干涉对比(DIC,differential interference contrast) 或Hoffmann对比的原理影响概览图像的对比，在显微镜的另外的实施中在照明光学器件的光程中和在检测物镜的光程中分别布置一个偏振器，在另外的实施中此外也布置至少一个相位片、Hoffmann光学器件或DIC-棱镜。
[0031] Hoffmann光学器件是通过其布置和协作可获得带有Hoffmann对比的样本图像的光学元件。对于Hoffmann对比显微镜(HMC，Hoffman modulation contrast microscopy)的情况，显微镜典型地具有带有狭缝遮光器的聚光器和偏转器。所述偏转器布置在聚光器和照明光学器件的照明光源之间。
[0032] 显微镜的另外的实施具有处在检测物镜和光学器件之间的扩散片。扩散片例如通过一个或多个静态或动态散射盘形成。
[0033] 散射照明的优点是不要求昂贵的光学器件，例如带有成像光学器件、聚光器和遮光器的柯勒照明。散射照明在许多照明角度和照明方向下进行。由此，可提高照明的在相干或部分相干成像时影响图像分辨率的有效数值孔径，这通过使扩散片靠近样本平面和样本来实现。
[0034] 因此，也可以以简单的方式通过对于例如照明光学器件的概览照明光学器件的名义地给出的值而提高有效照明NA。
[0035] 此外，可调节照明的空间角度和方向，这例如通过仅照亮扩散片的一个环或环部分来实现。这可简单地通过直接布置在扩散片上的相应的蒙片实现或通过在扩散片上的蒙片的成像实现，其中后者情况例如可通过以带有用于相对比显微镜的蒙片的通常的透射光聚光器照亮扩散片来实现。有利地，散射照明可与以上所述的倾斜照明组合。
[0036] 扩散片在一个实施中可直接布置在照明光源前方，所述照明光源例如形成为发光二极管(LED)或OLED(有机LED)、LED阵列或OLED阵列和 /或卤素灯。此外可使得扩散片由现有的(柯勒)显微镜照明设备照亮或可照亮。
[0037] 在另外的可能的实施中，散射照明通过以自照明的散射照明光源作为扩散片来实现，例如旁边布置有对焦屏(Mattscheibe)的LED和/或OLED。
[0038] 显微镜在另外的可能的实施中在概览照明设备的光程中具有例如蒙片的调暗元件，通过所述调暗元件将数值孔径的重叠区域调暗，使得在样本平面内产生或可产生暗远场照明。
[0039] 在显微镜的另外的实施中，蒙片作为调暗元件布置在概览照明设备或照明光学器件的光瞳内。
[0040] 暗远场照明可通过可形成为SPIM照明物镜的照明物镜进行。也可使得透射光照明平行于参考轴例如从上方进行，其中数值孔径的重叠区域例如通过蒙片，例如通过合适的遮光器遮挡或可遮挡。
[0041] 在另外的实施中，显微镜在概览照明设备的照明光瞳内具有可运动的蒙片，通过所述蒙片将照明光瞳精确地半侧覆盖或可半侧覆盖。
[0042] 所谓的半光瞳对比的方法(Mehta,S.et al.2009,Optics Letters 34: 1924-1926)以简单的方式实现了将相位物镜可视地图示。为此，将蒙片引入到照明光瞳内，其中蒙片将照明光瞳覆盖一半。然后，拍摄透射光图像。在下一步中将蒙片引入到照明光瞳内使得将照明光瞳的对置的一半覆盖。又拍摄图像。如果蒙片在柯勒照明中在轴向方向上精确地处于光瞳内，则分别产生了带有半强度的样本的均匀的被照明的图像。但样本中的相位梯度导致照明光瞳在物镜光瞳上的成像的侧向移动，所述侧向移动与相位梯度成比例。然后将两个所获得的部分图像相互相减且标准化，以此可图示相位梯度。
[0043] 光瞳划分必需精确地进行，即蒙片必需精确地覆盖光瞳的一半且在沿光轴的方向上精确地位于光瞳的位置上，因为否则在计算的图像中将产生强伪影。
[0044] 在光片布置中，半光瞳对比的前述方法以从现有技术中已知的方式不可行。在半侧覆盖(半分)光瞳时，在照明光程以及检测光程中总是在部分图像之间产生强非对称的强度分布。
[0045] 但如果照明光瞳的半侧覆盖精确地在通过检测物镜的光轴和照明物镜的光轴张成的平面内进行，则可避免此非对称的强度分布。
[0046] 在带有倾斜照明的显微镜的实施中，照明光瞳的覆盖可在照明光程以及检测光程中进行。
[0047] 如果实现共线的照明，则照明光瞳的覆盖也可在照明光程以及检测光轴中进行。在此，划分的定向原理上不起作用。
[0048] 蒙片可例如构造为可运动的且布置在检测物镜的光瞳内。通过可运动的蒙片，光瞳精确地被半侧覆盖或可被半侧覆盖。
[0049] 本发明的任务进一步通过用于运行光片显微镜的方法解决。方法包括如下步骤：以概览照明设备的光沿基本上与样本平面正交地指向的参考轴照亮处在样本平面内的样本，和通过具有称为第二光轴的检测轴的检测物镜检测作为透射光的概览照明设备的光，其中检测物镜的第二光轴与参考轴形成与零不同的角度。此外，方法包括如下步骤：即在所述步骤中取决于通过检测物镜记录的概览照明设备的光产生样本或样本的至少区域的概览图像。此外，有利地作为前述步骤的替代，为记录概览照明设备的光通过检测物镜记录在参考平面(样本平面)内产生的光片的光。在此，光片与样本平面相交足以被视作在样本平面内产生光片。
[0050] 在方法的另外的实施中，概览图通过TIE(transport of intensity equation) 产生。在此有利的是TIE所要求的Z堆栈总是存在且不必执行附加的方法步骤。
[0051] 图像拍摄在样本和检测物镜的焦点在样本平面内例如在X轴方向上相互运动期间进行。在此，在每个拍摄位置上拍摄样本的一个图像且如需要将所述图像存储。所拍摄的图像组合为图像堆栈，所述图像堆栈通常称为Z堆栈，因为所述图像堆栈在常规的显微镜中通过物镜或样本沿Z轴的移动产生。在本情况中，视野在其内延伸且焦点处在其内的检测物镜的图像平面相对于样本平面倾斜且沿第一光轴延伸。对此，也参考图7a和图7b以及图8a 至图8c和所属的描述。
[0052] 方法可在另外的构造中执行，这通过记录平面的Z堆栈即平面的各单独图像的来进行，其中在平面相对于第三光轴和样本平面倾斜时将平面变换到如下Z堆栈内，即所述Z堆栈的平面不相对于第三光轴和样本平面倾斜，这通过将所记录的其各个平面相互移动(偏斜)的Z堆栈以具有相互正交地走向的X轴、Y轴和Z轴的网格虚拟地包围来实现，其中X轴和Y轴平行于样本平面定向，且Z轴垂直于样本平面定向。
[0053] 标准化的Z堆栈的平面在Z轴的方向上的距离选择为使得所述距离对应于所记录的Z堆栈的侧向分辨率的一个，使得满足：
[0054] Δx’＝Δx
[0055] Δy’＝Δy，和
[0056] Δz’＝Δx或Δy。
[0057] 然后计算未移动的标准化的Z堆栈(去偏斜)的新的网格点Px,y,z，且通过所记录的Z堆栈的相邻的网格点Px’,y’,z’的三个加权插值计算各新的网格点Px,y,z上的强度。
[0058] X、Y和Z的说明涉及笛卡尔坐标系的轴的方向。
[0059] 符号x’、y’和z’代表网格点的各坐标。符号x、y和z表示在未移动的 (去偏斜、去偏斜的)网格内的网格点Px’,y’,z’的坐标。
[0060] 符号Δx、Δy、Δz以及Δx’、Δy’、Δz’表示对于轴X、Y和Z的一个轴的方向上的坐标之间的差异。以符号Δz’以及Δz也给出了Z堆栈的相邻的X-Y平面在Z轴的方向上的距离且称之为步长。
[0061] 在方法的变化的构造中记录平面的Z堆栈，其中平面变换到标准化的Z 堆栈的X-Y平面内，所述记录通过如下方式进行：
[0062] 将所记录的其各个平面相互移动(偏斜)的Z堆栈以具有相互正交地走向的X轴、Y轴和Z轴的网格虚拟地包围来实现，其中X轴和Y轴平行于样本平面定向，且Z轴垂直于样本平面定向，
[0063] 标准化的Z堆栈的X-Y平面在Z轴的方向上的距离选择为使得距离对应于所记录的Z堆栈(偏斜)的侧向分辨率的一个，使得满足：
[0064] Δx’＝Δx
[0065] Δy’＝Δy
[0066] Δz’＝Δy*sin(α1)，
[0067] 其中角度α1由第一光轴和第三光轴形成。
[0068] 计算未移动的标准化的Z堆栈(去偏斜)的新的网格点Px,y,z，且通过所记录的Z堆栈的相邻的网格点Px’,y’,z’的三个加权插值计算各新的网格点 Px,y,z上的强度。
[0069] 在方法的另外的构造中通过如下方式调节平面的记录的拍摄速度：
[0070] 调节两个待记录的平面之间的步长Δz’，或
[0071] 以第一步长Δz’记录Z堆栈，选择关注区域(ROI)且以第二步长Δz’记录所选择的关注区域，其中第二步长Δz’小于第一步长Δz’，且以此使通过第二步长Δz’记录的关注区域的分辨率高于以第一步长记录的关注区域的分辨率，或
[0072] 分别计算和显示仅一个平行于参考平面的X-Y平面。
[0073] 也可在X轴或Y轴的方向上选择单行的关注区域且在Z轴的方向上对于每个X-Y平面分别记录单行的关注区域。
[0075] 本发明在下文中根据实施例和附图详细解释。各图为：
[0076] 图1a示出了根据现有技术的带有在样本平面上方的照明物镜和检测物镜的45°布置和样本下方的远场物镜的显微镜的示意性图示；
[0077] 图1b示出了根据现有技术的相反的带有在样本平面下方的照明物镜和检测物镜的45°布置和样本上方的远场物镜的显微镜的示意性图示；
[0078] 图2a示出了根据本发明的显微镜的第一实施例的示意性图示；
[0079] 图2b示出了根据本发明的显微镜的第一实施例的数值孔径的示意性图示；
[0080] 图3a示出了根据本发明的带有扩散片的根据本发明的显微镜的第二实施例的示意性图示；
[0081] 图3b示出了根据本发明的显微镜的第二实施例的数值孔径的示意性图示；
[0082] 图4a示出了根据本发明的带有蒙片的显微镜的显微镜的第三实施例的示意性图示；
[0083] 图4b示出了根据本发明的显微镜的第三实施例的数值孔径的示意性图示；
[0084] 图5a示出了根据本发明的带有半侧蒙片的显微镜的显微镜的第四实施例的示意性图示；
[0085] 图5b在侧视图中示出了根据本发明的显微镜的第四实施例的示意性图示，以及图中带有示意性地图示的光瞳覆盖；
[0086] 图6示出了根据本发明的带有符号化的记录区域的显微镜的(第五)实施例的示意性图示；
[0087] 图7a示出了沿根据本发明的显微镜的检测物镜的光轴观察的Z堆栈的示意性图示；
[0088] 图7b在样本的侧视图中示出了Z堆栈的示意性图示；
[0089] 图8a示出了移动的记录的Z堆栈(偏斜)以及虚拟网格的示意性图示；
[0090] 图8b示出了第一变换1的示意性图示；和
[0091] 图8c示出了第二变换2的示意性图示。
[0092] 在如下的实施例和示意图中，相同的附图标号指示相同的元件。
具体实施方式
[0093] 从现有技术中已知在图1a中示意性地图示的竖立的显微镜1，所述显微镜1具有照明物镜2、检测物镜3和远场物镜20。通过照明物镜2沿第一光轴A1产生或可产生光片6，所述光片6可用于检查布置在样本平面4内的样本5。检测物镜3具有第二光轴A2，沿所述第二光轴A2可记录从样本平面4发出的光。第一光轴A1和第二光轴A2相互正交地定向且分别与用作参考平面B的样本平面4形成45°的角度。
[0094] 远场物镜20具有第三光轴A3，所述第三光轴与样本平面4正交地指向且用作参考轴B。第一光轴A1至第三光轴A3在光片6在样本5内的延展的区域内相交。此外，第一光轴A1与参考轴B形成第一角度α1且第二光轴与参考轴B形成90°-α1的第二角度α2，例如分别为45°。
[0095] 样本5布置在样本保持部7内，所述样本保持部填充以液体8。
[0096] 图1b示意性地示出了带有照明物镜2和检测物镜3的相反布置的显微镜1，其中照明物镜2和检测物镜3布置在样本平面20下方且远场物镜20 布置在样本平面20上方。角度α1和α2又每个为45°。
[0097] 如下的实施例根据相反的显微镜1示例地图示且可在另外的实施中也形成为竖立式显微镜1。
[0098] 在图2a中示意性地图示的相反的显微镜1中，照明2物镜和检测物镜 3以45°的角度α1和α2布置。
[0099] 在显微镜1的另外的实施中，角度α1和α2具有与45°偏差的角度值，其中角度基本上凑成90°。
[0100] 作为远场物镜20(见图1a和图1b)的替代，概览照明设备的照明光学器件9以聚光器的形式存在，所述聚光器形成为沿与参考轴B重合的第三光轴A3将光发送到样本平面4内。聚光器在另外的实施中形成为空气聚光器。照明光学器件9在另外的实施中形成为光学透镜。
[0101] 在另外的实施中，照明光学器件9通过照明物镜20形成。所述照明物镜可除照明外也形成为用于样本5的观测和/或成像。
[0102] 通过照明光学器件9将样本5的处在检测物镜3的视野(Field of View) 内的区域照亮。因为照明光学器件9的第三光轴A3与第二光轴A2以不等于0°或180°的角度定向，所以强制地存在倾斜照明，而不同于如在常规的三角架相应地将蒙片引入到照明光学器件9的光程内。
[0103] 倾斜照明实现了通过检测物镜3对于远场图像的记录以作为带有增强对比的概览图像。照明光学器件9不必强制地浸入到样本保持部7的例如水的液体8内(水浸)。而是(空气)聚光器可通过空气-液体界面照亮样本5。这是可行的，因为在照明中在此出现的像差对于成像是不严重的。
[0104] 在显微镜1的另外的实施中，在照明光学器件9的光程中且在检测物镜 3的光程中选择地以合适的组合分别布置偏振器、Hoffmann光学器件和/或 DIC棱镜，这通过以附图标号10指示的方框示意性地示出。
[0105] 在图2b中图示了照明光学器件9的开口锥形即数值孔径NA1以及检测物镜3的数值孔径NA2，以及图示了其上数值孔径NA1、NA2重叠的区域 (重叠区域)。第一数值孔径NA1和第二数值孔径NA2不相互平行地走向。
[0106] 照明光学器件9的数值孔径NA1示意性地图示为沿第三光轴A3的物镜侧的开口角度以及图像侧的开口角度。
[0107] 数值孔径的此图示形式也在如下的实施例中使用。
[0108] 在照明光学器件9的光程中在所述照明光学器件9和样本5之间布置了具有散射盘的形式的扩散片12(图3a)。通过扩散片12散射的照明光学器件9的光通过以虚线圈起的半椭圆形来解释(图3b)。
[0109] 与数值孔径NA1、NA2及其相互重叠相关地通过检测物镜3仅可检测来自重叠的区域的照明光的部分。通过照明物镜20或照明光学器件9的数值孔径NA1的匹配，可调节重叠的程度。为实现尽可能高的分辨率，需要在照明侧以及检测侧以高的数值孔径NA1和NA2工作。在低结构密度的样本的情况下，例如带有分立的小物体的样本的情况，NA1和NA2的强重叠反而是不利的，因为必须在亮背景前检测小的变化。
[0110] 通过如下方式避免此不利影响，即在概览照明设备的光瞳或照明光学器件9的光瞳内布置蒙片11，所述蒙片11精确地阻挡了NA1和NA2的重叠区域，如在图4a中示意性地图示。
[0111] 在图4b中以NA1mask标记了数值孔径NA1的通过蒙片11遮挡的区域且以NA1unmask标记了不被遮挡的区域。
[0112] 蒙片可因此如所描绘阻挡了重叠区域，因而实现了暗场，其中仅在样本 5内由检测物镜3检测散射光。替代地，可通过蒙片11阻挡非重叠区域，以此实现了最优的倾斜照明。
[0113] 在图5a中在此处示意性地图示的显微镜1的第四实施例中将蒙片11布置在概览照明设备的光程中，通过所述蒙片11导致概览照明光瞳的半侧覆盖，且可产生半光瞳对比，如前文所述。
[0114] 在图5b中图示了在概览照明设备和照明光学器件9的光程内的覆盖以及作为结果的在检测物镜3的光程内的遮挡。
[0115] 前述实施例的每个可包括控制单元13(仅在图5a中图示)，所述控制单元13可形成为用于控制未详细图示的照明光源、照明物镜2、检测物镜3 和/或照明光学器件9。此外，控制单元13可形成为用于评估所记录的概览图像和/或光片6的图像。控制单元13可与用于图形图示所记录的概览图像和/或光片6的图像的显示器连接。
[0116] 通过根据本发明的显微镜1的实施，可实现图像记录的基本上不同的可能性。图6的示例解释了可能性中的一些。
[0117] 光片6的简化的图示同时给出了检测物镜3的物镜平面。样本扫描可在样本平面4的方向上以第一扫描运动SB1实现。在此，扫描示例地以实线圈起的且为简化图示示出为矩形的样本体积。
[0118] 在另外的可能性中，进行在样本5和光片6或物镜平面之间的在第二光轴A2的方向上的作为第二扫描运动SB2的相对运动。在此，扫描例如通过实线圈起示出的样本体积。
[0119] 第三可能性在于在第三光轴A3的方向上产生作为第三扫描运动SB3的相对运动，其中扫描通过点划线圈起示出的样本体积。
[0120] 此外也可进行扫描运动SB1、SB2和/或SB3的组合。
[0121] 被扫描的样本体积可然后通过下面阐述的变换转移到Z堆栈内。
[0122] 专业人员可考虑实施例的组合。
[0123] 根据本发明的方法可与显微镜1的前述实施的每个一起实施。
[0124] 根据附图，特别地根据图7a、图7b以及图8a、图8b和图8c在下文中描述了方法的构造。
[0125] 在图7a中示意性地且由于可图示性的原因仅以透视图示出了Z堆栈，如在检测物镜3以及在未图示的检测器的坐标系中可实现的Z堆栈的情况。以Δz’标记了所记录的单独图像EB在Z轴Z的方向上的相互距离(见下文)。
[0126] 图7b在相对于图7a旋转的侧视图中示出了样本5的坐标系内的Z堆栈。
[0127] 在图8a中示例地且示意性地示出了虚拟网格，其中X轴X和Y轴Y 平行于样本平面4定向，且Z轴Z垂直于样本平面4定向。图中示意性地图示了形成被移动的Z堆栈的所记录的单独图像EB。
[0128] 图8b示意性地图示了在下文中详细描述的变换1，且图8c示意性地图示了变换2。
[0129] 在方法中首先获得单独图像EB(图7a和图7b)，所述单独图像以以上所述的显微镜1的实施拍摄。单独图像EB垂直于检测物镜3的第二光轴 A2(图7a)且相对于样本平面4以角度α2定向(图7b)。在拍摄位置记录多个单独图像EB，其中拍摄位置分别是相互相距预调节的或可选择的步长 (以Δz’标记)。通过样本5在X方向X上的运动(扫描)和在每个拍摄位置的单独图像EB的拍摄，可产生Z堆栈(3D体积堆)，所述Z堆栈在本情况中为被移动的Z堆栈，因为单独图像EB相对于样本平面4以角度α2定向(图7b)。
[0130] Z堆栈是在Z轴Z的方向上前后相继的单独图像EB的序列。对于无优选方向的样本5这可容易地实施。
[0131] 在例如由于外部和/或实际情况样本5在空间内不具有任意的位置和/或延展时，样本5具有优选方向。例如在例如为玻璃板的底座上靠放或生长的细胞。细胞的形状沿其与底座的接触面通过底座预先给定，且基本上形成为平的。细胞因此具有背离底座的优选方向。
[0132] 特别地对于例如在作为底座的盖玻片上生长的具有优选方向的样本5，对于使用者有益的是使样本具有名义的不移动的Z堆栈，如例如在激光扫描显微镜(LSM)或在使用可旋转的孔板(spinning disk)时通常的情况。相应的Z堆栈的各个层平行于样本平面4定向(X-Y平面)。因此，所记录的 Z堆栈必需通过合适的变换(“去偏斜”)被转化为标准化的非移动的Z堆栈，所述Z堆栈的X-Y平面平行于样本平面4定向。这可例如通过如下两个变换实现：
[0133] 变换1(xyz插值)
[0134] 以网格包围原始记录的Z堆栈(图8a)，其中X轴X和Y轴Y平行于样本平面4放置且Z轴Z垂直于样本平面4定向。单独平面的距离Δz’可选择为对应于原始Z堆栈的侧向分辨率，以实现各向相同的体素尺寸：
[0135] Δx’＝Δx
[0136] Δ’＝Δy
[0137] Δz’＝Δx或Δy
[0138] 在新的网格点Px,y,z上的强度的计算通过原始网格的相邻的网格点Px’,y’,z’的三个加权插值执行。经受插值的距离以IP1、IP2或IP3标记。
[0139] 变换2(y插值)
[0140] 以网格虚拟地包围原始记录的Z堆栈(图8a)，其中X轴X和Y轴Y 平行于样本平面4放置且Z轴Z垂直于样本平面4定向。各个网格平面的距离Δz’可选择为使得：
[0141] Δx’＝Δx
[0142] Δy’＝Δy
[0143] Δz’＝Δy*sin(α1)
[0144] 在新的网格点Px,y,z上的强度的计算通过原始网格的相邻的网格点Px’,y’,z’的加权插值执行(图8c)。
[0145] 在执行两个变换1或2之后，存在带有平行于样本平面4的X-Y平面的变换的且因此标准化的Z堆栈。
[0146] 通过方法可实现的拍摄速度可通过如下四个可能性A至D的一个或通过其组合进一步提高。
[0147] A.如果概览图像平行于样本平面4产生，则缺点是总是必需拍摄完整的Z堆栈。这导致产生概览图像可能要求更长的时间。可通过如下方式缩短等待时间，即加大两个X-Y平面之间的步长Δz且因此需要拍摄更少的图像。
[0148] B.替代地也可接受更长的等待时间，以使用更低分辨率(例如，包括倾斜)拍摄大体积的样本5。然后，借助于3D-Viewer虚拟地观察整个体积且识别关注区域(Region of Interest，ROI)。在概览图像之后可使用更高的分辨率例如以X-Y平面之间更小的步长Δz拍摄此关注区域。
[0149] C.在作为一次性计算整个Z堆栈的替代仅计算且立即显示平行于样本平面4的X-Y平面时，可实现方法的另外的加速。可省去每个插值。
[0150] D.替代地也可直接通过在检测器上选择单行ROI，例如在照相机上直接读取单独的行。作为在Z方向Z上拍摄很大的单独图像EB的替代，现在在 Z方向Z上拍摄许多行。与拍摄完整的单独图像EB相比，这可更快地进行。
[0151] 在方法C和D中可选择显示哪行且因此显示平行于样本平面4的哪个 X-Y平面。在显示时必需注意到每个单独的X-Y平面相对于先前的X-Y平面必需移动Δ＝Δz/tan(α1)。
[0152] 附图标号列表
[0153] 1 显微镜
[0154] 2 照明物镜
[0155] 20 远场物镜
[0156] 3 检测物镜
[0157] 4 样本平面
[0158] 5 样本
[0159] 6 光片
[0160] 7 样本保持部
[0161] 8 液体
[0162] 9 照明光学器件
[0163] B 参考轴
[0164] 10 偏振器、Hoffmann光学器件、DIC棱镜
[0165] 11 蒙片
[0166] 12 扩散片
[0167] 13 控制单元
[0168] EB 单独图像
[0169] NA1 (照明光学器件9的)数值孔径
[0170] NA2 (检测物镜3的)数值孔径
[0171] NA1mask (NA1的)被遮挡区域
[0172] NA1unmask (NA1的)未被遮挡区域
[0173] A1 第一光轴
[0174] A2 第二光轴
[0175] A3 第三光轴
[0176] IP1 第一插值
[0177] IP2 第二插值
[0178] IP3 第三插值
[0179] α1 (第一光轴A1和第三光轴A3之间的)角度
[0180] α2 (第二光轴A2和第三光轴A3之间的)角度
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