发明领域

本发明例如涉及扩增DNA分子以及无细胞克隆的方法。

背景资料

已开发用于指数扩增核酸的许多方法。这些包括聚合酶链式反应 (PCR)、连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)、自动维持序列扩 增(self-sustained sequence replication，SSR)、基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence based amplification，NASBA)、链置换扩增(strand displacement amplification，SDA)和用Qβ复制酶进行的扩增(参见，例如Birkenmeyer 等.(1991)J.Virological Methods 35，117-126和Landegren(1993)Trends Genetics 9，199-202)。

目前的PCR扩增方法包括利用杂交至目的核酸序列侧翼区域的两个引 物，使得在引物处起始的DNA复制使目的核酸序列得以复制。通过变性步 骤从模板链分离被复制的链，利用相同引物的另一轮复制可引起目的核酸 序列的几何级数扩增。除了其他一些缺陷之外，PCR扩增倾向于发生序列 错误；其限于短DNA片段的扩增；并且无法连续进行，必须通过将核酸样 品在交替温度下进行多个循环而进行。

已描述了等温DNA扩增方法，其中不需要这种热循环。这些方法利用 了诸如Φ29(Phi 29)DNA聚合酶的DNA聚合酶的性质，这种聚合酶高度 续进性(processive)，能够置换处于其路线中的DNA链。

这种等温方法中的一种，有时称为多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)，已被用于扩增大分子量的线性DNA，如基因组DNA。 在该方法的一种形式中，使用与靶序列侧翼核苷酸序列的相反链互补的两 组引物。扩增通过复制进行，其中复制在每个引物起始，并且沿靶核酸序 列继续进行，正在延长的链遭遇并置换先前已复制的链。在该方法的另一 种形式中，随机引物组被用于随机起始基因组核酸的样品。该组的引物总 体上并且随机地互补于分布在样品核酸中的核酸序列。扩增通过复制进行， 其中复制在每个引物起始，并且继续，使得延伸的链遭遇并且置换邻近的 被复制的链。在该方法的另一种形式中，串联DNA通过链置换合成而扩增， 该链置换合成使用随机引物组，或与串联DNA之间的接头序列互补的引物。 合成从接头开始，经过串联DNA的区段，到达下一个接头，并且向远处继 续，其中延长的链遭遇并且置换之前已被复制的链。

滚环扩增(RCA)为多重置换扩增方法，其可在环状、或可被成环、 并且合适大小的DNA分子上进行。在一个实施方案中，双链核酸被成环(例 如通过将目的核酸分子插入线性载体，以形成环状分子)，并且在一条链上 切口，使得一条链为连续的，而另一条链为不连续的。一个或多个引物与 环状载体的连续链(单链环状DNA分子)退火，并且用于起始DNA复制。 由于每条引物与环状模板退火，DNA被延伸，伸长的链遭遇并且置换之前 已被复制的DNA，以产生环的串联拷贝的连续序列。随后可发生继发的起 始事件，导致指数扩增。当使用不同的引物、每条链用一个或多个引物时， 发生链置换的级联，产生图1中显示的某种针轮(pinwheel)结构。最终， 扩增的DNA的单链被转变为双链DNA。

DNA(例如具有未知序列的DNA)的分子克隆常规利用在细胞内复制 的质粒、噬菌体或病毒载体进行。这种方法有时称为体内克隆方法。体内 克隆方法例如在Sambrook等.Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第 二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989 中描述。体内克隆方法是费力的，需要将DNA电穿孔入细胞、将细胞铺板、 挑取克隆、过夜培养所挑取的克隆和从那些培养物制备模板的步骤。这些 过程费时、昂贵并且不适合高密度操作。此外，因为例如其对在其中克隆 的大肠杆菌或其他宿主细胞有毒，或出于其他未充分了解的原因，某些DNA 序列已被证明难以体内克隆。

已描述了体外(无细胞)克隆方法，其避免了体内克隆的一些问题。 例如，已描述了一种方法，其中单个DNA分子通过在溶液中连续稀释、并 且随后从包含单个分子的试管中PCR扩增而被克隆(Lukyanov等.(1996) Nucleic Acid Research 24，2194-2195)。已描述了另一种方法，用于从固定 化培养基中克隆源自单个RNA分子的RNA群体(Chetverina等.(1993) Nucleic Acids Research 21，2349-2353)。已描述另一种方法——“腊肠 (polony)”方法，用于单个分子的原位PCR扩增(Mitra等.(1999)Nucleic Acids Res 27，e34)。除了其他缺点之外，这种方法产生高的突变率，并且 在低复杂度序列处发生犹豫，尤其在同聚体带处。

发明人在此描述了高保真、无细胞的方法以克隆DNA(例如未知序列) 的单个拷贝，其利用等温滚环扩增，该扩增由多重引物起始，这些多重引 物包括随机、部分随机或确定序列。

附图描述

图1为(比较性)举例说明多重起始的滚环扩增的示意图。与扩增靶 环互补的寡核苷酸引物杂交至该环。DNA链的3’端由箭头表明以显示聚合 作用的极性。添加DNA聚合酶和三磷酸脱氧核苷(dNTP)至起始的环， 引起每条引物的延伸，并且每条新合成链的置换由其后面引物的延伸而引 起。随后在最初的滚环扩增步骤被置换的产物链上发生二级起始事件。该 图不按比例，因为环状模板通常约5-6kb，而产物链平均长度约70kb。

图2显示随着模板减少，本底合成提高。3μlφ29聚合酶反应用指定数目 的φX单链DNA分子起始，该数目基于已知浓度原液的稀释倍数加以计算。 反应物用Pst I消化并且通过凝胶电泳分析。

图3A和3B显示了通过降低φ29聚合酶反应体积而抑制本底合成。图 3A中，配制30μl、15μl和3μl的φ29聚合酶反应，每种或者包含50个 M13单链DNA分子，或者不含模板DNA。该反应产物用Pst I消化并且通 过凝胶电泳分析。图3B中，如所示的，φ29聚合酶反应为3μl或0.6μl， 并且每种或者包含100个或10个M13单链DNA分子，或者不含模板DNA。

图4显示从混合物中无细胞克隆φX174和M13。利用相同稀释度的φ X174和M13DNA混合物进行重复二十份的600nl φ29聚合酶反应。该反 应产物用Pst I消化并且通过凝胶电泳分析。

图5A、5B和5C显示φ29聚合酶克隆的DNA测序。图5A显示合成 的φX174分子无细胞克隆的测序。单个分子φ29聚合酶反应的PCR扩增 后进行测序。比较具有单碱基缺失的合成φX克隆(分子1)、在这一区域 具有野生型序列的分子(分子3)、和天然φXDNA的相同区域。图5B显 示无PCR扩增情况下φ29聚合酶反应产物的直接测序。该图显示对600nl 反应产物中的18％进行测序的结果。图5C显示由φ29聚合酶扩增的分子 上A18道和互补的T18道的序列读数。在无PCR扩增的情况下在无细胞φ29 聚合酶克隆产物上直接进行测序。

图6图解显示如何构建Φ29克隆的基因组文库。

图7显示生殖器支原体(M.genitalium)基因组DNA的无细胞克隆。 由连接至pBR322衍生物的1.5至2.5kb生殖器支原体DNA片段组成的文 库从最初的～0.3ng/μl DNA浓度在TE中稀释100倍，在95℃加热2分钟， 随后在冰上淬火。DNA再额外稀释1000倍(左上凝胶)或2000倍(右上 凝胶)，并且在两组600nl φ29聚合酶反应中用作模板(每组8份重复反 应)。每种反应物的一半用Pst I切割，并且通过凝胶电泳分析(上方凝胶)。 用每个反应剩下的部分通过PCR扩增插入物，其利用载体克隆位点侧翼的 M13正反向测序引物，并且在下方的凝胶上分析。

图8表明六聚体组H*C和H*H可降低本底合成。

图9显示示例性的克隆载体，其用于通过本发明的方法克隆DNA分子。

发明描述

本发明例如涉及用于高保真、等温扩增少量(包括单个拷贝)目的DNA 模板和/或无细胞克隆目的DNA的方法。利用从合适的引物以5’方向延伸 的链置换性、续进性DNA聚合酶，本发明的方法可用于扩增任何DNA。 该方法可应用于各种类型的扩增，包括MDA，特别是MDA的亚型—— RCA。在一个实施方案中，模板为单链环状DNA，具有例如约5-8千碱基 (kb)大小，例如约5-6kb；并且利用随机的或部分随机的引物(例如六聚 体引物)或确定的引物(例如十聚体引物)，通过Φ29型DNA聚合酶、通 过滚环机制扩增模板。

本发明人最初通过滚环扩增扩增少量模板的尝试引起产生不需要的本 底合成。参见例如实施例II和图2。如果反应混合物中不含引物，则不出现 这一本底。不希望受任何特定机制的束缚，这提示本底由对引物群体中建 立的简单复制单元加以拷贝而得到。发明人已开发出降低或消除该本底合 成(以改善信噪比)的方法。

降低该本底的一种方式为减少体积，其中固定量的少量模板分子被扩 增，而保持反应混合物中其他组分(例如引物、聚合酶、核苷酸等等)浓 度不变。实施例II显示反应体积从30μl减少至3μl后，观察到本底实质上 的降低，并且将体积减少至0.6μl或更小，观察到甚至更大的降低。

降低该本底的第二种方式为使用引物，这种引物包含阻止非特异性扩 增的碱基组成。不希望受任何特定机制的束缚，其提示某些引物(例如六 聚体)无法使其3’核苷酸发生碱基配对，并且因此无法退火并建立可被拷 贝的简单序列单元。例如，引物组H*C(243个序列HHHHHC(SEQ ID NO： 1)的混合物，其中H＝A、C或T)不包含G，所以3′C预计不会与引物的 其他拷贝发生碱基配对。如果本底通过Φ29聚合酶对引物的作用而产生， 该引物预计将产生减少的本底。例如实施例VIII显示该引物确实导致本底 减少。

降低该本底的第三种方式为将减少反应混合物的体积与利用本发明的 引物进行组合。

本底合成的降低使得目的DNA模板高度扩增。不希望受任何特定机制 的束缚，其提示发生高水平的扩增，因为即使有也没多少更小DNA的本底 干扰(例如，即使有也没多少对酶或底物的竞争，并且该小本底DNA不占 据该反应)。利用本发明的扩增方法，发明人已实现在单个扩增反应期间(在 单个反应室中)，扩增单个分子(例如约5-8kb环状DNA)大约109倍。当 该扩增方法为RCA时，可产生整个模板的109个拷贝。当更长的和/或线性 DNA通过非-滚环型MDA扩增时，通常仅扩增部分模板。然而，被扩增的 DNA的净质量可为起始材料的约109倍。本发明的实施方案中，模板DNA 被扩增至少约108倍，例如至少约2×108、5×108、109、2×109、5×109、1010、 2×1010或更多。本发明的方法可从单个DNA分子产生微克量的DNA。如果 反应混合物中被扩增的DNA随后进一步稀释入新的反应混合物，并且进行 进一步扩增循环，则产量提高。该用于扩大被扩增DNA产量的方法在下面 进一步讨论。

所披露的用于扩增和/或克隆目的模板(例如其序列未知的DNA)的无 细胞方法提供许多优点。单轮多重起始的滚环复制引起环状载体的大量扩 增，其数量级大于单轮PCR复制和其他每轮限于靶序列拷贝数目倍增的扩 增技术。该方法快速并且提供高产量的高保真扩增DNA，且允许快速克隆。 例如，通过本发明的无细胞克隆方法构建克隆序列文库需要的时间约为3 天，少于通过在大肠杆菌中常规克隆而构建同等文库需要的时间。由于该 方法不需要在大肠杆菌或其他宿主中克隆，其允许克隆那些对体内克隆有 抗性的DNA。这种有抗性的DNA包括：例如，携带致死突变，例如必需 基因中的移码的合成噬菌体基因组；对宿主有毒性的序列；倾向于发生复 制错误的序列；某些环境样品，等等。本发明的扩增方法不产生突变体“问 题(jackpots)”或在同聚体带处发生犹豫(stuttering)。此外，该体外克隆 方法不需要将扩增的DNA与其他细胞组分(包括细胞DNA)分离，这种 分离过程需要费时和效率低下的操作流程。该反应不需要产生在基于细胞 的分子克隆过程中常常出现的复杂核酸混合物。此外，由于本发明的方法 完全在体外进行，其可被自动化并且以基于细胞的分子克隆不可能的方式 扩大规模。例如，该扩增过程易于进行自动化，在自动化过程中多个反应 在小区域中同时进行，无需人为干预。

本发明的方法可应用于各种用途，包括例如DNA测序(例如基因组测 序)和/或目的基因或基因组的制备。例如，来自目的基因或基因组的DNA 片段的单拷贝，包括合成产生的DNA片段，可通过本发明的方法扩增并且 测序；如有必要可校正扩增拷贝的错误；并且扩增的DNA片段可被组装以 产生部分或全部目的基因或基因组。以高通量方式迅速产生可用作盒的准 确片段的能力使得我们能够“混合和匹配”每种盒的大量变体，并且因此迅速 组装各种组合的突变或变体基因或基因组。

本发明的用于降低单拷贝DNA扩增期间本底的方法还可以用于降低 DNA扩增的各种其他方法中的本底合成，包括扩增来自单细胞的DNA(例 如细菌或其他细胞，其包含约2-3条相同的染色体，或包含处于复制过程中 的部分染色体)，或扩增来自生物体的DNA，如某些病毒，其包含多条不同 的染色体(模板)。

本发明的一个方面为用于扩增不超过一个拷贝的DNA模板的方法(用 于扩增部分或全部DNA模板，其中温育起始时存在不超过一个拷贝的DNA 模板)。该方法包括将DNA与链置换性、续进性DNA聚合酶以及随机或部 分随机引物组在极小体积中(例如约10μl或更少)、在有助于促进DNA链 置换的条件下、在基本上等温的温度下接触，其中该扩增如下进行：

a)以低的引物浓度进行，例如约50μM或更低；和/或

b)在使得扩增DNA足够无本底、因此无需进一步纯化就能将其直接 用于测序、限制性酶分析、杂交分析、与其他的DNA分子体外重组以组装 基因或基因组的部分等等的条件下进行。这些或其他的检验可用于证实被 扩增的DNA相对无本底污染。

反应中所需要的引物浓度为约50μM或更低(“约”50μM包括40μM至 60μM)。引物太少，则发生的扩增太少。引物太多，则会出现过量引物所导 致的本底合成。本领域技术人员可以改变引物量，以确定是否可使用更少 或更多的引物量，并确定相对于本底合成的最优扩增量(信噪比)。

本发明的方法引起DNA模板的扩增。在一个实施方案中，DNA模板 通过多重置换扩增(MDA)而扩增。当模板比具有特定续进性的DNA聚合 酶能够延伸的长度还要长时，通过MDA扩增的DNA倾向于以比全长模板 更短的片段形式存在。在另一实施方案中，当DNA模板为环状的并且足够 小以通过滚环机制加以拷贝，则DNA通过滚环扩增(RCA)加以扩增，并 且扩增产物包括模板的两个或更多串联拷贝(参见图1)。(当然，可能还存 在模板的部分拷贝和单拷贝，但这些仅占总扩增DNA产物的小部分。)

RCA的扩增产物可被切割成大约为DNA模板大小的线型分子(例如用 切割目的DNA模板或用于环化DNA的载体一次的合适的限制性酶)。在本 发明的方法中，不需要的小DNA的本底非常低，以至于如果将扩增产物消 化至单位长度的DNA模板拷贝，经凝胶电泳(例如琼脂糖凝胶、丙烯酰胺 凝胶或任何其他适于将DNA按模板大小进行分级的凝胶)，用荧光染料染 色(例如嵌入性染料，如溴化乙锭、Syber GOLD或Syber GREEN (InVitrogen))并且用紫外线照射，则在本底之上可显现大约具有单位长度 DNA预期大小的不连续条带。这一或其他的测试可用于证实该扩增的DNA 相对无本底，并且另外用于确定扩增的信噪比。

该方法的一个实施方案中，扩增在单个反应室中进行，并且DNA模板 扩增至少约109倍。例如，DNA模板被扩增，直至扩增的DNA达到扩增至 少约109倍的程度。DNA模板可以被扩增至少约5×109倍、至少约1010倍或 更多。

本发明的实施方案中，DNA聚合酶为Φ29型聚合酶(例如Φ29聚合 酶)，和/或反应温度为约30℃。反应混合物的体积可以为约10μl或更少(例 如约5μl、2μl、1μl、0.6μl、0.2μl、0.064μl、0.01μl或0.001μl或更少)。体 积可以小至大肠杆菌的体积(约3×10-6nl)，或甚至更小。

本发明方法中使用的随机或部分随机引物可具有约6至约20个核苷酸 (nt)的长度，例如6、8、10、12、14或16nt，优选六聚体。引物可以对 核酸外切酶耐受。例如，每个引物中至少两个核苷酸(例如至少三个核苷 酸)可通过硫代磷酸酯键连接。例如，引物混合物中的引物可通过通式 NNNN*N*N(SEQ ID NO：9)表示，其中N＝A、G、C或T，并且*表示硫 代磷酸酯键。

在一个实施方案中，DNA由从mRNA制备的cDNA组成。

本发明的一个实施方案为扩增单拷贝的约5-7kb环状单链DNA模板的 方法，包括在约0.6μl或更小体积中、在有助于促进DNA链置换的条件下、 在约30℃时、将DNA与Φ29DNA聚合酶以及约50μM或更低浓度的随机 或部分随机的引物混合物接触。

在该方法的一个实施方案中，当反应在单个反应室中进行时，起始反 应混合物中最初存在不超过一个拷贝(分子)的DNA模板；并且DNA模 板被扩增，直至其达到至少约109倍的扩增程度。本发明的另一个方面 为用于扩增单拷贝DNA模板的方法，包括将DNA模板环化入载体，所述 载体包含2-约20个串联拷贝的第一确定的引物识别序列(例如十聚体)， 以及散布于这些拷贝之间的、2-约20个串联拷贝的第二互补引物识别序列 (例如十聚体)；将DNA与链置换性、续进性DNA聚合酶和与两个引物序 列互补的引物组在有助于促进DNA链置换的条件下、在实质等温的温度下 接触，其中扩增如下进行：

a)引物浓度约5μM；和/或

b)在约10μl或更小(例如约0.6μl或更小，或约0.06μl或更小)的体 积中进行。

在该方法的一个实施方案中，扩增在单个反应室中进行；起始反应混 合物中最初存在不超过一个拷贝(分子)的DNA模板；而DNA模板被扩 增，直至其达到至少约109的扩增程度。确定的引物的大小可在约8至约 20nt的范围(例如8、10、12或14nt)；优选十聚体。确定的引物的浓度可 为约2μM至约10μM。对于十聚体，约5μM的浓度是合适的。重复序列用 作DNA聚合酶的多重起始位点。

本发明的另一个方面包括从单个细胞(例如细菌或其他细胞，其包含 约1-3条相同的染色体或处于复制过程中的部分染色体)扩增DNA。这些 DNA分子太长而难以通过RCA扩增，并且因此通过其他类型的MDA扩增。 该方法的一个实施方案为用于扩增每个DNA模板的部分或全部的方法，包 括在10μl或更小(例如约0.6μl或更小，或约0.06μl或更小)体积中、在有 助于促进DNA链置换的条件下、实质等温的温度时，将DNA分子与链置 换性、续进性DNA聚合酶和随机或部分随机的引物组接触，其中扩增如下 进行：

a)引物浓度约50μM或更低；和/或

b)在使得扩增DNA足够无本底、而无需进一步纯化就能将其直接用 于测序、限制性酶分析、杂交分析、和/或与其他的DNA分子体外重组以组 装基因或基因组的部分等等的条件下进行。

本发明的扩增方法可应用于多种用途中的任何一种。

在一个实施方案中，该方法为无细胞克隆(分离和扩增单拷贝目的 DNA)的方法。DNA的混合物被环化，以形成环状双链(ds)DNA，并且 进行有限稀释(终点稀释)操作，以获得包含单拷贝环状目的dsDNA的溶 液。该DNA分子随后转变成单链(ss)环状DNA，并且通过本发明的滚环 方法扩增。该DNA由此不经过涉及在细胞(如细菌)中生长/传代的体内克 隆过程而被克隆。克隆的DNA可随后经过各种操作，如测序、限制性酶分 析等等，而无需任何更进一步的纯化步骤。这简化了克隆，并且允许进行 自动化。

在一个实施方案中，对克隆的、被扩增的DNA进行测序。该方法包括 将单拷贝的目的DNA转变成单链环状DNA；通过本发明的方法扩增该单 链环状DNA；并且对扩增的DNA进行测序。

在另一实施方案中，DNA模板包括目的基因或基因组的邻近部分。可 通过本发明的方法进一步扩增包括目的基因或基因组的其他邻近部分的一 个或多个另外的DNA模板，并且组装被扩增的DNA，以形成目的基因或 基因组的部分或全部。

通过本发明的方法产生的被扩增的DNA可如下进行进一步扩增：将反 应混合物的等分试样稀释入新的反应混合物，所述新的反应混合物包括 DNA聚合酶和第二种引物混合物(其可以是随机的、部分随机的或确定的 引物)；并且随后该新的反应混合物在有助于促进DNA链置换的条件下、 在基本上等温的温度下温育。在一个实施方案中，第一和第二组引物包括 由不同通式表示的序列。新反应混合物中的反应条件可以相同或不同。

本发明的方法可改编成高通量操作。例如，本发明的扩增方法可在自 动化的纳摩尔系统中进行(如Parallab 350机)。在一个实施方案中，反应 混合物的组分于纳米室(nano-chamber)(即承载非常小体积的小反应容器， 如等于或小于约500nl、200nl、64nl或更小的体积)中组合；在基本上等 温的温度下温育；并且从该纳米室移除被扩增的DNA，其中所有步骤都自 动化进行。

本发明的一个方面为用于进行本发明扩增方法的系统，其包括：(a)用 于进行扩增的试剂，和(b)自动化的纳摩尔装置，其包括用于组合反应组 分(例如在纳米室中)的手段(例如自动机械手段)；利用合适的加热单元， 用于在固定温度(等温)温育反应组分的手段；和用于移除扩增的DNA的 手段。该装置不必包含热循环所需的元件；事实上，相比于具有进行重复 热循环所需的复杂体系的装置，仅将溶液加热至一个或几个预先确定的温 度的装置建立和维护起来价格更低廉。

本发明的另一个方面为用于目的DNA的无细胞克隆的线性双链载体， 所述载体由不超过约200bp组成(例如不超过约100bp，不超过约60bp， 或甚至更小)，并且其末端可与要被环化并扩增的线性DNA模板任一末端 上的相容序列连接。例如，该相容的序列可以为限制性酶位点，如IIS型限 制性位点，其允许DNA插入物从载体切除，而不把起始DNA模板中不存 在的序列包括在末端序列内。一种所述的限制性酶为BstXI。由于这种载体 不需要在细胞中复制，它们可缺乏用于体内克隆的载体中存在的许多元件。 例如，本发明的载体可缺乏复制起点、选择标记等等。对于测序文库而言， 载体可小至约60nt(例如，刚好够在任一末端包含正向和反向测序引物和 克隆位点，如BstXI的长度)。

本发明的一个实施方案中，如上的载体包含2-约30个串联拷贝(例如 约2、4、6、8、10、12、14或更多)的第一确定的引物识别序列(例如8-12nt， 如十聚体)，并且包含散布于那些拷贝之间的、2-约30个串联拷贝的第二种 互补引物识别序列(例如8-12nt，如十聚体)。本领域技术人员可设计和检 验候选引物序列，以鉴定产生很少或不产生本底扩增的序列。包含这种串 联拷贝的载体尤其适于克隆要被测序的DNA分子。如果使用包含单拷贝引 物(面向一个或两个方向)的载体，测序可从引物位点起始。

在本发明的另一实施方案中，如上的载体进一步包括下列元件中的一 种或多种(例如全部)：允许DNA的一条链被切口和除去、从而留下单链 环用于通过φ29型聚合酶加以扩增的位点(如M13复制起点或酶如BbvCI 位点)；允许测序进入DNA插入物任一末端的引物位点(如上述的M13引 物位点或重复的引物序列)；一个或多个归巢核酸内切酶位点(如PI-PspI 和I-SceI)，其允许被克隆的DNA从载体序列内线性化；允许DNA从DNA 混合物中回收的序列(如乳糖阻遏子位点，其可作为利用乳糖阻遏子蛋白 特异性结合载体的手段)。此类载体的例子在实施例IX和图9中显示。

本发明的一个方面为测序目的线性双链DNA的方法，包括：将该目的 线性双链DNA插入如上的克隆载体中，由此使目的DNA成环；将双链DNA 转变成单链环；通过本发明的滚环扩增方法扩增该单链环；和对该扩增的 DNA测序。

在本发明的一个实施方案中，扩增在单个反应室(容器)中进行，并 且DNA模板被扩增至少约2×108倍(例如至少约5×108、109、2×109、5×109、 1010、2×1010倍或更多)。在一个实施方案中，模板DNA不超过约500kb大 小(例如不超过约200、100、70、50、25、10、7、5或3kb，并且实质上 可以更短)。对于其中需要获得模板的全长或几乎全长拷贝的本发明的实施 方案而言(例如用于克隆或测序该分子)，模板的大小主要受DNA聚合酶 的续进性限制。例如，已报道Φ29聚合酶能拷贝约500,000nt，所以500kb 的DNA模板可用于使用该DNA聚合酶的反应中。优选地，DNA模板为单 链DNA环形式，并且通过滚环机制发生扩增。在一个实施方案中，DNA 模板为长度约3kb-10kb的单链DNA环(在此所述的范围中，该范围的端 点被包括在内)，更优选长度约5-6kb(例如约4.5-约6.5kb)。

在小体积中进行反应的方法对本领域技术人员是显而易见的。例如， 为了降低由于蒸发所带来的损耗，反应可在一层油下面进行，或在密封反 应室中(如纳米毛细管中)进行。在一个实施方案中，反应混合物的体积 和细菌细胞(如大肠杆菌细胞)一样小。此体积为约3×10-6nl。这样的反应 例如可通过将反应混合物包裹于脂质体或人工膜中而进行。获得所述小反 应混合物的方法包括，例如在合适的脂类存在下通过超声乳化反应混合物， 或对本领域技术人员显而易见的其他的方法。例如可通过利用纳升移液管 装置如Parallal 350(Brooks Automation，Chelmsford，MA)获得常规移液 管下限之下的反应体积。

如上所述反应混合物的小体积引起本底合成的降低，不仅在通过滚环 机制扩增单拷贝的约5-8kb DNA期间，还可在扩增更大量模板时，在扩增 大基因组DNA(例如通过MDA)等等时，降低本底。

除了降低反应混合物的体积以减少本底，还可以降低引物或聚合酶的 浓度(例如降低约10-约1000倍)，而将反应体积保持在较大体积(例如在 大约30或100μl)。引物和/或聚合酶的最小种子量似乎是起始复制所必需 的。引物与模板的摩尔比可以是约1015∶1或更小(例如约2×1014、1014、 1013、1012、1011、1010、109、108、107或106比1)；和/或聚合酶与模板的摩 尔比可以是约1.5×1010∶1或更小(例如约3×109∶1、109∶1、108∶1、107∶ 1、107∶1、106∶1或更小的体积，如细菌细胞体积的数量级，约103∶1、 102∶1或50∶1)。

在一个实施方案中，引物对模板的摩尔比为约1016或更小。例如，在 包含单分子模板和约50μM浓度的引物的600nl反应混合物中，六聚体引物 与模板的克分子比为约2×1014∶1。对于3μl的反应，比例为该比例的约5 倍，或约1015∶1；对于约为大肠杆菌大小的反应体积(约3×10-6nl)，该比 例为约106∶1。引物对模板的重量比可以为约1013∶1或更小。例如，对于 六聚体引物和约6kb的单链模板，引物与模板的重量比比摩尔比小约1000 倍，其中摩尔比例如对于600nl反应为约2×1011∶1；对于3μl的反应为约 1012∶1；并且对于3×10-6nl反应为约103∶1。

在一个实施方案中，聚合酶与模板的比例为约1.5×1011∶1或更小。例 如，对于如上的600nl反应，摩尔比为约3×109∶1；对于3μl的反应，摩尔 比为约1.5×1010∶1；对于大肠杆菌大小的反应，摩尔比约50∶1。

本发明的方法中，扩增后信噪比高。例如，与本底合成相比，所需的 被扩增的DNA反应产物的量可以是本底的至少约25％(例如与本底总量相 比，或与大约为所需DNA大小的DNA的本底相比)。其可以是本底的例如 至少约50％，至少约等量，至少两倍，三倍，五倍，100倍，或200倍，等 等。无论如何，所需的被扩增的DNA的相对量与本底相比足够用于进一步 的过程中而无需经进一步的纯化步骤，该进一步的过程用以将所需的扩增 产物从本底合成中移除。所需的有关浓度取决于随后的过程。

本发明的另一个方面为扩增反应混合物中的DNA模板的方法，包括在 有助于促进DNA链置换的条件下、在基本上等温的温度下，将DNA与DNA 聚合酶和随机或部分随机的引物组接触，其中引物的混合物用HHHHHC (SEQ ID NO：1)或HHHHHH(SEQ ID NO：5)表示，其中H＝A、C或 T。所述引物的使用引起本底合成的降低，不仅在通过滚环机制扩增单拷贝 的约5kb DNA期间，还可在扩增更大量模板时；在扩增大基因组DNA(例 如通过MDA)等等时降低本底。

所披露的方法可用于克隆或扩增任何目的核酸分子。核酸分子可来自 任何来源，包括细胞或组织核酸样品、之前克隆的片段的亚克隆、mRNA、 化学合成的核酸、基因组核酸样品、获自核酸文库的核酸分子、特定的核 酸分子和核酸分子的混合物。

可通过本发明的RCA方法扩增的DNA大小下限是DNA被环化的能力 的函数。因此例如，小至约100bp的DNA模板可通过本方法扩增；单链 DNA甚至可以更小。可通过RCA扩增的分子大小的上限是DNA聚合酶续 进性程度的函数。该酶必须能经过环状DNA模板数轮，以获得显著的扩增 量。例如，Φ29聚合酶，其被报道能够复制约70kb的DNA，可很容易地 通过约7kb的环状模板约10圈。约15-20kb的环可很容易地通过Φ29聚合 酶扩增。在允许更大续进性的条件下、或通过使用更有续进性的酶，可扩 增更长的模板。可通过非滚环MDA扩增的模板可更长；其大小仅受DNA 聚合酶续进性的限制。因此，例如约70bp的线性分子可用Φ29聚合酶来扩 增。

所披露的方法可用于从将要在文库中被代表的核酸分子的复杂混合物 开始，产生被克隆的核酸分子的文库。例如，可从细胞样品中的所有cDNA 产生mRNA，并且用于制备cDNA文库；或从基因组核酸样品产生基因组 DNA文库。在一个实施方案中，合成制备的目的基因或基因组的部分被扩 增，并且被组装，以形成合成的基因或基因组。在一个实施方案中，目的 基因组DNA的部分(片段)通过常规手段霰弹克隆入载体；将克隆的混合 物稀释，使得被稀释的DNA每个样品平均包含一个分子的被克隆的DNA； 随后通过本发明的方法扩增样品中的DNA。

在本发明的方法中，通常把将要被扩增的核酸分子插入很容易被环化 的双链载体中(例如通过平头连接，或通过经由已添加至该DNA的末端的 接头或衔接子而连接)，或者将单链分子直接环化。优选通过连接完成向 载体中的插入，虽然也可以使用任何合适的偶联机制。单链核酸分子，如 RNA，可通过将其转变成双链而使用。在RNA分子的情况下，这可例如通 过产生该RNA的cDNA分子实现。已知许多方法用于制备核酸分子和将其 插入载体，这些中的任何都可用于制备用于所披露的方法中的核酸分子(对 于本方法中所用的这种和其他分子生物学方法的论述，参见例如Sambrook 等.Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989，)。在一个实施方案中， 通过产生粘性末端以促进向线性载体中插入而制备核酸分子。此可例如通 过用限制性酶切割目的核酸分子或核酸样品，或通过将接头添加至具有或 可经处理而具有粘性末端的目的核酸分子的末端而完成。核酸分子的一个 末端或两个末端还可以保留平末端。用于所披露的方法中的核酸分子的两 个末端还可以不同，以允许定向插入。例如，两个末端可具有不同的粘性 末端，或一个具有粘性末端而另一个具有平末端。

DNA优选克隆入本发明的特别的、多用途的克隆载体中，该载体被设 计成能促进靶DNA的环化、以及随后该产物能用于测序、纠错(例如通过 利用寡核苷酸诱变)、进一步的扩增或其他目的。这种载体可以非常小(例 如几百个碱基对或更小)，因为它们不需要支持在细菌中的复制。如需要， 其它元件也可被包括在该微小载体中。某些所述的载体在此在别处讨论。

本发明的一个实施方案中，将要被扩增的DNA被克隆入如实施例IX 中所述的小的合成载体。连接进入载体后，通过用f1基因2蛋白质处理而 在f1复制起始位点(ori位点)导入切口；或者可通过用NEB切口酶N.BsmI 或N.BbvCIb处理，而在“切口位点”将切口导入。切口后，可加热带切口的 DNA，以使链融熔开。不需要分离环状单链。然而，如果需要的话，单链 环可在扩增之前通过常规方法分离。一些在包含插入物的环状双链载体上 切口并且分离完好的单链环的方法在Lizardi的美国专利No.6,287,824 中描述。

通过如以上讨论的那些操作，目的DNA可“转变”成适于通过本发明的 方法扩增的单链环状DNA的形式。

如此处所用的“有效促进DNA链置换”的条件除了存在合适的DNA聚 合酶、DNA模板和引物之外，还包括反应组分如盐、辅因子、核苷酸库等 等。这样的组分为常规的和众所周知的。实施例I中描述了一些Φ29扩增 的典型条件。本发明实施例中的反应物不受限制，其包含足够的四种dNTP， 以使每1μl反应体积产生大约1μg DNA。也参见Dean等.(2001)Genome Res.11，1095-1099。本发明的扩增反应在“基本上等温”的条件下进行，例如 温度与给定温度相比上下变化不超过约2-3℃的条件。滚环扩增步骤的温度 和温育时间长短是所用的聚合酶、反应条件等等的函数。已报道Φ29聚合 酶在30℃在24小时的时间内是稳定的，并且呈现线性动力学，从而允许进 行较长时间的温育。优选地，对于聚合酶而言，温育温度为约30℃。 如此处所用的，术语“约”指升高或降低约20％。因此，约30℃包括24℃至 36℃。优选，温度为30℃加或减约2-3℃。通常，利用Φ29聚合酶的反应 在大约30℃进行约4-6小时，虽然也可以使用更短或更长的时间。本领域 技术人员可很容易优化利用给定的DNA聚合酶进行的扩增步骤中的因素。

使得被扩增的DNA足够无本底、因而可以无需进一步纯化而直接用于 测序、限制性酶分析、杂交分析和/或与其他的DNA分子体外重组以组装基 因或基因组的部分的条件包括有效促进DNA链置换的条件，以及合适的小 体积和合适浓度的引物分子的存在。

通过RCA产生模板的串联重复拷贝后，可通过用仅切割模板一次的限 制性酶(例如在克隆载体的位点附近或位点中切割的限制性酶)切割RCA 产物而产生单位拷贝。

用来起始DNA合成的引物可以是支持引物和所要扩增的DNA的互补 部分之间稳定杂交的任何长度。通常，此为约4-约20个核苷酸长度；优选 引物为六聚体。

本发明方法中所用的引物可包含随机或部分随机的序列。“随机”序列的 引物指对于本发明方法中所用的反应条件下的模板核酸序列而言，引物与 核酸模板并置的位置基本上不确定。应该认识到的是随机引物的序列不是 数学意义上的随机。化学合成的随机引物在保证合成步骤的物理和化学效 率的范围内是随机的。只要由引物起始的沿着模板核酸链延伸的位置在很 大程度上不确定，引物类型就定义为随机的，包括由所选择的组的核苷酸 的变换所组成的随机序列。

本发明方法中所用的随机引物包括六聚体引物，其在六个位点中每一 个包含选自A、G、C或T的随机核苷酸。可选的，六个位置中每一个上的 核苷酸可选自更有限的核苷酸组，如A、G或C；A、G或T；A或G，等 等。部分随机的六聚体引物可在前5个位置中的每一个上具有随机选自给 定组核苷酸的核苷酸(例如，选自A、G、C或T；选自A、G或C；选自 A、G或T；选自A或G，等等)，而该寡核苷酸3′末端的核苷酸为固定的 (例如A、G、C或T中任一个)。在其他部分随机的六聚体引物中，六个 位置中的两个或三个上的核苷酸可以是固定的。随机核苷酸的类似分布也 可存在于更长的引物中。通常，引物互补部分中随机碱基位置的数目优选 占引物互补部分的核苷酸总数的约20％至100％。更优选地，随机碱基位置 的数目占引物互补部分核苷酸总数的约30％-100％、或约50％-100％、或约 85％至100％。

在用于本发明方法中的合适的引物中，有具有下列序列的六聚体引物： HHHHHC(SEQ ID NO：1)；DDDDDG(SEQ ID NO：2)；VVVVVA(SEQ ID NO：3)；BBBBBT(SEQ ID NO：4)；HHHHHH(SEQ ID NO：5)； RRRRRR(SEQ ID NO：6)；YYYYYY(SEQ ID NO：7)；NNNNNH(SEQ ID NO：8)；NNNNNN(SEQ ID NO：9)；MMMMMM(SEQ ID NO：10)； KKKKKK(SEQ ID NO：11)；SSSSSS(SEQ ID NO：12)或WWWWWW (SEQ ID NO：13)。这些通式中，H＝A、C或T；D＝A、G或T；V＝A、C 或G；B＝C、G或T；N＝A、G、C或T；R＝A或G；Y＝C或T；M＝A或C； K＝G或T；S＝C或G以及W＝A或Y。其他合适的引物包括具有下列序列 的引物：(H)nC；(D)nG；(V)nA以及(B)nT，其中n为3-19之间的 整数，优选4-6之间，并且H、D、V和B如所述。

在优选的实施方案中，引物包括修饰的核苷酸，使其对核酸外切酶消 化耐受。例如，可存在1、2、3或更多个硫代磷酸酯键。本发明的实施方 案中，两个最3′的末端残基通过硫代磷酸酯键连接；或三个最3′的末端残 基如此连接。所述引物的典型实例包括：HHHH*H*C(SEQ ID NO：1)， 其中H＝A、C或T；DDDD*D*G(SEQ ID NO：2)，其中D＝A、G或T； VVVV*V*A(SEQ ID NO：3)，其中V＝A、C或G；BBBB*B*T(SEQ ID NO： 4)，其中B＝C、G或T；以及HHHH*H*H(SEQ ID NO：5)，其中H＝A、 C或T。在这些引物的每一个中，*表示硫代磷酸酯键。另一种优选的引物 为NNNN*N*N(SEQ ID NO：9)，其中N＝A、G、C或T。

用于本发明方法中的引物可具有一个或多个修饰的核苷酸。这种引物 在此称为修饰的引物。修饰的引物具有若干优点。第一，一些形式的修饰 引物，如RNA/2′-O-甲基RNA嵌合引物，具有比DNA引物更高的解链温 度(Tm)。这提高了引物杂交的稳定性，并且将增加引物的链侵入。此将引 起更有效的起始。此外，由于引物由RNA组成，其将耐受核酸外切酶。这 样的引物，如果在其5′端带有小沟结合序列(binder)，将对模板dsDNA具 有更好的链侵入性。

还可使用嵌合引物。嵌合引物为具有至少两种类型核苷酸的引物，如 脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸、核糖核苷酸和修饰的核苷酸、或两种不同 类型的修饰核苷酸。嵌合引物的一种形式为肽核酸/核酸引物。例如，可使 用5′-PNA-DNA-3′或5′-PNA-RNA-3′引物，用于更有效的链侵入和聚合侵 入。这样的引物的DNA和RNA部分可具有随机或简并序列。嵌合引物的 其他形式为例如，

5′-(2′-O-甲基)RNA-RNA-3′或5′-(2′-O-甲基)RNA-DNA-3′。

已知许多修饰的核苷酸(核苷酸类似物)，并且可用于寡核苷酸中。核 苷酸类似物为包含对碱基、糖或磷酸部分中的任一种进行某种类型的修饰 的核苷酸。对碱基部分的修饰包括对A、C、G和T/U的天然和合成的修饰， 以及不同的嘌呤或嘧啶碱基，如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)和2-氨基 腺嘌呤-9-基。修饰的碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基 胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其 他烷基的衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基的衍生物、2-硫尿嘧 啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤基尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶 和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4- 硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-烷硫基、8-羟基和其他的8-取代腺 嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基尤其5-溴、5-三氟甲基和其他的5-取代尿嘧啶和胞嘧 啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-去氮鸟嘌 呤和7-去氮腺嘌呤和3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。另外的碱基修饰可例 如在美国专利No.3,687,808，Englisch等.(1991)Angewandte Chemie， International Edition 30，613，和Sanghvi，Y.S.第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.ed.CRC Press， 1993中查找。某些核苷酸类似物，如5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶和N-2、N-6 和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞 嘧啶。5-甲基胞嘧啶可提高双螺旋形成的稳定性。其他的被修饰碱基是用作 通用碱基的那些。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基取代 正常碱基，但对碱基配对无偏爱。也就是说，通用碱基可与任何其他碱基 进行碱基配对。完全或部分由具有通用碱基的核苷酸组成的引物可用于降 低或消除对靶样品中重复序列的扩增偏爱。这在例如当不希望在扩增产物 中损失序列复杂性时是有用的。碱基修饰常常可与例如糖修饰结合，如2′-O- 甲氧基乙基，以获得独特性质，如双螺旋稳定性提高。已有许多美国专利 如美国专利No.4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273； 5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908； 5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121； 5,596,091；5,614,617和5,681,941，其详述了大量碱基修饰。

核苷酸类似物还可以包括糖部分的修饰。对糖部分的修饰将包括对核 糖和脱氧核糖的天然修饰以及合成修饰。糖修饰包括但不限于对2’位点的 下列修饰：OH；F；O-，S-或N-烷基；O-，S-或N-烯基；O-，S-或N-炔基； 或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至 C10、烷基或C2至C10的烯基和炔基。2’糖修饰还包括但不限于--O[(CH2) nO]mCH3，

--O(CH2)nOCH3，--O(CH2)nNH2，--O(CH2)nCH3，

--O(CH2)n--ONH2和--O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1- 约10。

2’位点其他的修饰包括但不限于：C1至C10的低级烷基、取代的低级烷 基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、 CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、 杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基 团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸药物动力学性质的基团、或改 善寡核苷酸药效性质的基团、和具有类似性质的其他取代基。也可在糖的 其他位点上进行类似的修饰，尤其是3’端核苷酸上或2’-5’连接的寡核苷酸 中糖的3’位点、和5’端核苷酸的5’位点。修饰的糖还包括包含在桥接环氧 包含修饰的那些，如CH2和S。核苷酸糖类似物还可具有糖模拟物，如取 代戊呋喃糖基的环丁基部分。许多美国专利教导了这种修饰的糖结构的制 备，如美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359, 044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519, 134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610, 300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670, 633和5,700,920，每篇此处通过整体引用引入。

核苷酸类似物还可以在磷酸部分修饰。修饰的磷酸部分包括但不限于 那些可经修饰而使得两个核苷酸之间的键包含硫代磷酸酯、手性硫代磷酸 酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他的烷基磷 酸酯包括3’-亚烷基磷酸酯和手性磷酸盐、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3’- 氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸 酯、硫代烷基磷酸三酯和硼代磷酸酯。当然两个核苷酸之间的这些磷酸酯 键或修饰的磷酸酯键可以经由3’-5’键或2’-5’键，并且该键可包含颠倒的极 性，如3’-5’变成5’-3’，或2’-5’变成5’-2’。还包括各种盐、混合盐和游离酸 形式。许多美国专利教导了如何制备和使用包含修饰的磷酸酯的核苷酸， 包括但不限于，美国专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301； 5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019； 5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939； 5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126； 5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5, 587,361和5,625,050。

当然核苷酸类似物可仅需要包含单一修饰，但也可在一个部分中或不 同部分之间包含多个修饰。

核苷酸取代物为核苷酸或核苷酸类似物，它的磷酸部分和/或糖部分已被 取代。核苷酸取代物包括具有核苷酸类似功能性质、但不包含磷酸部分的 分子，如肽核酸(PNA)。核苷酸取代包括以Watson-Crick或Hoogsteen方 式识别和杂交互补核酸、但通过磷酸部分外的部分连接在一起的分子。当 与合适的靶核酸相互作用时，核苷酸取代物能够遵循双螺旋类型的结构。

磷酸的取代物例如可以是短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子 和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这 些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物， 亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主链； 亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；包含烯烃的主链；氨基磺酸盐主链；亚 甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和氨磺酰主链；酰胺主链；和其他 具有混合N、O、S和CH2组成部分的那些。许多美国专利公开了如何制备 和使用这类磷酸取代物，并且包括但不限于美国专利No.5,034,506；5, 166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033,5, 264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5, 470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5, 602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5, 618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437和5, 677,439。

还可了解的是，在核苷酸取代物中，核苷酸的糖和磷酸部分可例如由 酰胺型键代替(氨乙基甘氨酸)(PNA)。美国专利No.5,539,082；5,714, 331和5,719,262教导了如何制备和使用PNA。也参见Nielsen等.(1991) Science 254，1497-1500。

本发明的引物可由不同类型的核苷酸或相同类型的核苷酸组成。例如， 引物中的一种或多种核苷酸可以为核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸、或 核糖核苷酸和2’-O-甲基核糖核苷酸的混合物；约10％至约50％的核苷酸可 以为核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸、或核糖核苷酸和2’-O-甲基核糖核 苷酸的混合物；约50％或更多的核苷酸可以为核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖 核苷酸或核糖核苷酸和2’-O-甲基核糖核苷酸的混合物；或所有的核苷酸为 核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸、或核糖核苷酸和2’-O-甲基核糖核苷酸 的混合物。核苷酸可由碱基组成(即核苷酸的碱基部分)，并且可包括不同 类型的碱基。例如，一种或多种碱基可以为通用碱基，如3-硝基吡咯或5- 硝基吲哚；约10％至约50％的碱基可以为通用碱基；约50％或更多的碱基 可以为通用碱基；或所有的碱基可以为通用碱基。

引物还可以可以(但不必须)在该引物的5’末端包含另外的不与靶序 列互补的序列。此序列称为引物的非-互补部分。如果存在引物的该非互补 部分，其用来促进DNA复制期间的链置换。引物的该互补部分可以是任何 长度，但通常为1至100个核苷酸长，并且优选4至8个核苷酸长。

具有随机或部分随机序列的引物组可利用常规方法通过在将要被随机 化的每个位点添加任何核苷酸(或如上述的任何更有限的核苷酸组中的任 一个)而合成。优选该引物组由具有类似长度和/或杂交特性的引物组成。 常规的合成技术包括利用亚磷酰胺固相化学以通过磷酸二酯键连接核苷 酸。还可利用通过硫代磷酸酯键或不同的键，如甲基膦酸酯键，来连接核 苷酸的化学。例如，可使用Milligen或Beckman System 1 Plus DNA合成仪 (例如，Milligen-Biosearch的8700型自动化合成器，Burlington，MA或 ABI 380B型)，可利用氰乙基亚磷酰胺的方法。可用于制备寡核苷酸的合 成方法也由Ikuta等.(1984)Ann Rev.Biochem.53，323-356，(磷酸三酯和 亚磷酸三酯方法)以及Narang等.(1980)Methods Enzymol.65，610-620(磷 酸三酯方法)描述。蛋白质核酸分子可利用已知的方法如由Nielsen等. (1994)Bioconjug.Chem.5，3-7描述的那些方法制备。通过如上方法制备 的引物可从商品化来源得到，如Integrated DNA Technologies(IDT)， Coralville，IA。

扩增期间，可另外包括放射性的或修饰的核苷酸，如三磷酸溴脱氧尿嘧 啶，以标记反应中产生的DNA。或者，可包括提供结合部分(如生物素化 核苷酸)的合适前体。

通常，用于进行MDA(如滚环扩增)的DNA聚合酶为Φ29型聚合酶。 “Φ29型”DNA聚合酶指分离自包含用于DNA复制起始中的末端蛋白的相关 噬菌体的任何DNA聚合酶，所述相关噬菌体。这些噬菌体一般由Salas， 在The Bacteriophages 169，1988中描述。这些噬菌体的DNA聚合酶在结构 上密切相关，一些仅在6个氨基酸上有不同，其中5个氨基酸由类似的氨 基酸代替。这些噬菌体具有长约6-300个核苷酸的短的反向末端重复序列。 这些聚合酶具有高度活跃的3’-5’核酸外切酶活性，但没有5’-3’核酸外切酶 活性。优选的实施方案中，Φ29型DNA聚合酶选自如下噬菌体的DNA聚 合酶：Φ29、Cp-1、PRD1、ΦPRD1、Φ15、Φ21、PZE、PZA、Nf、M2Y、 B103、SFS、GA-1、Cp-5、Cp-7、PR4、PRS、PR722或L17；或该DNA 聚合酶为Φ29型聚合酶，其已被修饰，以具有小于百分之十(例如小于百 分之一或基本上没有)天然存在的聚合酶的核酸外切酶活性。

优选，该DNA聚合酶为Φ29DNA聚合酶(有时在此指Φ29Pol；Φ29 聚合酶或phi29聚合酶)。参见例如Blanco等的美国专利No.5,198,543 和5,001,050。纯化的Φ29Pol可从商业渠道(例如从New England Biolabs) 得到。Φ29聚合酶已显示通过高续进性滚环机制在30℃等温扩增环状DNA (Lizardi等.(1998)Nat Genet.19，225-32；Dean等.(2001)Genome Res.11， 1095-9)。已报道这些延伸产物的平均大小为约70kb；其他的报道提示Φ29 聚合酶可合成长达约650,000nt的产物(Dean等.(2001)中引用的，上文)， 或可能长达1,000,000nt的产物(Nelson(2002)Journal of Clinical Ligand Assay 25，276-279中引用的)。当通过随机引物组起始时，该合成从每个最 初的模板分子的多个起始位点上产生产物。这些产物还可以用作模板用于 另外的合成，产生复杂的包括双链DNA的分枝针轮结构。这类结构在图1 中举例说明。该反应经过指数期，所以其可能具有类似于或大于PCR的灵 敏度。已报道Phi29聚合酶的错误率为106-107碱基中仅1个，以及比用于 PCR的聚合酶呈现更高的保真度(Esteban等.(1993)J Biol Chem 268(4)， 2719-26)。因此，通过Φ29聚合酶扩增而克隆的分子中的错误率预计较低。 对Φ29聚合酶错误率的进一步论述以及Φ29克隆准确度，参见实施例X。

其他的DNA聚合酶也适用于本发明的方法中，只要其呈现续进性、链 置换活性并且例如可进行经起始的单链环的滚环复制。这样的DNA聚合酶 有时在此称为“链置换”聚合酶或“滚环”聚合酶。对于滚环复制，优选DNA 聚合酶能够置换与模板链互补的链，称为链置换，并且缺乏5’至3’的核酸 外切酶活性。链置换为引起合成环状载体多个串联拷贝所必需。5’至3’核酸 外切酶活性，如果存在，可导致合成链被破坏。还优选用于所披露方法中 的DNA聚合酶为高续进性的、以高保真度复制DNA、和/或包括校正活性 (3’编辑功能)。如此处所用的，术语“续进性”指DNA聚合酶保持附着于 延伸复合物而不分离，由此允许非常长的DNA的延伸。是否适合用于所披 露的方法中的DNA聚合酶可通过评估其进行MDA(例如滚环复制)的能 力而很容易地确定。合适的DNA聚合酶当中，有噬菌体M2 DNA聚合酶 (Matsumoto等.(1989)Gene 84，247)；VENTTM DNA聚合酶(Kong等. (1993)J Biol.Chem.268，1965-1975)；DNA聚合酶I的Klenow片段(Jacobsen 等.(1974)Eur.J.Biochem.45，623-627)；T5DNA聚合酶(Chatteijee等 (1991)Gene 97，13-19)；修饰的T7DNA聚合酶(Tabor等.(1987)J Biol Chem.262，15330-15333；Tabor等.(1989)J Biol Chem.264，6447-6458)； SequenaseTM(U.S.Biochemicals)；和T4DNA聚合酶全酶(Kaboord等.(1995) Curr.Biol.5，149-157)。

如有必要，链置换可通过使用链置换因子(如解旋酶)而变得更为方 便。我们认为可在链置换因子存在下进行滚环复制的任何DNA聚合酶适合 用于所披露的方法中，即使该DNA聚合酶在缺少链置换因子时不进行滚环 复制也是如此。可用于RCA中的链置换因子包括BMRF1聚合酶辅助亚基 (Tsurumi等.(1993)J.Virology 67，7648-7653)；腺病毒DNA-结合蛋白 (Zijderveld等.(1994)J.Virology 68，1158-1164)；单纯疱疹病毒蛋白ICP8 (Boehmer等.(1993)J.Virology 67，711-715；Skaliter等.(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，10665-10669)；单链DNA结合蛋白(SSB； Rigler等.(1995)J.Biol.Chem.270，8910-8919)；和小牛胸腺解旋酶(Siegel 等.(1992)J.Biol Chem.267，13629-13635)。

聚合酶进行MDA(例如滚环复制)的能力可通过在常规测定法中利用 该聚合酶而确定，如在本文或Fire等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92， 4641-4645中描述的滚环复制测定法。

可以通过利用在低温无活性、而仅在高温下有活性的DNA聚合酶增强 用于所披露的方法中的DNA扩增反应的特异性。所述酶的实例，AmpliTaq Gold，已由Moretti等.(1998)Biotechniques 25，716-722描述。AmpliTaq Gold 在PCR热循环加热之前是无活性的。类似的酶可用于所披露的方法中。DNA 聚合酶的温度激活也可利用该聚合酶的特异性抗体获得。例如，DNA聚合 酶Bst大片段的特异性抗体可通过小鼠免疫获得。可基于抗体结合该酶和在 室温下抑制该酶的能力在这些抗体当中选择。还可以利用已知的筛选步骤 选择抗体，使得在加热后中止对DNA聚合酶的抑制。将抗体与DNA聚合 酶Bst大片段组合，将产生加热后被活化的酶混合物。

本发明的扩增/无细胞克隆方法可用于各种用途。本发明的方法可用于 制备扩增核酸，其无需进一步纯化而用于任何目的，并且可以通过已知方 式(例如体内方法)被克隆或扩增的核酸可以被使用的任何方式。例如， 核酸可被探查、亚克隆、转录、进一步扩增、存储、或进行杂交、变性、 限制性消化、进行单倍型或微卫星分析或各种SNP分型技术。还包括诊断 用途，如测序和探查特定序列。本发明的方法还可用于DNA Amplification： Current Technologies and Applications，eds Demidov等.Horizon Bioscience， 2004中讨论的用途。

本发明的一个方面为目的DNA的无细胞克隆方法，包括通过本发明的 RCA方法扩增目的DNA的单拷贝。例如，目的DNA分子库可经有限稀释 (终点稀释)，使得样品平均包含一个DNA分子。即，一些样品包含一个 DNA分子，其它的包含两个，而另外的不包含DNA分子。如有必要，每 个样品中的DNA分子随后转变成单链环，并且通过本发明的方法扩增。在 一个实施方案中，环化dsDNA分子，并且选择性地在进行有限稀释步骤之 前转变成ssDNA。选择其中存在单拷贝模板DNA的样品。单拷贝的目的 DNA因此可通过体外方法克隆，而无需体内克隆过程(例如通过活细胞(如 细菌)生长/传代)。通过该方法产生大DNA(例如约7,000至约500,000nt) 拷贝的能力允许克隆大DNA。

本发明的另一个方面为组装基因或基因组的方法，例如线粒体基因组 或编码独立生命所有结构的最小基因组，例如来自支原体的基因组。该方 法包括通过本发明的方法扩增(克隆)基因或基因组的部分；测序该克隆 的DNA；如果扩增的序列中有的话，校正错误；和组装该扩增的DNA以 形成基因或基因组的一个或多个步骤。在一个实施方案中，DNA部分通过 合成方法制备。

如此处所用的，除非上下文另外清楚地规定，单数形式“a”、“an”和“the” 包括复数。例如，如上使用的“a synthetic gene”包括两个或更多合成基因。

本发明的另一个方面为(例如为基因组测序计划)测序目的DNA的方 法，包括通过本发明的方法扩增将要被测序的DNA，并且测序所述扩增的 DNA。本方法中，模板DNA或被扩增的DNA不经过体内克隆步骤。该方 法可实质上减少制备和测序模板所需的时间；使得与不可克隆的序列有关 的问题减少；并且可方便地适应于可被自动化和用机械化操作进行的高通 量方法。扩增的DNA的核苷酸序列可通过常规方法测定，如常规的Sanger 测序，例如利用来自Applied Biosciences(Foster City，CA)的ABI毛细管 测序仪。可采用引物延伸测序的各种形式。用于所披露的方法产生的扩增 序列测序的一种形式为十亿分之一测序(nanosequencing)或单核苷酸延伸 测序。单核苷酸引物延伸测序涉及基于被查询(interrogated)核苷酸的性质 的基础上通过掺入特定的和可识别的核苷酸在扩增的靶序列中查询 (interrogation)单核苷酸。简并探针引物延伸测序包括将简并探针顺次添 加至与被扩增的靶序列杂交的查询引物(interrogation primer)。合适的测 序方法例如由Jalanko等(1994)Clinical Chemistry 38，39-43(1992)；Nikiforov 等.(1994)Nucleic Acids Research 22，4167-4175；Kobayashi等.(1995) Molecular and Cellular Probes 9，175-182；和PCT申请WO97/20948描述。

此外，通过本发明的方法产生的克隆(例如，Φ29聚合酶无细胞克隆) 末端的配对序列读数可便于组装通过新一代序列测定仪如454基因组序列 测定仪20(454 Life Sciences，Roche Applied Sciences)产生的数据(Margulies 等(2005)Nature 437，376-80；Rogers等.(2005)Nature 437，326-7)。这 样的装置具有非常高的通量，并且不依赖于大肠杆菌克隆，但目前比常规 方法产生仅仅较低质量的较短的读取长度。将这种“454数据”和无细胞克隆 数据(例如，Φ29聚合酶无细胞克隆数据)组合，产生非常快速和准确的 基因组测序方法。

本发明的另一个方面为通过本发明的无细胞方法、利用自动化的纳摩 尔系统扩增单拷贝的DNA模板的方法。该方法包括在约200nl或更小体积 (例如，约64nl或更小的体积)的反应室(如玻璃毛细管)中组合反应混 合物，其包括DNA模板、DNA聚合酶和合适引物的混合物；以及在有效 促进DNA链置换的条件下，在基本上等温温度，温育该反应混合物。

本方法的一个实施方案中，扩增反应在自动化的纳升系统中进行，如 由Brooks Automation Inc.15 Elizabeth Drive，Chelmsford，MA，01824， USA制造的Parallab 350机。所希望的系统同时进行许多反应(例如约50、 96、500、1,000个或更多的反应)；吸出、混合、热循环(如果需要)以 及纯化微型玻璃管(毛细管)内的组分；利用500nl的标准反应体积，虽 然可很容易地减小至200nl或仅仅64nl；以及利用少量如190nl的标记物 如Big Dye。自动化纳升系统的其他合乎需要的性质包括自动净化能力， 再使用时无需一次性枪头；在200nl时产生＜5％Cv的液体操作准确度的能 力；以及被设计成易于野外维护的能力。

利用如Parallab 350纳升基因组工作站的装置，DNA扩增可在无人看管 的自动化系统中进行。反应组分和相关的分离和提纯物质可在一起存储。 为了开始反应，将自动机械装置移到需要的位置，并且移去盖以让纳升液 体处理器(如可从Parallab购买的Nano-Pipetter)进入。例如，液体处理器 可将试剂吸入96个薄壁500nl玻璃毛细管中，每个毛细管用作反应器。可 通过将毛细管内的液体高速混匀而混合组分。该反应后，任选将磁珠溶液 吸入每个反应管中以分离扩增的DNA。因此，多达96个DNA产物可被分 配入输出平皿中用于脱机分析。纳升液体处理器可用随车携带的洗涤工作 站自动清洁，以准备用于另一轮反应。

还可使用其他自动化(自动机械)系统，如各种高通量的纳摩尔装置， 包括那些应用微流体方法的装置，其例子为本领域技术人员所熟知。一些 这样的装置包括：Chiou等.(2001)Anal.Chem.73，2018-21中所述的闭合 循环毛细管PCR机；Tan等(2004)Expert Review of Molecular Diagnosis 4， 219-230中所述的Roche毛细管热循环仪(LightCyclerTM)；美国专利申请 2004/0171055中用于检测样品中单个靶核酸存在的小型化装置；和Kalinina 等(1997)Nuc.Acids Research 25，1999中所述的关于十亿分之一等级PCR 方法的微毛细管PCR装置。

可选地，多个扩增反应可在阵列中、磁珠上或作为稀释的载体涂覆于 表面上或包埋于琼脂糖中而同时进行。所得到的被扩增DNA的“克隆”代表 具有插入的核酸分子的先祖环状载体的分子克隆。这样的克隆共同形成被 克隆的核酸分子的文库，其可被平板复制，或被排列、贮存和筛选。代表 性的所述步骤在Lizardi的美国专利No.6,287,824中描述。

注意的是，在单个反应室中(例如单轮复制中)通过本发明的方法扩 增的DNA的产量可以是起始材料的至少约2×108倍扩增，例如约5×108倍、 109倍、2×109倍、5×109倍、1010倍、2×1010倍或更大。各种合适的反应室 对于本领域技术人员是显而易见的。这些包括，例如试管(如毛细管)、 液滴、小瓶、胶囊、安瓿或其他容器。试管可具有可拆装的盖和/或可替换 的盖。盖可保持容器密封，使得容器不透水且不透气。容器可以是密封的。 容器可以在一端打开而在另一端封闭。根据各种实施方案，一端可以是例 如顺着该容器长度的锥形。根据各种实施方案，该容器可以承载包括测定 试剂在内的混合物，并且具有例如等于或小于约10μl(例如1μl或更小、 0.064μl或更小、或甚至更小)的体积。

本发明的一个实施方案中，通过在合适的温育和扩增时间后，测定扩 增反应中被扩增的核酸的存在，并且将包含被扩增的核酸的第一扩增反应 物的等分试样转移至新的反应混合物组，而增加扩增产物的产量。等分试 样在其中加以稀释的新反应混合物包含进一步扩增所必需的聚合酶、用来 补充之前的反应消耗的核苷酸库的核苷酸、和盐等等。在一个实施方案中， 新的反应混合物包含与第一次扩增所用的相同的引物组。在另一实施方案 中，为了降低可能在第一次反应中导致本底合成的累积序列单元的进一步 扩增，使用不同的部分随机或确定的引物组，其预计不会与来自第一个反 应混合物的引物相互作用。如果需要，可例如通过酶促手段除去来自第一 反应混合物的剩余的引物。包含来自第一反应混合物的被扩增DNA的新的 反应混合物随后在有效促进DNA链置换的条件下、在基本上等温的温度温 育。

可用于所披露的方法中的材料的任何组合可包装在一起，作为试剂盒， 用于进行所披露的任何方法。载体和引物为所述试剂盒的有效组分。所披 露的方法必需的酶也可以是所述试剂盒的组分。本领域技术人员将认识到 适于进行本发明任何方法的组分。任选地，试剂盒包括用于进行该方法的 说明书。本发明的试剂盒可进一步包括本发明的元件可附着或固定的支持 物或基质。本发明试剂盒的其他可选元件包括合适的缓冲液等等、容器或 包装材料。试剂盒的试剂可在容器中，在这些容器中试剂是稳定的，例如 为冻干形式或稳定的液体。试剂还可以是单次使用形式，例如单次扩增的 形式。

在一个实施方案中，试剂盒包括，例如引物组，如确定的引物组和/或 六聚体引物组，其序列由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5表示；和/或由通 式HHHH*H*C(SEQ ID NO：1)或通式HHHH*H*H(SEQ ID NO：5)表 示的六聚体引物组，其中H＝A、C或T并且*表示硫代磷酸酯键。试剂盒中 的引物可以包装为适于单个扩增反应的浓度，或其可以适于多个扩增反应 的量存在。在一个实施方案中，试剂盒包括本发明的多用途载体。

上述和下列实施例中，所有温度以未校正的摄氏温度表示；并且除非 另有陈述，所有部分和百分比以重量计。

实施例

实施例I-材料和方法

DNA制备。ΦX174am3cs70单链病毒粒子DNA和M13mp18单链DNA 获自New England BioLabs(NEB，Beverly，MA)。在本文中称为synΦX的 DNA是由Smith等.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，15440-445描述的 连接的环状双链合成ΦX174DNA。生殖器支原体基因组DNA文库制备自 从菌株G37分离的DNA，该菌株在1996年获自ATCC。剪切至1.5-2.2kb 的DNA如之前所述克隆入中度拷贝pBR322衍生物(Adams等.(2000) Science 287，2185-95)。

酶。Φ29DNA聚合酶以纯的形式、10,000单位/ml的浓度购自NEB。 来自USB公司的无机焦磷酸酶以40单位/ml提供。限制性酶来自NEB。

Φ29聚合酶扩增反应。反应包含37mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM KCl， 10mM MgCl2，5mM(NH4)2SO4，1mM四种dNTP中每一种，1mMDTT， 1xBSA(NEB)，0.2％Tween 20，1单位/ml酵母焦磷酸酶，540单位/mlΦ29 DNA聚合酶和50μM耐受核酸外切酶的六聚体混合物(Fidelity Systems， Inc.Gaithersburg，MD)。除了酶和六聚体之外，所有组分制成2x浓缩的 缓冲液(2xG-缓冲液)。开始反应前立即添加酶和H20至2xG-缓冲液，在室 温下温育10分钟，并且添加六聚体以使所有组分的浓度目前为1.5x最终 反应条件(此为Φ29混合物)。通过将TE缓冲液中的一倍体积模板DNA 添加至两倍体积的Φ29混合物来起始反应。反应在30℃进行。对于我们的 标准600nl反应，将400nlΦ29混合物用2μlPipetman(Gilson，Inc.Middleton， WI)添加至0.5ml PCR管。随后添加200nl模板稀释物，并且通过上下抽 吸约20次混合反应物。反应物用10μl生物技术级的矿物油(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)覆盖以防止蒸发，随后短时离心并且目测检 查以确保水相在管底部形成小球。反应物在热循环仪中30℃温育6小时， 随后保存在4℃直至分析。

PCR在Advantage 2缓冲液中进行，利用Advantage HF 2PCR试剂盒(目 录号K1914-1，Clontech Laboratories，Mountain View，CA)。

扩增反应物的限制性分析。为了消化全部反应物，将包含10单位Pst I 的20μl NEB缓冲液2加BSA(1x，NEB)添加至矿物油下的反应物，试管 短暂混合，并且在37℃温育30-60分钟。除去水相并且上样于E-凝胶 (Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。除非另有说明，0.8％E-凝胶在60 V电泳40分钟。DNA大小标记物为HyperLadder I(Bioline USA，Randolph， MA)。为了通过限制性消化和DNA测序分析Φ29聚合酶反应物，反应物 用10μl TE稀释，且随后分成份用于分析。

DNA测序。PCR和Φ29聚合酶反应产物用虾碱性磷酸酶(SAP)和大 肠杆菌核酸外切酶I(Exo I)处理，以在用作测序模板之前除去引物和dNTP。 SAP-Exo I主要混合物(SAP-Exo I master mix)每个反应含0.5μl SAP (Boerhinger Mannheim，Germany，1单位/μl)，0.1μl ExoI(NEB，20单位 /μl)，0.5ml 10xSAP缓冲液和8.9μl H20。为了测序PCR反应物，将8μl反应 物添加至10μl SAP-Exo I主要混合物，并且溶液在37℃温育60分钟，随后 在72℃温育15分钟，且随后保存在4℃，直至用于测序。为了直接测序Φ29 聚合酶反应物，600nl反应物用10ml TE稀释。将4μl反应物添加至5μl SAP-Exo I主要混合物，并且溶液如以上PCR样品那样温育。无论哪种情况， 4μl经处理的模板在8μl反应物中利用Big Dye Terminator化学(3.1型， Applied Biosystems，Foster City，CA)利用35个延伸循环的60℃4分钟进 行测序。DNA测序利用配备有50cm毛细管的ABI 3100型毛细管测序仪进 行。

实施例II-本底合成随着模板量降低而提高，并且小反应的信号本底比 率提高。

随着Φ29聚合酶滚环扩增反应中模板DNA的量降低，本底合成的量提 高。如果模板为环状ΦX174单链DNA(图2)，则Pst I在唯一的位点切割 真正的扩增产物，以产生5.4kb的线性DNA。然而本底产物通常不包含Pst I位点，并且作为大DNA迁移，使得其易于与ΦX174的滚环扩增产物区分 (图2)。

由于反应体积减小，在保持模板DNA的量不变的情况下，本底明显降 低，信噪比显著改善(图3A)。利用50个单链M13 DNA分子(7.2kb)作 为模板，3μlΦ29聚合酶反应物的Pst I消化产物呈现M13线性的清晰条带 (＞10ng)。当反应中无模板时，通过本底合成产生类似量的DNA，但此DNA 不被Pst I切割。更大体积的反应物(15μl和30μl)产生的本底合成非常高， 以致看不到M13产物。图3B显示将体积减少到0.6μl引起本底甚至进一步 降低。

实施例III-单个分子的终点稀释和无细胞克隆

利用600nl φ29聚合酶反应物，我们将单个分子扩增超过109倍，以 产生10ng或更多的DNA产物，从而在凝胶电泳后用溴化乙锭染色很容易 显影。图4呈现了二十份重复的600nl用Pst I消化的φ29聚合酶反应物的 凝胶电泳。每个反应的模板为200nl φX174(5.4kb)和M13(7.2kb)单 链DNA的相同的稀释混合物，每种包含唯一的PstI位点。一些泳道看起来 既不包含φX又不包含M13(11/20)，一些仅包含φX(2/20)，一些仅包含 M13(5/20)而一些包含两者(2/20)。从混合物克隆φX174和M13已通过 如图4中所示的反应物的PCR和实时PCR分析而加以证实，表明一些反应 物对每个分子都呈阳性，而对另一种则完全阴性(数据未显示)。图4中的 一些泳道显示既不是φX174正确大小、也不是M13正确大小的条带。此现 象常常在未添加模板的反应中看到，我们认为这是由于本底合成产物中偶 然存在Pst I位点所致。基于稀释之前起始DNA样品的UV吸光度，估计图 4的反应中所用的模板等分试样平均包含4个φX174分子和2个M13分子。 参与扩增反应的分子的比率在稀释系列间有所变化，但对于相同的DNA稀 释度每天都是十分恒定的。变化可部分由于分子在DNA浓度极低时粘附于 试管、移液管或颗粒材料引起。

实施例IV-双链环状DNA的克隆

我们还成功进行了双链环状DNA的无细胞克隆。将我们之前所述的 (Smith等.(2003)，上文)合成的φX174基因组制品加热至95℃，随后 快速冷却至0℃，以促进随机六聚体的起始。该制品中104个分子中约1个 为感染性噬菌体基因组，产生估计每个分子大约10个致死突变(Smith等. (2003)，上文)。图5A显示来自由φ29聚合酶扩增而克隆的两个分子的 测序色谱的一部分。为了比较，我们还对天然φX174DNA的商品化制品进 行了测序。我们测序了来自7个不同分子的约1kb。每种具有来自天然DNA 制品的独特的序列差异组。作为例子，图5A显示了分子1中的单核苷酸(C) 缺失。分子3和天然的DNA与其他5个被测序的分子一样在该位点都具有 野生型序列(未显示)。无细胞φX174克隆的序列读数精确到超过700bp (参见支持信息)。

实施例V-制备文库用于Φ29克隆

图6示例性举例说明了用于基因组文库的Φ29克隆的方法。基因组 DNA被打碎(例如通过雾化)至约5kb的片段，并且添加衔接子至片段的 末端，与载体连接，切口，并且转变成单链DNA环。环随后通过本发明的 方法滚环扩增。

实施例VI-用Φ29聚合酶反应无细胞克隆细菌基因组DNA

我们在600nl φ29聚合酶反应中克隆了细菌基因组DNA的片段。我们 从生殖器支原体基因组DNA文库开始，其被剪切至约2kb，并且连接入常 规的测序载体pBR194c。应当注意的是该生殖器支原体DNA从未在大肠杆 菌中扩增。稀释文库DNA，以产生通过单个分子起始的φ29聚合酶反应。 图7(上栏)显示用Pst I切割的所述反应物的分析。由于载体尺寸为3.5kb， 我们预期克隆具有约5.5kb的总尺寸。图7中大多数阳性泳道具有该尺寸范 围内的条带，但尺寸多少有些变化，这是预料之内的，因为克隆的DNA大 小不完全均一。插入物通过利用载体克隆位点侧翼的M13正向和反向测序 引物位点进行PCR扩增(图7，下栏)。有些泳道似乎包含大小稍微不同的 两个克隆。在凝胶上看来为单一种类的PCR产物利用M13测序引物从两头 测序。七个被克隆的分子中的六个产生清楚可读的序列，其在整个可读范 围内与生殖器支原体基因组序列完全匹配(多至～650bp或更大——参见支 持信息)。600nl φ29聚合酶反应的产物还可以不经PCR扩增而直接测序。 所述序列的色谱在图5B中显示，其在超过750bp的范围内呈现与生殖器支 原体基因组正确匹配的序列。

通过φ29聚合酶克隆的分子产生准确的DNA序列。然而，DNA测序 确定共有序列，因此不检测扩增期间可能发生的随机突变。设法估计扩增 自单分子的φ29产物中的突变率是有意义的。然而，该分析不是直截了当 的，因为滚环扩增不是简单的倍增过程。因此通常的涉及聚合酶错误率、 突变频率和倍增数目的方程式不适用。由于许多拷贝直接从最初的输入分 子产生，突变体的问题将不会是一个问题，因为突变体是随着PCR反应的 第一轮期间产生的突变而发生的。φ29聚合酶看起来具有可与其他具有3’ 编辑功能的聚合酶相比较的准确度(Esteban等.(1993)，上文)。基于已公 开的对φ29聚合酶错误率的估计而进行的计算，以及该反应的合理模型， 表明通过φ29聚合酶对5kb环状DNA进行的109倍扩增所产生的大部分分 子应当具有与亲本分子完全相同的序列。

实施例VII-来自单分子的同聚体带的准确扩增

φ29聚合酶的高度续进性(processivity)允许对来自单分子的同聚体 带(homopolymer tract)进行准确扩增。稀释包含A18/T18带的生殖器支原体 克隆的DNA，并且用于起始单分子φ29聚合酶反应。直接对来自这些反应 的DNA进行测序，图5C中显示部分色谱。一条链显示了18个A残基的 一段序列，而正如所料，互补链显示18个T残基。两条链上同聚体序列之 外的序列清楚可读，并且对于可读长度的测序(＞700bp)与生殖器支原体 基因组序列正确匹配。

实施例VIII-本发明的限制性六聚体组可降低Φ29Pol本底

图8显示六聚体引物组H*C和H*H与随机引物相比提供显著降低的本 底。H*C为35(243)个序列HHHHHC(SEQ ID NO：1)的混合物，其中 H＝A、C或T。引物组H*H为36(729)个序列HHHHHH(SEQ ID NO：5) 的混合物，其中H同上。

实施例IX-用于插入DNA片段的短载体序列，用于利用本发明的φ29 聚合酶扩增系统进行单分子克隆。

为了克隆DNA分子，将其连接至BstXI衔接子，并且随后连接至载体 的互补BstXI末端。通过用BstXI切割并且凝胶纯化所得到的196bp载体片 段，使载体为插入物做好准备。载体的序列和其组成位点在图9中显示。 如所表明的，该序列互补的上下链鉴定为SEQ ID NO：14和SEQ ID NO： 15。M13复制起点(ori)位点使得DNA的一条链被切口并且除去，留下单 链环用于通过φ29聚合酶扩增。M13引物位点允许测序入DNA插入物的 任一端。(M13和f1起始位点是相同的。)两个归巢核酸内切酶位点，PI-PspI 和I-SceI，允许被克隆的DNA从载体序列内线性化。其包括Lac阻遏物位 点，作为利用Lac阻遏物蛋白特异性结合载体、以从DNA混合物的回收的 工具。BbvCI为任一链的另外的切口位点。

我们开发了添加至克隆的DNA末端的新的BstXI衔接子。这些衔接子 包含IIS型限制性位点，使得DNA插入物可从载体切除，而不包括克隆的 DNA中不存在的末端序列。两个可能的衔接子在下表1中显示。标准的衔 接子为标记的BstX1衔接子，并且IIS型位点(最左边的6个碱基对)用来 自New England Biolabs(NEB)的酶名称(enzyme name)标记。当这些衔 接子中任何一个连接至平端插入DNA的末端，并且利用BstXl重叠序列将 DNA连接入载体时，IIS型位点将直接邻近于插入物DNA，并且切割在短 距离内在插入物中发生。插入物末端丧失几个碱基不会影响随后的组装反 应。存在至少一打其他的6-碱基IIS型切割位点，除了上面所显示的那两个 位点之外还可使用这些。对于任何给定的插入物，可选择衔接子，使得IIS 型位点不被包含在该插入物中，因此其可从载体中完整切割下来。

表1

BstI BstXI衔接子

CACTGCCTTTCCAGCACA(SEQ ID NO：16)     向左在第0个位置处切(进入插入物)

GTGACGGAAAGGTC(SEQ ID NO：17)         向左在第2个位置处切

BstDI BstXI衔接子

CATTGCCTTTCCAGCACA(SEQ ID NO：18)     向左在第0个位置处切(与插入

                                      物齐平)

GTAACGGAAAGGTC(SEQ ID N：19)          向左在第2个位置处切

                                      (进入插入物2个碱基)

实施例X-Φ29克隆的聚合酶错误率和准确度

评估通过φ29聚合酶滚环扩增(RCA)克隆的DNA序列准确度的一个 问题为：对该酶的总错误率缺乏良好估计。Esteban等.(1993)，上文在酶 保真度上所做的工作是最常被引用的。然而，该文章利用核酸外切酶缺陷 突变体测量不正确核苷酸的错插入率。因此在这些测量中有意未包含φ29 聚合酶3’核酸外切酶的校正活性。此似乎在以后的工作中被忽视(Nelson 等.(2002)Biotechniques Suppl，44-7)，其引用Esteban等，报道错误率为 5×10-6。此外，该后来的工作将错误率(ER)计算为：

ER＝mf/(bpxd)

其中mf为突变频率，bp为用碱基对表示的突变靶位的大小，而d为模 板倍增的数目。利用该方程式，错误率估计为3×10-6。但由于φ29 RCA反 应不是倍增过程，这一分析是不适当的。

我们认为，φ29聚合酶真正的错误率一定是～1×10-6或更低，正如其他 具有校正功能的复制型DNA聚合酶那样(Esteban(1993)，上文；T.A.Kunkel (2004)JBiol Chem 279，16895-8)。我们已建立RCA反应的许多简化模型。 例如，考虑一个四阶段反应，其中从最初的输入分子形成1000个拷贝。该 最初阶段后，进行三个连续的循环，每个循环产生100倍的扩增，产生总 共109倍的扩增。假定错误率为1×10-6，环状DNA5kb，我们得到：

通过这类推理，我们预计通过φ29RCA反应而进行的109倍扩增所产 生的大部分分子与起始分子相同，即使错误率高达10-5，并且第二轮的扩增 低至10倍。

根据上述描述，本领域技术人员可很容易地确定本发明的必要特征， 并且在不背离其精神和范围时可改变和改进本发明，以使其适合各种用途 和条件，以及最大程度地运用本发明。之前优选的特定实施方案将认为仅 仅是例证性的，而不是以任何方式限制本发明的范围。以上引用的所有申 请、专利和出版物，包括2005年4月29日提交的美国临时申请系列号 No.60/675,850、2005年9月30日提交的美国临时申请系列号No.60/722, 070和2005年10月12日提交的美国临时申请系列号60/725,300和附图 的全部公开内容在此通过引用整体并入。

本发明由美国政府支持完成(DOE拨款编号DE-FG02-02ER63453)。 政府拥有本发明一定的权利。

本申请要求2005年4月29日提交的美国临时申请系列号60/675,850， 2005年9月30日提交的美国临时申请系列号60/722,070以及2005年10 月12日提交的美国临时申请系列号60/725,300的优先权，其在此通过引 用整体并入。