成体干细胞
阅读：921发布：2020-09-09
专利汇可以提供成体干细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种CD10+、CXCR4+以及CD31+的成体干细胞以及另一种CD105+、CD44+以及巢蛋白(nestin)+的成体干细胞。也揭示制备这些干细胞的方法以及使用它们来 治疗 退行性 疾病 ，如肌肉退行性疾病，的方法二者。本 发明 另外包括制造以及使用由CD105+、CD44+以及巢蛋白+的 体细胞 衍生而来的 肝细胞 。，下面是成体干细胞专利的具体信息内容。
1.分离的成体干细胞群，其为CD105+、CD44+和巢蛋白+。
2.权利要求1的分离的成体干细胞群，其中所述成体干细胞是CD34-,CD90-,CD41-,CD117-,甲胎蛋白-,POU5F1-,Nanog-,Sox2-,HNF4a-,CD36-,HNF3B-,Pax6-,和Pax7-，并且大小为7-30μm。
3.权利要求1的分离的成体干细胞群，其中所述成体干细胞是多潜能的或多能的。
4.权利要求1的分离的成体干细胞群，其中所述成体干细胞是贴壁细胞。
5.权利要求1的分离的成体干细胞群，其中所述成体干细胞是人细胞。
6.包含多种权利要求1的成体干细胞群的细胞库，其中所述群来源于不同的受试者。
7.权利要求6的细胞库，其中所述不同的受试者是人。
8.权利要求1-5任一项的分离的成体干细胞群，其用于治疗肌肉损伤或肌肉退行性疾病。
9.权利要求8的分离的成体干细胞群，其中所述肌肉退行性疾病是肌营养不良、纤维肌痛、肌病、皮肌炎、多肌炎、横纹肌溶解或心肌炎。
10.制备成体干细胞的方法，所述方法包括：
将从受试者获得含有多种细胞的体液样品在容器中与EDTA或肝素温育，直到所述样品分离成上层和下层，
收集所述上层，
从所述上层分离大小为0.3-6.0微米的小成体干细胞的群，并且
在含有R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF和PDGF的培养基中培养所述小成体干细胞，由此制备成体干细胞，由此制备的成体干细胞是CD105+、CD44+和巢蛋白+。
11.权利要求10的方法，其中所述体液样品是血液样品或骨髓样品。
12.由成体干细胞制备肝细胞的方法，所述方法包括：
在含有激活蛋白的第一分化培养基中培养权利要求1的分离的成体干细胞；
在含有碱性FGF和BMP2的第二分化培养基中培养所述分离的成体干细胞；
在含有HGF和DEX和OSM的第三分化培养基中培养所述分离的成体干细胞；和收集由此获得的肝细胞，所述肝细胞表达白蛋白、转铁蛋白和HNF3B。
13.制备体外生物人工肝装置的方法，所述方法包括：
在含有激活蛋白的第一分化培养基中培养权利要求1的分离的成体干细胞；
在含有碱性FGF和BMP2的第二分化培养基中培养所述分离的成体干细胞；
在含有HGF和DEX和OSM的第三分化培养基中培养所述分离的成体干细胞；
收集由此获得的肝细胞，所述肝细胞表达白蛋白、转铁蛋白和HNF3B；
提供生物人工装置，所述装置包括卡匣，所述卡匣含有中空纤维阵列，其中所述中空纤维各由具有0.1μm至0.3μm孔径的膜形成；和
将收集的肝细胞置于所述中空纤维间的毛细管外空间。
14.权利要求13的方法，其中所述卡匣是圆柱形的，其在一端具有第一开口，和在另一端具有第二开口；并且所述第一开口固定至第一通道，和所述第二开口固定至第二通道；所述两个通道从所述卡匣延伸出去。
15.产生白蛋白的方法，所述方法包括：
在含有激活蛋白的第一分化培养基中培养权利要求1的分离的成体干细胞；
在含有碱性FGF和BMP2的第二分化培养基中培养所述分离的成体干细胞；
在含有HGF和DEX和OSM的第三分化培养基中培养所述分离的成体干细胞；
收集由此获得的肝细胞，所述肝细胞表达白蛋白、转铁蛋白和HNF3B；
在培养基中培养收集的肝细胞，和
从所述培养基中收集由所述肝细胞产生的白蛋白。
成体干细胞
[0002] 参考相关申请
[0003] 本申请请求在2011年9月28日提申的美国临时申请第61/540,191号以及在2012年3月12日提申的美国临时申请第61/609,522号的优先权。这两个先前申请的全部内容在此并入本案以为参考。
[0004] 发明背景
[0005] 干细胞是可在活体内或试管中分化成许多或所有的细胞类型的全能干(totipotent)细胞、多潜能(pluripotent)干细胞或多能(multipotent)干细胞。由于它们的多潜能性(pluripotency)，一般认为胚胎干(ES)细胞在治疗退化性或先天性疾病方面拥有非常高的潜力。可是道德考虑阻碍了人类ES细胞的使用。非胚胎起源的干细胞可规避此障碍。因此，需要有一种非胚胎干细胞。
发明概要
发明概要
[0006] 本发明涉及成体干细胞以及相关的方法。
[0007] 本发明的一个方面涉及一种CD10+、CXCR4+以及CD31+的分离的体非贴壁干细胞。此细胞在此称作“SB-3细胞”。细胞标记后面的符号“+”，代表与同型的抗体对照组的较低的荧光染色相比，具较多特异性标记抗体的荧光染色。细胞标记后面的符号“-”，代表具有与同型的抗体对照组相同的特异性标记抗体的荧光染色。
[0008] 本发明的另一方面涉及一种CD105+、CD44+以及巢蛋白+的分离的体贴壁干细胞。此细胞在此称作“SB-4细胞”。
[0009] 在又另一方面中，本发明描述一种细胞库，其包括多受试者干细胞群。该成体干细胞各自为CD10+、CXCR4+以及CD31+，以及该群源自于不同的受试者。该受试者可为人类或非人类。
[0010] 在又另一方面中，本发明描述一种细胞库，其包含多受试者干细胞群。该成体干细胞各自为CD105+、CD44+以及巢蛋白+，以及该群源自不同的受试者。该受试者可为人类或非人类。
[0011] 同样在本发明的范畴内的是一种用于治疗肌肉损伤或肌肉退行性疾病的方法。该方法包括对需要此治疗的受试者施用一有效量的CD10+、CXCR4+以及CD31+的成体干细胞。该肌肉退行性疾病的例子包括肌营养不良、纤维肌痛、肌肉病变、皮肌炎、多发性肌炎、横纹肌溶解以及心肌炎。
[0012] 本发明另外描述另一种用于治疗肌肉损伤或肌肉退行性疾病的方法。该方法包括对需要此治疗的受试者施用一有效量的CD105+、CD44+以及巢蛋白+的成体干细胞。
[0013] 在此也涵盖一种制备成体干细胞的方法。该方法包括1)从一受试者(如，人类或非人类)获得含有多种细胞的体液检体(如，血液、骨髓、脐带血、月经液以及羊水)、2)于容器中用二价阳离子螯合剂(如，EDTA、EGTA以及柠檬酸钠)或肝素培育该检体，直到该检体分成上层以及下层、3)收集该上层、4)从该上层分离出0.3-6.0微米大小的成体干细胞群以及5)在含有特定成长因子：R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF以及PDGF的培养基中培养该分离的成体干细胞。成体干细胞可为CD10、CXCR4以及CD31阳性的。它们也可为CD105、CD44以及巢蛋白阳性的。
[0014] 进一步涵盖的是一种由以上所述的CD105+、CD44+以及巢蛋白+的成体干细胞制备肝细胞的方法。该方法包括在含有激活蛋白的第一分化培养基中培养该分离的成体干细胞；在含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及骨形态发生蛋白2(BMP2)的第二分化培养基中培养该分离的成体干细胞；另外在含有肝细胞生长因子(HGF)、地塞米松(DEX)以及制瘤素M(OSM)的第三分化培养基中培养该分离的成体干细胞；以及收集因此获得的肝细胞，该肝细胞会表达白蛋白、转铁蛋白以及肝细胞核因子3B(HNF3B)。
[0015] 本发明也包括一种体外生物人工肝装置。该装置具有一卡匣(cartridge)，其含有一中空纤维阵列以及用以上所述的方法制得的肝细胞。该肝细胞会表达一种或多种选自于由下列所组成的群组的蛋白质：白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、第V因子、补体C3、抗凝血酶III以及转铁蛋白。它们被置于各由孔径约0.1μm至0.3μm的膜形成的中空纤维间的毛细管外空间。该卡匣可具有圆柱形，在接近一端的侧壁上具有第一开口，且在接近另一端的侧壁上也具有第二开口。该第一开口固定至第一通道，而该第二开口固定至第二通道，这两个通道各从该卡匣延伸出去。
[0016] 此外，本发明描述一种治疗急性肝衰竭的方法。该方法包括鉴定需要治疗的受试者；通过该第一通道将以上所述的体外生物人工肝装置接到该受试者的动脉，以及通过该第二通道接到该受试者的静脉；从该受试者输注血液通过该卡匣的各中空纤维内部的毛细管空间；以及通过允许从该血液而来的毒素溶解物与培养在该中空纤维间的毛细管外空间的肝细胞交换，使能够净化血液，以及也使从该肝细胞而来的重要代谢物能够扩散至血液返回到该受试者。该受试者可为罹患慢性肝病的人类，它们大部分是因C型肝炎感染、酒精成瘾以及药物过量引起。在一个实施方式中，该受试者正等待肝移植。
[0017] 在此也描述一种产生白蛋白的方法。该方法包括在培养基中培养使用以上所述方法制得的肝细胞，以及从该培养基收集由该肝细胞产生的白蛋白。
[0019] 图1是显示培养中的SB-3细胞以及SB-4细胞的照片。
[0020] 图2是接到人类受试者的体外生物人工肝装置的概要图。
[0021] 图3a是可用于体外生物人工肝装置的例示卡匣的照片。
[0022] 图3b是例示卡匣的横截面影像。
[0023] 详细说明
[0024] 本发明，至少部分，是根据非预期的发现(i)CD10、CXCR4以及CD31为阳性的非贴壁细胞(即，SB-3细胞)可分化成三种胚层；以及(ii)这些细胞可变成CD105、CD44以及巢蛋白为阳性的贴壁细胞(即，SB-4细胞)。
[0025] SB-3细胞以及SB-4细胞
[0026] SB-3以及SB-4细胞可从由体液检体(如，血液、骨髓、脐带血、月经液以及羊水)分离出的细胞群制得。该体液检体可获自人类或非人类。从其中可获得以上所提及的成体干细胞的非人类的例子包括，但不限于，灵长类、狗、啮齿动物、豚鼠、猫、马、牛、羊以及猪。的确，涵盖所有的宠物动物、农场动物、实验动物以及疾病模型动物。
[0027] 从一受试者中抽出体液，然后于容器中以二价阳离子螯合剂(如，EDTA、EGTA以及柠檬酸钠)或肝素培育，直到该检体分成上层以及下层。从该上层中分离出0.3-6.0μm大小的成体干细胞群，之后在含有某些成长因子(即，R-Spondin-1、SCF、G-CSF、bFGF、EGF以及PDGF)的培养基中培养，历时1至30天(如，4至14天)。该培养基可含有每一种的浓度1至100ng/ml(如，2至50ng/ml以及5至20ng/ml)。在这些培养条件下，细胞的直径增加至6-25μm。
[0028] 仍未贴壁的细胞为SB-3细胞，而该等变成贴壁的细胞为SB-4细胞。在该SB细胞群中的成体干细胞可为CD9+、SSEA1+、SSEA4+、CD13+或Strol+。例如，一些为CD9+CD349+。
[0029] SB-3以及SB-4细胞二者均为成体干细胞。它们可用于再生分化的功能细胞，用于治疗各种退化性病症或组织伤害。这些细胞可容易地在试管中维持以及扩张，以及使用常规技术方法诱导分化。此外，在移植这些细胞进入动物受试者(如，小鼠)之后，没有恶性肿瘤生长的证据。这些干细胞含有正常的染色体配对。它们对谱系诱导剂、增殖剂以及分化抑制剂有反应。由于这些优点，它们可为其它干细胞的替代物。
[0030] 在此的术语“干细胞”意指一种全能性(totipotent)、多潜能性(pluripotent)、多能性(multipotent)或单能性(unipotent)细胞，即能够分化成一种或多种终末分化细胞类型的细胞。全能干细胞典型地具有发展成任何细胞类型的能力。它们可为胚胎来源与非胚胎来源二种。多潜能干细胞典型地能够分化成外胚层、内胚层以及中胎层细胞。多能干细胞可分化成许多不同终末分化细胞类型。单能性干细胞仅可分化成一种细胞类型。它们具有自我再生的特性，此区分它们与非干细胞。以上提及的干细胞可源自各种组织或器官，包括，但不限于，血液、神经、肌肉、皮肤、肠子、骨头、肾、胰脏以及胸腺。
[0031] 在此揭露的干细胞是实质上纯的。术语“实质上纯的”用在涉及干细胞或从其衍生而来的细胞(如，分化的细胞)时，意指该特定细胞构成制品中主要的细胞(即，超过20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)。一般来说，实质上纯化的细胞群构成制品中至少约70％的细胞，通常是制品中至少约80％的细胞，特别是制品中至少约90％的细胞(如，95％、97％、99％或100％)。如此，本发明的方法提供可在无其它细胞类型的污染下，获得实质上纯的特定细胞类型的群(如，SB-3以及SB-4细胞)的优点。
[0032] 各种从一受试者而来的含有细胞的检体可用于制备本发明的成体干细胞。在本发明的优选实施方式中，SB-3以及SB-4细胞是从SB细胞群制得。
[0033] 为确认分离的细胞的确为SB-3或SB-4细胞，可检验一些特征，包括细胞表面标记。可使用抗细胞表面标记，诸如CD10、CXCR4、CD31、CD105、CD44以及巢蛋白，的抗体。它们可结合适合的标签，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或量子点。
[0034] 为确认这些成体干细胞的分化潜能，可用此技艺中已知的方法，诱导它们形成，例如，神经胶质细胞、骨细胞以及脂肪细胞。例如，可继代培养这些细胞，并培养至细胞贴壁长满，移至成骨培养基或脂肪形成培养基，然后培育一段适合的时间(如，3周)。骨生成的分化潜能可通过钙累积的矿化作用评估，其可利用von Kossa染色显现。为检验脂肪形成的分化作用，可用油红O染细胞内的脂质液滴，然后在显微镜下观察。对于神经分化作用方面，可在神经生成培养基中培育这些细胞历时一适合的期间(如，7天)，之后经血清耗竭处理，以及用β-巯基乙醇培育。分化之后，它们会展现出折光细胞体的形态，具有排列成网状的延伸像神经突的结构。进一步进行RT PCR以及谱系特异性标记的免疫细胞化学染色，以确认神经分化。标记的例子包括神经元特异性III类β-微管蛋白(Tuj-1)、神经纤维丝以及GFAP。
[0035] SB-3以及SB-4细胞可另外在非分化培养基中进一步增殖超过10、20、50或100个群倍增，而没有显示出自发性分化、衰老、形态改变、生长速率增加以及分化成神经元的能力改变。在使用之前，这些干细胞可用标准方法贮存。
[0036] 在此使用的术语“增殖”以及“扩增”，用在细胞时可交换使用，意指相同类型的细胞经分裂而数量增加。术语“分化”意指使细胞特化变成特定功能的发展过程，例如，在此细胞获得一种或多种与一开始的细胞类型不同的形态特征和/或功能。术语“分化”包括谱系定向以及终末分化过程二者。分化的评估可经由，例如，使用免疫组织化学或其它熟悉此技艺的工作者已知的程序，监控谱系标记的出现与消失。从祖细胞衍生出的分化的后代细胞，可与该干细胞的来源组织相同的胚层或组织有关联，但不是必然地。例如，神经祖细胞以及肌肉祖细胞可分化成造血细胞谱系。
[0037] 术语“谱系定向”以及“特化”在此可交换使用，意指干细胞经历的过程，其中干细胞引起祖细胞定向形成特定有限范围的分化的细胞类型。定向祖细胞通常能够自我再生或细胞分裂。
[0038] 术语“终末分化”意指细胞最后分化成成熟、完全分化的细胞。例如，神经祖细胞以及肌肉祖细胞可分化成造血细胞谱系，其的终末分化产生特定细胞类型的成熟血液细胞。通常，终末分化与退出细胞周期以及终止增殖有关。在此使用的术语“祖细胞”意指一种细胞，其定向形成特定细胞谱系，且其会引起此谱系的细胞产生一系列的细胞分裂。祖细胞的例子可为肌母细胞，其能够分化成仅一种类型的细胞，但其本身还未完全成熟或完全分化。
[0039] 在本发明的范畴内的是一种具有多个SB-3或SB-4细胞群的细胞库或文库。这些干细胞可为人类细胞或非人类细胞。该库可由下列产生：贮存源自不同受试者的SB-3或SB-4细胞群；描述群中SB-3或SB-4细胞的特征，以获得针对每一种的至少一种预定特征；以及根据该至少一种预定特征编制各群的目录。为产生该库，可进一步扩增SB-3或SB-4细胞群。该特征的例子包括受试者的名字、性别、生理状况(包括基因病症以及MHC数据)。
[0040] 以上所述的SB-3细胞以及SB-4细胞均可用于药物筛选、治疗退化性病症以及基因疗法。
[0041] 筛选方法
[0042] 以上所述的SB-3细胞以及SB-4细胞可用于筛选分析，以便鉴定会影响特定细胞类型的药物，在某种程度上指出可用于治疗与该细胞类型相关的病症。例如，该干细胞可使用于，用于鉴定可治疗疾病(如，退行性疾病)的药物候选者的方法。该方法包括下列步骤：使测试化合物与该干细胞接触，以及测定此疾病中向下调节的多肽的表达水平。测试化合物存在时的表达水平假如高于无该化合物的水平时，指出该化合物是用于治疗该疾病的候选者。该疾病的例子包括糖尿病、神经退行性疾病、关节炎、癌症或自体免疫病症。可测定的表达水平是mRNA水平或蛋白质水平。
[0043] 因此，本发明的一个方面涉及一种用于鉴定会改变SB-3或SB-4细胞的功能的剂，其是通过使该细胞与测试剂接触。与缺少测试剂的情况下相比，该细胞在有测试剂的情况下的功能或基因表达的改变，显示出该测试剂是会改变细胞的功能或细胞中基因的表达的剂。术语“测试剂”意指任何欲检验其能够改变细胞的功能或细胞中的基因的表达的能力的分子。虽然该方法通常是用作为鉴定之前具有所欲活性的未知的分子的筛选分析，但本发明的筛选方法也可用于确认已知具有该活性的剂的特殊活性。
[0044] 该功能可以是细胞中典型地表达(或没有表达)的基因的表达，以及该剂可通过增加或减少该细胞中表达基因的表达水平，或通过打开该细胞中未表达基因的表达(如，诱导谱系特异性抗原的表达)而改变功能。
[0045] 在一个实施方式中，会影响该细胞的功能的剂是一种会引起干细胞分化，从而产生分化的细胞的剂。此分化的细胞可为多能性人类干细胞(如，造血干细胞)或可为终末分化的细胞(如，肌肉细胞、肝细胞、神经细胞、血液细胞、结缔组织或表面细胞)。如此，该方法可用于鉴定会诱导SB-3或SB-4细胞分化成终末分化的细胞(包括胰脏β细胞、肝细胞、心肌细胞、骨髂肌细胞或任何其它细胞类型的剂。因此鉴定出的剂或化合物可用于治疗退化性病症、癌症或免疫病症。
[0046] 该表达水平可以是测定mRNA水平或蛋白质水平。测量一检体中mRNA水平的方法是本领域熟知的。为测量mRNA水平，将细胞水解，然后可利用如杂交分析(使用可检测标签的基因特异性DNA或RNA探针)以及定量或半定量RT-PCR(使用适常的基因特异性引物)，测定水解物(不管纯化与否)中mRNA的水平。选择性地，可在组织切片或未水解的细胞悬浮液上，使用可检测标签(如，荧光或酶)的DNA或RNA探针，进行定量或半定量原位杂交分析。额外的mRNA定量方法包括RNA酶蛋白质分析(RPA)方法以及基因表现连续分析法(SAGE)方法，以及基于阵列的技术。
[0047] 测量检体中蛋白质水平的方法也为本领域熟知的。它们中一些使用抗体(如，单克隆或多克隆抗体)，其特异性结合至目标蛋白。于此分析法中，抗体本身或结合至其上的第二抗体可为可检测标签的。选择性地，该抗体可与生物素结合。其的存在可用可检测标签的亲和素(结合生物素的多肽)测定。结合这些方法(包括“多层三明治”分析法)，可用于提高方法的灵敏性。适当的标签包括放射性核素(如，125I、131I、35S、3H或32P)、酶(如，碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、荧光素酶或β-半乳糖苷酶)、荧光/冷光剂(如，荧光素、若丹明、藻红蛋白、GFP、BFP以及纳米粒子(如，由Quantum Dot Corporation，Palo Alto，CA提供的QdotTM)。一些蛋白测量分析法(如，ELISA以及蛋白质印迹法)可应用于体液或细胞水解物，而其它(如，免疫组织学方法以及荧光流式细胞仪)可应用于组织切片或未水解的细胞悬浮液。其它可应用的方法包括定量免疫沈淀法以及补体固定分析法。
[0048] 测试化合物或剂可为任何类型的分子，例如，多核苷酸、肽、拟肽、类肽如乙烯化类肽、小型有机分子或相似物，且可以各种方式作用，以改变SB-3或SB-4细胞的功能。例如，该测试剂可在细胞外作用，通过结合至细胞表达的细胞表面受体，从而改变经由配体(其通常结合至受体或通过受体产生作用)的结合而介导的功能。选择性地，该测试剂可为一种被动或通过主动传送机制横过细胞膜，且在细胞内作用以改变功能的剂。
[0049] 肽测试剂可为任何的氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，且可从约3至4个残基变化至数百或数千个。肽测试剂可经由化学合成法制得；或使用蛋白质纯化方法，接着蛋白质水解，需要时，另外用色层分析法或电泳方法纯化制得；或可从编码多肽表达而得。肽测试剂可以已知的肽为基础，例如，自然发生的肽，但与自然发生的序列不同，例如，含有一个或多个氨基酸类似物。
[0050] 多核苷酸剂可为二或多个由磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。其可为RNA或DNA，其可为基因或其蛋白质、cDNA、RNAi剂、合成多脱氧核糖核酸序列或相似物，且可为单股或双股以及DNA/RNA杂交物。其可为从细胞分离出的自然发生的核酸分子，以及可为经，例如，化学合成法或酶方法(诸如聚合酶链反应(PCR))制成的合成分子。于各种实施方式中，本发明的多核苷酸可含有核苷酸或核苷酸类似物，或除了磷酸二酯键外的骨架键。此核苷酸类似物是本领域熟知的以及商业可得的，如含有此核苷酸类似物的多核苷酸(Pagratis et al.，Nature Biotechnol.15：68-73，1997)。
[0051] 使用在此所述的方法或其它本领域已知的方法，可使多肽测试剂与SB-3或SB-4细胞接触或将其引入SB-3或SB-4细胞中。一般而言，但不是必须地，将多核苷酸引入细胞内，在此其会直接或在转录或转译或二者之后影响其功能。例如，多核苷酸可编码肽测试剂，其在细胞中表达，然后改变细胞的功能。多核苷酸测试剂也可为，或可编码，反义分子、核酶或三联剂，其可设计成可标靶一个或多个特异性目标核酸分子。
[0052] 使用本领域已知的组合库方法中许多方法中的任一种，可获得欲进行筛选的候选剂或化合物(如，蛋白质类、肽类、拟肽类、类肽类、抗体类、小型分子类或其它药物)。这些库包括：肽库、类肽库(具有肽的功能，但具新的、非肽骨架(对酶降解具有抗性)的分子库)；空间可定位平行固相或液相库；反卷积运算或亲和性色层分析选择法获得的合成库；以及“一珠一化合物”库。参见，如Lam，1997，Anticancer Drug Des.12：145。用于合成分子库的例子可在如Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；以及Gallop et al.，1994J.Med.Chem.37：1233中找到。化合物的库可存在溶液中(如，Houghten，1992，Biotechniques 13：412-421)或在珠子上(Lam，1991，Nature354：82-84)、芯片上(Fodor，1993，Nature 364：555-556)、细菌中(美国专利案第5,223,409号)、孢子中(美国专利案第5,223,409号)、质粒中(Cull et al.，1992，PNAS USA 89：1865-1869)或噬菌体中(Felici 1991，J.Mol.Biol.222：301-310；以及美国专利案第5,223,409号)。
[0053] 治疗方法
[0054] 可使用在此揭示的SB-3或SB-4细胞来治疗退化性或先天性疾病，避免人类胚胎操作的道德考虑。
[0055] 如此，可从病人(如，缺少组织或器官的适当发展必须的功能基因的病人)中分离出SB细胞群。之后使该SB细胞群经历可获得SB-3细胞或SB-4细胞的条件处理。之后可于这些干细胞中引入编码该功能性版的基因的表达核酸载体。可通过各种技术将该载体引入该干细胞中，包括磷酸钙共沈淀、DEAE-葡聚糖介导转染、脂质体转染、电穿孔法、微注射或病毒介导的技术。不影响细胞的多潜能性的方法是优选的。这些技术的说明可在公开文件中找到，如美国专利案第7,422,736号以及第5,591,625号。在将该功能基因送进该干细胞后，可使用本领域熟悉的方法将它们移植回病人身上。当该干细胞在病人身上产生时，此治疗不会引起免疫排斥。
[0056] 选择性地，可从由健康受试者制得的SB-3或SB-4细胞，制造通用型供体细胞。制造通用型供体细胞的方法是本领域已知的。从SB-3或SB-4细胞制造通用型多潜能干细胞的例示性技术述于下文中。
[0057] 在适当的条件下，移植的干细胞可发展成功能组织或器官。为促进此发展，可施用病人用以诱发细胞发展的因子。这些因子可为小型分子化合物类、肽类以及核酸类。例子包括，但不限于，转形成长因子β、骨形态发生蛋白以及神经成长因子。
[0058] 通用型多潜能干细胞也可用于研究谱是发展以及分化的发展以及分化机制。可使用这些细胞作为模型系统，用以鉴定可诱导全能性多潜能干细胞发展成特定组织或器官的条件。此外，可使用本领域已知的差异cDNA筛选方法，分离在发展期间参与的基因。可由已经诱导发展成某谱系，如，以上所述的神经胶质谱系，的细胞制备cDNA库。之后该库可用于分离以及研究差异表达基因。这些分离的基因可经进一步的研究，界定它们在各别过程中的角色。相关的技术是本领域已知的。见，美国专利案第7,422,736号。使用本领域已知的方法也可使多潜能干细胞发展成动物的器官或选殖株。据此，这些细胞对宠物以及家畜产业很有用，且可用于保存快绝种的动物。
[0059] 在一方面中，本发明描述一种治疗一受试者的退行性疾病的方法。该方法包括对一需要此治疗的受试者施用一有效量的以上所述的SB-3或SB-4细胞。在一个实施方式中，这些细胞中的至少一种包括重组核酸。该重组核酸可编码多肽以及该干细胞可含有编码该多肽的mRNA。退行性疾病的例子包括肌肉退行性疾病、肝退行性疾病、糖尿病、神经退行性疾病以及关节炎。神经退行性疾病的例子是帕金森病。
[0060] 在另一方面中，本发明描述一种治疗一受试者的自体免疫的方法。该方法包括对一需要此治疗的受试者施用一有效量的以上所述的SB-3或SB-4细胞。
[0061] 退行性疾病意指一种疾病，其中受影响的组织或器官的功能或结构，因基因缺陷、损伤、缺少适当的细胞分化(如，细胞增生病症)、正常的身体消耗或生活形态的选择，随着时间日渐的恶化。退行性疾病的例子包括神经退行性疾病(如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨丁顿舞蹈症、多发性硬化症以及肌萎缩性侧索硬化症(ALS))；其它神经系统病症(如，横贯性脊髓炎、脑或脊髓创伤后发生的脱髓鞘、急性脑损伤、头部创伤、脊髓损伤、周边神经损伤、缺血性脑损伤、CNS的遗传髓鞘病变、癫痫、新生儿周产期窒息、窒息、缺氧症、癫痫持续状态、Shy-Drager综合征、孤独症以及中风)；癌症(如，肝癌)或由抗癌治疗(如，化疗)产生的病况；代谢病症(如，糖尿病以及尼曼匹克症(Niemann Pick disease))；自体免疫或发炎相关病症(如，红斑、炎性肠病(IBD)、前列腺炎、骨关节炎、骨质疏松、风湿性关节炎、狼疮、糖尿糖以及气喘)；眼病(如，青光眼、色素沉积性视网膜炎、诺里病(Norrie disease)以及黄斑部退化)；心脏以及循环病症(如，动脉硬化症、心衰竭、心肌梗塞以及心血管疾病)；血液病症(如，Wiscott-Aldrich氏综合征)；肌肉营养失调；胃肠疾病、肾病、肝病；肺病、肾上腺病(如，艾迪森氏病(Addison′s disease))；因损伤引起的病况(如，烧伤、中风、包括轻伤的受损组织、老化受损的细胞以及老化受损的组织)；与老化相关的病况(如，掉发，包括雄性秃以及圆秃)；病毒病况(如，C型肝炎感染以及后天免疫缺乏综合征)；以及任何其它可通过器官移植或干细胞而复原，或减缓与该其相关的症候和/或症状的病症。本发明的方法可用于治疗勃起障碍以及女性的整型手术或隆乳。
[0062] 于又另一方面中，在此所述的是一种治疗一受试者的脑或CNS组织损害或减缓该病症的症状的方法。该方法包括鉴定罹患或有发展成脑组织损害的风险的受试者。脑组织损害的例子包括该等因脑缺氧(如，慢性中风)或神经退化疾病(如，帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑疾病以及亨丁顿舞蹈症)引起的病症。该治疗方法需要对需要该治疗的受试者施用一有效量的以上所述的干细胞或活性剂/化合物。
[0063] 干细胞的治疗作用可依照标准方法评估。例如，为确认促进脑血管的血管新生的效率，可在治疗前以及治疗后，用标准脑影像技术，诸如电脑断层(CT)、都卜勒超音波造影(DUI)、核磁共振造影(MRI)以及质磁共振光谱法(1H-MRS)检验该受试者。例如，1H-MRS代表一种可获得与脑代谢活性有关联的生化信息的非侵入性工具(Lu et al.，1997，Magn.Reson.Med.37，18-23)。此技术可用以评估在有或无干细胞移植的情况下，涉及脑部缺血的代谢的改变。例如，其可用于研究脑中N-乙酰天门冬胺酸(NAA)的浓度，一种神经元完整性标记。虽然神经元碎片中的NAA的再分配以及扣留限制了其用作为定量神经标记的用途，但在脑部缺氧时脑中的NAA浓度的减少仍可被视为神经元丢失或功能障碍的指针(Demougeot et al.，2004，J.Neurochem.90，776-83)。因此，由1H-MRS测得的NAA水平是脑部缺血后，用于密切注意干细胞移植的作用的有用的指标。
[0064] 可用针对以上所述的病症的标准诊断技术，鉴定一受试者是否患有该等特殊病症中的一种。“治疗”意指对一罹患或有发展成一病症的受试者施用一组合物(如，细胞组合物)，目的是治愈、减轻、缓和、去除、延迟、预防或改善该病症、该病症的症状、该病症继发的疾病状态或易患该伤害/病症的体质。可用诊断相关病状或病症的标准技术，鉴定欲治疗的受试者。“有效量”意指该组合物在治疗受试者中能够产生医疗所需的结果的数量。该治疗方法可单独进行，或结合与其它药物或治疗法一起进行。该受试者可为人类或非人类哺乳动物，诸如猫、狗或马。
[0065] 制造以及使用肝细胞
[0066] 在本发明的范畴内也为制造以及使用从SB-4衍生而来的活细胞的方法。SB-4细胞当在含有激活蛋白的培养基中培养5天后，在含有bFGF以及BMP2的培养基中培养10天至15天，最后在含有HGF、DEX以及OSM的培养基中培养10至15天，会经历分化而形成内胚层细胞。这些内胚层细胞会表达白蛋白、转铁蛋白以及HNF3B，它们全部是肝特异性蛋白。换句话说，SB-4细胞可分化成用于产生白蛋白或用于生物合成肝装置的肝细胞。在此的术语“肝细胞(liver cells)”与“肝细胞(hepatocytes)”可交换使用。
[0067] 本发明的一个实施方式是一种使用从SB-4细胞衍生而来的肝细胞的体外生物人工肝装置。此一装置是用于治疗具有或怀疑具有肝相关病况或因疾病或创伤产生的肝功能不全的受试者。
[0068] 体外生物人工肝装置包括一个或多个卡匣。见图2。各卡匣含有各由可渗透性或半渗透性膜形成的中空纤维阵列。见图3a以及3b。各卡匣可具有圆柱形，在一终端具有第一开口以及在另一终端具有第二开口；以及该第一开口固定至第一通道，而该第二开口固定至第二通道，这两个通道从该卡匣延伸出去。见图3a。一个通道接到一受试者的动脉上，而另一个接到此受试者的静脉上。
[0069] 形成各中空纤维的膜能够通过允许从血液而来的毒素溶解物与培养在该中空纤维内的肝细胞交换，使能够净化血液(如，胆红素，其会扩散通过该膜，然后被处理以及代谢掉)，且也使培养在该装置中的细胞而来的重要代谢物能够扩散至血液回到该受试者。该膜的选择性渗透或半渗透特征也提供该受试者的血液中免疫系统的组份的物理障碍。典型地，该膜具有分子量截留值从约20,000道尔顿至约80,000道尔顿，通常约30,000道尔顿至约50,000道尔顿。在一优选实施方式中，该膜具有孔径0.1μm至0.3μm，典型地约0.2μm。在此范围内的孔径，除了细胞元素之外，容许蛋白质(如，白蛋白)以及蛋白质复合物通过，因此减轻罹患肝衰竭的受试者的血清蛋白质的缺陷。
[0070] 在此使用的术语“净化”或“清理”意指从该受试者的血液中移除不想要的分子。此外，术语“净化”或“清理”进一步包括使从SB-4衍生的肝细胞而来的不欲的分子(即，白蛋白)，在其返回至该受试者之前，释放至血液中。
[0071] 相似的装置、它们的用途以及作用的机制是本领域技术人员公知的。例如，生物人工肝装置述于Viles，et al.的美国专利案第4,675,002号以及第4,853,324号；Jauregin，GB 2,221,857A；Wolf，et al.的1979，International J.of Artificial Organs 2：97-103；Wolf，et al.的1978，International J.of Artificial Organs，1：45-51；以及Ehrlich，et al.的1978，In Vitro 14：443-450中。这些装置也可用SB-4细胞衍生的肝细胞。
[0072] 中空纤维卡匣具有两个槽单元，即，一槽在该中空纤维每一个的内部，而另一个位在该中空纤维的外部，其再生出正常器官的三维特征。见Knazek，R.H.，1974，Feder.Proc.33：1978-1981；以及Ku，K.et al.，1983，Biotechnol.Bioeng.23：79-95。
[0073] 培养或生长培养基在该卡匣的每一个中空纤维的内部的毛细管空间循环，以及提供接种后在该卡匣的中空纤维之间的毛细管外空间生长的细胞恒定的新鲜培养基流入。见Tharakan，J.P.et al.，1986，Biotechnol.Bioeng.28：1605-1611。典型地，在1400cm2的卡匣中接种一有效量的SB-4细胞衍生的肝细胞(如，大约1x 109个细胞)，然后在14至约21天内生长至贴壁长满。此中空纤维培养系统是已知的(如，Heifetz et al.，1989，BioTechniques7：192-199；以及Donofrio，D.，Amer.Biotech.Lab.Sept.1989，Publication#940)且可在市面上购得(如，Anchornet series)。
[0074] 当用在生物人工肝装置时，中空纤维为主的系统提供许多的优点。卡匣能支撑非常高密度培养物的生长。以毛细管外体积为基础，1400cm2的单元中可长15至20g的细胞，而7000cm2中可长100g的细胞。此细胞团的数量能够提供罹患肝衰竭的受试者肝的支持。且，卡匣生长的细胞是分化的，且它们的生长近似正常的肝结构。该细胞接受从毛细管空间而来的养份，且分泌废物至该毛细管外空间。灌洗毛细管外空间，以预防毒素的累积。连续流动的培养基以及在线制氧机提供更恒定的氧以及能量供给。
[0075] 就绝大部分而言，预计使用SB-4衍生的肝细胞的生物人工肝装置先通过体外接到一受试者来处理血液(如，典型地，制造该装置至该受试者的血液供应的流体连通，通常是动脉与静脉之间)。此一安排特别有用于提供罹患严重肝病的受试者暂时的肝支持。
[0076] 选择性地，SB-4衍生的肝细胞在身体内使用作为生物人工肝或作为生物人工肝支持。当以此方式使用时，该SB-4衍生的肝细胞是被包覆起来的，或在中空纤维毛细管膜中生长，供内部使用。典型地，该细胞生长时会附着于该支撑物上。然而，可提供连接材料使该细胞附着于支撑物上(见，如Jauregin，GB 2,221,857A)。Cai et al.，Artificial Organs 12：388-393；Sun et al.，1986，Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs Vol.XXXII：39-41；
O′Shea et al.，1984，Biochimica Biophysica Acta 804：133-136；Sun et al.，1985，J.Controlled Release 2：137-141；以及Lim，美国专利案第4,391,909中，教示将该SB-4衍生的肝细胞包覆在诸如藻酸聚离胺酸膜的生物材料中。之后将包覆的细胞以及载体胶囊经腹膜注射至受试者中。
O′Shea et al.，1984，Biochimica Biophysica Acta 804：133-136；Sun et al.，1985，J.Controlled Release 2：137-141；以及Lim，美国专利案第4,391,909中，教示将该SB-4衍生的肝细胞包覆在诸如藻酸聚离胺酸膜的生物材料中。之后将包覆的细胞以及载体胶囊经腹膜注射至受试者中。
[0077] 额外地，SB-4衍生的肝细胞可用于合成像肝的组织，包含成纤维细胞以及该SB-4衍生的肝细胞。典型地，一起培养成纤维细胞以及肝细胞，不会自动采用典型地在肝中找到的排列。此外，因为二种细胞类型的交流很差，所以肝细胞的功能常常效率不好。为解决此问题，可使用微电技术的标准的光刻技术，以图案化的胶原薄膜压印基材(如，硼硅酸晶片)，其会促进细胞的附着。见Toner et al.，1997，Fall Meeting of the Materials Research Association，1-5；Toner et al.，1988，Nature，39：128。之后SB-4衍生的肝细胞可在此表面上培养，仅贴在胶原涂覆的区域。随后在裸表面区域上引入成纤维细胞，在周期图案中产生二种细胞类型的亲密混合。此技术容许在基材上产生任何比率的细胞类型，因此允许调整至任何生理值。再者，可演算以及工程设计出任何图案尺寸、形状以及数量密度。
[0078] 基因疗法
[0079] 在此所述的干细胞可用于表达外源重组多肽。因此，在本发明的范畴内是此种含有重组核酸的干细胞。该重组核酸可编码多肽以及该干细胞可含有编码该多肽的mRNA。
[0080] 这些干细胞可经基因操作成它们不会表达β2-微球蛋白基因或不会表达一种或多种由第I类主要组织兼容性复合体(MHC)基因编码的蛋白(其会引起对抗细胞的T淋巴细胞介导的反应)。这些细胞可用作为通用型供体细胞，因为它们不会引起宿主对移植物排斥。
[0081] 据此，本发明描述一种于一受试者中引入异源核酸的方法。该方法包括下列步骤：获得以上所述的干细胞，在此该干细胞中的至少一种包括异源核酸；以及将该细胞施用至需要治疗的受试者。该异源核酸可编码多肽。
[0082] 术语“异源”是相对术语，其当用于核酸的部分时，指的是该核酸包含二或多个在自然情况下，彼此找不到相同关系的序列。例如，重组产生的核酸典型地具有二或多个从不相关的基因而来，经人工合成安排制成一个新的功能核酸的序列，如，启动子从一来源而来，而编码区域从另一来源而来。因此在此情况下，这两个核酸彼此之间为异源的。当加入细胞时，该重组核酸与该细胞的内源性基因也可为异源的。因此，在染色体中，异源核酸可能包括已整合进入染色体中的非天然(非天然发生的)核酸，或非天然(非天然发生的)染色体外核酸。相反的，在此专利申请中，染色体的天然易位的片段，不被视为异源的，因为其包含突变细胞中天然的内源性核酸序列。相似地，异源性蛋白指的是，该蛋白包含二或多种在天然情况下彼此找不到相同关系的序列(如，“融合蛋白”，在此二种序列由单一核酸序列编码)。此蛋白可利用重组技术产生。
[0083] 术语“重组”当用在，如，细胞、核酸、蛋白或载体时，意指该细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源核酸或蛋白，或修改天然核酸或蛋白的修饰，或意指该细胞是从如此修饰的细胞衍生而来。因此，例如，重组细胞会表达不会在该细胞的天然形式内找到的(天然发生的)基因，或会表达一在表达或根本不会表达的情况下，以其它方式正常或不正常表达的天然基因的第二复本。
[0084] 以上所述的干细胞以及方法可用于各种本领域已知的基因疗法。基因疗法包括活体外以及活体内技术二者。明确而言，用寡核苷酸调整物或编码该调整物的核酸分子，对以上所述的干细胞进行活体外基因工程，之后提供该基因工程细胞给欲进行治疗的病人。细胞培养物可通过，例如，将细胞分开(如，机械分开)以及密切混合该细胞与一药学上可接受的载剂(如，磷酸盐缓冲液)进行配制，以供施用至病人。选择性地，细胞可在适合的生物兼容性支撑物上培养，然后移植至病人。该基因工程细胞典型地是自体移植的，以致防止异种或同种异体排斥发生。此活体外方法是本领域熟知的。
[0085] 使用本领域已知的技术，通过施用寡核苷酸或核酸分子，可进行细胞的基因工程。例如，寡核苷酸以及其它核酸分子可以下列方式施用：直接注射“裸”核酸分子(美国专利案第5,679,647号)或，核酸分子配制于具有一种或多种其它剂的组合物中，其会促进核酸分子被细胞吸收，诸如皂苷(见，例如，美国专利案第5,739,118号)或阳离子聚酰胺(见，例如，美国专利案第5,837,533号)；微粒轰击(例如，通过使用“基因枪”；Biolistic，Dupont)；用脂质、细胞表面受体或转染剂涂覆该核酸分子；将该核酸分子包覆在脂质粒、微粒或微胶囊中；施用连结至已知可进入细胞核的肽的核酸分子；或施用连结至配体的核酸分子，经受受体介导的内吞作用，其可用于标靶特异性表达该受体的细胞类型。
[0086] 可形成核酸-配体复合物，其中该配体包含融合病毒肽以便打断核内体，使该核酸能够避免溶酶体的降解；或该核酸分子可为细胞特异性摄入的目标，且通过标靶特异性受体而在活体内表达。此外，有关导入、表达以及累积反义寡核苷酸于细胞核中的有效的方法，述于美国专利案第6,265,167号中，其容许反义寡核苷酸与细胞核内的正义mRNA杂交，从而预防反义寡核苷酸被处理或转送至细胞质。本发明也涉及细胞内导入核酸分子以及随后并入宿主细胞DNA内，供利用本领域已知的同源重组进行表达。
[0087] 也可将多核苷酸并入适合的表达载体中。一些适合基因疗法应用的载体是本领域已知的(见，例如，Viral Vectors：Basic Science and Gene Therapy，Eaton Publishing Co.(2000))。
[0088] 表达载体可为质粒载体。产生以及纯化质粒DNA的方法是快速且简单的。此外，质粒DNA典型地不会整合入宿主细胞的基因组中，而是以个别实体的形式维持在游离位置中，排除染色体整合可能引起的基因毒性争议。目前从市面上可很容易地购得各式各样的质粒，包括该等从大肠杆菌以及枯草杆菌衍生而得的，许多特别设计成用于哺乳动物系统。可用于本发明的质粒的例子包括，但不限于，真核生物表达载体pRc/CMV(Invitrogen)、pCR2.1(Invitrogen)、pAd/CMV以及pAd/TR5/GFPq(Massie et al.，(1998)Cytotechnology 28：53-64)。在例示性实施方式中，该质粒是pRc/CMV、pRc/CMV2(Invitrogen)、pAdCMV5(IRB-NRC)、pcDNA3(Invitrogen)、pAdMLP5(IRB-NRC)或PVAX Invitrogen)。
[0089] 表达载体可为病毒为主的载体。病毒为主的载体的例子包括，但不限于，该等从复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒以及腺相关病毒衍生而来的。逆转录病毒载体以及腺相关病毒载体是目前选择用于在活体内传送外源性寡核苷酸或基因的重组基因传送系统，特别至传送至人类。这些载体提供基因有效的传送进入细胞，以及转移的核酸稳定地整合进入宿主的染色体DNA。使用逆转录病毒的主要的前提是确定它们使用的安全性，特别是涉及野生型病毒在细胞群中扩散的可能性。可衍生成逆转录病毒载体的逆转录病毒包括，但不限于，莫罗尼(氏)鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳氏(Rous)肉瘤病毒、哈维(Harvey)肉瘤病毒、鸟类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒以及乳房肿瘤病毒。特别的逆转录病毒包括pLJ、pZIP、pWE以及pEM，其是本领域技术人员熟知的。
[0090] 细胞库(cell bank)
[0091] 本发明描述一种干细胞库(cell bank)或文库(library)，供用于方便的有系统的取得不同的干细胞株。在该库或文库中的SB-3或SB-4细胞是从健康受试者或具有已知疾病状态或疾病症状的受试者衍生而来的，对使用者，如研究人员，而言是很宝贵的。本发明的范畴也包括一种具有从以上所述的干细胞分化的细胞的细胞库或文库。从该干细胞分化的细胞的例子包括脑细胞、神经元、星形细胞、胶质细胞、T细胞、B细胞、软骨细胞、骨细胞、胰岛细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肝细胞、肾细胞、肺细胞、肌细胞以及眼睛细胞。该受试者可为人类或非人类脊椎动物。该干细胞可从任何哺乳动物有机体衍生而来，诸如人类、小鼠、兔子、牛、猪等等。
[0092] 将在该库或文库中的细胞依照预定的特征分类，包括表现型信息、形态特征、分化的档案、血型、主要组织兼容性复合体、供体的疾病状态、基因型数据(如，与基因或基因组或粒腺体DNA相关的特异性核酸序列的单一核苷酸多态性(SNPs))。将细胞贮存在适当的条件下(典型地冷冻)，以保持干细胞存活以及有作用。编制目录可指定制造一个从各细胞群获得的特征的集中记录，诸如，但不限于，汇集的书面记录或输入有信息的电脑数据库。基本上，此实施方式涉及产生干细胞库。该干细胞库可帮助从多个特定干细胞检体中选择适合使用者需求的检体。因此，本发明的另一个实施方式涉及一种干细胞库，其包含多个从不同的来源获得的干细胞检体，然后描述它们的特征，之后根据至少一种预定特征编制目录。额外的实施方式涉及一种建立干细胞库的方法，其包含收集从多方来源而来的检体；根据至少一种预定的特征编制该检体的目录以及将该细胞贮存在保持细胞存活的条件下。
[0093] 本发明的范畴包括一种干细胞库系统，其含有多个干细胞群，安置在个别容器中，保持在使该干细胞群存活的条件下；一数据库电脑，包含至少一种处理模块、显示器以及储存媒体，包含各干细胞群的至少一种特征的信息；以及至少一种程序代码模块，用于在用户下命令时，可在该显示器上看见该信息。在一特定实施方式中，本发明描述一种干细胞库系统，在此干细胞群具有从具有疾病病况的受试者获得的干细胞。该疾病病况可包括以上所述的退行性疾病。SB-3或SB-4细胞从具有不同疾病的受试者衍生而来，且描述该干细胞的特征。该/该等特征输入该数据库电脑中。此外，或选择性地，依照特定表现型(不一定要与疾病病况有关)描述细胞的特征。例如，以它们有代谢某些化合物，诸如咖啡因、酒精、药物等的能力来描述肝细胞，以便研究此不同代谢能力的遗传基础或与其相关的潜在生理机能。可依照功能和/或形态表现型描述其它类型的细胞的特征。
[0094] 在某些实施方式中，可使从SB-3或SB-4细胞分化而来的细胞，经历通过引入基因工程载体或其它遗传物质影响分化或去分化的处理。分化包含将细胞操作成使其呈现较少分化细胞的特性。
[0095] 本发明的干细胞库可用于筛选可用以上所述的方法治疗退化性病症、癌症或免疫病症的剂或化合物。该库适合高通量筛选，且可用于鉴定对特殊受试者特别有效的剂。在高通量筛选方面，将干细胞引入多孔培养皿的孔中或玻璃玻片或微芯片的孔中，且使其与测试剂接触。大体而言，将该细胞组织成阵列，特别是可寻址的阵列，如此机器人可方便地用于操纵该细胞以及溶液且用于监控该细胞，特别是有关要检验的功能。使用高通量形式的优点是可平行检验数个测试剂，且需要的话，也可在与测试条件一致的条件下进行对照组反应。如此，本发明的筛选方法提供一种筛选一种、小或大量测试剂的工具，以便鉴定可改变干细胞的功能的剂，例如，会引起细胞分化成所欲细胞类型的剂，或预防自发性分化的剂，例如通过维持调节分子高水平的表达。
[0096] 通用型供体细胞
[0097] 以上所述的干细胞可经基因工程而产生供移植用的组织兼容性供体细胞或组织。移植以及细胞疗法的目标，是顺利地用功能性供体组织或器官取代衰竭组织或器官。然而，为能顺利的移植，需要克服两个主要的障碍：适合供体组织或器官的可利用性以及免疫排斥。衰竭组织或器官的取代以及排斥的治疗，受有限数量的可接受供体以及同时施用毒性免疫抑制药物以及长效免疫操作程序的限制。目前以及实验室移植操作程序主要依靠兄弟姐妹捐赠、其它小型的同种异体捐赠者以及异种捐赠者池。以上所述的基因工程干细胞可用于克服这些限制。
[0098] 更明确地，在此所述的干细胞可经基因工程而在它们的表面上不表达第II型MHC分子。更佳地，该细胞可经基因工程而实质上不表达所有的细胞表面第I型以及第II型MHC分子。在此使用的术语“不表达”意指在细胞的表面上表达不足以引起反应的数量，或表达有缺陷的蛋白质，因此不会引起反应。
[0099] MHC分子意指HLA分子，具体地有HLAA型、B型以及C型，以及第II型HLA DP、DQ以及DR，以及它们的亚型。此术语通常理解为对人类MHC的特异性，但在此意图包括从供体细胞种类而来的相等的MHC基因，例如，假如细胞为猪来源，术语HLA可能意指相等的猪MHC分子，不管的MHC I或II。当移除第II型MHC分子时，CD4+T-细胞无法辨认出基因工程内皮细胞；当第I型以及第II型MHC分子均移除时，CD4+以及CD8+细胞均无法辨认出该经修饰的细胞。
[0100] 在该干细胞上进行的优选的基因修饰包括1)打断功能为整合以及传送第II型MHC分子至细胞表面上以及装载抗原性肽的内源性不变链基因，以及2)打断内源性β2-微球蛋白基因(β2M基因)，其编码细胞表面表现所有第I型MHC分子所需的蛋白。选择性地，仅打断不变链基因。一般认为将抗原性肽片段插进第II型MHC分子需要不变链。同时，T细胞可辨认出抗原性肽以及MHC。在缺少抗原性肽的情况下，T细胞辨认无法正常的获得，第II型MHC分子也无法适当地折迭。因此，在缺少不变链的细胞中，肽的呈现会被取消，即使获得微小量的细胞表面MHC，它们可能缺乏肽，因此为无致免疫性的。
[0101] 打断这些基因可通过同源重组基因标靶技术的方法完成。这些技术是本领域熟知的。见，如，美国专利案第6916654号以及第6986887号。
[0102] 组合物
[0103] 本发明提供含有SB-3或SB-4细胞或活性剂/化合物的药学组合物。药学组合物可通过混合药学上有效量的细胞或活性剂/化合物，以及任择地其它活性物质，以及药学上可接受的载剂而制得。该载剂可具有不同的形式，取决于施用的途径。其它活性物质的例子包括已知或由以上所述的筛选方法鉴定的活性化合物。
[0104] 以上所述的药学组合物可通过使用公知药学赋形剂以及制备方法制得。所有的赋形剂均可混合与崩散剂、溶剂、造粒剂、湿润剂以及结合剂。在此使用的术语“有效量”或‘治疗上有效量’意指一数量，其导致至少一种症状或特定病症的参数显著的改善。治疗有效量的以上所述的干细胞可由本领域已知的方法测定。用于治疗病症的有效量可很容易地由本领域技术人员已知的实验方法测定。要施用至病人的正确数量会随着病症的状态以及严重性以及病人的生理状况而改变。任何症状或参数的显著的改善可由本领域技术人员，或由病人对临床医师的报告而决定。应了解，以上所述病症的任何临床上或统计学显著的减少，或任何症状或参数的改善，均落在本发明的范畴内。临床上显著的减少或改善，意指可被病人和/或临床医师察觉。
[0105] 词组“药学上可接受”意指此组合物的分子实体或其它成份，当施用至人类时，是具生理耐受性的且典型地不会产生不想要的反应。优选地，术语“药学上可接受”意指由联邦或州政府的管理机构认可，或列在美国药典或其它普遍认可的药典中，可用于哺乳动物，更特别地于人类。药学上可接受的盐类、酯类、酰胺类以及前趋药物，意指该等落在深思熟虑的医疗决定内，适合用于与病人的组织接触，无不当的毒性、刺激、过敏反应等等，具合理的利益/风险比率，且对它们意图的用途有效的盐类(如，羧酸盐、氨基酸加成盐)、酯类、酰胺类以及前趋药物。
[0106] 应用于以上所述的药学组合物的载剂，意指与化合物一起施用的稀释剂、赋形剂或载剂。此药学载剂可为无菌液体，诸如水与油。水或水溶液、食盐水以及葡萄糖液以及甘油溶液最常作用为载剂，特别是用于注射溶液。适当的药学载剂述于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，第18版中。
[0107] 以上所述的干细胞可通过输注或注射(例如，静脉内、脑脊髓膜内、肌肉内、管腔内、气管内、腹膜内或皮下)、口服、经皮或其它本领域已知的方法施用至受试者。给药可为每二周一次、一周一次或更常，但在疾病或病症的维持阶段期间，频率可减少。
[0108] 可使用异源以及自体细胞二者。在前者的情况下，应进行HLA-配对，以避免或使宿主的反应最小。在后者的情况下，浓缩以及纯化从一受试者中而来的自体细胞，然后贮存供以后使用。可在宿主或移植T细胞的存在下，活体外培养该细胞，然后重新导回该宿主。此具有宿主可辨识该细胞为自己的以及提供活性减低的T细胞的优点。
[0109] 剂量以及施用频率取决于临床征兆，当减少或缺少至少一种或多种(优选地超过一种)本领域技术人员已知的急性期的临床征兆时，确认维持在缓解期。更一般地，剂量以及频率部分取决于预期用以上所述的组合物治疗的病理征兆的衰退以及疾病病况的临床以及亚临床症状。剂量以及给药方案可随着下列调整：被给药的年龄、性别、身体状况以及在欲治疗的病人或哺乳动物受试者中的缀合物的利益以及副作用以及临床医师的判断，这是本领域技术人员公认的。在以上所述的所有方法中，可施用至一受试者的干细胞的数量为1x104至1x1010个/次。
[0110] 以下具体实施例仅用以例示说明，任何情况下均不能作为该揭示内容剩余部分的限制。在无进一步详细说明的情况下，一般相信本领域技术人员，依照在此的说明书，可利用本发明至其最大的范围。在此所引述的所有的公开文献的全部内容均在此并入本案限制以为参考。另外，以下假设的任何的机制，在任何情况下均不能约束所请求的发明的范畴。
[0111] 实施例1
[0112] 从人的身体上抽出血液检体或骨髓，然后置于抗凝血EDTA管或肝素管中。令该管在4℃下静置72个小时后，将该检体分成二层。看起来红色的底层几乎全部由红细胞(RBC)以及白细胞构成。上层含有具直径小于6μm的细胞，即SB细胞。SB细胞在US2012/0034194中有更详细的说明。
[0113] 之后将SB细胞培养在含有5ng/ml的R-Spondin-1、5ng/ml的SCF、5ng/ml的G-CSF、20ng/ml的bFGF、20ng/ml的EGF以及5ng/ml的PDGF的StemPro-34培养基(INVITROGEN)中，历时4至14天。在以上所述的培养条件下，细胞的直径增大至6-25μm。保持未贴壁的细胞称作SB-3细胞，该等变成贴壁的称作SB-4细胞。SB-4细胞呈圆形或椭圆形，比SB-3细胞大，即7-
30μm。
30μm。
[0114] 使用CD349抗体，从SB混合物中分离出CD349+细胞。也见US2012/0034194。这些以与SB细胞相同方法培养的CD349+细胞也长成SB-3细胞，且像SB-4细胞一样贴在壁上。
[0115] 测试显示出，SB-3细胞具有扩张的能力。只要添加所需的生长因子，SB-4细胞能够经历增殖以及分化。SB-4细胞能够经历至少40个具正常染色体核型以及正常端粒酶活性的继代。培养的SB-4细胞具有倍增时间约24个小时。
[0116] RT-PCR分析显示，SB-3细胞会表达CD10、CXCR4以及CD31，但不会表达CD9、CD349、CD271、CD133、CD66e、CD45、CD20或CD4。SB-4细胞会表达CD105、CD44以及巢蛋白，但不会表达CD34、CD90、CD41、CD117、甲胎蛋白、POU5F1、Nanog、Sox2、HNF4a、CD36、HNF3B、Pax6或Pax7。用于RT-PCR的引物示于以下表1中：
[0117] [表1]
[0118]
[0119]
[0120] 实施例2
[0121] 进行用以证实SB-3能够分化成不同细胞谱系的干细胞的分析。
[0122] 简言之，用以上所述的方法，从一受试者中取得SB-3细胞。之后将SB-3细胞培养在分化培养基中。所有用在RT-PCR中，用于检测分化标记的引物列在以下表2中：
[0123] 表2
[0124]
[0125]
[0126] 诱导SB-3细胞表达巢蛋白，一种形成神经元(外胚层)以及小岛细胞(内胚层)的早期标记。简言之，在含有10nM糖皮质激素以及10％FBS的诱导培养基中培养SB-3细胞。处理1个月后，取出RNA，然后用实时PCR测定基因表达。检测巢蛋白的表达。
[0127] 内胚层细胞的特征为具多角形的形状。检测二种肝细胞标记(转铁蛋白以及白蛋白)以及三种小岛细胞标记(胰岛素、α-胎儿蛋白以及HNF4α)的表达。此外，蛋白质印迹法以及ELISA二者也会检测分化细胞中的白蛋白的表达。这些结果指出，SB-3细胞分化成肝细胞，而一些分化成小岛细胞。
[0128] 外胚层细胞的特征为具有细丝状特征。SB-3细胞分化成神经细胞可用实时RT-PCR确认，其会检测许多神经元标记的表达，包括CD133、巢蛋白、微管相关蛋白II、GABA受体、NR4A2、N-cam、酪氨酸羟化酶、神经纤维丝以及Tau。
[0129] 另外，诱导SB-3分化成脂肪细胞或成骨细胞，即中胎层细胞。依序在培养基A、B、C、D以及E中培养SB-3细胞。之后，用脂肪细胞分化培养基(Invitrogen)取代该培养基，历时8周。使用油红-O染脂肪细胞，然后在OD490ELISA分光亮度计中检测。选择性地，用成骨培养基(Invitrogen)取代该培养基。在培养基取代后2-4周观察成骨细胞。用茜素红染成骨细胞，然后萃取出细胞茜素红，在分光亮度计中，OD 405nm下测量。结果显示，SB-3细胞可分化成脂肪细胞或成骨细胞。
[0130] 在诱导成其它中胎层细胞方面，在含有10nM糖皮质激素以及10％FBS的培养基中培养SB-3细胞。处理1个月后，从细胞中取出RNA，然后用实时PCR测定许多基因的表达。检测至肌球蛋白重链以及骨骼肌球蛋白轻链的表达指出，SB-3细胞分化成心肌细胞以及骨髂肌细胞。
[0131] 以上的结果建议，收到信号时，SB-3细胞被活化以及分化成适合的组织，用以修复受损的组织。因此，这些细胞含有成熟多潜能干细胞，且可用于基因治疗、基因库建制、药物筛选以及制造通用型供体细胞。此外，这些细胞可用于治疗退行性疾病、自体免疫疾病或癌症。
[0132] 实施例3
[0133] 在4种不同类型的培养基中培养SB-4细胞，分析以便确认分化成功。为测试中胎层分化，于脂肪生成以及成骨培养基中培养细胞。油红O以及茜素红染色显示，与它们的阴性对照组相比，脂肪细胞以及成骨细胞分别显著的增加。
[0134] 为研究外胚层分化能力，在神经元分化培养基中培养SB-4细胞。从ICC神经纤维丝染色以及实时PCR的结果确认，SB-4具神经元分化能力。
[0135] 也通过将SB-4细胞连续于如下3种不同培养基中培养，诱导SB-4细胞分化成肝细胞。
[0136] 首先，在含有3％马血清、1x抗真菌素、1xL-谷氨酰胺以及5ng/mL激活蛋白的DMEM/高葡萄糖培养基中培养SB-4细胞5天。接着，在相同培养基(但以20ng/mL bFGF以及5ng/mL BMP2取代激活蛋白)中进一步培养15天。最后，在含有1％马血清、10ng/mL HGF、10nM糖皮质激素DEX以及10ng/mLOSM的培养基中培养该细胞15天，直到像肝细胞的细胞出现。常规更新培养基至少一周二次。用显微镜观察像肝细胞的细胞。另外，用以下列出的引物进行实时RT-PCR，测试它们的肝细胞标记的表达：
[0137] 表3
[0138]
[0139] 结果显示，像肝细胞的细胞的确表达三种肝细胞标记，即，白蛋白、转铁蛋白以及HNF-3β。
[0140] 我们相信，这些像肝细胞的细胞可具有代谢以及成功地移除毒性，诸如氨，以及合成尿素用于排毒的能力。因此，像肝细胞的细胞可用作为人工肝系统，其能够复制人类肝功能以及支持具急性肝衰竭的病人。此外，我们的像肝细胞的细胞可产生白蛋白，其是市场上非常重要的产品，因为其可用作为小型丸剂/药物的载剂。
[0141] 因此，这些像肝细胞的细胞可用于制造人工肝系统以及促进药学传送。这些细胞也可用于治疗肝退行性疾病以及肝癌。
[0142] 其它实施方式
[0143] 在此说明书中所揭示的所有的特征可以任何组合的形式组合。在此说明书中揭示的每一种特征均可被作用相同、相等或相似目的的替代特征取代。因此，除了明确地说明，否则所揭示的每一种特征仅一系列相等或相似特征的实施例。
[0144] 已经说明了本发明的一些实施方式。不过，应了解，可在不脱离本发明的技术思想的范畴的情况下制得各种修饰物。据此，其它实施方式是落在以下申请专利范围的范畴内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 生物人工肝系统 | 2020-05-12 | 460 |
| 组合型生物人工肝支持系统专用管路 | 2020-05-21 | 215 |
| 组合型生物人工肝支持系统 | 2020-05-22 | 756 |
| 全血灌流生物人工肝系统 | 2020-05-17 | 808 |
| 一种用于生物人工肝的改性膜材料 | 2020-05-18 | 830 |
| 生物人工肝细胞反应器 | 2020-05-13 | 212 |
| 全血灌流生物人工肝系统 | 2020-05-26 | 610 |
| 一种人工肝生物反应器 | 2020-05-15 | 1017 |
| 一种膜式板状生物人工肝反应器 | 2020-05-22 | 651 |
| 毛绒线式生物反应器人工肝系统 | 2020-05-17 | 737 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
生物人工肝热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈