技术领域
[0001] 本
发明涉及一种转基因技术，尤其涉及一种改造人工肝种子细胞的方法。
背景技术
[0002]
生物人工肝(BAL)目前是临床肝脏领域研究的重点和热点。人工肝种子细胞是BAL的重要组成部分，人工肝种子细胞的
肝细胞代谢
水平决定了BAL的肝功能的能
力大小。人工肝种子细胞包括正常成人肝细胞、胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)，永生化肝
肿瘤细胞系，永生化肝细胞系，猪肝细胞等。
[0003] 每种细胞作为人工肝种子细胞都有各自的优缺点：正常成人肝细胞正常成人肝细胞作为BAL的细胞是理想的细胞来源，但由于供体肝源短缺，限制了BAL的临床应用。而胚胎来源的人肝细胞仍存在供体有限和伦理问题等限制因素。正常人胎肝细胞培养条件苛刻，难以传代，不易在体外大规模长期培养。胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)仍然面临在体外大规模扩增和诱导肝定向分化相互矛盾的问题，体外培养的干细胞不能达到生物人工肝
治疗的细胞数量级等诸多因素限制，而且干细胞培养和定向诱导分化的因子价格昂贵，不适合临床大规模应用。肝肿瘤来源的肝细胞和永生化肝细胞系尽管来源广泛、可大规模培养扩增达到人工肝支持所需的数量标准，但因部分肝细胞表型及肝功能不全，其功能较正常肝脏细胞低下，甚至缺乏一些特异性的肝细胞反应，随细胞培养时间的延长，其功能逐渐减退，作为BAL种子细胞还存在
缺陷。
[0004] 现有的提高人工肝种子细胞肝功能是从调节分化效率来加强肝细胞功能。调节细胞分化效率的缺点在于：1)干细胞培养和定向诱导分化的因子价格昂贵，不适合临床大规模应用；2)诱导的成熟肝细胞不能进行大规模的增值，不适合临床大规模应用。
发明内容
[0005] 本发明的目的是，本发明的目的是利用基因编辑技术，提供一种改造人工肝种子细胞的方法，以简单、快捷、经济地增强BAL细胞中的缺陷功能，从而完善BAL细胞的肝功能，实现BAL的临床使用价值。
[0006] 为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 一种改造人工肝种子细胞的方法，其包括如下步骤：
[0008] 分别制备含有应用于所述CRIPRS/Cas9技术的dCas9的载体和含有应用于CRIPRS/Cas9技术的能与靶向基因结合的sgRNA的重组载体；
[0009] 将所述两种重组载体共同
转染至受
体细胞，培养所述经转染的受体细胞，筛选并鉴定以获得单克隆转基因受体细胞；
[0010] 检测所述靶向基因的基因表达水平。
[0011] 进一步地，所述重组载体还包括含编码dCas9-CIB1融合蛋白的嵌合基因的重组载体和编码CRY2-转录激活因子融合蛋白的嵌合基因的重组载体。
[0012] 具体地，所述受体细胞为生物人工肝的种子细胞。
[0013] 可选择地，所述种子细胞为正常成人肝细胞、胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞、永生化肝肿瘤细胞系、永生化肝细胞系、猪肝细胞、诱导肝细胞(induced-hepatocyte)、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脂肪干细胞中的一种。
[0014] 优选地，所使用的载体为真核表达载体。
[0015] 具体地，所述sgRNA的序列与所述靶向基因的启动子区域的部分序列互补
配对。
[0016] 可选择地，所述sgRNA包括与至少一个靶向基因的启动子区域互补配对的序列。
[0017] 进一步地，在检测所述靶向基因的基因表达水平之前，对所述转基因受体细胞施加诱导条件。
[0018] 具体地，所述诱导条件为光照。更具体地，所述光照的
波长为400～480nm。
[0019] 进一步地，所述检测靶向基因的基因表达水平的方法包括以下至少一种：
[0020] 通过RT-PCR检测所述靶向基因的转录水平；
[0021] 通过real-time PCR检测所述靶向基因的转录水平；
[0022] 通过Northern Blot检测所述靶向基因的转录水平；
[0023] 通过Westhern Blot检测所述靶向基因的翻译水平；
[0024] 通过双
荧光素酶报告基因系统检测所述靶向基因的原位基因表达水平；
[0025] 通过融合荧光蛋白系统检测所述靶向基因的原位基因表达水平。
[0026] 与
现有技术相比较，本发明具有如下优势：
[0027] 技术操作简便：基因编辑技术改造不同的BAL细胞可应用通用的技术流程，可实现3个月内获得一株或多株肝功能增强的BAL细胞系。
[0028] 功能强大：该技术可改善一株BAL细胞的一种肝功能，也可同时增强一株BAL细胞的多种肝功能。
[0029] 蓝光可调控性：该技术应用了蓝光受体蛋白与CRISPR/dCas9技术结合，实现了在BAL细胞中任意时间控制是否增强肝功能。
[0030] 成本经济：该技术通过前期质粒转染，后期荧光或药物筛选细胞的方法获得增强肝功能的BAL细胞株，该过程耗费低廉；后期不需要特殊培养维持肝功能；一经获得增强肝功能的BAL细胞株，可大规模培养增殖，无需特殊处理。
附图说明
[0031] 图1为本发明改造人工肝种子细胞的方法中采用CRISPR/dCas9系统在BAL细胞中增强基因表达的示意图。
[0032] 图2为本发明改造人工肝种子细胞的方法中采用蓝光调控蛋白与CRISPR/dCas9系统相结合在BAL细胞中增强基因表达的
流程图。
[0033] 图3为本发明改造人工肝种子细胞的方法在C3A细胞中增强CYP3A4基因的鉴定结果图。
具体实施方式
[0034] 以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
[0036] 如图1所示，本发明的改造人工肝种子细胞的方法包括以下步骤：
[0037] S1：制备重组载体(质粒)
[0038] 所述质粒主要包括两种：包含有dCas9(失活的Cas9蛋白)和转录激活因子的稳转质粒，以及包含有sgRNA(small guide RNA，向导RNA)的稳转质粒，这两种质粒主要是应用CRIPRS/Cas9技术。
[0039] CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic)repeats/Cas9是一种可被操控的DNA靶向基因编辑系统，其基因编辑位点的特异性取决于其sgRNA(small guide RNA,小向导RNA)的
碱基序列。这些特殊的RNA碱基序列可以通过互补特异的基因组DNA序列来识别靶向基因，从而进行基因编辑。
[0040] CRISPR/dCas9主要包括sgRNA和dCas9两个部分。sgRNA中插入一段20nt的碱基序列，经过特应性设计，该20nt序列匹配靶向基因的启动子区的序列，dCas9蛋白在细胞中，受到sgRNA的招募，
定位在靶向基因启动子去中，转录激活因子与dCas9蛋白相连接，同样定位在靶向基因启动子去中，发挥转录激活的作用，激活下游基因的表达。本发明主要采用CRISPR/dCas9系统，增强目标人工肝种子细胞的肝细胞功能相关的系列基因的表达，以获得精准调节的肝功能基因高表达的BAL种子细胞。
[0041] 具体的操作主要是：先确定靶向基因，根据所述靶向基因设计特异性的20nt；如存在多个所述靶向基因则利用PCR将不同的特异性的20nt
串联到同一sgRNA载体中。
[0042] S2：转染并筛选
[0043] 将所述dCas9-转录激活因子质粒和sgRNA质粒稳定转入BAL细胞中。利用荧光分选或药物筛选获得稳定表达dcas9-转录激活因子和sgRNA的细胞株。
[0044] 其中，所述BAL细胞可以选自正常成人肝细胞、胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞、永生化肝肿瘤细胞系、永生化肝细胞系、猪肝细胞、诱导肝细胞(induced-hepatocyte)、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脂肪干细胞。这些细胞/细胞株/细胞系都可以接收本发明所述的方法的改造，并且用于生物人工肝的科研和临床需求。
[0045] S3:检测靶向基因的基因表达水平
[0046] 应用不同的技术手段检测目标基因表达量。常用的检测手段包括以下几种：RT-PCR、real-time PCR、Northern Blot、Westhern Blot、双荧光素酶报告基因系统和融合荧光蛋白系统。本领域技术人员可以根据实验条件、检测成本、检测手段的灵敏度等因素选择合适的检测方法。
[0047] 如图3所示，C3A细胞中CRISPR/dCas9-转录激活因子(VP64)系统可以增强内源CYP3A4基因的表达。
[0048] 实施例二
[0049] 如图2所示，本发明的改造人工肝种子细胞的方法包括以下步骤：
[0050] S1：制备重组载体(质粒)
[0051] 所述质粒主要包括三种：包含有CIB1-dCas9(转录激活因子)的稳转质粒、CRY2-转录激活因子的稳转质粒，以及包含有sgRNA(small guide RNA，向导RNA)的稳转质粒，本实施例应用将蓝光调控蛋白CIB1、CRY2系统与CRISPR/dCas9技术相结合的体系。
[0052] 最新CRISPR/dCas9系统研究结合应用了
植物对阳光的反应系统中存在的特殊受体，从而与CRISPR/dCas9系统结合构成了“光学
开关”。该“光学开关”由一对融合蛋白组成：即dCas9蛋白结合到CIB1的蛋白和转录激活因子结合到CRY2的蛋白。
[0053] CIB1(整合素结合蛋白)和CRY2(隐花色素)广泛存在在真核细胞内，其中，CIB是一种介导细胞和其外环境之间的连接的跨膜受体，其本身可以穿过膜结构，也参与细胞讯息、细胞周期调节、细胞形态及细胞的运动等细胞活动；CRY是蓝光受体的其中一类，在植物中作为蓝光和近紫外线的受体，用于调节植物的生长发育，如光形态建成、开花调控、生物钟调节、气孔开放等。
[0054] 通过模式生物拟南芥的研究发现，在蓝光的条件(蓝光波长400nm-480nm)下可诱导CIB1蛋白和CRY2蛋白聚集结合成为异源二聚体，从而引导dCas9蛋白与转录激活因子共同锚定在靶向基因的启动子序列上，激活表达靶向基因；当蓝光撤离后，所述靶向基因的过表达情况也随之暂停；当蓝光不断被打开和关闭，所述靶向基因的表达情况也跟着蓝光的打开而增强，随着蓝光的关闭而暂停。该技术实现了利用蓝光对其基因表达可进行快速简单地的开启和关闭。
[0055] S2：转染并筛选
[0056] 将所述dCas9-CIB1质粒、CRY2-转录激活因子质粒和sgRNA质粒稳定转入BAL细胞中。利用荧光分选或药物筛选获得稳定表达dcas9,转录激活因子和sgRNA的细胞株。
[0057] 如上所述，所述BAL细胞可以选自正常成人肝细胞、胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞、永生化肝肿瘤细胞系、永生化肝细胞系、猪肝细胞、诱导肝细胞(induced-hepatocyte)、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脂肪干细胞，这些细胞/细胞株/细胞系都可以接收本发明所述的方法的改造，并且用于生物人工肝的科研和临床需求。
[0058] S3:检测靶向基因的基因表达水平
[0059] 应用不同的技术手段检测目标基因表达量。常用的检测手段包括以下几种：RT-PCR、real-time PCR、Northern Blot、Westhern Blot、双荧光素酶报告基因系统和融合荧光蛋白系统。本领域技术人员可以根据实验条件、检测成本、检测手段的灵敏度等因素选择合适的检测方法。
[0060] 如图3所示，C3A细胞中蓝光开关CRISPR/dCAS9-转录激活因子(VP64)系统可以增强内源CYP3A4基因的表达。
[0061] 综上所述，本发明改造人工肝种子细胞的方法简单，快捷，经济的增强BAL细胞中的缺陷功能，从而完善BAL细胞的肝功能，实现BAL的临床使用价值。
[0062] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。
