具有多功能或结合特异性的明确组成的改进的稳定束缚结构
阅读：250发布：2020-12-27
专利汇可以提供具有多功能或结合特异性的明确组成的改进的稳定束缚结构专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及针对稳定束缚结构(stably tethered structure)的方法和组合物，所述稳定束缚结构具有明确的组成及多功能性和/或结合特异性。具体的实施方案涉及包含第一 单体 的同型二聚体和第二单体的稳定束缚结构，其中第一单体包含与第一前体连接的二聚化和停靠结构域(dimerization and docking domain)，第二单体包含与第二前体连接的锚定结构域。第一前体和第二前体实际上可以是任何分子或结构，例如 抗体 、抗体 片段 、抗体类似物或模拟物、适体、结合肽、结合蛋白的片段、 蛋白质 或其它分子的已知配体、酶、可检测标记或标签、 治疗 药、毒素、药物、细胞因子、白介素、干扰素、 放射性 同位素、蛋白质、肽、肽模拟物、多核苷酸、RNAi、寡糖、天然或合成 聚合物 、纳米粒、 量子点 (quantum dot)、有机或无机化合物，等等。本文所公开的方法和组合物提供以简单易纯化方式获得任何二元化合物(与任何单体化合物相连接)或者任何三元化合物。，下面是具有多功能或结合特异性的明确组成的改进的稳定束缚结构专利的具体信息内容。
1.一种包含稳定束缚结构的组合物，所述结构包含： a)同型二聚体，所述同型二聚体的每个第一单体包含与第一前体连接的二聚化和停靠结构域(DDD)； b)第二单体，包含与第二前体连接的锚定结构域(AD)，AD与DDD共价或非共价连接。
2. 权利要求1的组合物，其中AD通过二硫键与DDD结合。
3. 权利要求1的组合物，其中DDD与第一前体共价结合，AD 与第二前体共价结合。
4. 权利要求3的组合物，其中第一单体是包含第一前体和DDD 的融合蛋白，第二单体是包含第二前体和AD的融合蛋白。
5. 权利要求3的组合物，其中第一前体与DDD化学交联，笫 二前体与AD化学交联。
6. 权利要求l的组合物，其中第一和第二前体选自蛋白质、肽、 肽模拟物、多核苷酸、RNA/、寡糖、天然或合成聚合物、納米粒、 量子点、以及有机或无机化合物。
7. 权利要求6的组合物，其中所述蛋白质选自细菌毒素、植物 毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶 I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白 喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、豹蛙酶(Rap)、 Rap (N69Q)、 PE38、 dgA、 DT390、 PLC、 tPA、细胞因子、生长因子、 可溶性受体組分、表面活性蛋白D、 IL-4、 sIL-4R、 sIL-13R、 VEGF121、 TPO、 EPO、；容血才全剂、酶、焚光蛋白、sTNFa-R、 avimer、 scFv、 dsFv 和纳米抗体。
8. 权利要求1的组合物，其中第一和笫二前体选自抗体、IgG 抗体、抗体片段、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、 抗体的抗原结合区、纳米4元体、scFv、 scFv-Fc融合物、Fab、 Fab'、dsFv、单链抗体和F(ab')2。
9. 权利要求8的组合物，其中所述抗体片段选自以下抗体的抗 体片段：hMN-14、 L19、 hA20、 hLL2、 L243、 hCC49、 7E3、 hLLl、 hPAM4、 hRS7、 rHl 、 L49 、抗CD14 、抗CD111 、 Humira® 、 REMICADE®、 Xolair®、 Synagis⑧和hMN-15。
10. 权利要求1的组合物，其中DDD序列来源于依赖cAMP的 蛋白激酶(PKA)调节亚基。
11. 权利要求1的组合物，其中AD序列来源于A-激酶锚定蛋 白(AKAP)序列。
12. 权利要求1的组合物，其中第一前体和第二前体具有针对抗 原的结合亲和性。
13. 权利要求12的组合物，其中第一前体和第二前体具有针对 相同抗原的亲和性。
14. 权利要求12的组合物，其中第一前体和第二前体具有针对 两种不同抗原的亲和性。
15. 权利要求12的组合物，其中所述抗原选自碳酸酐酶IX、曱 胎蛋白、A3、 A33抗体特异性抗原、Ba 733、 BrE3-抗原、CA125、 CD1、 CDla、 CD3、 CD5、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD30、 CD33、 CD38、 CD45、 CD74、 CD79a、 CD80、 CD 138、结肠特异性抗原-p(CSAp)、 CEA(CEACAM5)、 CEACAM6、 CSAp、 EGFR、 EGP-1、 EGP-2、 Ep-CAM、 Flt-l、 Flt-3、叶酸受体、 HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、低氧诱 导因子(HIF-I)、 Ia、 IL-2、 IL-6、 IL-8、胰岛素生长因子-1 (IGF-1)、 KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、 Le-Y、巨嗟细胞抑制因子(MIF)、 MAGE、 而C1、 MUC2、固C3、 MUC4、 NCA66、 NCA95、 NCA90、 PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、 PSMA、 RS5、 SIOO、 TAC、 TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、 ED-B纤连蛋白、17-lA-抗原、血管生成标记、癌基因标记或癌基因产物。
16. 权利要求1的组合物，其中第一前体包含与免疫球蛋白CH1 序列连接的免疫球蛋白Vh序列。
17. 权利要求16的组合物，其中第一前体与免疫球蛋白轻链连接。
18. 权利要求17的组合物，其中所述轻链包含与CK或CL序 列连接的V^序列。
19. 权利要求17的组合物，其中第一前体通过二硫键与所述轻 链连接。
20. 权利要求l的组合物，其中第一前体具有肿瘤相关抗原的结 合位点。
21. 权利要求20的组合物，其中所述肿瘤相关抗原选自碳酸酐 酶IX、曱胎蛋白、A3、 A33抗体特异性抗原、Ba"3、 BrE3-抗原、 CA125、 CD1、 CDla、 CD3、 CD5、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD30、 CD33、 CD38、 CD45、 CD74、 CD79a、 CD80 、 CD138 、结肠特异性抗原-p (CSAp) 、 CEA (CEACAM5)、 CEACAM6、 CSAp、 EGFR、 EGP-1、 EGP-2、 Ep-CAM、 Flt-l、 Flt-3、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其 亚基、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF-I)、 Ia、 IL-2、 IL-6、 IL-8、胰 岛素生长因子-1 (IGF-1)、 KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、 Le-Y、巨 噬细胞抑制因子(MIF)、 MAGE、 MUC1、 MUC2、 MUC3、 MUC4、 NCA66、 NCA95、 NCA90、 PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、 p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、 PSMA、 RS5、 SIOO、 TAC、 TAG-72、 生腱蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肺 瘤坏死抗原、VEGF、 ED-B纤连蛋白、17-lA-抗原、血管生成标记、 癌基因标记或癌基因产物。
22. 权利要求1的组合物，其中第二前体具有半抗原的结合位点。
23. 权利要求22的组合物，其中所述半抗原与治疗药连接。
24. 权利要求23的组合物，其中所述治疗药选自相思豆毒蛋白、 金刚烷胺、阿莫西林、两性霉素B、氨千西;f木、aplidin、阿扎立平、 阿那曲唑、氮杂胞苷、氨曲南、阿奇霉素、杆菌肽、复方新诺明、 巴特芬⑧、联苯苄唑、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1 、白消安、 加利车霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、羧千西林、卡泊芬净、卡莫 司汀、头孢克洛、头孢唑林、头孢菌素类、头孢吡肟、头孢曲松、 头孢噻肟、西乐葆、苯丁酸氮芥、氯霉素、盐酸环丙沙星制剂⑧、顺 铂、伊立替康(CPT-ll)、 SN-38、卡铂、克拉曲滨、环磷酰胺、阿糖 胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、葡糖苷酸道诺霉素、柔 红霉素、地塞米松、己烯雌酚、白喉毒素、DNA酶I、多柔比星、2-二氢吡咯多柔比星(2P-DOX)、多西环素、氰基吗啉代多柔比星、葡 糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、雌激素 受体结合剂、依托泊普、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、 erythrocyclme、红霉素、甲硝唑、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、氟尿 苷(FUdR)、 3',5'-0-二油酰基-FudR (FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、 氟尿嘧啶、氟曱睾酮、更昔洛韦、庆大霉素、多花白树毒蛋白、吉 西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、异烟肼、 伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、 氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌 呤、曱氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、米诺环 素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、诺维本、硝基脲、制霉菌素、onconase、 苯唑西林、巴龙霉素、青霉素、喷他脒、哌拉西林-三唑巴坦、丁酸 苯酯、泼尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、美洲商陆抗病毒蛋 白、PSI-341、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、雷洛昔芬、rapLRl、 核糖核酸酶、蓖麻毒蛋白、司莫司汀、利福布汀、利福平、金刚乙 胺、链霉素、磺胺曱嗯唑、柳氮磺吡啶、葡萄球菌肠毒素-A 、链佐 星、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙酸睾酮、四环素、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、反铂、曱氧千啶-磺胺曱噁唑、乌拉莫司汀、伐昔洛韦、万古霉素、velcade、长春碱、长春 瑞滨、长春新;威、 zanamir、 zithromycin、反义寡核香酸、干扰RNA 或其组合。
25. 权利要求22的组合物，其中所述半抗原与造影剂连结。
26. 权利要求25的组合物，其中所述造影剂选自铬(ni)、锰(II)、铁(in)、柳)、钴(n)、镍(n)、铜(n)、钕(m)、衫(m)、镱(ni)、钆(ni)、 钒(ii)、铽(iii)、镝(m)、钬(ni)、铒(m)、镧(m)、金(in)、铅(n)和铋 (ni)。
27. 权利要求22的组合物，其中所述半抗原与造影用或治疗用 放射性同位素连接。
28. 权利要求27的组合物，其中所述放射性同位素选自225Ac、 211At、 212Bi、 213Bi、 14C、 51Cr、 36C1、 45Ti、 57Co、 58Co、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 166Dy、 152Eu、 18F、 67Ga、 68Ga、 195mHg、 166Ho、 3H、 mIn、 123I、 124I、 125I、 131I、 52Fe、 59Fe、 177Lu、 1910s、 212Pb、 32P、 33P、 l42Pr、 195mPt、 223Ra、 l86Re、 188Re、 189Re、 47Sc、 75Se、 mAg、 153Sm、 89Sr、 35S、 161Tb、 94mTc、 99mTc、 86Y、卯Y和89Zr。
29. 权利要求22的组合物，其中所述半抗原与抗血管生成药连接。
30. 权利要求29的组合物，其中所述抗血管生成药选自血管生 长抑素、baculostatin、人血管能抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体 或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-l抗体、抗Flt-l抗体或肽、 层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋 白酶抑制剂、干扰素、白介素12、 IP-IO、 Gro画P、血小板应答蛋白、 2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、carboxiamidotriazole、 CMIOI、 马立马司他、戊聚糖多聚硫酸酯、促血管生成素2、干扰素-a、除莠 霉素A、 PNU145156E、 WK催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮 可可碱、染料木碱、TNP-470、内皮生长抑素、紫杉醇、accutin、血管生长抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板 因子4和米诺环素。
31. 权利要求22的组合物，其中所述半抗原与光检测标记连接。
32. 权利要求l的组合物，其中第一前体选自细菌毒素、植物毒 素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、 葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉 毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、抗gpl20、抗P1GF、抗(3-淀粉状蛋白、hMN-14、 L19、 hA20、 hLL2、 L243、 hCC49、 7E3、 hLLl、 hPAM4、 hRS7、 rHl、 L49、豹蛙酶(Rap)、 Rap (N69Q)、 PE38、 dgA、 DT390、 PLC、 tPA、细胞因子、生长因子、可溶性受体组分、表面 活性蛋白D、 IL-4、 sIL-4R、 sIL-13R、抗VEGF12I、抗CD14、抗CD川、 HUMIRA®、 REMICADE⑧、XOLAIR⑧、SYNAGIS⑧、hMN-15、 TPO、 EPO、溶血栓剂、酶、焚光蛋白和sTNFa-R。
33. 权利要求1的组合物，其中第二前体选自细菌毒素、植物毒 素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、 葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉 毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、溶血栓蛋白、尿激酶、 水蛭素、h679、 h734、 hA20、 Sll、 P4B6、 Rap、 Rap(N69Q)、 PE38、 dgA、 DT390、 PLC、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、HRP、 AP、 GFP、 tPA、细胞因子、生长因子、可溶性受体组分、羧肽酶G2、青 霉素酰胺酶、P-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、大肠杆菌P-半乳糖香酶、绿色焚光蛋白（GFP)、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、 链霉抗生物素蛋白、人羧基酯酶2、抗gp120、抗P1GF、抗VEGF^、 hLLl、 hLL2、 hPAM4、 hRS7、 hRl、 7E3、 ot-CD89、 IL-4、 sIL誦13R、 sIL-4R、志贺样毒素、白喉毒素、抗CD14、抗CD1U、 HUMIRA®、 REMICADE⑧、XOLA鹏、SYNAGIS®、 hMN-15、 TPO、 EPO、溶 血栓剂、酶、荧光蛋白和sTNFa-R。
34. 权利要求1的组合物，其中第一前体具有针对以下物质的结合亲和性：细胞表面受体、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、P-半乳糖 苷酶、tpA、链激酶、水蛭素、尿激酶、CA19-9、 CEA、 CEACAM6、 CD19、 CD20、 CD22、 CD30、 CD33、 CD40、 CD74、 ED-B纤连蛋 白、EGFR、 EpCAM/17-lA、 GD2、 G250、 HER2/neu、 hTR、 II类HLA、 HMWMAA、 HN歸V、 IGF1R、 IL-2R/Tac、 IL-17、 MUC1、 PSMA、 M13外壳蛋白、GpIIb/IIIa、 CD74、 EGP隱1、 IGF1R、 CD25/Tac、 LeY、 间皮素、Erb-B2、 EpCAM、 GP240、 GPII固a、 p97、 CD3、 IL-4R、 IL-4、 IL-13、 VEGFR-2、 CD14、 CDlll/柄蛋白-l、叶酸受体a、 Gpl20、 IL-6、 IL-5、 IL-8、 CD154、 IgE、 LFA-1、 （3-类胰蛋白酶、CD105/内 皮糖蛋白、TNFa、 RSVF-蛋白、CEA的A1B1、 CEA的N结构域、 P歸P-1、 TAG-72、 MUC1、固C2、固C3、 MUC4、 VEFGR1諸、 VEGFR2/KDR或VEGRF3/Flt-4 。
35. 权利要求1的组合物，其中第二前体具有针对以下物质的结 合亲和性：IL-17、组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)、铟-DTPA、 CD22、 CD20、 EGFR、 IGF1R、 VEFGR1/Fltl、 VEGFR2/KDR、 VEGRF3/Flt陽4 、 CD3、 CD16、 CD64、 CD89、 CD2、腺病毒纤突结、M13外壳蛋白、GpIIb/IIIa、 碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、P-半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭 素或尿激酶。
36. 权利要求1的组合物，其中第一前体具有针对选自以下的细 胞表面抗原的亲和性：CEA、 ED-B纤连蛋白、CD20、 CD22、 CD19、 EGFR、 IGF1R、 VEFGR1/Fltl 、 VEGFR2/KDR 、 VEGRF3/Flt-4 、 HER2/腿、CD30、 CD33、 PfMSP-I、 HN/NDV、 EpCAM/17画lA、 hTR、 IL-2R/Tac、 CA19-9、固C1、 II类HLA、 GD2、 G250、 TAG誦72、 PSMA、 CEACAM6、 HMWMAA、 CD40、 M13外壳蛋白和GPIIb/IIIa;第二 前体具有针对选自组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)和铟-DTPA的半抗原的 亲和性，或者具有针对选自以下的细胞表面抗原的亲和性：CD22、 CD20、 EGFR、 IGF1R、 VEFGR1/Fltl、 VEGFR2/KDR、 VEGRF3/Flt國4 、 CD3、 CD16、 CD64、 CD89、 CD2和腺病毒纤突结。
37. 权利要求1的组合物，其中第一前体具有针对选自M13夕卜 壳蛋白和GpIIb/IIIa的细胞表面抗原的亲和性，或者具有针对选自以 下的生物分子的亲和性：碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、（3-半乳糖香 酶、tpA、链激酶、水蛭素和尿激酶；第二前体具有针对选自M13外 壳蛋白和GpIIb/IIIa的细胞表面抗原的亲和性，或者具有针对选自以 下的生物分子的亲和性：碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、P-半乳糖香 酶、tpA、链激酶、水蛭素和尿激酶。
38. 权利要求l的组合物，其中第一前体具有针对以下物质的亲 和性：CD3、 CD74、 CD19、 CD22、 MUC1、 EGP-1、 IGF1R CD30、 CD25/Tac、 LeY、卩-淀粉状蛋白、间皮素、Erb-B2、 EpCAM、 GP240、 GPIIb/IIIa或p97;第二前体是核糖核酸酶、豹蛙酶、基因工程豹蛙 酶、细菌毒素、植物毒素、PE38、 dgA、 DT390、磷脂酶C (PLC)、 多花白树毒蛋白、溶血栓蛋白、tPA、尿激酶或水蛭素。
39. 权利要求1的组合物，其中第一前体具有针对疾病或病症相 关的任何细胞表面抗原的亲和性；第二前体选自细胞因子、生长因 子、羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、p-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基 还原酶、P-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白（GFP)、碱性磷酸酶、辣根过 氧化物酶和链霉抗生物素蛋白。
40. 权利要求1的组合物，其中第一前体选自核糖核酸酶、细菌 毒素、植物毒素、细胞因子、生长因子和表面活性蛋白D (Sp-D); 第二前体具有针对疾病或病症相关的任何细胞表面抗原的亲和性。
41. 权利要求1的组合物，其中第一前体选自细胞表面受体的配 体、IL-4、 VEGF121、可溶性受体组分、sIL-4R、 sIL國13R、毒素、PE38、志贺样毒素和白喉毒素；第二前体选自细胞表面受体的配体、IL-4、VEGF121、可溶性受体组分、sIL-4R、 sIL-13R、毒素、PE38、志贺样 毒素和白喉毒素。
42. 权利要求1的组合物，其中第一和第二前体相同，并且选自 以下物质的结合分子：CD14、 CDll/柄蛋白-l、叶酸受体a、 gpl20、IL-6、 IL-5、 IL-8、 CD154、 IgE、 LFA-1、 （3-类胰蛋白酶、CD105/内 皮糖蛋白、GpIIb/IIIa、 TNFa、 RSV F-蛋白、CEA的A1B1和CEA的N结构域。
43. 权利要求l的组合物，其中第一和笫二前体相同，并且选自 细胞因子、生长因子、可溶性受体组分、tPA、 TPO、 EPO和sTNFa-R。
44. 权利要求1的组合物，所述组合物还包含通过共价或非共价 键与所述稳定束缚结构缀合的一种或多种效应物或载体。
45. 权利要求44的组合物，其中所述效应物是诊断试剂、治疗 药、化疗药、放射性同位素、显像剂、抗血管生成药、细胞因子、 趋化因子、生长因子、药物、前体药物、酶、结合分子、细胞表面 受体的配体、螯合剂、免疫调节剂、寡核苷酸、激素、光检测标记、 染料、肽、毒素、造影剂、顺磁标记、超声标记、促凋亡剂、脂质 体、纳米粒或其组合。
46. 权利要求44的组合物 束縛结构化学交联。
47. 权利要求44的组合物 效应物或两个以上载体连才妻。
48. 权利要求47的组合物效应物是相同或不同的。
49. 权利要求44的组合物一种诊断试剂或治疗药。
50. —种方法，所述方法包括：a) 获取权利要求1的稳定束缚结构；和b) 将所述稳定束縛结构给予疾病患者；其中所述稳定束缚结构对疾病具有治疗效果。
51. 权利要求50的方法，其中所述疾病是癌症、增生、糖尿病 性一见网膜病、黄斑变性、炎性肠病、节l殳性回肠炎、溃疡性结肠炎、 类风湿性关节炎、结节病、哮喘、水肿、肺动脉高压、青少年糖尿,其中所述效应物或载体与所述稳定 ,其中所述稳定束缚结构与两个以上 ,其中所述两个以上载体或两个以上 ,其中所述一种或多种载体包含至少病、银屑病、系统性红斑狼疮、斯耶格伦综合征、多发性硬化、重 症肌无力、脓毒病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、遗传性出 血性毛细血管扩张、心肌血管生成、斑块新血管形成、再狭窄、血 管创伤后新内膜形成、毛细管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、 慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、深部静脉血栓形成或伤口肉芽 形成。
52. 权利要求51的方法，其中所述疾病是癌症，而且第一前体具有针对肿瘤相关抗原的结合亲和性。
53. 权利要求52的方法，所述方法还包括给予一种或多种抗癌 治疗与所述稳定束縛结构联用。
54. 权利要求53的方法，其中所述治疗是化疗药、细胞因子、 肽、免疫调节剂、放疗、免疫治疗、放免治疗、局部高温、激光照 射、抗血管生成药或手术切除。
55. 权利要求51的方法，所述方法还包括给予所述患者能结合 第二前体的半抗原。
56. 权利要求55的方法，其中在所述稳定束缚结构定位到疾病 相关组织之后再给予所述半抗原。
57. 权利要求56的方法，其中所述半抗原与选自以下的物质连 接：抗血管生成药、化疗药、细胞因子、药物、前体药物、毒素、 酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫调节剂、激素、结合分子、脂 质、聚合物、胶束、脂质体、纳米粒或其组合。
58. 权利要求50的方法，其中所述疾病是由真菌引起的。
59. 权利要求50的方法，其中所述疾病是由病毒引起的。
60. 权利要求50的方法，其中所述疾病是由细菌引起的。
61. 权利要求50的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病。
62. 权利要求50的方法，其中所述疾病是神经变性性疾病。
63. 权利要求62的方法，其中所述疾病是阿尔茨海默病。
64. 权利要求63的方法，其中所述稳定束缚结构具有至少一个针对p-淀粉状蛋白的结合位点。
65. 权利要求50的方法，其中所述疾病是心肌梗塞、缺血性心 脏病、动脉粥样;更化斑块、脉管炎、移植排斥、特应性组织或者因 活化粒细胞、单核细胞、淋巴样细胞、NK细胞或巨噬细胞增多所引 起的炎症。
66. 权利要求50的方法，其中给予所述稳定束缚结构以诱导輩巴 细胞群体凋亡。
67. 权利要求66的方法，其中所述稳定束绰结构包含选自以下 的抗体或抗体片段组合：抗CD74X抗CD20、抗CD74X抗CD22、 抗CD22X抗CD20、抗CD20 X抗HLA-DR、抗CD19X抗CD20、 抗CD20 X抗CD80、抗CD2 X抗CD25 、抗CD8 X抗CD25和抗CD2 X抗CD 147。
68. 权利要求66的方法，其中第一前体和/或第二前体具有针对 选自以下抗原的结合亲和性：CD2、 CD3、 CD8、 CDIO、 CD21、 CD23、 CD24、 CD25、 CD30、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD48、 CD52、 CD55、 CD59、 CD70、 CD74、 CD80、 CD86、 CD138、 CD147、 HLA画DR、 CEA、 CSAp、 CA國125、 TAG-72、 EFGR、 HER2、 HER3、 HER4、 IGF-1R、 c-Met、 PDGFR、 MUC1、 MUC2、 MUC3、 MUC4、 TKFR1、 TNFR2、 NGFR、 Fas (CD95)、 DR3、 DR4、 DR5、 DR6、 VEGF、 PIGF、 ED-B纤连蛋白、生腱蛋白、PSMA、 PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。
69. —种诊断疾病的方法，所述方法包括：a) 获得一种包含同型二聚体的稳定束缚结构，所述同型二聚体 的每个第 一单体含有与第 一前体连接的二聚化和停靠结构域(DDD)， 所述二元复合物还包含第二单体，第二单体含有与第二前体连接的 锚定结构域(AD), AD与DDD共价连接，其中笫一前体与疾病相关 抗原结合，第二前体与诊断用半抗原结合；b) 将所述复合物给予怀疑患有疾病的患者；c) 给予同一患者能结合所述二元复合物的诊断用半抗原；和d)检测与所述二元复合物结合的半抗原的存在； 其中所述半抗原定位于疾病相关组织，即诊断所述患者患有所 述疾病。
70. 权利要求69的方法，其中所述半抗原与放射性核素缀合。
71. 权利要求69的方法，其中放射性核素用同位素检测器进行 检测，或者用单光子发射计算机断层扫描或正电子发射断层扫描来 成像。
72. 权利要求69的方法，其中所述疾病是癌症，而且笫一前体 与肿瘤相关抗原结合。
73. 权利要求69的方法，其中所述半抗原与磁共振成像(MRI)造 影剂缀合，通过MRI检测与二元复合物结合的半抗原。
74. 权利要求69的方法，其中所述半抗原与超声成像增强剂缀 合，通过超声成像检测与二元复合物结合的半抗原。
75. 权利要求74的方法，其中所述超声成像增强剂是脂质体。
76. 权利要求69的方法，其中第一前体或第二前体具有针对 CD19、 CD20、 CD22或IL-17的结合亲和性。
77. 权利要求69的方法，所述方法还包括采用体内内窥镜检查、手术中检查或者手术中检查及治疗，来检测结合半抗原。
78. —种体外诊断的方法，所述方法包括：a) 获得包含同型二聚体的二元复合物，所述同型二聚体的每个 第一单体含有与第一前体连接的二聚化和停靠结构域(DDD),所述二 元复合物还包含第二单体，第二单体含有与笫二前体连接的锚定结 构域(AD)， AD与DDD共价连接，其中第一前体与疾病相关抗原结 合，第二前体与诊断用半抗原结合；b) 将所述复合物给予来自怀疑患有疾病的患者的样品；c) 给予能结合所述二元复合物的诊断用半抗原；和d) 检测与所述二元复合物结合的半抗原的存在； 其中所述半抗原与所述样品结合，即诊断所述患者患有所述疾病。
79. —种诊断疾病的方法，所述方法包括：a) 获得包含同型二聚体的二元复合物，所述同型二聚体的每个 第一单体含有与第一前体连接的二聚化和停靠结构域(DDD)，所述二 元复合物还包含第二单体，第二单体含有与第二前体连接的锚定结 构域(AD), AD与DDD共价连接，其中第一前体与疾病相关抗原结 合，第二前体包含可检测部分；b) 将所述复合物给予来自怀疑患有疾病的患者；和c) 检测所述诊断部分的存在；其中所述诊断部分定位于疾病相关组织，即i貪断所述患者患有 所述疾病。
具有多功能或结合特异性的明确组成的改进的稳定束缚结构 发明背景[0001]具有多功能或结合特异性的基于抗体的药物的现有生产技术，存在很多局限性。对于通过重组工程生产的药物来说，这些 局限可包括生产成本高，表达收率低，在血清中不稳定，在溶液中 不稳定而导致有聚集体或离解亚基形成，因存在多种产物形式并含 有污染副产物而导致不确定的批组成，由于位阻因素或构型改变而 导致的功能活性或结合亲和力/亲合力降低，等等。对于用不同化学 交联方法生产的药物来说，两个主要的局限是生产成本高与纯化产 物异质性。[0002]近年来，对于能结合不止一个抗原决定簇(也称为表位） 的抗体或其它结合部分，人们的兴趣不断增加。 一般来说，天然存 在的抗体和单克隆抗体有识别同 一表位的两个抗原结合位点。相比语)是经合成或基因工程改造的可结合两个不同表位的结构。因此， 同一分子构建体中存在能结合两个不同抗原决定簇的能力。[0003]双特异性抗体可用于许多生物医学应用。例如，具有肿 瘤细胞表面抗原结合位点和T细胞表面受体结合位点的双特异性抗 体，能导致特定肿瘤细胞被T细胞溶解。识别胶质瘤和T细胞CD3 表位的双特异性抗体，已成功地用于治疗人类患者的脑肿瘤(Nitta等, Lancet. 1990; 355:368-371)。[0004]已知有多种生产双特异性抗体的方法。构建和利用双特 异性及多特异性抗体的方法，公开于例如美国专利申请公布号 20050002945 (2004年11月2日申请），所述文献的全部内容通过引 用结合到本文中。双特异性抗体可通过四源杂交瘤（quadroma)方法生产，该方法包括使两个不同杂交瘤融合，每个杂交瘤都产生一种识别不同抗原性位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello. Nature. 1983; 305:537-540)。该融合杂交瘤能合成两个不同重链和两个不同轻链， 它们能随机结合产生具有10种不同抗体结构的异质群体，其中只有 一个（占全部抗体分子的1/8)是双特异性的，因而必须进一步纯化以 与其它形式分开，即使这是可行的但也是不经济的。此外，在细胞 遗传学上融合杂交瘤经常不如亲代杂交瘤稳定，导致生产细胞系在 传代时有很多问题。[0005]另 一个生产双特异性抗体的方法利用杂双官能交联剂， 用化学键束缚两个不同单克隆抗体，致使所得的杂交缀合物能结合 两个不同草巴标(Staerz等，Nature. 1985; 314:628-631; Perez等，Nature. 1985; 316:354-356)。用此方法产生的双特异性抗体基本上是两个IgG 分子的异源缀合物，它緩慢扩散到组织中并迅速从循环中清除。双 特异性抗体也可通过如下方法制备：将两个亲本单克隆抗体各自还 原成相应的半个分子，然后混合并氧化得到杂合体结构，从而生产 双特异性抗体（Staerz和Bevan. Proc Natl Acad Sci USA. 1986; 83:1453-1457)。 一个替代方法是利用合适接头，使两个或三个单独纯 化的Fab'片段发生化学交联。例如，欧洲专利申请0453082公开了应 用三-马来酰亚胺化合物来制备双特异性或三特异性抗体样结构。美 国专利第6,511,663号提供了一种通过连接结构使三个或四个Fab片 段彼此共价连接来制备三价和四价单特异性抗原结合蛋白的方法。 由于所有这些化学方法都有生产成本高、生产过程繁复、纯化步骤 过多、收率低(<20%)及产物异质性等缺点，因此不适于商业开发。[0006]其它方法包括：通过逆转录病毒衍生的穿梭载体，将带 有不同选择标记的基因转移到相应亲本杂交瘤中并随后使之融合， 以提高杂合杂交瘤的生产效率(DeMonte等，Proc Natl Acad Sci USA. 1990, 87:2941-2945);或者用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达 质粒转染杂交瘤细胞系。这些方法也面临上述不可避免的纯化问题。[0007]美国专利第5，582,9%号公开了产生重组双特异性抗体的 方法，该重组双特异性抗体由来自相同或不同抗体的Fab片段组成， 这些Fab片l殳通过插入该抗体重链恒定区的互补相互作用结构域而 締合。互补相互作用结构域选自交互的亮氨酸拉链或一对肽区段， 其中一个含有一系列带正电荷的氨基酸残基，而另一个含有一系列 带负电荷的氨基酸残基。该方法的一个局限性是，含有融合的互补 相互作用结构域的各个Fab亚基表现出对其靶抗原的亲和力急剧下 降，除非两个亚基结合在一起。[0008]通过重组DNA技术产生的抗体的离散VH区和VL区会 彼此配对，形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(美国专利第 4,642,334号)。然而，这样非共价締合的分子在生理条件下不够稳定 以致没有实际用途。关联VH区和VL区能通过具有合适长度(通常由 多于12个氨基酸残基组成)和合适组成的肽接头连接起来，形成具有 结合活性的单链Fv (scFv)。 scFv的生产方法公开于美国专利第 4,946，778号和美国专利第5,132,405号。将肽接头长度减少到少于12 个氨基酸残基，可以避免同一链的Vh区和W区配对，而迫使Vh区 和V^区与其它链的互补区配对，形成功能性多聚体。由3-12个氨基 酸残基接头连接的VH区和VL区多肽链主要形成二聚体(称为双链抗 体(diabodies))。 0-2个氨基酸残基接头主要形成三聚体(称为三链抗体 (triabodies》和四聚体(称为四链抗体(tetrabodies)),但是除了接头长度 外，寡聚化的确切形式看来还取决于V区的组成和取向(VH-接头-Vi 或V^接失-Vh)。[0009]用5个氨基酸残基或更短的肽接头，可得到多价单特异 性双链抗体、三链抗体和四链抗体。利用双顺反子(dicistronic)表达载 体也制备了双特异性双链抗体，该双特异性双链抗体是两个不同scFv 的异源二聚体，其中每个scFv由一个抗体的VH区经短肽接头与另一 抗体的Vl区連接而成；所述双顺反子表达载体中的一个顺反子含有 由Vw-接头-Vu构成的重组基因构建体，而另一个顺反子含有由VH2-接头-Vu构成的笫二重组基因构建体(Holliger等，Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90:6444-6448; Atwell等，Mol Immunol. 1996; 33:1301-1302; Holliger等，Nature Biotechnol. 1997; 15: 632-631; Helfrich等，Int. J Cancer. 1998; 76: 232-239; Kipriyanov等，Int J Cancer. 1998; 77: 763-772; Holliger等，Cancer Res.1999; 59: 2909-2916)。[0010]最近，也报道了具有双特异性的四价串联双链抗体(称为 串联双链抗体(tandab)) (Cochlovms等，Cancer Res. 2000; 60: 4336-4341)。该双特异性串联双链抗体是两个相同多肽的二聚体，每个多 肽含有两个不同抗体的四个可变区(VH,、 Vu、 VH2、 VL2)，这四个可 变区按一定方向连接，以便一旦自締合就形成各自针对两个不同特 异性的两个潜在结合位点。[0011]迄今为止，尚未构建得到表达双特异性或三特异性三链 抗体的载体。然而，含有胶原凝集素颈区（collectin neck region)的多 肽三聚化已有报道(H叩pe等，FEBS Letters. 1994; 344: 191-195)。美 国专利第6,190,886号公开了用含有胶原凝集素颈区的融合蛋白生产 同源三聚体或异源三聚体。[0012]美国专利第5,844,094号、美国专利第5,837,242号和WO 98/44001中公开了通过改变接头长度，制备基于scFv的多价和多特 异性药物的方法。美国专利第5,989,830号和美国专利第6,239,259 号公开了通过构建两条多肽链，制备基于scFv的多价和多特异性药 物的方法，其中一条多肽链含有来自至少两个抗体的Vh区，另一条 多肽链含有相应的区。用现有技术产生基于scFv的多价和多特异 性药物的常见问题是：表达水平低，产品形式不均一，在溶液中不 稳定导致聚集，在血清中不稳定以及亲和力降低。[0013]美国专利第6,809,185号公开了通过重组方法产生的双特 异性或三特异性抗体，该抗体中Fab的CHI和Q链的C端各自与 来自相同或不同单克隆抗体的scFv融合。这项"三链体(Tribody)" 技术的主要缺点包括附加的scFv结合亲和性降低，产品形式不均一，在溶液中不稳定导致聚集。[0014]因此，本领域仍然需要多所述特异性或功能性的多价结构的制备方法，特别是双特异性抗体的制备方法，这类多价结构的 组成确定，纯度均一，亲和性未改变，并且生产收率高而无需大量 的纯化步骤。此外，这类结构物必须在血清中足够稳定，以便在体 内应用。需要易于构建和/或以相对纯的形式获得的多特异性或功能 性的稳定多价结构。发明概述[0015]本发明提供定量产生稳定束绰结构的平台技术，所述结 构具有多功能或结合特异性。在优选的实施方案中，通过两个不同肽序列间特定的相互作用，将这类稳定束缚结构制备成任何两个组 分(在本文中称为A和B)的独特二元复合物，这两个肽序列中的一个 称、为二聚/ft和4亭靠结构域(dimedzation and docking domain， DDD)， 另 一个称为锚定结构域(anchoring domain, AD)。在更优选的实施方案 中，DDD序列（见图1中的DDD1和DDD2)来自依赖cAMP的蛋白 激酶(PKA)调节(R)亚基，而AD序列（见图2中的AD1和AD2)来自 不同A-激酶锚定蛋白（AKAP)中存在的特定区域，其介导与PKA的 R亚基的締合。然而，技术人员将会知道，其它二聚化和停靠结构域 及锚定结构域是已知的，任何这样的已知结构域可在本文要求保护 的主题范围之内使用。其它示例性的4-螺旋束类型DDD结构域可得 自p53、 DCoH (肝细胞核因子la (TCF1))的蝶呤4a甲醇胺脱水酶/二 聚化辅因子)和HNF-1 (肝细胞核因子l)。尽管S100蛋白也表现4螺 旋-束DDD序列，但是这些蛋白质都具有生物活性，例如使其无法 实用的致癌性。具有潜在用途的其它AD序列可参见专利申请顺序号 US2003/0232420A1 ，所述文献的全部内容通过引用结合到本文中。[0016]在最优选的实施方案中，二元复合物中的一个组分A是 通过重组工程或者经间隔基团进行化学缀合，将DDD序列与A的前体(称为力)连接而产生的，结果产生爿/DDD结构(在下文中称为a)。 因为a中的DDD序列影响二聚体的自发形成，所以A由32组成。 二元复合物中的另一组分B是通过重组工程或者经间隔基团进行化 学缀合，将AD序列与B的前体(称为S)连接而产生的，结果产生S/AD 结构(在下文中称为b)。 二聚体结构包含在a2中，这一事实产生停靠 位点，用于结合b中所含的AD序列，导致a2与b迅速締合，形成 由a2b组成的二元复合物。在不同实施方案中，这样的结合事件还因 后续反应而进一步稳定化，所述后续反应共价保护了该装配的两个 组分，例如通过二硫桥，所述反应非常有效地发生，因为起始结合 相互作用使活性硫醇基定向，以便进行位点特异性连接。[0017]为了将半胱氨酸残基放置在DDD和AD序列（如DDD2 和AD2所示)的战略位置上，32与b间可通过二硫桥而发生共价结合 相互作用，由此形成稳定束縛结构，这使得体内应用更可行。稳定 束缚结构也保留了两个前体和S的全部功能特性。本发明人无法公开的设计在自然界是模块状的，因为所选的两个前体中的每个都 可与DDD或AD连接并随后组合。这两个前体也可相同04=3)或不 同G4-5)。当爿=5时，所得a2b复合物由稳定束縛装配的3个亚基组 成，在下文中称为a3。适合作为前体的材料包括蛋白质、肽、肽模 拟物、多核苷酸、RNAz、寡糖、天然或合成聚合物、纳米粒、量子 点(quantum dot)以及有机或无机化合物。可能应用的前体的其它非限 制性实例见下表6-10。[0018]除了使用二硫键以防组成性亚基解离之外，也可使用能 增强a2b结构的总体稳定性的其它方法。例如，可选择市售的或研究 中使用的各种交联剂或方法，用于这些目的。可能有用的试剂是戊 二醛，它已广泛用于探究非共价締合的多聚体蛋白质的结构，即通 过使组成性亚基交联，形成稳定的缀合物（Silva等，Food TechnolBiotechnol. 2004; 42:M-56)。两种涉及蛋白质亚基氧化交联的化学方 法也令人感兴趣。 一 个方法是近端标记#支术(proximity labeling technique),采用六组氨酸标记的蛋白质(Fancy等，Chem Biol. 1996; 3:551-559)或N端甘氨酸-甘氨酸-组氨酸标记的蛋白质(Brown等， Biochemistry. 1998; 37:4397-4406)。这些标记与Ni(II)紧密结合，当用过酸氧化时，生成Ni(m), Ni(m)能介导各种氧化反应，包括蛋白 质-蛋白质交联。称为picup (未修饰蛋白质的光诱导交联)的另一技术采用[Ru(II)(bipy)3:T、过硫酸铵和可见光，以诱导蛋白质-蛋白质交 联(Fancy和Kodadek. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96:6020-6024)。 然而，如下所述，用于化学交联肽、多肽、蛋白质或其它各种大分 子的多种方法是本领域已知的，任何这样的已知方法都可用于使a2b 结构共价稳定。[0019]可以用要求保护的方法和组合物开发各种产物。例如， 考虑了至少6类基于蛋白质或基于肽的产物，其由稳定束缚装配的 基因工程结构组成：1类：双特异性三价321)复合物，由两个来自同一单克隆抗体(mAb) 的Fab或scFv片段以及一个来自不同mAb的Fab或scFv片段组成(参 见例如表6);2A类：多功能性a^复合物，由两个来自同一 mAb的Fab或scFv 片段以及一个非免疫球蛋白或肽组成(参见例如表7A);2B类：多功能性a^复合物，由两个相同的非免疫球蛋白或肽 以及一个来自mAb的Fab或scFv片段组成(参见例如表7B);3类：多功能性321)复合物，由三个非免疫球蛋白或肽组成，这 三个中有两个是相同的（参见例如表8);4类：三价33复合物，由三个来自同一 mAb的Fab或scFv片 段組成(参见例如表9);5类：三价33复合物，由三个相同的非免疫球蛋白或肽组成(参 见例如表10)。[0020]技术人员将会知道，尽管以上讨论涉及Fab或scFv片段， 但是在下文中详细讨论的其它类型的抗体和/或抗体片l殳也可被替 代。 一般来讲，1类产物可用于需要双特异性抗体的各种用途。例如， 同时与活化血小板和组织纤溶酶原激活物(tPA)反应的双特异性抗体 不仅能通过抑制血小板聚集而防止进一步形成血凝块，而且能通过 将内源tPA募集到血小板表面而溶解现有的血凝块(Neblock等， Bioconjugate Chem. 1991, 3:126-31)。[0021] —般而言，2A类和2B类产物可用于需要靶特异性递送 或结合非免疫球蛋白的各种用途。例如，由针对内化胂瘤相关抗原(例 如CD74)及与其连接的毒素(例如核糖核酸酶)的双价抗体结合结构組 成的稳定束绰a2b复合物，对选择性递送毒素以破坏目标肿瘤细胞来 说是很重要的。[0022] —般而言，3类产物可用于更需要两种不同非免疫球蛋 白组合、而非单个非免疫球蛋白的各种用途。例如，由IL-4R受体的 可溶性组分(sIL-4R)以及IL-13受体的可溶性组分(sIL-13R)组成的稳 定束縛a2b复合物，将是治疗哮喘或变态反应的潜在治疗药。[0023] —般而言，4类和5类产物可用于更需要三价复合物、 而非其单价类似物的各种用途。例如，与单价类似物(ReoPro, Centocor) 或双价类似物相比，由三个抗GPIIb/IIIa Fab片段组成的稳定束縛a3 复合物结合结构，在预防血凝块形成中应该更有效，因为后者具有 更高结合亲合力。在治疗类风湿性关节炎和某些其它自身免疫性疾 病(AID)中，对于抑制TNF方面来说，由TNFa-R的可溶性组分的三 个拷贝组成的稳定束缚a3复合物比Enbrel (Amgen)更有效。[0024]要求保护的方法和组合物也包括缀合物，所述缀合物由 一种或多种效应物或载体及与其连接的a2b或33形式的稳定束缚结 构组成。效应物或载体可与a2b或a3复合物非共〗介或共^介连^妄，例 如通过化学交联。根据所需用途，效应物可选自诊断试剂、治疗药、化疗药、放射性同位素、放射性核素、显像剂（imaging agent)、抗血 管生成药、细胞因子、趋化因子、生长因子、药物、前体药物、酶、 结合分子、细胞表面受体的配体、螯合剂、免疫调节剂、寡核香酸、 激素、光检测标记、染料、肽、毒素、造影剂（contrast agent)、顺磁 标记、超声标记、促凋亡剂（pro-apoptotic agent)、月旨质体、纟内米粒或 其组合。此外，缀合物可含有不止一种效应物（效应物可以相同或不 同）或不止一种载体（载体可以相同或不同）。效应物和载体也可存在 于同一缀合物中。当效应物是螯合剂时，所得缀合物通常还与金属 络合，所述金属可以是放射性或非放射性的。含有载体的缀合物还 可与诊断或治疗功能试剂联合用于所需用途。[0025]在某些实施方案中，效应物或载体可以在给予患者a2b 复合物之后给予，例如在如下讨论的预靶向(pre-targeting)策略中。可 先将a2b复合物给予患者，让其定位于例如患病组织，例如肿瘤。随 后添加效应物或载体，让其与定位的a2b复合物结合。尽管效应物或 载体与有毒部分(例如放射性核素)缀合，但是这种预靶向方法减少了患者对毒性的全身暴露，让毒性剂按更大比例递送到靶组织。在这 样的实施方案中，A亚基可含有例如肿瘤相关抗原的结合位点，而B 亚基可含有效应物或载体的结合位点或者含有与效应物或载体缀合 的半抗原的结合位点。[0026]本文所公开的方法和组合物能使任何两个结构与 DDD/AD偶联系统定点共价或非共价締合。DDD结构特征的X类4-螺旋束二聚化基序(Newlon等，EMBO J. 2001; 20:1651-1662; Newlon 等，Nature Struct Biol. 1999; 3: 222-227)存在于其它类型的蛋白质中， 例如S100蛋白（例如S100B和钙周期蛋白）和转录因子的肝细胞核因 子(HNF)家族(例如HNF-la和HNF-1(3)。参与信号转导或转录活化的 超过300种蛋白质也含有6S-70个氨基酸的模块，称为不育oc基序(SAM) 结构域，其具有在二聚化界面上存在的X类4-螺旋束的变化。对于S100B,该X类4-螺旋束能使各二聚体以孩l摩尔亲和力与来自c端 调节结构域(残基367-388)的两个p53肽结合(Rustandi等，Biochemistry. 1998; 37: 1951-1960)。同样，HNF-loc的N端二聚化结构域(HNF-pl) 显示出通过HNF-pl 二聚体与DCoH 二聚体(HNF-1的二聚化辅因子） 締合(Rose等，Nature Struct Biol. 2000; 7: 744-748)。在替代实施方案 中，这些天然存在的系统也可用于要求保护的方法和组合物，以提 供具有多功能或结合特异性的稳定的多聚体结构。其它结合事件例 如酶与其底物/抑制剂（例如角质酶和膦酸西旨）间的结合事件(Hodneland 等，Proc Natl Acd Sci USA. 2002; 99: 5048-5052)也可用于产生两个締 合组分（"停靠"步骤)，其随后经共价稳定化（"锁定"步骤)。[0027]在不同实施方案中，可将题述组合物给予疾病患者，用 于治疗和/或诊断目的。技术人员将会知道，可用多功能性、双价、 三价、多特异性或双特异性复合物诊断和/或治疗的任何疾病，都可 用题述组合物治疗。示例性的疾病包括但不限于癌症、增生、神经 变性性疾病、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、脉管炎、病毒感染、 真菌感染、细菌感染、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、自身免疫性 疾病、炎性肠病、节段性回肠炎(Crohn，s disease)、溃疡性结肠炎、 类风湿性关节炎、结节病、哮喘、水肿、肺动脉高压、青少年糖尿 病、银屑病、系统性红斑狼裔、斯耶格伦综合征(Sj6gren，s syndrome)、 多发性硬化、重症肌无力、脓毒病、角膜移植排斥、新生血管性青 光眼、遗传性出血性毛细血管扩张(Osler-Webber Syndrome)、心肌血 管生成、斑块新血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细 管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、慢性炎症相关的纤维化、肺 纤维化、深部静脉血栓形成或伤口肉芽形成。[0028]在具体实施方案中，本文所?^开的方法和組合物可用于 治疗自身免疫性疾病（例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发 性血小板减少性紫癜）、皮肌炎、小舞蹈病（Sydenham's chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱痴、青少年糖尿病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后的肾炎(post-streptococcalnephritis)、结节性红 斑、无脉病(Takayasu，s arteritis)、艾迪生病(Addison's disease)、类风 湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA 肾病、结节性多动脉炎、关节强硬性脊推炎、肺出血肾炎综合征 (Goodpasture's syndrome)、 闭塞 4生血才全'性月永管 炎 (thromboangitisubiterans)、 斯耶格伦综合征(Sjogren's syndrome)、 原 发性胆汁性肝硬化、桥本曱状腺炎(Hashimoto's thyroiditis),曱状腺 毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常 性天疱齊、韦格纳肉芽肿病(Wegener，s granulomatosis)、膜性肾病、 肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急 进性肾小球性肾炎、银屑病或纤维性肺泡炎。[0029]在某些实施方案中，稳定束缚结构可用于癌症的治疗性 治疗。可以预料，可以靶向任何类型的肿瘤和任何类型的肺瘤抗原。 可以耙向的示例性肿瘤类型包括急性成淋巴细胞性白血病、急性髓 细胞性白血病、胆嚢癌、乳癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、 慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、 头颈部癌、霍奇金淋巴瘤（Hodgkm，s lymphoma),肺癌、甲状腺髓质 癌、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin，s lymphoma))、多发性骨髓瘤、肾 癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。[0030]可以靶向的胂瘤相关抗原包括但不限于碳酸酐酶IX、 A3、 A33抗体特异性抗原、BrE3-抗原、CD1、 CDla、 CD3、 CD5、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD30、 CD45、 CD74、 CD79a、 CD80、 HLA-DR、 NCA95、 NCA90、 HCG 及其亚基、CEA(CEACAM-5)、 CEACAM-6、 CSAp、 EGFR、 EGP-1、 EGP隱2、 Ep-CAM、 Ba 733、 HER2Zneu、低氧诱导因子(HIF)、 KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、 Le-Y、巨復细胞抑制因子(MIF)、 MAGE、MUC1、 MUC2、 MUC3、 MUC4、 PAM-4-抗原、PSA、 PSMA、 RS5、 S100、 TAG-72、 p53、生腱蛋白、IL-6、 IL-8、胰岛素生长因子-1 (IGF-1)、 Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、胎盘 生长因子(P1GF)、 17-lA-抗原、血管生成标记(例如ED-B纤连蛋白）、 癌基因标记、癌基因产物和其它肺瘤相关抗原。目前对肿瘤相关抗 原的报道包括Mizukami等(2005, Nature Med. 11:992-97); Hatfield等 (2005, Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48); Vallbohmer等(2005, J. Clin. Oncol. 23:3536-44);和Ren等(2005, Ann. Surg. 242:55-63),所述各文 献通过引用结合到本文中。[0031]其它实施方案涉及治疗患者的淋巴瘤、白血病或自身免 疫病的方法，即通过给予患者一种或多种剂量的稳定束缚结构，其 中第二前体的结合位点与淋巴细胞抗原结合，第 一前体的结合位点 与相同或不同的淋巴细胞抗原结合。 一个或多个结合位点可与选自 以下的抗原的一个或多个独特表位结合：CD4、 CD5、 CD8、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD40L、 CD46、 CD52、 CD54、 CD74、 C函、CD126、 CD13S、 CD154、 B7、 MUC1 、 Ia、 Ii、固1.24、 HLA-DR、生腱蛋 白、VEGF、 P1GF、 ED-B纤连蛋白、癌基因、癌基因产物、NCA 66a-d、 坏死抗原、IL-2、 T101 、 TAG、 IL-6、 MIF、 TRAIL-R1 (DR4)和TRAIL-R2 (DR5)。可通过胃肠外给予组合物，剂量例如为每剂20-1500毫克蛋 白、每剂20-500毫克蛋白、每剂20-100毫克蛋白、或每剂20-1500 毫克蛋白。[0032]在又一些实施方案中，稳定束缚结构可用于治疗例如细 菌、病毒或真菌等病原生物感染的患者。可治疗的示例性真菌包括 小孑包子菌属(A/z'cmsporwm)、 发裤菌属(7>/c/?o/?/^to")、 表皮裤菌属 (五/7/de/7wo/?/2少to")、 申克孑包子丝菌(iS/?o/Y?^n^: sc/^"ch7) 、 #f型隐3求菌 (C7/7tococcMS /7eq/b/7?2(5fm1)、 4丑3求孑包子菌(Cocc/力oz^fes1 z'w,m'"力、荚刀莫 组织胞浆菌(7iXsto/?/"5wa ca戸w/afMw)、 皮炎芽生菌(5/osto附;;ces6fermfl"'^fo)或白色念珠菌(C朋WJa a/6Zcan)。 示例性的病毒包括人免 疫缺陷病毒(HIV)、疱渗病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、 人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血 病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小病毒样病毒 (parvo-like virus)、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病 毒、水痘带状疱渗病毒、登革热病毒、风渗病毒、麻渗病毒、腺病 毒、人T细胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、鼠白血病病毒、肥、腺 炎病毒、疱渗性口腔炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、淋巴细胞 性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病毒。示例性的细菌包括炭疽芽孢杆菌 (5ac〃/ws朋f/irac/s)、 无乳链球菌(Sfr，ococcws aga/a"iae)、 嗜肺军团 菌(Leg/cwe〃a /wew附o/7/^7/a)、酉良脓葡萄J求菌(5Treptococciw 、 大肠杆菌(五》c/^n'c/n'" co")、淋病奈瑟氏;求菌(A^/Me厂z'" go"o"/zoeae)、 月S膜炎奈瑟氏3求菌(iVe""n'" wem'"gz."cfo)、月巿炎球菌(尸"ewOTococczw s/7/7.)、；危感p耆血4干菌B (//ewo/^Z/zi1 ^)、 苍白密虫累》走体(7>e/?o"e/?7a p"〃i(iMm)、 莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、 绿脓 々支单月包菌CP^w6fomo/7cw aerwg7'"ora)、 麻风分4支4干菌(A^yco6actehwm /eprae)、 流产布鲁氏杆菌(3race〃a "/wm^)、 结核分枝杆菌 (A/j/coMcten'ww fw6en^/o57力或支原体(A^yco;7/as7wa)。 这些稳、定束缚结 构可包含例如针对病原体上 一 个或多个抗原决定簇的结合位点，并 且可以与针对病原体的治疗药缀合或连接，所述治疗药例如抗病毒 药、抗生素或抗真菌药。或者，稳定束縛缀合物可包含针对病原体 抗原的第 一结合位点和针对半抗原或载体的第二结合位点，所述半 抗原或载体与 一种或多种治疗药连接。[0033]所采用的针对感染性生物体的、并缀合或掺入或定向結 合所述稳定束缚结构的治疗药，包括但不限于阿昔洛韦、阿苯达唑、 金刚烷胺、阿米卡星、阿莫西林、两性霉素B、氨千西林、氨曲南、 阿奇霉素、杆菌肽、复方新诺明(bactrim)、巴特芬(Batmfen)⑤、联苯千唑、羧千西林、卡泊芬净、头孢克洛、头孢唑林、头孢菌素类(cephalosporins),头孢吡肟、头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素、西多福 韦、盐酸环丙沙星制剂(Cipro)⑧、克拉霉素、克拉维酸、克霉唑、氯 唑西林、多西环素、益康唑、erythrocycline、红霉素、甲竭峻、氟康 唑、氟胞嘧啶、膦曱酸、呋喃唑酮、更昔洛韦、庆大霉素、亚胺培 南、异烟肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑胺、 美罗培南、咪康唑、米诺环素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米 星、呋喃妥因、制霉菌素、奥塞米韦、苯唑西林、巴龙霉素、青霉 素、喷他脒、喊拉西纟木-三唑巴坦、利福布汀、利福平、金刚乙胺、 链霉素、磺胺甲嗯唑、柳氮磺吡啶、四环素、噻康唑、妥布霉素、 托西拉酯、托萘酯、甲氧千啶-磺胺甲嗨唑、伐昔洛韦、万古霉素、 zanamir和zithromycin。[0034]尽管并非限制性的，在不同实施方案中，掺入到稳定束 缚结构中的前体可包含一种或多种蛋白质，例如细菌毒素、植物毒 素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、 葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉 毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、豹蛙酶(Rap)、 Rap(N的Q)、 PE38、 dgA、 DT390、 PLC、 tPA、细胞因子、生长因子、可溶性受 体组分、表面活性蛋白D、 IL-4、 sIL-4R、 sIL-13R、 VEGF121、 TPO、 EPO、溶血栓剂、酶、焚光蛋白、sTNFa-R、 avimer、 scFv、 dsFv或 纳米抗体(nanobody)。[0035]在其它实施方案中，抗血管生成药可形成前体的一部分 或全部，或者可与稳定束缚结构连接。使用的示例性抗血管生成药 包括血管生长抑素、baculostatin、人血管能抑素（canstatin)、乳腺丝 抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-l抗 体、抗Flt-l抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活 物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、 IP-IO、 Gro-p、血小板应答蛋白（thrombospondin)、 2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相关 蛋白、carboxiamidotriazole、 CM101、马立马司他、戊聚糖多聚石克酸 酯(pentosan polysulphate)、促血管生成素2、干扰素-ot、除莠霉素A、 PNU145156E、 16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可石威、 染料木碱、TNP-470、内皮生长抑素、紫杉醇、accutin、血管生长抑 素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或 米诺环素。[0036]在又一些实施方案中， 一种或多种例如以下的治疗药可 与稳定束缚结构缀合或者掺入到其中：aplidin、阿4L立平、阿那曲唑、 氮杂胞苷、博来霉素、硼替佐米(bortezomib)、苔藓抑素-1、白消安、 加利车霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸 氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-ll)、 SN-38、卡铂、克拉曲滨、环磷酰 胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、葡糖苷酸道诺 霉素、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、多栗比星、二氢吡咯多柔 比星(2P-DOX)、氰基吗啉代多柔比星、葡糖普酸多柔比星、葡糖苷 酸表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、葡糖苷酸依托泊苷、 磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、 3',5'-0-二油酰基-FudR (FUdR-dO)、 氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟曱睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、 羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、 氮芥、醋酸甲羟孕酮(medroprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮、美 法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、曱氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝 裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、泼尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他 丁、 PSI-341、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙 酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌 4立莫司汀、velcade、长春石成、长春瑞滨、长春新石咸、蓖麻毒蛋白、 相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、onconase、 mpLRl、 DNA酶I、葡萄J求 菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA或其组合。[0(B7]在其它实施方案中，第一前体可与患病组织相关抗原或 其它靶标结合，而第二前体可设计成与可寻耙构建体(targetable construct)结合，用于递送一种或多种效应物。给予稳定束绰结构并 定位于疾病相关细胞或组织之后，可以添加可寻耙构建体，以结合 定位的稳定束缚结构。任选可给予清除剂，以便从环境循环中清除 未定位的稳定束缚结构，然后再给予可寻靶构建体。这些方法是本 领域已知的，详见美国专利第4,624,846号、WO 92/19273和Sharkey 等，Int. J. Cancer 51: 266 (1992)。示例性的可寻草巴构建体具有以下结 构：X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2,其中该化合物在 X或Y上包含硬酸阳离子螯合剂，在剩余X或Y上包含软酸阳离子 螯合剂；并且其中该化合物还包含至少 一种诊断性或治疗性阳离子， 和/或一种或多种螯合的或化学结合的治疗药、诊断试剂或酶。诊断 试剂可以是例如Gd(III)、 Eu(III)、 Dy(III)、 Pr(III)、 Pa(IV)、 Mn(II)、 Cr(m)、 Co(III)、 Fe(III)、 Cu(II)、 Ni(II)、 Ti(III)、 V(IV)离子或基团。 第二个示例性的构建体可以是下式：X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2，其中该化合物在X或Y上包含硬酸阳离子螯 合剂或软酸螯合剂，而在剩余X或Y上没有；并且其中该化合物还 包含至少一个诊断性或治疗性阳离子，和/或一种或多种螯合的或化 学结合的治疗药、诊断试剂或酶。[0038]不同实施方案可涉及用于诱导患病细胞凋亡的稳定束縳 结构及其使用方法。详情可参见美国专利申请公布号20050079184， 所迷专利申请的全部内容都通过引用结合到本文中。这类结构可包 含具有针对选自以下抗原的结合亲和性的第一和/或第二前体：CD2、 CD3、 CD8、 CDIO、 CD21、 CD23、 CD24、 CD25、 CD30、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD48、 CD52、 CD55、 CD59、 CD70、 CD74、 CD80、 CD86、 CD138、 CD147、 HLA-DR、 CEA、 CSAp、 CA-125、TAG-72、 EFGR、 HER2、 HER3、 HER4、 IGF-1R、 c-Met、 PDGFR、 而C1、固C2、固C3、 MUC4、 TNFR1、 TNFR2、 NGFR、 Fas (CD95)、 DR3、 DR4、 DR5、 DR6、 VEGF、 PIGF、 ED-B纤连蛋白、生腱蛋白、 PSMA、 PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。在更具体的实施方案中，用于 诱导细胞凋亡的稳定束绰结构可包含单克隆抗体、Fab片段、嵌合抗 体、人源化抗体或人抗体或片段。在优选的实施方案中，稳定束缚 结构可包含以下抗体的组合：抗CD74 X抗CD20、抗CD74 X抗 CD22、抗CD22 X抗CD20、抗CD20 X抗HLA-DR、抗CD19 X抗 CD20、抗CD20X抗CD80、抗CD2X抗CD25、抗CD8 X抗CD25 和抗CD2 X抗CD147。在更优选的实施方案中，嵌合抗体、人源化 抗体或人抗体或抗体片段可来自LL2 (抗CD22)、LL1 (抗CD74)或A20 (抗CD20)的可变区。[0039]不同实施方案可涉及治疗炎性和免疫失调疾病、感染性 疾病、病理性血管生成或癌症的方法。在本申请中，稳定束缚结构 与选自以下的两个不同靶标结合：（A)先天免疫系统的促炎效应物，（B) 凝血因子，（C)补体因子和补体调节蛋白，和(D)与炎性或免疫失调障 碍或与病理性血管生成或癌症特异性相关的靶标，其中后 一 靶标不 是(A)、 （B)或(C)。至少一个靶标是(A)、 （B)或(C)。合适的靶标组合 参见美国临时申请第60/634,076 (2004年12月8日申请，发明名称 为 "Methods and Compositions for Immunotherapy and Detection of Inflammatory and Immune-Dysregulatory Disease, Infectious Disease, Pathologic Angiogenesis and Cancer"), 所迷临时申i青的内容通过引用全部结合到本文中。[0040]结合分子可结合的先天免疫系统的促炎效应物，可以是 促炎效应物细胞因子、促炎效应物趋化因子或促炎效应物受体。合 适的促炎效应物细胞因子包括MIF、 HMGB-1 (高迁移率族框蛋白1 (high mobility group box protein l))、 TNF-a、 IL-1、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL隱8、 IL-12、 IL-15和IL-18。促炎效应物趋化因子的实例包括CCL19、CCL21、 IL-8、 MCP-1、 RANTES、 MIP-1A、 MIP-1B、 ENA-78、 MCP-1、 IP-IO、 GROB和嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)。促炎效应物受体 包括IL-4R (白介素-4受体)、IL-6R (白介素-6受体)、IL-UR (白介素 -13受体)、IL-15R(白介素-15受体)和IL-18R(白介素-18受体)。[0041]结合分子也可与至少一种凝血因子(尤其是组织因子(TF) 或凝血酶)发生特异性反应。在其它实施方案中，结合分子与至少一 种补体因子或补体调节蛋白特异性反应。在优选的实施方案种，补 体因子选自C3、 C5、 C3a、 C3b和C5a。当结合分子与补体调节蛋 白特异性反应时，补体调节蛋白优选选自CD46、 CD55、 CD59和 mCRP。附图简述[0042]图1显示两个示例性DDD序列。DDD1中加下划线的序DDD2 (SEQ ID NO:2)在N端有两个氨基酸与DDD1不同。[0043]图2显示两个示例性AD序列。AD1中加下划线的序列(SEQ ID NO:3)对应于AKAP-w，它是据报道Kd为0.4 nM的优化RII-选才奪性肽。也显示了 AD2(SEQIDNO:4)。[0044]图3显示RII的DDD与AKAP的AD之间相互作用的结构模型。[0045]图4显示N-DDD2-Fab-hMN-14 (A)以及由DDD2介导的 二聚化而形成的推定的a2结构(B)的示意图。[0046]图5显示N-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2质粒表达载体的 设计。[0047]图6显示C-DDD2-Fab-hMN-14 (A)以及由DDD2介导的 二聚化而形成的推定的a2结构(B)的示意图。[0048]图7显示C-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2质粒表达载体的 设计。A)及其推定的结构(B)的示意图。[0050]图9显示h6"-VH-AD2-pdHL2质粒表达载体的设计。 [0051]图10显示用IMP-291-Affigel纯化的h679-Fab-AD2的 SE-HPLC分析。[0052]图11显示h679-Fab-AD2ds (A)通过还原而活化成h679-Fab-AD2 (B)的示意图。[0053]图12显示用CBind L (蛋白L纤维素)纯化的N-DDD2-Fab-hMN-14中占优势存在34型。SE-HPLC描记图也揭示了存在a2 型，以及以单体形式和二聚体形式存在的游离轻链。[0054]图13显示当用5 mM TCEP还原时，纯化的N-DDD2-Fab-hMN-14中存在的34型解离成32型，5 mM TCEP也将二聚体轻 链转化成单体轻链。[0055]图14显示当还原时，N-DDD2-Fab-hMN-14的a4型（A) 转化成a2型(B)的示意图。[0056]图15显示用CBind L (蛋白L纤维素)纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14中占优势存在34型。SE-HPLC描记图也揭示了存在a2 型，以及以单体形式和二聚体形式存在的游离轻链[0057]图16显示当用5 mM TCEP还原时，纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14中存在的34型解离成32型。[0058]图17显示(A)在还原条件下当N-DDD2-Fab-hMN-14与 h679-Fab-AD2混合时所形成的非共价a2b复合物和(B)通过二6H桥形 成的共价TF1结构的示意图。〖0059]图18显示包括产生TF1的步骤的SE-HPLC分析。图A 显示在添加TCEP之前含有N-DDD2-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD2 的反应混合物。图B显示在添加5 mM TCEP之后，形成非共价a2b 复合物。图C显示用10% DMSO处理后经二斩J建连接的产物。图D 显示经IMP-291-亲和色谱和制备型SE-HPLC后TF1的纯度。[0060]图19显示在BIAcore分析所采用的条件下，仅共价TF1 结构能同时结合HSG (作为IMP-239固定在传感器芯片上)和WI2(针 对hMN-14的抗id)。 N-DDDl-Fab-hMN-14与h679-Fab-ADl之间所 形成的非共价a2b复合物未能捕获WI2,虽然已与偶联HSG的传感 器芯片结合。[0061]图20显示TF1含有hMN-14的两个功能性结合位点，因 为它能结合WI2的两个Fab分子。[0062]图21显示在组分A和B的DDD和AD序列中战略性放 置半胱氨酸残基的作用，以影响稳定结构(N-DDD2+AD2)的形成，该 结构在BIAcore分析所采用的条件下能同时结合HSG (作为IMP-239 固定在传感器芯片上)和WI2 (针对hMN-14的抗id)。在DDD与AD 特异性结合后，当组分A不能与组分B形成二硫键时，所得321>复 合物在BIAcore分析所采用的条件下不够稳定，不能保持结合在一 起。32与b解离是明显的，因为复合物(N-DDD1+AD2)不能捕获WI2。[0063]图22显示IMP-291亲和纯化之前(A)和之后(B)的SE-HPLC分析。将过量N-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2混合， 以保证在IMP-291亲和色谱后，没有游离h679-Fab-AD2与稳定束缚 复合物一起纯化出来。[0064]图23显示TF2的示意图。[0065]图24显示包括产生TF2的步骤的SE-HPLC分析。图A 显示在添加TCEP之前含有C-DDD2-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD2 的反应混合物。图B显示在添加5 mM TCEP之后形成非共价a2b复 合物。[0066]图25显示对TF2的IMP-291亲和纯化的SE-HPLC分析。 图A显示上样到IMP-291-affigel之前的TF2。图B显示未结合流分。 图C显示结合流分，仅包含TF2。[0067]图26显示TF2的(A)非还原性和(B)还原性SDS-PAGE 分析。[0068]图27显示TF2的MALDI-TOF质i普分析。[0069]图28显示通过BIAcore分析，TF2与HSG (固定在传感 器芯片上)和WI2的结合。[0070]图29显示TF2含有hMN-14的两个功能性结合位点，因 为它能结合WI2的两个Fab分子。[0071]图30显示比较TF1、 TF2和hMN-14 IgG对CEA的亲合 力的竟争性ELISA结果。[0072]图31显示在7天为一个周期，监测TF2在合并人血清 中的稳定性结果。在浓度或双特异性结合活性方面都没有观察到可 ;险测变化。[0073]图32显示注射99mTc-IMP-245的、用TF2预靶向的棵鼠 体内造影。给雌性无胸腺棵鼠皮下(s.c.)注射1 x 107 LS-174T肿瘤细 胞/小鼠。 一周后，平均肿瘤大小为0.105±0.068 cm3。给20只为一 组的第 一组小鼠每只注射80吗125I-TF2 (500 pmol, 2 pCi),在给予TF2 后16小时给予99mTc-IMP-245 (40 ^Ci， 92 ng， 50 pmol)(图像中上面一 排)。笫二组小鼠仅给予99mTc-IMP-245,没有TF^图像中下面一排)。 注射99mTc-IMP-245后1、 4和24小时的图像显示出强的胂瘤特异性 信号，TF2定位于肿瘤(上面一排)。不同于肿瘤，在1小时时仅膀胱 具有强烈信号，表明从尿液中排出。在不存在TF2时仅观察到非特 异性分布(下面一排)。数据表明，TF2对体内应用来说是高度稳定的， 能提供良好的肺瘤造影。发明详述[0074]在某些实施方案中，提供了新的a2b形式的稳定束缚二元复合物及其制备方法。 一般而言，二元复合物是由非共价连接的 同型二聚体结构(称为A或a。与第二结构(称为B或b)经位点特异性 締合而形成。所得a2b结构可经A与B间非共价、或优选共〗介相互 作用（例如二硫键)而稳定。A是由两个相同亚基构成，其中每个亚基都由前体与肽序列连接而组成，称为二聚化和4f靠结构域(DDD),在 优选实施方案中DDD来自依赖cAMP的蛋白激酶(PKA)。亚基中所 含的DDD结构域自发締合形成稳定的同型二聚体，而这样的締合又 对肽序列产生具有高亲和性的结合位点，称为锚定结构域(AD),该 AD在例如各种A-激酶锚定蛋白（AKAP)中存在，而且在B中含有。 因此，B由前体与AD连接而组成。[0075]通过AD肽与(DDD)2结合位点的相互作用，很容易地进 行二元复合物的装配。DDD肽可插入到几乎任何多肽序列中或束缚 到任何前体中，只要这样的衍生不干扰其二聚化、以及与AD肽结合 的能力。同样，AD肽可插入到几乎任何多肽序列中或束绰到任何前 体中，只要这样的衍生不干扰其与同型二聚体DDD结合位点的结合。 该模块方法是高度通用的，可用于将几乎任何A与任何B结合形成 二元装配物，该二元装配物含有来自A的前体的两个亚基(32)和来自 B的前体的一个亚基(b)。当A和B的前体都含抗体结构域，该结构 域可与第二抗体结构域締合产生抗原结合位点(例如Fab或scFv)，则 所得a2b复合物是双特异性和三价的。在某些实施方案中，二元复合 物可通过例如化学缀合而与效应物(例如配体或药物)连接，与载体(例如葡聚糖或纳米粒)连接，或同时与效应物和载体连接，通过这样的 修饰而具有额外用途。[0076]因为二元复合物的稳定性基本取决于A中所含的DDD 对B中所含的AD的结合亲和性，经平衡尺寸排阻HPLC分析估计， 对于两种原型a2b结构来说，其亲和性不大于8 nM (描述于实施例5)， 这两种原型是C端融合AD1构建体(h679-Fab-ADl，参见实施例3) 至C端或N端融合DDD1构建体(C-DDDl-Fab-hMN-14或N-DDD1-Fab-hMN-14,都参见实施例4)而形成，共价连接a2b复合物中所含 的A和B，将会防止各个亚基的不合要求的締合，因而方便体内应 用。为了使二元复合物稳定，可将半胱氨酸残基引入DDD和AD序 列的战略位置上，使DDD与AD间能形成二好"建。可采用其它方法或策略，通过使32和b交联而形成稳定复合物。例如，采用戊二醛 或PICUP方法，组成性亚基可以低特异性方式、以低效率，彼此共 价连接。也可使用其它已知的共价交联方法。定义[0077]在下面的描述中，使用各种术语，提供以下定义以便于 理解本文所公开的内容。尚未明确定义的术语按其通常含义来使用。包括复数形式。[0079]本文所用的术语"和"和"或"可用于指与（conjunctive) 或析取(disjunctive)。也就是说，这两个术语应当理解为等同于"和/ 或"，除非另有说明。[0080〗二聚化和停靠结构域(dimerization and docking domain, DDD)是指允许含有DDD序列的两个同型单体自发形成二聚体的肽 序列。所得同型二聚体在DDD序列内含有锚定结构域的停靠位点。 尽管示例性的DDD序列可得自依赖cAMP的蛋白激酶，但也可使用 其它已知DDD序列。〖0081]锚定结构域(anchoring domam, AD)是对二聚化DDD序列 具有结合亲和性的肽序列。尽管示例性AD序列可得自任何A-激酶 锚定蛋白（AKAP),但也可使用其它已知AD序列。[0082]术语前体按其物质的通常含义来使用，自该物质能形成 更稳定而确定的产物或终产物。[0083]本文所用的结合分子、结合部分或靶向分子是可特异性 结合耙分子、细胞、复合物和/或组织的任何分子。结合分子可包括 但不限于抗体或其片段、类似物或模拟物、avimer、适体或把向肽。[0084]本文所述的抗体是指全长(即天然存在的或经标准免疫球 蛋白基因片段重组方法而形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或 免疫活性（即特异性结合)部分或免疫球蛋白分子类似物，例如抗体片段。[0085]抗体片段是抗体部分，例如F(ab)2、 F(ab')2、 Fab、 Fv、 sFv 等。无论其结构如何，抗体片段所结合的抗原与完整抗体所识别的 抗原相同。术语"抗体片段"也包括任何合成或基因工程蛋白质， 其作用类似于抗体，是通过结合特异性抗原而形成复合物。例如， 抗体片段包括由可变区组成的分离的片段(例如由重链和轻链可变区 组成的"Fv"片段)、重组单链多肽分子(其中轻链和重链可变区由肽 接头连接（"scFv蛋白"）)以及最小识别单元（由模拟超变区的氨基酸 残基组成）。[0086]效应物是产生所选结果的原子、分子或化合物。效应物 可包括治疗药和/或诊断试剂。[0087]治疗药是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗 药的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激 素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA (siRNA)、螯合剂、 硼化合物、光敏剂、染料和放射性同位素。所采用的其它示例性治 疗药和方法公开于美国专利公布号20050002945、 20040018557、 20030148409和20050014207，所述各专利通过引用结合到本文中。[0088]诊断试剂是可用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有 用的诊断试剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如带有生物素-链 霉抗生物素复合物）、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成 像(MRI)的增强剂（例如顺磁离子）。[0089]免疫缀合物是结合分子(例如抗体组分)与原子、分子或 高级结构(例如与载体、治疗药或诊断试剂)的缀合物。[OO卯]棵抗体是未与任何其它药物或试剂缀合的抗体。[0091]载体是能与治疗药或诊断试剂締合、以便将这些药物或 试剂递送到靶细胞的原子、分子或高级结构。载体可包含脂质(例如 能形成高级结构的两亲性脂质）、多糖(例如葡聚糖）、肽、蛋白质或 其它高级结构，例如胶束(micelle)、脂质体或纳米粒。[0092]本文所用的术语抗体融合蛋白是重组产生的抗原结合分 子，其中具有相同或不同特异性的两个以上相同或不同scFv或抗体片段连接在一起。融合蛋白的价表示融合蛋白对单个抗原或表位具有多少结合臂或位点；即单价、双价、三价或多价。抗体融合蛋白 的多价表明它在结合抗原时可利用多重相互作用，因此增加了结合 抗原的亲合力。特异性表示抗体融合蛋白能结合多少抗原或表位； 即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，天 然抗体(例如IgG)是双价的，因为具有两个结合臂，但却是单特异性的，因为能结合一个表位。单特异性的多价融合蛋白具有不止一个 表位结合位点，但只结合一个这样的表位，例如双链抗体具有能与 同一抗原反应的两个结合位点。融合蛋白可包含单个抗体组分、不 同抗体组分的多价或多特异性组合、或者同一抗体组分的多个拷贝。 融合蛋白还可包含抗体或抗体片段以及治疗药。适用于这样的融合 蛋白的治疗药的实例包括免疫调节剂（"抗体-免疫调节剂融合蛋白"） 和毒素（"抗体-毒素融合蛋白"）。 一个优选的毒素包括核糖核酸酶(RNA 酶），优选重组RNA酶。[0093]多特异性抗体是能同时结合不同结构的至少两个靶标(例 如两种不同抗原、同一抗原的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或 表位)的抗体。[0094]多价抗体是能同时结合相同或不同结构的至少两个耙标 的抗体。[009"多特异性的多价抗体是具有不同特异性的不止一个结合 位点的构建体。[0096]双特异性抗体是能同时结合不同结构的两个耙标的抗 体。特别令人感兴趣的双特异性抗体和双特异性抗体片段具有至少 一个臂(该臂能特异性结合例如B细胞、T细胞、骨髓细胞、浆细胞 和肥大细胞抗原或表位)以及至少一个其它臂(该臂能特异性结合携带 治疗药或诊断试剂的可寻靶缀合物）。[0097]本文所用的功能性蛋白质是具有生物活性的蛋白质。
[0098]如果所给予的剂量具有生理上的意义时，就可以说是以"治疗有效量"给予抗体或免疫缀合物制剂或本文所述的组合物。 当受体哺乳动物的生理状态因 一 种药物或试剂的存在而导致可检测
的变化时，该药物或试剂就具有生理上的意义。具体地讲，当抗体 制剂的存在产生了抗肿瘤反应或减轻自身免疫性疾病状态的体征和 症状时，该制剂就具有生理上的意义。生理意义的效果也可以是诱 导受体哺乳动物的体液和/或细胞免疫应答，导致生长抑制或靶细胞死亡。
的变化时，该药物或试剂就具有生理上的意义。具体地讲，当抗体 制剂的存在产生了抗肿瘤反应或减轻自身免疫性疾病状态的体征和 症状时，该制剂就具有生理上的意义。生理意义的效果也可以是诱 导受体哺乳动物的体液和/或细胞免疫应答，导致生长抑制或靶细胞死亡。
[0117]如果给予的组合物是受体患者可耐受的，就可以说该组 合物是"药学上可接受的载体"。无菌磷酸緩冲盐溶液就是药学上 可接受的载体的一个实例。其它合适载体是本领域技术人员众所周 知的。参见例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第 19 X反(Mack Publishing Co. 1995)和Goodman and Gilman的THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Goodman等编 著.Macmillan Publishing Co., New York, 1980和2001出版)。产生模块亚基的稳定束缚装配的方法
[0118]本文所公开的方法和组合物提供产生模块亚基的稳定束 缚装配的平台技术。 一个实施方案涉及由两个确定组分(A和B)形成 的稳定束缚二元复合物，这两个组分优选分别制备。然而，在替代 实施方案中，A和B可一起制备，例如通过用同时编码A和B的载 体、或者用分别编码A和B的两个不同载体转染单细胞系。当A和 B都是Fab片段时，优选分别制备，否则，如果同时制备的话，将会 因轻链颠倒(scrambling)而产生不同产物。
[0119]在某些实施方案中，由两个相同亚基(a》组成的A与由 一个亚基(b)组成的B结合，形成a2b构型的装配。A与B的締合是 位点特异性的，而且是自发的，因为A和B中分别构建的DDD与AD序列间具有强烈的结合相互作用。A和B都可以是任何实体，连 接DDD的A的前体可与连接AD的B的前体不同或相同。在后一 种情况下，所得a2b复合物(称为33)由三个亚基组成，每个亚基都含 有相同前体，但都连接DDD和AD。
[0120]要求保护的方法和组合物的模块特性允许将任何A与任 何B组合。对可连接A和B或者掺入其中的前体类型基本上没有限 制，只要它们不妨碍DDD 二聚化或DDD与AD的结合。当经重组 工程而构建时，可在不同宿主细胞中独立制备(或者在如上所述的同 一宿主细胞中制备)、纯化并贮存A和B。然而，在装配之前，并非 绝对需要对A和B进行纯化。在合适条件下，可将含有A和B的细 胞提取物或培养物直接混合，从而形成二元复合物，然后在氧化后 通过二硫键而稳定该复合物，再进行纯化。在某些应用中，最好在 纯化之后、与A混合之前，将B与效应物或载体缀合。或者，最好 在纯化之后、与B混合之前，将A与效应物或载体缀合。最好在混 合之前，还用效应物或载体修饰A和B。另外，在某些应用中，最 好将a2b复合物与效应物或栽体缀合。当在同一宿主细胞中制备A 和B时，它们可自发装配成321)复合物。
[0121]优选的实施方案利用依赖cAMP的蛋白激酶(PKA)调节 亚基与天然存在的A-激酶锚定蛋白（AKAP)锚定结构域之间的特定的 蛋白质/蛋白质相互作用。PKA于1968年首次报道(参见Walsh等，J. Biol. Chem. 243:3763-65 (1968.))。在二十世纪七十年代中期才阐明全 酶结构，是由两个催化亚基组成，这两个亚基通过调节(R)亚基二聚 体维持无活性形式（参见Corbin等，J. Biol. Chem. 248:1813-21 (1973))。发现两类R亚基(RI和RII)，各自具有a和P同种型。已经分 离出R亚基，是稳定二聚体，而且已经知道二聚化结构域是由前44 个氨基端残基组成（参见Hausken等，J. Biol. Chem. 271:29016-22 (1996))。作为广谱丝氨g吏/苏氨酸激酶的PKA的信号转导特异性，是通过全酶经停靠蛋白（称为A-激酶锚定蛋白(AKAP》区室化而得到的 (Scott等，J. Biol. Chem. 265:21561-66 (1990》。
[0122] AKAP (微管相关蛋白-2)首先于1984年完成表征(Lohmann 等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 81:6723-27 (1984))。迄今为止，已经鉴 定出了超过50种结构不同的AKAP，其物种范围从酵母到人类(参见 Wong等，Nat Rev Mol Cell Biol. 12:959-70 (2004》。AKAP的PKA锚 定结构域是14-18个残基的两亲性螺旋(参见Carr等，J. Biol. Chem. 266:14188-92 (1991))。 PKA锚定结构域的氨基酸序列在AKAP中是 相当多变的，对RII 二聚体的结合亲和性范围为2-90 nM,而对RI 二聚体的结合亲和性低约100倍(参见Alto等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100:4445-50 (2003》。锚定结构域与RII 二聚体上由RII的氨基 端前23个残基所形成的疏水表面相结合(Colledge等，Trends Cell Biol. 6:216-21 (1999))。因此，RII 二聚化结构域和AKAP结合结构域全都 位于相同的44个氨基酸序列中。此外，AKAP只与RII 二聚体结合， 而不与单体结合。这种相互作用的结构模型见图3。
[0123]通过DDD和AD序列相互作用而形成的a2b或a3复合 物可以经共价键稳定，以允许体内应用。可通过将半胱氨酸残基同 时引入DDD和AD序列的战略位置上而达到这一目的（如DDD2和 AD2所示），以便在^与b间形成二硫键。或者，也可采用其它已知 类型的共价交联。
[0124]当通过重组工程产生二元复合物的两个组分(A和B)时， 可在同一宿主细^^内合成它们，或更优选在两个不同的宿主细^^系 内合成。指导A合成的表达载体含有目标多肽(J)的DNA序列，该 序列与PKAR-亚基的DDD (例如DDDl或DDD2)编码序列融合，其 由RIa、 RI(3、 RIIa、 RIip或任何天然或合成的功能类似物的前30个 或更多氨基酸组成。DDD可以直接与j的氨基端或羧基端偶联，或 者优选通过间隔区(其含有氨基酸残基的合适长度或组成)与j的氨基端或羧基端偶联。或者，可将DDD放在融合蛋白内部，只要不影响 DDD的结合活性和多肽融合配偶体的所需活性。合成后，A/DDD融 合蛋白将会与DDD1专一地形成稳定的同型二聚体(32)或者与DDD2 主要形成稳定同型四聚体(a》。[012"指导B合成的第二表达盒可以是与指导A合成的相同载 体，或者优选是在依赖性载体中；该表达盒含有目标多肽(B)的DNA 序列，该序列与锚定结构域(AD)(例如AD1或AD2)编码序列融合， AD可来源于任何AKAP蛋白或者公开于以下文献的天然或合成类似 物：US 20(B/02!32420A1 ，所述专利文献通过引用结合到本文中。AD 可以直接与6的氨基端或羧基端偶联，或者优选通过间隔区(其含有 氨基酸残基的合适长度或组成)与S的氨基端或羧基端偶联。在二硫 化物还原剂存在下，将融合蛋白（b)与Z/DDD2融合蛋白（主要 是aj混合，产生由a2b组成的二元复合物，随后因添加二曱基亚砜 (DMSO)而形成二硫键，使该复合物稳定。
[0126]亚基的模块特性允许任何DDD2-多肽二聚体与任何AD2-多肽组合。各种34/32和b模块亚基的贮液可以纯化产物形式或未纯 化的细胞培养物上清液形式分别保存，随后视需要进行混合，以得到各种321)结构。
[012"又一个实施方案是，使用合适缀合化学方法，使效应物(例 如药物或螯合剂）或载体(例如葡聚糖或納米粒)与A或B (在其纯化后） 连接。或者，可以对a2b结构(在其形成和纯化后)进行这样的修饰， 或者对A和B (在混合前)进行这样的修饰。
来自重组抗体结合结构域的模块亚基的稳定束缚装配
[012"又一个实施方案是，使用合适缀合化学方法，使效应物(例 如药物或螯合剂）或载体(例如葡聚糖或納米粒)与A或B (在其纯化后） 连接。或者，可以对a2b结构(在其形成和纯化后)进行这样的修饰， 或者对A和B (在混合前)进行这样的修饰。
来自重组抗体结合结构域的模块亚基的稳定束缚装配
[0128]本文所公开的方法和组合物可用于提供基于重组抗体的 多价结合结构，该结构可以是单特异性或双特异性的。例如，DDD2 序列可以与单链Fv融合，得到34/1)2形式的单特异性结合结构。更通 常的是，DDD序列可以与抗体可变区融合，其可与互补抗体可变区締合，形成抗原结合位点。例如，DDD1或DDD2序列可与含有VH 区和CH1区的抗体序列融合(Fd/DDD),或可与Vl区和CL区融合 (L/DDD)。 Fd/DDD或L/DDD再可分别与互补L或Fd締合，形成 Fab/DDD,然后形成Fab/DDD1 二聚体或Fab/DDD2四聚体和/或二 聚体。
[0129]同样，类似于AD2， AD序列可与单链Fv融合，或更常 见的是与含有VH区和CH1区的抗体序列融合(Fd/AD2),当与关联L-链配对时，其形成Fab/AD2。或者，类似于AD2, AD序列可与含有 区和CL区的抗体序列融合，当与关联Fd链配对时，其形成 Fab/AD2。将Fab/DDD2四聚体/二聚体与Fab/AD2混合，然后经还 原和氧化，产生三价结合结构的稳定束绰装配，该结构可以是单特 异性的(a》或双特异性的(a2b)。
[0130]结合结构的VH区和、区可来自"人源化，，单克隆抗体 或来自人抗体。或者，Vh和/或区可包含来自从组合免疫球蛋白 文库中分离得到的人抗体片段序列。参见例如Barbas等，Methods: A companion to Methods in Enzymology 2: 119 (1991)和Winter等，Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994)。可从例如STRATAGENE克隆系统(La Jolla, Calif.)得到克隆载体和表达载体，用于产生人免疫球蛋白噬菌 体文库。
[0131]人抗体Vh或Vt序列可来自小鼠产生的人单克隆抗体。 这类抗体得自转基因小鼠，该类小鼠已经"工程改造"而在响应抗 原攻击时产生特定人抗体。在该技术中，将人重链和轻链基因座元 件引入源自胚胎干细胞系的小鼠品系中，该类胚胎干细胞系含有定 向破坏的内源重链和轻链基因座。转基因小鼠可合成对人抗原具有 特异性的人抗体，而且小鼠可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。从转 基因小鼠得到人抗体的方法参见Green等，Nature Genet 7: 13 (1994), Lonberg等，Nature 368: 856 (1994)和Taylor等，Int. Immim. 6: 579 (1994)。含有抗体片段的重組融合蛋白的通用制备方法
[0132]可以通过本领域众所周知的技术，得到编码能识别特定 表位的抗体片段的核酸序列。例如，可使用分泌具有所需特异性的 抗体的杂交瘤，得到抗体编码DNA,可用PCR或传统cDNA克隆技 术等已知技术来制备这样的DNA。或者，可以构建Fab'表达文库或 抗体噬菌体展示文库，以筛选具有所需特异性的抗体片段。
[0133]然后，可将编码抗体片段的核酸与编码DDD或AD的核 酸直接连接，或通过编码肽间隔区的序列间接连接。产生编码这类 融合蛋白的核酸序列的方法是本领域众所周知的，而且在以下实施 例中有进一步讨论。
[0134]在另一个实施方案中，可将额外氨基酸残基添加在由 爿/DDD或S/AD组成的模块亚基的N端或C端，其中准确的融合位 点取决于DDD或AD是否与N端或C端(或内部位置)连接。额外氨 基酸残基可包括肽标记、信号肽、细胞因子、酶(例如前体药物活化 酶)、激素、毒素、肽药物、膜相互作用肽或其它功能性蛋白。
[0135]用所需宿主细胞制备重组蛋白的方法是本领域众所周知 的。为了便于纯化，稳定束缚结构可含有合适肽标记，例如FLAG 序列或多聚组氨酸序列，以便用相应的亲和柱进行纯化。
[0136]适于表达稳定束缚结构组成性亚基的示例性表达系统是 pdHL2载体，该载体具有可扩增的鼠dhfr基因，允许通过甲氨蝶呤 处理而进行选择和扩增。参见Gillies等，J. Immunol. Methods 125:191 (1989)。 pdHL2载体提供两个基因的依赖型表达，其由两个金属硫蛋 白（metallothiomne)启动子和IgH增强子独立控制。
[0137]用于稳定束缚结构组成性亚基表达的合适宿主细胞或细 胞系是本领域技术人员已知的。采用人宿主细胞，使得任何表达的 分子可经人糖基化模式而修饰。然而，对于本文所公开的方法来说， 这并非表示人宿主细胞是必需的或优选的。[0138]正如所说明的，可通过电穿孔，用线状pdHL2载体转染 鼠骨髓瘤细胞系（例如Sp2/0)，该载体编码稳定束缚结构的组成性亚 基。将细胞在含0.05-0.1 piM甲氨蝶呤的培养基中培养，转染后48 小时进行选择。再通过逐步增加曱氨蝶呤的浓度至5 iaM,扩增所选 克隆。稳定束缚结构的缀合物
[0139]可将额外部分与如上所述的稳定束缚结构缀合。例如， 药物、毒素、放射性化合物、酶、激素、细胞毒性蛋白、螯合物、 细胞因子和其它功能性试剂，均可与稳定束绰结构的 一 个或多个模 块亚基缀合。可通过例如共价连接亚基侧链上含有氨基、羧基、巯 基或羟基的氨基酸残基，来进行缀合。各种常规接头可用于该目的， 例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺-轻基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等。药物或试剂与稳定束缚 结构的缀合优选不显著影响未修饰结构中所含的各亚基的活性。在 形成稳定束缚结构之前，32或b都可用于化学缀合。32和b也都可 在混合之前缀合。也可在形成稳定束缚a2b结构之后进行缀合。另外， 细胞毒剂可先与聚合物载体偶联，然后再与稳定束缚结构缀合。对 于该方法，参见Ryser等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3867-3870, 1978, U.S. 4,699,784和U.S. 4,046,722，所述文献通过引用结合到本 文中。
[0140]可通过用于将抗体与以下载体连接的已知方法来制备本 文所述的缀合物：脂质、碳水化合物、蛋白质、放射性核素或其它 原子和分子。例如，本文所述的稳定束缚结构可与本文所述的一种 或多种载体(例如脂质、聚合物、脂质体、胶束或纳米粒)连接，形成 缀合物，再将其通过共价、非共价或其它方式与治疗药或诊断试剂 结合。或者，本文所述的任何稳定束缚结构可以直接与本文所述的 一种或多种治疗药或诊断试剂缀合。[0141]例如，稳定束缚结构可以用1311进行放射性标记并与脂质缀合，使得所得缀合物形成脂质体。该脂质体可掺入到一种或多
种治疗药(例如药物，例如FUdR-dO)或诊断试剂中。或者，除了载体
之外，稳定束缚结构还可与1311 (例如在酪氨酸残基上)和药物(例如在
赖氨酸残基的s氨基上)缀合，然后将载体与额外治疗药或诊断试剂结
合。治疗药和诊断试剂可与稳定束缚结构的一个或多个亚基共价締合。
种治疗药(例如药物，例如FUdR-dO)或诊断试剂中。或者，除了载体
之外，稳定束缚结构还可与1311 (例如在酪氨酸残基上)和药物(例如在
赖氨酸残基的s氨基上)缀合，然后将载体与额外治疗药或诊断试剂结
合。治疗药和诊断试剂可与稳定束缚结构的一个或多个亚基共价締合。
[0142]脂质体和胶束的形成是本领域已知的。参见例如Wrobel 和Collins, Biochimica et Biophysica Acta (1995), 1235: 296-304; Lundberg等,J. Pharm. Pharmacol. (1999), 51:1099-1105; Lundberg等， Int.丄Pharm. (2000), 205:101-108; Lundberg, J. Pharm. Sci. (1994), 83:72-75; Xu等，Molec. Cancer Ther. (2002), 1:337-346; Torchilin等， Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. (2003), 100:6039-6044; U.S. 5,565,215; U.S. 6,379,698;和U.S. 2003/0082154。
[0143]也已描述了由聚合物、二氧化硅或金属制成的纳米粒或 纳米嚢，用于药物递送或造影。参见例如West等，Applications of Nanotechnology to Biotechnology (2000), 11:215-217; U.S. 5,620，708; U.S. 5,702,727;和U.S. 6,530,944。已经描述了将抗体或结合分子与 脂质体缀合，形成耙向载体，用于治疗药或诊断试剂。参见例如Bendas, Biodrugs (2001)， 15:215-224; Xu等,Mol. Cancer Ther (2002), 1:337-346; Torchilin等，Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. (2003)， 100:6039-6044; Bally等，J. Liposome Res. (1998), 8:299-335; Lundberg, Int. J. Pharm. (1994), 109:73-81; Lundberg, J. Pharm. Pharmacol. (1997), 49:16-21; Lundberg, Anti-cancer Drug Design (1998), 13: 453-461。另见U.S. 6,306,393、美国专利申请顺序号10/350,096、美国专利申请顺序号 09/590,284和美国专利申请顺序号60/138,284 (1999年6月9日申请)。 所有这些参考文献都通过引用结合到本文中。[0144]可方便地使用各种诊断试剂和治疗药，以形成稳定束缚 结构的缀合物，或者可将各种诊断试剂和治疗药与半抗原连接，该 半抗原可与稳定束缚结构上的识别位点结合。诊断试剂可包括放射性同位素、MRI增强剂或超声成像的造影剂以及焚光化合物。许多
合适造影剂是本领域已知的，它们与蛋白质或肽的连接方法也是已
知的（参见例如美国专利5,021,236和4,472,509,这两篇文献都通过 引用结合到本文中）。某些连接方法包括使用金属螯合物(例如有机螯 合剂，例如DTPA)与蛋白质或肽连接(美国专利4,472,509)。
合适造影剂是本领域已知的，它们与蛋白质或肽的连接方法也是已
知的（参见例如美国专利5,021,236和4,472,509,这两篇文献都通过 引用结合到本文中）。某些连接方法包括使用金属螯合物(例如有机螯 合剂，例如DTPA)与蛋白质或肽连接(美国专利4,472,509)。
[0145]为了将放射性金属或顺磁离子加载到稳定束缚结构上， 可能需要先将其与栽体反应，使已经结合在载体上的多拷贝螯合基 团与放射性金属或顺磁离子结合。这样的载体可以是具有侧基的聚 赖氨酸、多糖或者经衍生的或可衍生的聚合物，其侧基上可结合螯 合基团，例如1,2-乙二胺四乙酸(EDTA)、 二亚乙基三胺五乙酸 (DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟等，已知可用于 该目的。用标准化学方法，将含有螯合物的载体与稳定束缚结构偶 联，其方式是尽量减少聚集和损失免疫反应性。于U.S. 4,824，659,所述专利通过引用全部结合到本文中。特别有用 的金属-螯合物组合包括2-千基-DTPA及其一甲基和环己基类似物， 与诊断用同位素一起使用，其通常的能量范围为60-4,000 keV。某些 有用的诊断用核素可包括18F、 52Fe、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 86Y、 89Zr、 94Tc、 94mTc、 99mTc或mIn。与非放射性金属(例如锰、铁 和礼)络合的相同螯合物可用于MRI，当单独与本文所述的稳定束缚 结构和载体一起使用时。大环螯合物(例如NOTA、 DOTA和TETA) 可与各种金属和放射性金属一起使用，尤其是镓、钇和铜的放射性 核素。通过针对目标金属来定制环的大小，可以非常稳定地制备这 样的金属-螯合复合物。可使用其它环-型螯合物，例如用于络合^Ra 的大环聚醚。[0147]治疗药包括例如化疗药物，例如长春花属生物碱、蒽环
类、印idophyllotoxin、紫杉》克类、4元^^射物、》克4b剂、4元生素、Cox國 2抑制剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药和促凋亡剂、尤其是多柔比 星、甲氨蝶呤、泰素、CPT-ll、喜树生物碱类(camptothecans)以及其 它这些类型和其它类型的抗癌药等。其它癌症化疗药物包括氮芥类、 磺酸烷基酯类、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸类似物、嘧啶类似物、 嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等。合适的化疗药参见 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第19版（Mack Publishing Co. 1995),和 Goodman and Gilman 的 THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 第 7 版 (MacMillan Publishing Co. 1985),以及这些出版物的修订版。其它合 适的化疗药例如实验性药物是本领域技术人员已知的，可采用本领 域已知方法与本文所述的稳定束缚结构缀合。
类、印idophyllotoxin、紫杉》克类、4元^^射物、》克4b剂、4元生素、Cox國 2抑制剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药和促凋亡剂、尤其是多柔比 星、甲氨蝶呤、泰素、CPT-ll、喜树生物碱类(camptothecans)以及其 它这些类型和其它类型的抗癌药等。其它癌症化疗药物包括氮芥类、 磺酸烷基酯类、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸类似物、嘧啶类似物、 嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等。合适的化疗药参见 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第19版（Mack Publishing Co. 1995),和 Goodman and Gilman 的 THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 第 7 版 (MacMillan Publishing Co. 1985),以及这些出版物的修订版。其它合 适的化疗药例如实验性药物是本领域技术人员已知的，可采用本领 域已知方法与本文所述的稳定束缚结构缀合。
[0148]另一类治疗药由以下放射性核素组成：发射a-粒子的放 射性核素(例如212Pb、 212Bi、 213Bi、 211At、 223Ra、 225Ac)、发射(3-粒子 的放射性核素(例如32P、 33P、 47Sc、 67Cu、 67Ga、 89Sr、 9°Y、 mAg、 125I、 131I、 142Pr、 153Sm、 161Tb、 166Ho、 166Dy、 177Lu、 186Re、 18SRe、 1S9Re), 或发射俄歇电子的放射性核素(例如mIn、 125I、 67Ga、 191Os、 193mPt、 195mPt、 195mHg)。可采用所述方法，将稳定束缚结构用一种或多种上 述放射性核素标记，用于诊断试剂。
[0149]含有可检测标记(例如荧光分子)或细胞毒剂（例如放射性 碘)的合适肽，可与稳定束縛结构共价、非共价或其它方式締合。例 如，通过将光敏剂或染料掺入到稳定束缚结构上，可得到治疗上有 用的缀合物。已经使用荧光组合物(例如荧光染料)和对可见光敏感的 其它发色团或染料(例如卟啉)来检测和治疗病变，即用合适的光照射 病变部位。在治疗中，这4皮称为光辐射、光疗或光动力疗法。参见Jori 等(编著)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHERDISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain(1986), 22:430。此外，已将单克隆抗体与光敏染料偶联，用于进行光疗。参见Mew等，J. Immunol. (1983), 130:1473;同上，Cancer Res.(1985), 45:4380; Oseroff等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986),83:8744;作者同上(idem.), Photochem. Photobiol. (1987), 46:83; Hasan等，Prog. Clin. Biol. Res. (1989), 288:471; Tatsuta等，Lasers Surg. Med.(1989), 9:422; Pelegrin等，Cancer (1991), 67:2529。也包括内窥镜或腹腔镜应用。检测和治疗的内窥镜方法参见U.S. 4，932,412、 U.S.5,525,338 、 U.S. 5,716,595 、 U.S. 5,736,119、 U.S. 5,922,302、 U.S.6,096,289和U.S. 6,387,350，所述专利通过引用全部结合到本文中。治疗药
药物组合物
药物组合物
[0150]在某些实施方案中，可将稳定束绰结构和/或一种或多种其它治疗药给予患者，例如癌症患者。这样的药物可以药物組合物的形式给予。 一般来说，需要制备基本上不含对人或动物有害的杂质的组合物。本领域技术人员应当知道，可通过包括口服或胃肠外(例如静脉内）在内的不同途径将药物组合物给予患者。
[0151]在某些实施方案中，必须给予患者有效量的治疗药。"有效量"是药物产生所需效果的用量。有效量取决于例如药物的功效和所需效果。例如，治疗增生性疾病(例如黄斑变性或子宫内膜异位症)可能需要较少量的抗血管生成药，相比之下，癌症治疗则需要更大用量，以减少或消除实体瘤，或者防止或减少其转移。可用本领域众所周知的方法，确定具体药物的有效量，用于特定目的。化疗药
[0152]在某些实施方案中，可给予化疗药。所用的抗癌化疗药包括但不限于5-氟尿嘧啶、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、法尼基(famesyl)-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、曱氨蝶呤、丝裂霉素、诺维本、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、泰素、temazolomide (DTIC含水形式)、反柏、长春碱和曱氨蝶呤、长春新碱或上述药物的任何类似物或衍生变异体。所采用的针对感染性生物体的化疗药包括但不限于阿昔洛韦、阿苯达唑、金刚烷胺、阿米卡星、阿莫西林、两性霉素B、氨千西林、氨曲南、阿奇霉素、杆菌肽、复方新诺明、巴特芬⑧、联苯千唑、羧千西林、卡泊芬净、头孢克洛、头孢唑林、头孢菌素类、头孢吡肟、头孢曲松、头孢p塞肟、氯霉素、西多福韦、Cipro⑧盐酸环丙沙星制剂、克拉霉素、克拉维酸、克霉唑、氯唑西林、多西环素、益康唑、erythrocycline、红霉素、曱硝唑、氟康唑、氟胞嘧咬、膦曱酸、呋喃唑酮、更昔洛韦、庆大霉素、亚胺培南、异烟肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑胺、美罗培南、咪康唑、米诺环素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、制霉菌素、奥塞米韦、苯唑西林、巴龙霉素、青霉素、喷他脒、哌拉西林-三唑巴坦、利福布汀、利福平、金刚乙胺、链霉素、石黄胺曱噁唑、柳氮磺吡啶、四环素、噻康唑、妥布霉素、托西拉酯、托萘酯、曱氧千咬-磺胺曱嗯哇、伐昔洛韦、万古霉素、zanamir和zithromycin。
[0153]化疗药及其给药方法、剂量等是本领域技术人员众所周知的(参见例如"Physicians Desk Reference" , Goodman and Gilman白勺"The Pharmacological Basis of Therapeutics " 和 "Remington'sPharmaceutical Sciences",所述文献的相关部分通过引用结合到本文中）。剂量上的某些变动取决于所治疗患者的情况。负责给药的人员在任何情况下都要为每个患者确定合适剂量。激素[0154]皮质类固醇激素可提高其它化学治疗药的有效性，因此，它们经常用于联合治疗。泼尼松和地塞米松是皮质类固醇激素药的实例。己酸羟孕酮、醋酸曱羟孕酮和醋酸曱地孕酮等孕酮类药，已经用于子宫内膜癌和乳癌。己烯雌酚和炔雌醇等雌激素药，已经用于前列腺癌等癌症。他莫昔芬等抗雌激素药已经用于乳癌等癌症。丙酸睾酮和氟曱睾酮等雄激素药也已用于治疗乳癌。
血管生成抑制剂
血管生成抑制剂
[0155]在某些实施方案中，可采用例如以下的抗血管生成药：血管生长抑素、baculostatin、人血管能抑素（canstatin)、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗P1GF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-l抗体、抗Flt-l抗体和肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、 IP-IO、Gro-P、血小板应答蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、carboxiamidotriazole、 CM101、马立马司他、戊聚糖多聚硫酸酯、促血管生成素-2、干扰素-a、除莠霉素A、 PNU1M1WE、 WK催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木碱、TNP-470、内皮生长抑素、紫杉醇、accutin、血管生长抑素、西多福韦、长春新石咸、博来霉素、AGM-l470、血小板因子4或米诺环素。免疫调节剂
[0156]本文所用的术语"免疫调节剂"包括细胞因子、干细月包生长因子、淋巴毒素和造血因子，例如白介素、集落刺激因子、干扰素(例如干扰素-ct、 -p和-力和称为"S1因子，，的干细胞生长因子。合适的免疫调节剂部分的实例包括IL-2、 IL-6、 IL-IO、 IL-12、 IL-18、IL-21、干扰素-Y、 TNF-a等。
[0157]术语"细胞因子"是由一个细胞群体释放、并作为细月包间介质而作用于另 一细胞的蛋白质或肽的通称。本文更广泛采用的细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；曱状旁腺激素；曱状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如滤泡剌激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和黄体激素(LH);肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-a和肺瘤坏死因子-p;米勒管抑制物(mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素(activin);血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子，例如NGF-(3;血小板-生长因子；转化生长因子(TGF),例如TGF-a和TGF-p;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素（EPO);骨诱导因子(osteoinductive factor);千扰素，例如干扰素-oc、 p和y;集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF (M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF (GM-CSF);和粒细胞-CSF (G-CSF);白介素(IL),例如IL-1、 IL陽la、 IL-2、IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-11、 IL-12; IL-13、IL-14、 IL-15、 IL-16、 IL-17、 IL-18、 IL-21、 LIF、 G-CSF、 GM-CSF、M-CSF、 EPO、 kit-配体或FLT-3、血管生长抑素、血小板应答蛋白、内皮生长抑素、肺瘤坏死因子和LT。本文所用的术语细胞因子包括天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
[0158]趋化因子通常作为化学引诱物起作用，以将免疫效应细胞募集到趋化因子表达的位点上。趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、 MIPl-a、 MIP1-P和IP-IO。技术人员将会知道，已知某些细胞因子也具有化学引诱效果，并且也可归类于该术语趋化因子之内。同样，术语免疫调节剂和细胞因子在其各自成员中是重叠的。放射性同位素治疗和放免治疗[0159]在某些实施方案中，肽和/或蛋白质可用于放射性核素治
疗或放免治疗方法(参见例如Govindan等，2005, Technology in CancerResearch & Treatment, 4:375-91; Sharkey和Goldenberg， 2005,丄Nucl.Med. 46:115S画127S; Goldenberg等(J Ciin Oncol 2006; 24:823-834),"Antibody Pre扁targeting Advances Cancer Radioimmunodetection andRadioimmunotherapy"，所述各文献通过引用结合到本文中)。在具体的实施方案中，稳定束缚结构可直接用放射性同位素标记，然后给予患者。在替代实施方案中，可以如上所述的预靶向方法，采用带有放射性标记的半抗原性肽或配体给予放射性同位素，并在给予双特异性稳定束缚结构（其定位于患病组织表达增加的位点上)之后注射。
疗或放免治疗方法(参见例如Govindan等，2005, Technology in CancerResearch & Treatment, 4:375-91; Sharkey和Goldenberg， 2005,丄Nucl.Med. 46:115S画127S; Goldenberg等(J Ciin Oncol 2006; 24:823-834),"Antibody Pre扁targeting Advances Cancer Radioimmunodetection andRadioimmunotherapy"，所述各文献通过引用结合到本文中)。在具体的实施方案中，稳定束缚结构可直接用放射性同位素标记，然后给予患者。在替代实施方案中，可以如上所述的预靶向方法，采用带有放射性标记的半抗原性肽或配体给予放射性同位素，并在给予双特异性稳定束缚结构（其定位于患病组织表达增加的位点上)之后注射。
[0160]用于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于mIn、177Lu、 212Bi、 213Bi、 211At、 62Cu、 67Cu、 90Y、 125I、 131I、 32P、 33P、 47Sc、mAg、 67Ga、 142Pr、 153Sm、 I61Tb、 I66Dy、 166Ho、 186Re、 188Re、 189Re、212Pb、 223Ra、 225Ac、 59Fe、 75Se、 77As、 89Sr、 "Mo、 105Rh、 109Pd、 143Pr、149Pm、 169Er、 194Ir、 19SAu、 199Au和211Pb。治疗性放射性核素优选衰变能范围为20-6，000 keV，对于俄歇发射体的优选范围为60-200keV,对于P发射体为100-2,500 keV,而对于a发射体为4,000-6,000keV。有用的(3粒子发射放射性核素的最大衰变能优选为20-5,000keV,更优选100-4,000 keV,最优选500-2,500 keV。还优选基本衰变俄歇发射粒子的放射性核素。例如，Co-58、 Ga-67、 Br-80m、 Tc-99m、 Rh-103m、 Pt-109、 In画lll、 Sb-119、 1-125、 Ho-161、 Os-189m和Ir-192。有用的(3粒子发射放射性核素的衰变能优选<1,000 keV,更优选<100 keV,最优选<70 keV。还优选基本衰变a粒子的放射性核素。这样的放射性核素包括但不限于：Dy-152、 At-211、 Bi-212、Ra-223、 Rn-219、 Po-215、 Bi-211、 Ac-225、 Fr-221、 At-217、 Bi-213和Fm-255。有用的a粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV,更优选3,000-8,000 keV,最优选4,000-7,000 keV。
[0161]例如，67Cu因其半衰期为61.5小时和充足供应P粒子和Y 射线，被认为是用于放免治疗的更有希望的放射性同位素，可采用 螯合剂对溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸(TETA)将67Cu与蛋白质或 肽缀合在一起。或者，使用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，可将发射 高能(3粒子的^Y与肽、抗体、融合蛋白或其片段缀合在一起。
[0162]额外的潜在放射性同位素包括"C、 I3N、 150、 "Br、 I98Au、 224Ac、 126I、 133I、 77Br、 113mIn、 95Ru、 97Ru、 103Ru、 105Ru、 107Hg、 203Hg、 121mTe、 122mTe、 125mTe、 165Tm、 167Tm、 168Tm、 197Pt、 l09Pd、 105Rh、 142Pr、 143Pr、 161Tb、 166Ho、 199Au、 57Co、 58Co、 51Cr、 59Fe、 75Se、 201T1、 225Ac、 76Br、 16、等。
[0163]在另一个实施方案中，可使用辐射敏化剂。添加辐射敏 化剂可导致功效增强。辐射敏化剂参见D. M Goldenberg (主编）， CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press (1995),所述文献通过引用全部结合到本文中。
[0164]通常以类似方式影响具有加载硼附加物的载体、用于热 中子活化治疗的稳定束缚结构。然而，有利的是可以等待下去，直 到非靶向免疫缀合物清除后再进行中子辐射。使用能结合配体的抗 体可加速清除。参见美国专利第4,624，846号对该通用原理的描述。 例如，硼附加物例如^?友硼烷，可以与抗体连"l妄。可以用垂悬侧4连上 的羧基官能团，制备碳硼烷，正如本领域众所周知的。可通过石炭硼 烷的羧基活化并与载体上的胺缩合，使碳硼烷与载体(例如氨基葡聚 糖)连接起来。然后将中间缀合物与抗体缀合。给予缀合物之后，通 过热中子辐射活化硼附加物并转化成放射性原子，其通过a-发射衰 变，产生高毒性、短射程效果。药盒
[0165]各种实施方案可涉及含有适于治疗或诊断患者患病组织的组分的药盒。示例性的药盒可含有至少一种稳定束缚结构。如果 含有给药组分的组合物并非配制成经消化道(例如口服)给予，则可包 括能够通过某些其它途径递送药盒组分的装置。 一类装置(例如用于 胃肠外给药)是注射器，用于将组合物注射到患者体内。也可使用吸 入装置。
[0166]可将药盒组分包装在一起，或分开包装在两个以上单独容器中。在某些实施方案中，容器可以是含有适于重配的无菌冻干 组合物制剂的小瓶(管）。药盒也可含有适于重配和/或其它试剂稀释的 一种或多种緩冲剂。可使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、 管等。可将药盒组分无菌包装并保存在容器内。可包括的另一部分 是给药盒使用人员的使用说明书。
配制和给药
配制和给药
[0167]还可配制稳定束缚结构（包括其缀合物），以得到包含一 种或多种药学上合适的赋形剂、 一种或多种额外成分或它们的某些 组合的组合物。这可通过已知方法来完成：即制备药学上有用的剂 量，其中活性成分(即稳定束缚结构或缀合物)与混合物中的 一种或多 种药学上合适的赋形剂混合在 一起。无菌磷酸緩沖盐溶液就是药学 上合适的赋形剂的一个实例。其它合适赋形剂是本领域技术人员众 所周知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea & Febiger 1990),和 Gennaro (主编)，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,笫 18片反(Mack Publishing Company 1990)及其修订X反。
[0168]给予本文所述的组合物的优选途径是胃肠外注射。在胃 肠外给药中，组合物可与药学上可接受的赋形剂 一起配制成单位剂 量注射用形式，例如溶液剂、混悬剂或乳剂。这类赋形剂是固有无 毒、无治疗性的。这类赋形剂的实例是盐水、林格液、葡萄糖溶液 和Hank液。也可使用非水赋形剂例如固定油和油酸乙酯。优选的贝武形剂是5%葡萄糖盐水。赋形剂可含有少量添加剂，例如增加等渗性 和化学稳定性的物质，包括緩冲剂和防腐剂。也包括其它给药方法（包 括口服给药）。
[0169]所配制的包含稳定束缚结构的组合物可用于静脉内给药，通过例如快速注射或连续输注。注射用组合物可呈单位剂型， 例如装在安瓿中，或者装在多剂量容器中并添加防腐剂。组合物也 可采用在油或含水溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可
含有配方剂（formulatory agent),例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。 或者，組合物可呈粉剂形式，用于在使用前用合适溶媒(例如无菌无 热原水)配制。
含有配方剂（formulatory agent),例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。 或者，組合物可呈粉剂形式，用于在使用前用合适溶媒(例如无菌无 热原水)配制。
[0170]组合物可以溶液剂形式给予。溶液剂的pH应该在pH 5-9.5范围内，优选在pH 6.5-7.5范围内。其制剂应该在具有合适药学 上可接受的緩冲剂的溶液中，所述緩冲剂例如磷酸盐、三(羟甲基)氨 基曱烷-HCl或柠檬酸盐等。緩冲剂浓度应当在1-100 mM范围内。 所配制的溶液也可含盐，例如氯化钠或氯化钾，浓度为50-150 mM。 也可包含有效量的稳定剂，例如甘油、白蛋白、球蛋白、去垢剂、 明胶、鱼精蛋白或鱼精蛋白的盐。所配制的组合物的系统给药通常 为每2-3天一次，或每周一次，如果采用抗体人源化形式作为稳定束 绰结构的模板的话。或者，可采用每日给药。通常给药是通过肌内 注射或血管内输注。
[0171]可通过哺乳动物皮下或其它胃肠外途径给予组合物。此 外，可通过连续输注或者单次或多次快速推注方式给药。可用于抗免疫缀合物、融合蛋白或棵抗体的人用剂量将取决于以下因素：患 者年龄、体重、身高、性别、基本身体状况和先前的医疗史。通常 最好给予受体的活性成分剂量的范围约为1 mg/kg-20 mg/kg (单次静 脉内输注），尽管视情况而定，也可给予更低或更高剂量。按照需要， 该剂量可重复，例如每周一次、共4-10周，优选每周一次、共8周，更优选每周一次、共4周。也可给予更少次数，例如每两周一次、 共数月。可通过不同的胃肠外途径给药，并适当调整剂量和时间表。
[017 2 ]用于控制免疫缀合物或抗体的作用持续时间的药学方 法，适用于所配制的本文所述的组合物。可通过使用生物相容的聚 合物以络合或吸收免疫缀合物或棵抗体，达到控释制剂，所述聚合 物例如乙烯醋酸乙烯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共
聚物基质。参见Sherwood等，Bio/丁echnology (1992), 10: 1446。免疫 缀合物或抗体从这类基质中释放的速率取决于免疫缀合物或抗体的 分子量、免疫缀合物的数量、基质内的抗体和分散颗粒的大小。参 见Saltzman等，Bi叩hys. J (1989), 55: 163; Sherwood等,出处同上。 其它固体剂型参见Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea & Febiger 1990),和 Gennaro (主编），REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第 18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订片反。
[017 2 ]用于控制免疫缀合物或抗体的作用持续时间的药学方 法，适用于所配制的本文所述的组合物。可通过使用生物相容的聚 合物以络合或吸收免疫缀合物或棵抗体，达到控释制剂，所述聚合 物例如乙烯醋酸乙烯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共
聚物基质。参见Sherwood等，Bio/丁echnology (1992), 10: 1446。免疫 缀合物或抗体从这类基质中释放的速率取决于免疫缀合物或抗体的 分子量、免疫缀合物的数量、基质内的抗体和分散颗粒的大小。参 见Saltzman等，Bi叩hys. J (1989), 55: 163; Sherwood等,出处同上。 其它固体剂型参见Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea & Febiger 1990),和 Gennaro (主编），REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第 18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订片反。
[0173]为了治疗目的，将组合物以治疗有效量给予哺乳动物。 适于本文所公开的治疗和诊断方法的患者通常是人患者，尽管也包 括非人类动物患者。
[0174]本文所公开的稳定束縛结构在治疗自身免疫病的方法中 是特别有用的，公开于待审的美国专利申请顺序号09/590,284 (2000 年6月9日申i青，发明名称为"Immunotherapy of Autoimmune Disorders using Antibodies that Target B-Cells"，所述文献通过引用全部结合到 本文中。含有所述结合结构的组合物优选经"^争脉内或肌内给予，剂 量为20-5000 mg。也可经鼻内或其它非胃肠外途径给予。也可通过 微球体、脂质体或放置在特定组织（包括血液）中的其它4敬粒 (microparticulate)给药系统给予组合物。
[0175]可通过气溶胶给予组合物，以达到肺局部给予。可使用 含水气溶胶或非水(例如氟代烃抛射剂）混悬剂。超声喷雾器优选用于 制备气溶胶，以尽量减少暴露组合物中的稳定束缚结构，从而降低剪切力，该剪切力能导致降解和活性损失。
[0176] —般而言，给药剂量将取决于诸如以下的因素：患者年 龄、体重、身高、性别、基本身体状况和先前的医疗史。优选将稳 定束缚结构的饱和剂量给予患者。
[0177]通常最好给予受体剂量的范围约为50-500毫克的稳定束 缚结构，尽管视情况而定，也可给予更低或更高剂量。剂量实例包 括20-1500毫克蛋白/剂，20-500毫克蛋白/剂，20-100毫克蛋白/剂， 20-1000毫克蛋白/剂，100-1500毫克蛋白/剂。在组合物包含放射性 核素的实施方案中，剂量可用毫居里(milUcumes)度量。就9°Y而论， 剂量可介于15-40mCi、 10-30mCi、 20-30 mCi或10-20 mCi之间。
[0178]与放射性核素连接的稳定束缚结构对微生物治疗特别有 效。当已测定到稳定束缚结构定位在患者体内的 一个或多个感染部 位之后，注射更高剂量的标记组合物，通常为20 mC1-l50 mCi/剂(对 于1311)， 5mCi-30mCi/剂(对于卯Y),或5 mCi-20 mCi/剂(对于賜Re), 都以70kg患者体重计。注射可以是静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘 内或腔内（即胃肠外)并可重复。对于某些治疗来说，最好给予多次、 分次剂量，从而提供更高的微生物毒性剂量，而对正常組织的辐射 方面通常不引起比例增加。
[0179]可在给予组合物之前、期间或之后，给予未与稳定束缚 结构化学连接的如下药物：化疗药、抗微生物药、细胞因子、粒细 胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素、血小板生成素等。或者，这些药物可与稳定 束缚结构连接。
[0180] a2b形式的稳定束縛结构是特别合适的预靶向剂。示例性 结构由两个scFv或Fab亚基(a。和一个scFv或Fab亚基(b)组成，其 中32双价结合靶组织或细胞，而b结合半抗原。对于治疗方法，先 将这种双特异性三价结构给予患者，任选再给予清除剂，最后给予 诊断试剂或治疗药，所述诊断试剂中半抗原与功能性试剂（例如可一企测标记)结合。技术人员将会知道，使用稳定束缚结构，也可采用双 特异性抗体的其它已知方法。这些诊断和治疗方法可用于几乎任何 情况下，其中已经使用基于抗体的药剂进行诊断或治疗。治疗和诊断用途：不包括预耙向的应用
[0181]稳定束缚结构（包括其缀合物)适用于采用抗体或免疫缀 合物的各种治疗和诊断用途，不需要预耙向。例如，三价结构可作 为"棵"构建体用于治疗，即在所述结构未与额外功能性试剂缀合 的实施方案中，以与使用棵抗体相同的方式进行治疗。或者，稳定 束縛结构可用 一 种或多种功能性试剂衍生，以便用于诊断或治疗用 途。额外试剂可与如上所述的稳定束绰结构共价连接。
[0182]也包括使用放射性和非放射性诊断试剂，所述试剂与稳 定束缚结构连接。合适的非放射性诊断试剂是那些用于磁共振成像 (MRI)、计算机断层扫描(CT)或超声的试剂。MRI试剂包括例如非放 射性金属(例如例如锰、铁和钆），它们可与合适的螯合物(例如2-千 基-DTPA及其一曱基和环己基类似物)络合。参见美国专利申请顺序 号09/921,290 (2001年10月10日申请），所述专利通过引用全部结合 到本文中。
[0183]稳定束縛结构可由用于诊断造影的放射性同位素进行标 记。合适的放射性同位素可包括能量范围为60-4,000 keV的同位素， 或更具体地讲，包括18F、 52Fe、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 86Y、 89Zj 94mTe 94Tc 99mTc 45rpi mIn i23I 】24I i25I U1I i54_158Gd mLu、 32P、 188Re等或其组合。参见例如美国专利申请，发明名称为 "Labeling Targeting Agents with Gallium-68"陽发明人为G. L. Griffiths 和WJ. McBride,以及美国临时申请第60/342,104号，其中/>开了正 电子发射体，例如18F、 6SGa、 94mTc等，用于造影目的；所述文献通 过引用全部结合到本文中）。可以通过例如单光子发射计算机断层扫 描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)进行检测。其应用也可用于手术中诊断，以鉴定隐蔽的肺瘤。
[0184]在另一实施方案中，稳定束缚结构可以用一种或多种放 射性同位素进行标记，用于杀伤胂瘤或其它快速分裂的细胞，所述 同位素包括(3-发射体(例如32p、 33P、 47Sc、 67Cu、 67Ga、 89Sr、 90Y、 mAg、 125I、 131I、 142Pr、 153Sm、 161Tb、 166Ho、 166Dy、 177Lu、 186Re、環Re、 189Re)， 俄歇电子发射体(例如mIn、 125I、 67Ga、 1910s、 193mPt、 195mPt、 195mHg)， a-发射体(例如2"Pb、 212Bi、 213Bi、 211At、 223Ra、 ^Ac)或其组合。
[0185]稳定束缚结构可用于MRI,即通过与一种或多种造影增 强剂连接，所述增强剂可包括选自以下金属的络合物：铬(III)、锰(II)、铁(in)、铁(n)、钴(ii)、镍(n)、铜(n)、钕(m)、衫(ni)、镱(ni)、钆(ni)、 钒(ii)、铽(ni)、镝(m)、钬(m)和铒(in)。同样，稳定束绰结构可用 于超声成像，即通过与目前市场上销售的一种或多种造影增强剂连
接。美国专利第6,331,175号描述了 MRI技术以及与MRI增强剂缀 合的抗体制剂，所述专利通过引用全部结合到本文中。
接。美国专利第6,331,175号描述了 MRI技术以及与MRI增强剂缀 合的抗体制剂，所述专利通过引用全部结合到本文中。
[0186]功能性蛋白质（例如毒素）可以几种方式存在于稳定束缚结构中。例如，功能性蛋白质可作为二元复合物组分的前体，即通 过与DDD2或AD2融合，然后将其与耙向实体(分别由例如Fab/AD2 或Fab/DDD2组成)结合。或者，功能性蛋白质可以与耙向结构融合， 作为A的前体，而且所得A任选与合适的B配对。可用于该目的的 毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA 酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、 白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。（参见例如Pastan.等, Cell (1986)， 47:641,以及Goldenberg, CA-A Cancer Journal for Clinicians (1994), 44:43。适用于本文的额外毒素是本领域技术人员已 知的，公开于U.S. 6,077,499，所述专利通过引用全部结合到本文中。 其它功能性目标蛋白包括各种细胞因子、溶血栓剂、酶和焚光蛋白 质。[0187]也提供治疗患者胂瘤的方法，即通过给予患者如上所述 的"棵"稳定束缚结合结构，其中至少一个抗原结合位点与选自以
下的抗原结合：碳酸肝酶IX、曱胎蛋白、A3、 A33抗体特异性抗原、 Ba 733、 BrE3-抗原、CA125、癌胚抗原(CEACAM5)、 CEACAM6、 CD1、 CDla、 CD3、 CD5、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD30、 CD33、 CD38、 CD45、 CD74、 CD79a、 CD80、 CD138、结肠特异性抗原-p (CSAp)、 EGFR、 EGP-1、 EGP-2、 Flt画l、 Flt-3、叶酸受体、HER2/neu、 HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素、Ia、 IL-2、 IL-6、 IL-8、胰岛素样生长因子、KC4-抗原、KS-1、 KSl-4、 Le(y)、 巨噬细胞-抑制因子(MIF)、 MAGE、 MUC1、 MUC2、 MUC3、 MUC4、 NCA66、 NCA95、 NCA90、坏死抗原、p53结合抗原、PAM-4抗体、 胎盘生长因子、前列腺酸性磷酸酶、PSA、 PSMA、 RS5、 SIOO、 TlOl、 TAC、 TAG-72、 Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗 原、生腱蛋白、TRAIL受体、ED-B纤连蛋白、VEGF、 17-lA-抗原、 血管生成标记、癌基因标记或癌基因产物。针对TRAIL受体(例如 TRAIL-R1和TRAIL-R2)的抗体是本领域众所周知的。（参见例如 Georgakis等，Br. J. Haematol. 2005, 130:501-510; Mori等，FEBS Lett. 2005, 579:5379-84)。这类抗体或片段可单独使用或与抗TAA抗体联 用，用于癌症治疗。
下的抗原结合：碳酸肝酶IX、曱胎蛋白、A3、 A33抗体特异性抗原、 Ba 733、 BrE3-抗原、CA125、癌胚抗原(CEACAM5)、 CEACAM6、 CD1、 CDla、 CD3、 CD5、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD30、 CD33、 CD38、 CD45、 CD74、 CD79a、 CD80、 CD138、结肠特异性抗原-p (CSAp)、 EGFR、 EGP-1、 EGP-2、 Flt画l、 Flt-3、叶酸受体、HER2/neu、 HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素、Ia、 IL-2、 IL-6、 IL-8、胰岛素样生长因子、KC4-抗原、KS-1、 KSl-4、 Le(y)、 巨噬细胞-抑制因子(MIF)、 MAGE、 MUC1、 MUC2、 MUC3、 MUC4、 NCA66、 NCA95、 NCA90、坏死抗原、p53结合抗原、PAM-4抗体、 胎盘生长因子、前列腺酸性磷酸酶、PSA、 PSMA、 RS5、 SIOO、 TlOl、 TAC、 TAG-72、 Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗 原、生腱蛋白、TRAIL受体、ED-B纤连蛋白、VEGF、 17-lA-抗原、 血管生成标记、癌基因标记或癌基因产物。针对TRAIL受体(例如 TRAIL-R1和TRAIL-R2)的抗体是本领域众所周知的。（参见例如 Georgakis等，Br. J. Haematol. 2005, 130:501-510; Mori等，FEBS Lett. 2005, 579:5379-84)。这类抗体或片段可单独使用或与抗TAA抗体联 用，用于癌症治疗。
[0188]瘤性疾病可选自癌症、肉瘤、胶质瘤、淋巴瘤、白血病 和黑素瘤。可靶向的示例性肿瘤类型包括急性成淋巴细胞性白血病、 急性髓细胞性白血病、胆嚢癌、乳癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白 血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、 胃癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、曱状腺髓质癌（medullary thyroid)、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、黑素瘤、肝 癌、前列腺癌和膀胱癌。
[0189]也提供治疗患者的B细胞恶性肺瘤或B细胞免疫病或自 身免疫病的方法，即通过给予患者一个或多个剂量的含有如上所述的稳定束缚结合结构和药学上可接受的载体的治疗性组合物，所述稳定束缚结合结构中各抗原结合位点与CD19、 CD20、 CD22或IL-17
的不同表位结合。可经胃肠外给予治疗性组合物，剂量为20-1500毫
克蛋白/剂，或20-500毫克蛋白/剂，或20-100毫克蛋白/剂。患者可
重复接受胃肠外给予的20-100毫克蛋白/剂，或重复接受胃肠外给予
的20-1500毫克蛋白/剂。在这些方法中，结合结构部分可用放射性
同位素标记，例如"P、 33P、 47Sc、 67Cu、 67Ga、 90Y、 mAg、 mIn、 125I、
131I、 142Pr、 153Sm、 161Tb、 I66Dy、 166Ho、 177Lu、 186Re、 188Re、 ls9Re、 212Pb、
212Bi、 213Bi、 211At、 223Ra和225Ac或其组合。
的不同表位结合。可经胃肠外给予治疗性组合物，剂量为20-1500毫
克蛋白/剂，或20-500毫克蛋白/剂，或20-100毫克蛋白/剂。患者可
重复接受胃肠外给予的20-100毫克蛋白/剂，或重复接受胃肠外给予
的20-1500毫克蛋白/剂。在这些方法中，结合结构部分可用放射性
同位素标记，例如"P、 33P、 47Sc、 67Cu、 67Ga、 90Y、 mAg、 mIn、 125I、
131I、 142Pr、 153Sm、 161Tb、 I66Dy、 166Ho、 177Lu、 186Re、 188Re、 ls9Re、 212Pb、
212Bi、 213Bi、 211At、 223Ra和225Ac或其组合。
[0190]也提供检测或诊断患者的B细胞恶性胂瘤或B细胞免疫病或自身免疫病的方法，即通过给予患者含有稳定束缚结合结构、 药学上可接受的载体和放射性核素的诊断用组合物，所述稳定束缚
结合结构中各抗原结合位点与CD19、 CD20、 CD22或IL-17的不同 表位结合；所述放射性核素选自18F、 52Fe、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga 86Y 89Zr 94mTc 94Tc ""Tc U1ln 123I 124I 125I、 131I、 154-158Gd、 177Lu、 32P、 45Ti和188Re或其组合。如上所述的SPECT或PET可进 行检测。其应用也可用于手术中诊断，以鉴定隐蔽的肿瘤。
结合结构中各抗原结合位点与CD19、 CD20、 CD22或IL-17的不同 表位结合；所述放射性核素选自18F、 52Fe、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga 86Y 89Zr 94mTc 94Tc ""Tc U1ln 123I 124I 125I、 131I、 154-158Gd、 177Lu、 32P、 45Ti和188Re或其组合。如上所述的SPECT或PET可进 行检测。其应用也可用于手术中诊断，以鉴定隐蔽的肿瘤。
[0191]也提供检测或诊断患者的B细胞恶性肿瘤或B细胞免疫病或自身免疫病的方法，即通过给予患者含有稳定束缚结合结构、 药学上可接受的载体和 一 种或多种造影增强剂的诊断用組合物，所
述稳定束缚结合结构中各抗原结合位点与CD 19 、 CDM 、 CD22或IL-17 的不同表位结合；所述造影增强剂用于磁共振成像(MRI)。造影增强 剂可选自上述造影增强剂。
述稳定束缚结合结构中各抗原结合位点与CD 19 、 CDM 、 CD22或IL-17 的不同表位结合；所述造影增强剂用于磁共振成像(MRI)。造影增强 剂可选自上述造影增强剂。
[0192]也提供诊断和/或治疗患者的非瘤性疾病或障碍的方法， 即通过给予患病的患者稳定束绰结合结构，其中连接可检测标记或 治疗药；并且一种或多种抗原结合位点对疾病的标记物具有特异性。 疾病或障碍可由真菌或病毒所引起，所述真菌例如小孢子菌属 (A//croj/7on/w)、 发辨菌属(7Wc/20/7/?_yto")、 表皮裤菌属(五/?i(sferw(9/7/2;Ko")、 申克孑包子丝菌0S^oraf/?nx sc/]ewcA:/z')、新型隐3求菌 (Oy/^ococcwi1 "eq/bw/朋力、粗球孑包子菌(Cocc/^o/c^ /w脂.to)、 荚月荚 组织月包浆菌(//"fo;?Zasma ca尸sw/afwm)、 皮炎芽生菌(别aWomyces derma"YW力和白色念珠菌(Ca"力(ia a/6z'c朋)；所述病毒例如人免疫击夫 陷病毒(HIV)、疱渗病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳 头瘤病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、 脊髓灰质炎病毒、人血清细小病毒样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合 胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘带状疱瘆病毒、登革热病毒、风 渗病毒、麻渗病毒、^泉病毒、人T细月包白血病病毒、Epstein-Barr病 毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、疱渗性口腔炎病毒、辛德比斯病 毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒和蓝舌病毒。
[0193]疾病或障碍可由细菌所引起，所述细菌例如炭疽芽孢杆 菌(5acz7/w5 a/if/7rac75)、 无孝lj链3求菌(5^eptococcw51 aga/art/ore)、 p省月申军 团菌(Leg70/ie〃fl /wewmop/?z7/a)、 酉良脓葡萄3求菌(5^e;?tococci/51 、大肠杆菌(Es"c/?m'c/2/a co//)、 淋病奈瑟氏球菌(A^逗n'a go"o"/2oeae)、月卤月荑炎奈瑟氏球菌(7Vezhena wem'"gz'"cfo)、 肺炎3求菌 (尸wew/wococcMS s户p.)、';虎感p者血详干菌B (//ewop/?z7,5" z>?//we«zae B)、 苍 白密虫累S走体(7>e/w"ewa /?a〃Www)、 莱姆病螺j走体(Lyme disease spirochetes)、纟录脓々支单月包菌(7^ewdo附o"(ZS1 aerwg/"osa)、麻风分牙支坤干菌 (A^ycoZ?(3"e厂/wm /e/?rae)、 流产布鲁氏杆菌(Brace〃a a6ortz^)和结核分 枝杆菌(A^yco6ac&n'ww fw6ercw/os7'力或支原体(A^yco/?/asma)。 疾病或障 碍可由寄生虫所引起，例如疟疾。
[0194]疾病或障碍可以是自身免疫性疾病，例如急性特发性血 小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、小舞蹈 病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多&，性 综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链3求菌感染后 的肾炎、结节性红斑、无脉病、艾迪生病、类风湿性关节炎、多发 性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、关节强硬性脊推炎、肺出血肾炎综合征、闭塞性血栓性脉 管炎、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本曱状腺炎、甲 状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、 寻常性天疱疮、韦格纳肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、 脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球性肾炎、 银屑病和纤维性肺泡炎。
[0195]疾病或障碍可以是心肌梗塞、缺血性心脏病、或动脉粥 样硬化斑块、或移植排斥、或阿尔茨海默病，或者是由特应性组织 所引起的。疾病或障碍可以是因活化粒细胞、单核细胞、淋巴样细 胞或巨噬细胞在炎症部位增多所引起的炎症，并且炎症是由感染性 因子所引起。
[0196]另外，使用稳定束绰结构，可以耙向表达特定受体或过 量表达受体的细胞，所述稳定束缚结构中A或B组分含有所述受体 的配体，所述受体指导该结构与带有受体的细胞结合。治疗药或诊 断试剂可以与该结构的 一个或多个亚基融合或缀合，以利于诊断和 治疗方法。治疗和诊断用途：包括预靶向的应用
[0197]预耙向是一种多步骤方法，起初是为解决直接靶向抗体 在血中緩慢清除而开发的，后者对正常组织(特别是骨髓)具有不想要 的毒性。有了预靶向，就可将放射性核素或其它治疗药与小的化合 物连接，这样在数分钟内即可从血中清除掉。首先给予除能识别靶 抗原之外、还能识别小的放射性标记化合物的预輩巴向剂，稍后当预 把向剂从血中充分清除时，再给予放射性标记化合物。
[0198]已经开发了预粑向方法，以增加检测试剂或治疗药的耙: 背景的比率。预靶向和生物素/抗生物素蛋白方法的实例参见例如 Goodwin等，美国专利第4,863,713号；Goodwin等，J. Nucl. Med. 29.226, 1988; Hnatowich等,J. Nucl. Med. 28:1294, 1987; Oehr等,J.Nucl. Med. 29:728, 1988; Klibanov等,J. Nucl. Med. 29:1951, 1988; Sinitsyn等，J. Nucl. Med. 30:66, 1989; Kalofonos等，J. Nucl. Med. 31:1791, 1990; Schechter等，Int. J. Cancer 48:167, 1991; Pag認lli等， Cancer Res. 51:5960, 1991; Paganelli等，Nucl. Med. Commun. 12:211, 簡;美国专利第5,256，395号；Stickney等，Cancer Res. 51:6650, 1991; Yuan等，Cancer Res. 51:3119, 1991;美国专利第6,077,499号； 美国专利申请顺序号09/597,580;美国专利申请顺序号10/361,026; 美国专利申请顺序号09/337,756;美国专利申请顺序号09/823,746; 美国专利申请顺序号10/116,116;美国专利申请顺序号09/382,186; 美国专利申请顺序号10/150,654;美国专利第6,090,381号；美国专 利第6,472，511号；美国专利申请顺序号10/114,315;美国临时申请 第60/386,411;美国临时申请第60/345,641号；美国临时申请第 60/3328,835号；美国临时申请第60/426,379;美国专利申请顺序号 09/823,746;美国专利申请顺序号09/337,756 ;美国临时申请第 60/342,103号；和美国专利第6,962,702号，所有这些文献都通过引用结合到本文中。
[0199]在一个具体的非限制性实例中，基于稳定束绰结构的预 靶向剂含有两个相同肿瘤抗原结合位点(其对CEA具有特异性)和第 三个结合位点(其对半抗原、组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)具有特异性)。 在替代实施方案中，可以用相同或不同半抗原靶向不同肿瘤相关抗 原。
[0200]对于预把向的应用，可寻耙试剂（taretable agent)可以是脂 质体，其带有与脂质体脂质膜外表面共价连接的双价HSG-肽。脂质 体可以充满气体。
[0201]如下提供治疗或诊断患者的疾病或障碍的预輩巴向方法：（l) 给予患者如上所述的双特异性三价结合结构，其中两个二聚体抗原 结合位点指向对疾病具有特异性的一个或多个标记物，而其它抗原 结合位点涉及含有双价半抗原的可寻靶构建体；（2)任选给予患者清除用组合物，让该组合物从循环中清除结合结构；和(3)给予患者含有双价半抗原的可寻靶构建体，其中可寻靶构建体还含有一种或多 种螯合或化学结合的治疗药或诊断试剂。疾病或障碍如上所迷。
[0202]如下还提供抗体依赖型酶前体药物治疗(ADEPT)方法：（1) 给予患有肿瘤的患者上述结合结构，其中该结构含有能够活化前体 药物的共价连接的酶，（2)任选给予患者清除用组合物，让该組合物 从循环中清除结合结构，和(3 )将前体药物给予患者。其它用途
[0203] —般而言，稳定束缚结构可替代基于抗体的药物，所述 药物已经显示有用于治疗癌症或非癌症疾病的功效。众所周知，放 射性同位素、药物和毒素可与抗体或抗体片段缀合，这些抗体或抗 体片段能特异性结合癌细胞产生的或与癌细胞相关的标记物，而且 这类抗体缀合物可用于将放射性同位素、药物或毒素靶向肿瘤部位， 以增强其疗效并减少副作用。有关这些药物和方法实例的综述参见 Wawrzynczak禾口 Thorpe (载于Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer, L. M. Franks和N. M. Teich主编，第18章，第378-410页，Oxford University Press. Oxford, 1986)，载于Immunoconjugates.Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer (C. W. Vogel主编，3-300, Oxford University Press， N. Y., 1987)和载于Dillman,
R. O. (CRC Critical Reviews m Oncology/Hematology 1:357, CRC Press, Inc., 1984)。另见Pastan等，Cell (1986), 47:641; Vitetta等,Science (1987):
238:1098-1104;和Brady等，Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. (1987),
13:1535-1544。
R. O. (CRC Critical Reviews m Oncology/Hematology 1:357, CRC Press, Inc., 1984)。另见Pastan等，Cell (1986), 47:641; Vitetta等,Science (1987):
238:1098-1104;和Brady等，Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. (1987),
13:1535-1544。
[0204]在某些实施方案中，多价稳定束縛结构可用于正常或患 病组织和器官的治疗和/或造影，例如采用参见以下文献的方法：美 国专利号6,126,916、 6,077,499、 6,010,680、 5，776,095、 5,776,094、 5,776,093、 5,772,981、 5,753,206、 5,746,996、 5,697,902、 5,328,679、5，128,119、 5,101,827和4,735,210,所述各专利通过引用结合到本文 中。另外的方法参见美国专利申请顺序号09/337,756 (1999年6月申 请)和美国专利申请顺序号09/823,746 (2001年4月3日申请)。通过 直接标记稳定束绰结构或通过预靶向造影方法，可以进行这样的造 影,参见Goldenberg等，"Antibody Pretargeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radiotherapy" G寺发表，J. Clin. Oncol.), 另 见美国专利乂>布号20050002945、 20040018557、 20030148409和 20050014207,所述各文献通过引用结合到本文中。
[0205]在以下美国专利中已经公开了免疫缀合物在癌症和其它 形式疗法中的用途：4,331,647、 4,348,376、 4,361,544、 4,468,457、 4，444,744、 4,460,459、 4,460,561、 4,624,846、 4,818,709、 4,046,722、 4,671,958、 4,046,784、 5,332,567、 5,443,953、 5,541，297、 5,601,825、 5,635,603、 5,637,288、 5,677,427、 5,686,578、 5,698,178、 5,789,554、 5,922,302、 6,187,287和6,319,500。这些方法也可用于本文所公开的 方法，即通过用本发明的稳定束缚结构替代先前方法中的基因工程 抗体。
[0206]在某些实施方案中，本文公开并要求保护的稳定束绰结 构可用于放射性核素治疗或放免治疗方法（参见例如Govmdan等， 2005, Technology in Cancer Research & Treatment, 4:375-91; Sharkey 和Goldenberg, 2005, J. Nucl. Med. 46:115S-127S; Goldenberg等(待发 表,J. Clin. Oncol.), " Antibody Pretargeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy",戶斤述各文南史通过引用结合到本文中）。
[0207]在另一个实施方案中，可将辐射敏化剂与棵的或缀合的 稳定束缚结构、抗体或抗体片段联用。例如，可将辐射敏化剂与放 射性标记的稳定束缚结构联用。与单用放射性标记的稳定束绰结构 进行治疗相比，添加辐射敏化剂可导致功效增强。辐射敏化剂参见 D. M. Goldenberg (主编），CANCER THERAPY WITHRADIOLABELED ANTIBOD正S， CRC Press (1995)，所述文献通过引 用全部结合到本文中。
[0208]用于任何要求保护的方法的稳定束绰结构可与抗微生物 药结合或一起给予。和免疫调节剂结合或 一起给予。这些细胞因子和免疫调节剂至少包 括干扰素-a、 -P和-"f以及集落刺激因子。
应答。在一个实施方案中，稳定束缚结构可包含抗独特型抗体的抗 原结合位点(ABS)。这类稳定束缚结构可模拟胂瘤相关抗原表位，以 增强机体的免疫应答。
应答。在一个实施方案中，稳定束缚结构可包含抗独特型抗体的抗 原结合位点(ABS)。这类稳定束缚结构可模拟胂瘤相关抗原表位，以 增强机体的免疫应答。
[0211]稳定束缚结构可用于目前使用抗体的许多免疫学方法。 这些方法包括使用抗独特型抗体和与抗体缀合的表位，以增强免疫 系统。参见美国专利5,798,100、 6,090,381和6,132,718。抗独特型抗 体也用作针对癌症和感染性疾病的疫苗。参见美国专利6,440,416和 6,472，511。此外，多特异性三聚体结合结构可结合多药转运蛋白并 征服细胞和病原体的多重药物抗性表型。这些方法中的抗体可用本 文所公开的稳定束绰结构来替代。
[0212]不同实施方案涉及治疗自身免疫病症状的方法。在该方 法中，将稳定束缚结构给予自身免疫病患者，所述结构在给药前可 与药学上可接受的载体混合。该方法中的稳定束縛结构应含有对B 细胞或T细胞的抗原表位具有结合特异性的至少一个ABS。 B细胞 抗原可以是CD22,而表位可以是CD22等的表位A、表位B、表位 C、表位D和表位E。 B细胞相关抗原也可以是另一细月包抗原，例如 CD19、 CD20、 HLA-DR和CD74。 T细胞抗原可包括CD25。在某些实施方案中，可选择用于治疗自身免疫性疾病的稳定束缚结构，以 结合IL-17。[0213] ABS可含有近似人类的灵长类、鼠单克隆抗体、嵌合抗
体、人源化抗体或人类来源的序列。例如，ABS可以来源于人源化 LL2 (抗CD22)、人源化LL1 (抗CD74)或A20 (抗CD20)单克隆抗体。
体、人源化抗体或人类来源的序列。例如，ABS可以来源于人源化 LL2 (抗CD22)、人源化LL1 (抗CD74)或A20 (抗CD20)单克隆抗体。
[0214]可经胃肠外给予20-2000 mg/剂。可重复给药，直至达到 症状减轻的程度。[021习可以用要求保护的方法治疗的患者包括任何动物，包括 人类。优选的动物是哺乳动物，例如人、灵长类、马、犬和猫。
[0216]稳定束缚结构可用于治疗对系统化学治疗具有抗性或难 治性的疾病。这些疾病包括各种病毒感染、真菌感染、细菌感染和 原生动物感染、特别是寄生虫感染。病毒感染包括以下病毒所引起 的感染：流感病毒、疱渗病毒、Epstein-Barr病毒和巨细月包病毒、狂 犬病毒（弹状病毒科(尺/^Z^oWmtoe》、乳头瘤病毒和乳多空病毒，所 有这些感染都难以用系统抗生素/细胞毒剂治疗。采用多价结合结构 可提供对靶病毒的更高亲合力，导致显著增加的治疗指数。采用具结构的缀合物进行靶向放免治疗，为抗病毒治疗提供了新方法。
[0217]可用本发明所述方法治疗的原生动物包括例如痴原虫（尤 其是恶性疟原虫（尸/wmo力ww /a/cz/wn/m)，疟疾寄生虫）、鼠弓形体 (roxop/os"wa go"dz7, 弓开j体病感染因子)、矛M十曼原虫(丄e^/2mam'ae, 利什曼病感染因子)和Escherichia histolytica。在疟疾不同时相中,使 用稳定束缚结构可显著增强对疟疾的检测和治疗。能结合子孢子抗 原的单克隆抗体(mAb)是已知的。然而，因为子孢子抗原并非血内寄 生虫（blood stage parasite)所共有，所以使用针对子孢子抗原的这类 mAb来寻靶，仅局限在相对短时间内，在此时间内子孢子游离于循 环中，这只是在刚注射后和在宿主肝细胞内发育之前。因此，优选 使用靶向原生动物(例如恶性疟原虫）的不止一种寄生时相的mAb混 合物，可以用具有多特异性的 一种或多种稳定束缚结构来达到该目 的。使用缀合物可为造影(例如用""Tc)或治疗(例如用川At或其它抗疟药，例如乙胺嘧啶)提供更多优势。
[0218]弓形体病也对系统化学治疗具有抗性。尚不清楚，能特异性结合鼠弓形体的mAb或天然宿主抗体是否在针对弓形体病的免 疫应答中起作用，但是在疟原虫的情况下，合适的靶向稳定束缚结 构是递送治疗药的有效载体。
[0219]血吸虫病是广泛流行的蠕虫感染，它是由某些淡水螺所 携带的自由泳动的尾蚴而引发的疾病。与症疾的情况类似，在感染 过程中也存在不同时相的尾蝴。可以将能结合多个时相的尾姆、任 选结合在一种或多种尾蚴的表位上、优选呈多特异性组成形式的稳 定束縛结构，与造影剂或治疗药缀合，用于有效寻耙并增加疗效。
[0220]可以制备与 一 种或多种形式的克氏4,虫（7>_y/7a"o^wa cn^'),恰加斯病(Chagas' disease)的病原体)结合的稳定束缚结构，用 于检测和治疗该类纟敛生物感染。与不同时相锥虫的细胞表面糖蛋白 或其它表面抗原反应的稳定束缚结构，适用于将造影剂和治疗药靶 向体内寄生虫浸润部位。
[0221]用合适药物治疗的另一非常难治的传染性生物体就是麻 风杆菌(麻风分枝杆菌(A^yco6ac化m/m /e/?rae))。可以制备能特异性结 合麻风分枝杆菌表面多个表位的稳定束绰结构，单独或联合用于将 造影剂和/或抗生素/细胞毒剂靶向该杆菌。
[0222]用化疗药相当难治的肠道寄生虫感染（例如类圆线虫病 (Strongyloidosis)和旋毛虫病（Trichinosis》，是稳定束缚结构的合适革巴 标。通过能特异性结合寄生虫的一个、或优选多个表位的合适稳定 束縛结构或缀合物，可以进行对它们的诊断和治疗。
[0223]可以使用、或者可以容易地产生这样的抗体：所述抗体 能特异性结合引起大部分人类感染的大多数微生物和寄生虫。它们 许多先前已经用于体外诊断目的，可以掺入到稳定束绰结构中作为 抗体缀合物组分，以将i貪断试剂和治疗药耙向感染部位。人和哺乳 动物的微生物病原体和无脊推动物寄生虫是具有复杂生命周期的生物，在其不同时相表达多种抗原。因此，当制备能识别不同形式上 的抗原决定簇的稳定束缚结构(连接有合适的治疗药）、并以混合物或 多特异性缀合物形式联用时，最好进行耙向治疗。同样的原理也适 用于使用包含用于测定感染部位的稳定束缚结构的试剂，即通过连 接造影剂(例如放射性核素)和/或MRI增强剂。
[0224]其它实施方案涉及手术中鉴定患病组织的方法，即通过 给予有效量的稳定束绰结构和可寻靶构建体，其中该稳定束绰结构 包含能特异性结合靶组织的至少一个抗原结合位点以及能特异性结 合可寻靶构建体的至少 一个其它抗原结合位点；并且所述至少 一个 抗原结合位点能结合靶细胞、组织或病原体上的互补结合部分，或 者能结合由这些靶细胞、组织或病原体产生的或与它们締合的分子 上的互补结合部分。
[0225]又一些实施方案涉及用于内窥镜检查患者的患病组织的 方法，即通过给予有效量的稳定束缚结构并给予可寻靶构建体。稳 定束缚结构包含能特异性结合靶组织的至少 一 个抗原结合位点以及 能特异性结合可寻靶构建体的至少 一 个抗原结合位点；并且其中至 少一个抗原结合位点显示出能特异性结合靶细胞、组织或病原体上 的互补结合部分，或者能结合由这些靶细胞、组织或病原体产生的 或与它们締合的分子上的互补结合部分。
[0226]检测用途的 一个替代方法是无线的胶嚢内窥镜(capsule endoscopy), 采用可咽下的胶嚢照相才几/检测器(capsule camera/detector),这样的照相才几/检测器是市售的，来自例如Given Imaging (Norcross GA)。某些实施方案涉及用内窥4竟鉴定患者患病组 织的方法，即通过给予有效量的稳定束缚结构并给予可寻耙构建体。 在该实施方案中，稳定束缚结构包含能特异性结合耙组织的至少一 个抗原结合位点以及能特异性结合可寻靶构建体的至少一个抗原结 合位点；并且其中至少 一 个抗原结合位点显示出能特异性结合把细 胞、组织或病原体上的互补结合部分，或者能结合由这些耙细胞、组织或病原体产生的或与它们締合的分子上的互补结合部分。
[0227]替代实施方案涉及血管内鉴定患者患病组织的方法，即通过给予有效量的稳定束缚结构和可寻靶构建体。稳定束缚结构包
含至少一个ABS,所述ABS能特异性结合耙细胞、组织或病原体上 的互补结合部分，或者能特异性结合由这些把细胞、组织或病原体
个ABS，所述ABS能特异性结合可寻耙构建体。耙组织可以是正常 组织，例如甲状腺、肝、心、卵巢、胸腺、曱状旁腺、子宫内膜、 骨髓、淋巴结或脾脏。
含至少一个ABS,所述ABS能特异性结合耙细胞、组织或病原体上 的互补结合部分，或者能特异性结合由这些把细胞、组织或病原体
个ABS，所述ABS能特异性结合可寻耙构建体。耙组织可以是正常 组织，例如甲状腺、肝、心、卵巢、胸腺、曱状旁腺、子宫内膜、 骨髓、淋巴结或脾脏。
[0228]某些实施方案涉及实施要求保护的方法的药盒。药盒可 包含可寻靶构建体。可寻靶构建体可用适于上述可寻靶构建体的任 何试剂进行标记。此外，可寻靶构建体也可不标记，但是药盒可包 含标记用试剂，以标记可寻耙构建体。如果有的话，标记用试剂可 含有标记和交联剂。药盒也可含有稳定束缚结构，其包含对可寻靶 构建体具有特异性的至少一个ABS和对可寻靶组织具有特异性的至 少一个ABS。药盒可任选含有清除用组合物，以从循环中除去稳定 束縛结构。稳定束缚结构的靶标
[0229]涉及稳定束縛结构的耙标的额外公开内容公开于临时美 国专利申请顺序号60/634,076, "Methods and Compositions for Immunotherapy and Detection of Inflammatory and Immune-dysregulatory Disease, Infectious Disease, Pathologic Angiogenesis and Cancer", Goldenberg等(2004年12月9日申请)，所述文献的全部内容都通过引用结合到本文中。
[0230]在某些实施方案中，本文要求保护的稳定束绰结构与两 种不同靶标特异性反应。不同靶标可包括但不限于先天免疫系统的 促炎效应物、凝固因子、补体因子和补体调节蛋白，与炎性障碍或免疫失调障碍、与传染性病原体或与病理性血管生成或癌症特异性 相关的靶标，其中这后一类靶标不是免疫系统的促炎效应物或凝固 因子。因此，在某些实施方案中，稳定束缚结构含有至少一个结合 特异性(其与患病细胞、病理性血管生成或癌症，或传染性疾病相关）以及至少一个特异性[其针对免疫系统组分(例如B细胞、T细胞、嗜 中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞和树突细胞的受体或抗原），或凝 固调节剂（例如凝血酶或组织因子），或促炎细胞因子(例如IL-1、 IL-6、 IL-IO、 HMGB-1和MIF)]。
[0231]当稳定束缚结构包含单个抗体的组合时，不包括这样的 組合：所述组合中的一个组分靶向B细胞抗原，而另一组分靶向T 细胞、浆细胞、巨噬细胞或炎性细胞因子，因为这样的组合能引起 免疫系统功能障碍。
[0232]稳定束縛结构可以是棵露的，也可以与诊断造影剂（例如 同位素、放射性造影剂）缀合，或者与治疗药缀合，所述治疗药包括 放射性核素、硼化合物、免疫调节剂、肽、激素、激素拮抗剂、酶、 寡核苷酸、酶抑制剂、光敏治疗药、细胞毒剂、血管生成抑制剂及 其组合。稳定束绰结构与靶标结合，可以下调或以其它方式影响免 疫细胞功能，但是稳定束缚结构也可结合其它靶标而不直接影响免 疫细胞功能。例如，抗粒细胞抗体，例如针对CD66或CEACAM6(例 如NCA90或NCA95)，可用于靶向受感染组织中的粒细胞，而且也 可用于靶向表达CEACAM6的癌症。
[0233]在一个实施方案中，治疗药是寡核苷酸。例如，寡核苷 酸可以是反义寡核苷酸或双链干扰RNA (RNA/)分子。寡核苷酸可针 对癌基因，例如bcl-2或p53。抑制bcl-2表达的反义分子参见美国专 利第5,734,033号。可将其缀合，或形成稳定束缚结构的治疗药部分。 或者，.寡核苷酸可与稳定束缚结构同时给予或序贯给予。
[0234]在另一个实施方案中，治疗药是硼附加物，并且当治疗 药定位后，治疗需要用热或超热中子辐射。治疗药也可以是光敏治疗药，尤其是发色团或染料。[023习在一个优选的实施方案中，治疗药是细胞毒剂，例如药
物或毒素。也优选选自以下的药物：氮芥类、氮丙啶衍生物、^美酸
烷基酯类、亚硝基脲类、吉西他滨、三氮烯类、叶酸类似物、蒽环
类、紫杉烷类、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、 酶、酶抑制剂、表鬼臼毒素、钼配位络合物、长春花属生物碱、取 代脲、曱基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮生长 抑素、泰素、SN-38、喜树碱、多柔比星及其类似物、抗代谢物、烷 化剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药、细胞凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-ll 及其组合。
物或毒素。也优选选自以下的药物：氮芥类、氮丙啶衍生物、^美酸
烷基酯类、亚硝基脲类、吉西他滨、三氮烯类、叶酸类似物、蒽环
类、紫杉烷类、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、 酶、酶抑制剂、表鬼臼毒素、钼配位络合物、长春花属生物碱、取 代脲、曱基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮生长 抑素、泰素、SN-38、喜树碱、多柔比星及其类似物、抗代谢物、烷 化剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药、细胞凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-ll 及其组合。
[0236]在另一优选实施方案中，治疗药是来自动物、植物和孩史 生物来源的毒素。优选的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、oc毒 素、皂草毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒 素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞 菌外毒素和假单胞菌内毒素。
[0237]治疗药可以是免疫调节剂，例如细胞因子、干细胞生长 因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干 细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素及其组合。所述淋巴 毒素是肿瘤坏死因子(TNF)。造血因子可以是白介素(IL),集落刺激 因子可以是粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺 激因子(GM-CSF)),干扰素可以是干扰素-a、 P或y,干细胞生长因子 可以是S1因子。或者，免疫调节剂可包括IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-6、 IL-IO、 IL-12、 IL-17、 IL-18、 IL-21、干扰素-y、 TNF-a或其组合。
[0238]优选的治疗用放射性核素包括p、 a和俄歇发射体，其keV 范围为80-500 keV。示例性的治疗用放射性同位素包括"P、 33P、 47Sc、 125I、 131I、 86Y、 90Y、 186Re、 188Re、 189Re、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 mIn、川Ag、 142Pr、 153Sm、 161Tb、 166Dy、 166Ho、 177Lu、 198Au、 211At、 212Pb、 212Bi、213Bi、 223Ra和225Ac及其组合。示例性的光敏治疗药选自生色团和染料。
[0239]还优选的治疗药是选自以下的酶：苹果酸脱氢酶、葡萄 球菌核酸酶、S-V-甾体异构酶、酵母醇脱氢酶、a-甘油磷酸脱氬酶、 丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡 萄糖氧化酶、P-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄 糖-6-磷酸脱氬酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆石威酯酶。
[0240]治疗用肽的各种实例是本领域已知的，任何这类已知药 物都可使用。示例性的治疗用肽包括但不限于激素、生长因子、细 胞因子、趋化因子、结合肽、封闭肽(blockmg peptide)、毒素、血管 生成因子、抗血管生成因子、抗生素、抗癌肽、抗病毒肽、药用肽、 酶、激动剂、拮抗剂、造血因子例如红细胞生成素和许多其它临床 用化合物。
[0241]稳定束缚结构可与至少一个促炎效应物细胞因子、促炎 效应物趋化因子或促炎效应物受体特异性结合。稳定束缚结构可结 合的促炎效应物细胞因子包括但不限于MIF、 HMGB-1、 TNF-a (肿 瘤坏死因子a)、 IL-1、 IL画4、 IL-5、 IL-6、 IL-8、 IL-12、 IL-15、 IL-17 和IL-18。促炎效应物趋化因子包括但不限于CCL19、 CCL21、 IL-8、 MCP-1 (单核细胞趋化蛋白1)、 RANTES、 MIP-1A (巨噬细胞炎性蛋 白1A)、 MIP-1B (巨噬细胞炎性蛋白1B)、 ENA-78 (上皮嗜中性粒细 胞活化肽78)、 IP-IO、 GROB (GRO (3)和嗜酸性粒细胞趋化因子。促 炎效应物受体包括但不限于IL-4R、 IL-6R、 IL-13R、 IL-15R、 IL-17R 和IL-18R。稳定束缚结构也可与至少一个凝固因子(例如组织因子或 凝血酶)特异性反应。淋巴因子/细胞因子与免疫细胞上它们的受体反 应，导致活化，而抗体则可通过中和这些淋巴因子/细月包因子而阻断 活化。或者，抗体可以与淋巴因子/细胞因子受体反应而阻断活化。
[0242]稳定束缚结构特异性结合的不同靶标可以是相同或不同类型的效应物和凝固因子。例如，稳定束绰结构特异性结合的两种 或多种不同靶标可以选自同类效应物或凝固因子，例如两种或多种 不同促炎效应物细胞因子、两种或多种不同促炎效应物趋化因子、 两种或多种不同促炎效应物受体、或两种或多种凝固因子。或者， 两种或多种不同輩巴标可以选自不同类型的效应物和凝固因子。例如， 一种靶标可以是先天免疫系统的促炎效应物，另 一种靶标可以是凝 固因子。或者，稳定束缚结构可以与诸如以下的两种不同类型的促 炎效应物特异性反应：至少 一种促炎效应物细胞因子和至少 一种促 炎效应物趋化因子、至少 一种促炎效应物细胞因子和至少 一种促炎 效应物受体、或者至少一种促炎效应物趋化因子和至少一种促炎效应物受体。也可有这种情况：稳定束绰结构特异性反应的两种不同 靶标是先天免疫系统同 一促炎效应物的不止一个表位，或同 一凝固 因子的不止一个表位。
[0243]因此，"两个不同耙标"可指两种不同抗原或同一抗原 的两个不同表位。多种抗体可针对同一抗原而使用，因此增加价位。 例如，当耙向MIF或HMGB-1时，尤其是用于治疗脓毒病、某些癌 症和动脉粥样硬化斑块时，结合靶标的两个相同表位的两个抗体可 以掺入到稳定束缚结构中，所述结构带有另一抗体，其具有针对不 同抗原的一个或多个结合臂，所述抗原例如II类HLA恒定链抗原， 例如CD74。可以选择抗体，以结合两种不同抗原，例如针对MIF和 CD74的抗体；针对HMGB-1和CD74的抗体。
[0244]当促炎效应物受体被輩巴向时，在一个优选的实施方案中， 真实把标可以是促炎效应物受体的胞外区。在一个替代实施方案中， 稳定束缚结构可包含至少一个能与促炎效应物受体反应的分子。该 分子可以是所述促炎效应物受体的天然拮抗剂，或者该拮抗剂的片 段或突变体，并且能与受体发生特异性相互作用。在一个优选的实 施方案中，天然拮抗剂是天然IL-1受体拮抗剂，或该拮抗剂的片段 或突变体。[0245]在一个实施方案中，靶标可以是适应性免疫系统的抗原或受体。在其它实施方案中，稳定束縛结构的靶标可存在于先天免 疫系统的细胞上，所述细胞例如粒细胞、单核细胞、巨谨细胞、树
突细胞和NK细胞。其它靶标包括血小板和内皮细胞。而另一组耙标 选自C5a、 LPS、 IFNy和B7。再一组合适的輩巴标包括CD2、 CD4、 CD14、 CD18、 CDlla、 CD20、 CD22、 CD23、 CD25、 CD29、 CD38、 CD40L、 CD52、 CD64、 CD83、 CD147和CD154。 CD是免疫细胞上的耙标， 可将其阻断以阻止免疫细胞反应。CD83是特别有用的活化树突细胞 标记(Cao等，Biochem J, Aug. 23, 2004 (Epub ahead of print); Zinser等， J. Exp Med. 200(3):345-51 (2004》。
突细胞和NK细胞。其它靶标包括血小板和内皮细胞。而另一组耙标 选自C5a、 LPS、 IFNy和B7。再一组合适的輩巴标包括CD2、 CD4、 CD14、 CD18、 CDlla、 CD20、 CD22、 CD23、 CD25、 CD29、 CD38、 CD40L、 CD52、 CD64、 CD83、 CD147和CD154。 CD是免疫细胞上的耙标， 可将其阻断以阻止免疫细胞反应。CD83是特别有用的活化树突细胞 标记(Cao等，Biochem J, Aug. 23, 2004 (Epub ahead of print); Zinser等， J. Exp Med. 200(3):345-51 (2004》。
[0246]某些靶标特别令人感兴趣，例如MIF、 HMGB-1、 TNF-a、补体因子和补体调节蛋白以及凝固因子。MIF是先天免疫系统的 关键性细胞因子，在炎症反应控制中起到重要作用。原先是作为抑 制巨噬细胞随机迁移的T淋巴细胞衍生因子而予以描述，称为巨噬 细胞迁移抑制因子(MIF)的蛋白质，在大约30多年以来一直是谜一样 的细胞因子。近年来，发现MIF是脑垂体腺前叶的产物，生物活性 的重组MIF蛋白的克隆和表达，得出了它在体内关键性生物学作用 的定义。MIF具有独特性质，是由巨噬细胞和T淋巴细胞在受到糖 皮质激素刺激后释放的。 一旦释放，MIF在体外能克服糖皮质激素 对TNF-a、 IL-1(3、 IL-6和IL-8产生的抑制效应（这些TNF-a、 IL-lp、 IL-6和IL-8是由LPS刺激的单核细胞产生的)并在体内抑制甾体对致 死性内毒素血症的保护效应。MIF在体外也拮抗T细胞增殖的糖皮 质激素抑制，即通过恢复产生IL-2和IFN卞MIF是第一种已鉴定的 可反调节（counter-regulate)糖皮质激素抑制效应的介质，因而在炎症 和免疫的宿主控制中起到关键性作用。MIF在治疗癌症、病理性血 管生成和脓毒病或脓毒性休克中特别有用。
[0247] HMGB-1是DNA结合核和胞质溶胶蛋白，它是在IL-ip、TNF或LPS活化后由单核细胞和巨噬细胞释放的一种促炎细胞因 子。通过其B框结构域，它诱导DC的表型成熟。它也可引起促炎 细胞因子IL-la、 IL-6、 IL-8、 IL-12、 TNTF-a和RANTES的分泌增加。 由坏死细胞释放的HMGB-1可以是组织或细胞损伤的信号，这样的 信号当被DC感受到之后，能诱导和/或增强免疫反应。Palumbo等 报道了 HMBG1诱导成血管细胞(mesoangioblast)迁移和增殖(J Cell Biol, 164:441-449 (2004))。
[0248] HMGB-1是内毒素诱导的致死率的晚期介质，它相对于 TNF和IL-1(3表现出显著延迟动力学。已经证明，靶向特定早期炎性 介质(例如单独的TNF和IL-1(3)的实验性治疗药在临床上是有效的， 但稳定束縛结构可提高反应，即通过同时靶向早期和晚期炎性介质。
[0249]靶向HMBG-1的稳定束缚结构在治疗关节炎、尤其是胶 原诱发的关节炎中特别有用。包含HMBG-1的稳定束缚结构也可用 于治疗脓毒病和/或脓毒性休克。Yang等，PNAS USA 101:296-301 (2004); Kokkola等，Arthritis Rheum, 48:2052-8 (2003); Czura等，J Infect Dis， 187 Suppl 2:S391-6 (2003); Treutiger等，J Intern Med, 254:375-85 (2003)。
[0250] TNF-ot是参与全身炎症和急性期反应的 一种重要细胞因 子。TNF-ot由受刺激的单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞释放。巨噬 细胞、T细胞和B淋巴细胞、粒细胞、平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞、 软骨细胞、成骨细胞、肥大细胞、神经胶质细胞和角质细胞在受到 刺激后也产生TNF-a。在损伤过程中，例如感染过程中，其释放受 到白介素-1和细菌内毒素等其它几种介质的刺激。它在不同器官系 统中具有许多作用，通常与白介素-1和-6在一起。TNF-a的作用之 一是抑制食欲；因此用于治疗恶病质的稳定束缚结构优选草巴向TNF-ot。它也刺激肝脏急性期反应，导致C-反应蛋白和多种其它介质的增 加。当治疗脓毒病或脓毒性休克时，它也是有用的耙标。[0251]补体系统是复杂级联，包括血清糖蛋白的蛋白水解(通常 由细胞受体激活）。"补体级联"是组成型而非特异性的，但它必须 被活化，才能起作用。补体激活导致单向顺序的酶促和生化反应。在该级联中，特定补体蛋白C5形成两个高度活化的炎性副产物C5a 和C5b,它们共同激活白细胞。这反过来又产生大量其它炎性副产物，
包括有害的细胞因子、炎性酶和细胞粘附分子。总而言之，这些副 产物可导致在许多炎性疾病中可见的组织破坏。该级联最终引起对 炎症反应、吞噬细胞趋化性和调理作用和细胞溶解的诱导。
包括有害的细胞因子、炎性酶和细胞粘附分子。总而言之，这些副 产物可导致在许多炎性疾病中可见的组织破坏。该级联最终引起对 炎症反应、吞噬细胞趋化性和调理作用和细胞溶解的诱导。
[0252]补体系统可通过两个不同途径而活化，即经典途径和替 代途径。大多数补体组分是有编号的(例如Cl、 C2、 C3等），但有些 则称为"因子"。某些组分必需经酶促切割以活化其功能；其它的 则简单结合以形成具有活性的复合物。经典途径的活性组分包括 Clq、 Clr、 Cls、 C2a、 C2b、 C3a、 C3b、 C4a和C4b。 一,4戈途径的 活性组分包括C3a、 C3b、因子B、因子Ba、因子Bb、因子D和备 解素。各途径的最后阶段相同，都包括将组分装配到膜攻击复合体 (membrane attack complex)。膜攻击复合体的活性组分包括C5a、 C5b、 C6、 C7、 C8和C9n。
[0253]尽管稳定束缚结构可以靶向补体系统这些组分中的任一 种，但是优选某些补体组分。C3a、 C4a和C5a使肥大细胞释放趋化 因子(例如组胺和5-羟色胺，这些因子攻击吞噬细胞)、抗体和补体等。 这些构成一组优选靶标。另一组优选的靶标包括C3b、 C4b和C5b, 它们增强对外源细胞的吞噬作用。另 一组优选的靶标是这两组的前 体组分，即C3、 C4和C5。 C5b、 C6、 C7、 C8和C9请导外源细胞 溶解(膜攻击复合体)并构成又一组优选的靶标。
[0254]补体C5a，同C3a —样，也是一种过敏毒素。它介导炎 症，是诱导嗜中性粒细胞释放抗微生物蛋白酶和氧自由基的化学引 诱物。因此，C5a及其前体C5是特别优选的靶标。通过耙向C5，不 仅C5a受影响，而且C5b也受影响，这引起膜攻击复合体的装配。因此，C5是另一优选靶标。C3b及其前体C3也是优选靼标，因为 经典和替代补体途径依赖于C3b。三种蛋白质影响该因子水平：Cl 抑制剂、蛋白H和因子I,它们也是本发明的优选靶标。补体调节蛋 白（例如CD46、 CD55和CD59)可以是稳定束绰结构所结合的耙标。
[0255]凝固因子也是优选耙标，尤其是组织因子(TF)和凝血酶。 TF也称为组织促凝血酶原激酶、CD142、凝固因子III或因子m。 TF 是膜内在受体糖蛋白，是细胞因子受体超家族成员。TF的配体结合 胞外域由两个结构模块組成，其特征与TF的分类一致，都是2型细 胞因子受体的成员。TF参与凝血蛋白酶级联，引发外源性和内源性 凝血级联，即通过形成TF胞外域与循环凝血因子、丝氨酸蛋白酶因 子VII或因子Vila之间的高亲和性复合物。这些酶促活性复合物再 激活因子IX和因子X,导致凝血酶的产生和血凝块的形成。
[0256] TF由包括单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞在内的不 同细胞类型表达，并由IL-1、 TNF-a或细菌脂多糖诱导。蛋白激酶C 参与内皮细胞TF表达的细胞因子活化。内毒素和细胞因子诱导TF 是引发革兰氏阴性脓毒病患者中可见的弥散性血管内凝血的重要机 制。TF也表现出参与不同的非止血功能，包括炎症、癌症、脑功能、 免疫应答和肿瘤相关血管生成。因此，按照本发明，靶向TF的稳定 束缚结构不仅在治疗凝血病中有用，而且在治疗脓毒病、癌症、病 理性血管生成和其它免疫和炎症失调疾病中也有用。认为凝血途径 与细胞因子网络间具有复杂的相互作用，因为几种细胞因子影响各 种细胞内TF表达的能力以及配体对受体的结合作用。已经报道了配 体结合(因子VIIa)，以给出胞内《丐信号，因此表明TF是真受体。[0257】凝血酶是凝固因子II (凝血酶原）的活化形式；它将血纤 蛋白原转化成血纤蛋白。凝血酶对巨噬细胞来说是潜在的化学吸引 素，可改变它们的细胞因子和花生四烯酸代谢物的产量。它在伴有 脓毒病的凝血病中特别重要。大量研究已经证明，无论在脓毒病患者体内还是在将LPS给予动物模型之后，都有凝血系统的活化。尽 管有三十多年的研究，但是对LPS诱发肝脏毒性的机制仍然知之甚 少。目前已经清楚，它们涉及细胞和体液介质间复杂而连续的相互 作用。在相同时间周期内，革兰氏阴性系统脓毒病及其后遗症
(sequallae)已成为重要的健康问题，采用针对LPS或不同炎性介质的 单克隆抗体的努力，在治疗上都是失败的。靶向凝血酶和至少一个 其它靶标的稳定束縛结构正是致力于脓毒病治疗上的临床失败。
(sequallae)已成为重要的健康问题，采用针对LPS或不同炎性介质的 单克隆抗体的努力，在治疗上都是失败的。靶向凝血酶和至少一个 其它靶标的稳定束縛结构正是致力于脓毒病治疗上的临床失败。
[0258]在其它实施方案中，稳定束缚结构结合I类MHC、 II类 MHC或辅助分子，例如CD40、 CD54、 CD80或CD86。稳定束缚结 构也可结合T细胞活化细胞因子，或结合细胞因子介质，例如NF-kB。
[0259]在某些实施方案中，两个不同靶标中的一个可以是癌细 胞受体或癌症相关抗原，尤其是选自以下的一个：B-细胞谱系抗原 (CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23等）、VEGFR、 EGFR、癌胚抗 原（CEA)、胎盘生长因子(PLGF)、生腱蛋白、EER-2/"ew、 EGP-1 、 EGP-2、 CD25、 CD30、 CD33、 CD38、 CD40、 CD45、 CD52、 CD74、 CD80、 CD138、 NCA66、 CEACAM6 (癌胚抗原相关性细胞粘附分子 6)、 MUC1、 MUC2、 MUC3、 MUC4、 MUC16、 IL-6、甲胎蛋白（AFP)、 A3、 CA125、结肠特异性抗原-p (CSAp)、叶酸受体、HLA-DR、人 绒毛膜促性腺激素(HCG)、 Ia、 EL-2、胰岛素样生长因子(ILGF)和ILGF 受体、KS-1、 Le(y)、 MAGE、坏死抗原、PAM-4、前列腺酸性裤酸 酶(PAP)、 Prl、前列腺特异性抗原（PSA)、前列腺特异性膜抗原 (PSMA)、 SIOO、 TlOl、 TAC、 TAG72、 TRAIL受体和碳酸酐酶IX。
[0260]脓毒病和免疫失调以及其它免疫性疾病相关的靶标包括 MIF、 IL-1、 IL-6、 IL-8、 CD74、 CD83和C5aR。已经发现针对C5aR 的抗体和抑制剂能提高患有脓毒病的啮齿动物的生存率(Huber-Lang 等，FASEB J 2002; 16:1567-1574; Riedemann等，J Clm Invest 2002; 110:101-108),并提高患有脓毒性休克和成人呼吸窘迫综合征的猴子的生存率(Hangen等，J Surg Res 1989; 46.195-199; Stevens等，J Clin Invest 1986; 77:1812-1816)。因此，对于脓毒病，两个不同輩巴标之一 优选是感染相关靶标，例如LPS/C5a。其它优选靶标包括HMGB-l、 TF、 CD14、 VEGF和IL-6,它们各自与败血症或脓毒性休克相关。 优选稳定束縳结构是那些靶向两个或更多以下靶标的结构：HMGB-1、 TF和MIF,例如MIF/TF和HMGB-1/TF。[026】]在另一些实施方案中，两个不同靶标之一可以是移植物 抗宿主病或移植排斥相关靶标，例如MIF (Lo等，Bone Marrow Transplant, 30(6):375-80 (2002))。这两个不同把标之一也可以是以下 疾病相关靶标：急性呼吸窘迫综合征相关靶标，例如IL-8(Bouros等， PMC Pulm Med, 4(1):6 (2004),动脉粥样硬化或再狭窄相关靶标，例 如MIF (Chen等，Artenoscler Thromh Vase Biol, 24(4):709-14 (2004), 哮喘相关輩巴标，例如IL-18 (Hata等，Int Immunol, Oct. 11, 2004 Epub ahead of print),肉芽肿性疾病相关靶标，例如TNF-a (Ulbricht等， Arthritis Rheum, 50(8):2717-8 (2004)，神经病相关靶标，例如氨曱酰 化EPO (红细胞生成素)(Leist等，Science 305(5681): 164-5 (2004)或恶 病质相关靶标，例如IL-6和TNF-a。
[0262]其它耙标包括C5a、 LPS、 IFN-y、 B7; CD2、 CD4、 CD14、 CD18、 CDlla、 CDllb、 CD〗]c、 CD14、 CD18、 CD27、 CD29、 CD38、 CD40L、 CD52、 CD64、 CD83、 CD147、 CD154。可以通过针对CD18、 CD 11 b或CD 11 c的抗体，在某种程度上抑制某些微生物抗原（包括LPS) 对单核细胞的活化，因此涉及p2-整联蛋白（Cuzzola等，J Immunol 2000; 164:5871-5876; Medvedev等，J Immunoll998; 160:4535-4542)。 已经知道CD83在巨细胞动脉炎(GCA)中起作用，这是一种影响中动 脉到大动脉(主要是主动脉弓颅外分枝及其主动脉本身）的全身性脉管 炎，导致血管狭窄并随后造成组织缺血以及失明、中风和主动脉弓 综合征的严重并发症（Weyand和Goronzy, N Engl J Med 2003;349:160-169; Hunder禾口 Valente，载于：Inflammatory Diseases of Blood Vessels. G. S. Hoffman禾口 C.M. Weyand主编，Marcel Dekker, New York, 2002; 255-26"。发现抗CD幻的抗体在人GCA的SCID小鼠模型中 能消除脉管炎(Ma-Krupa等，J Exp Med 2004; 199:173-183),向这些 研究人员表明，树突细胞(当激活时表达CD83)在GCA中是重要的抗 原加工细胞。在这些研究中，他们使用小鼠抗CD83 Mab (IgGl克隆 HB15e，来自Research Diagnostics)。 CD 154是TNF家族成员，在CD4-阳性T淋巴细胞表面表达，已经报道了针对CD 154的人源化单克隆 抗体在活动性系统性红斑狼疮(SLE)患者中产生明显的临床益处 (Grammar等，J Clin Invest 2003; 112:1506-1520)。也表明该抗体可用 于其它自身免疫性疾病(Kelsoe, J Clin Invest 2003; 112:1480-1482)。 实际上，也报道了该抗体在难治性免疫血小板减少性紫癜患者中是 有效的(Kuwana等，Blood 2004; 103:1229-1236)。
[0263]在类风湿性关节炎中，重组白介素-1受体拮抗剂IL-IRa 即阿那白滞素（anakmra) (Kineret®)已经显示出活性（Cohen等，Ann Rheum Dis 2004; 63:1062-8; Cohen, Rheum Dis Clin North Am 2004; 30:365-80)。在治疗这些患者（至今需要同时用曱氨蝶呤治疗）方面的 一个改进，就是将阿那白滞素与 一种或多种抗促炎效应物细胞因子 或抗促炎效应物趋化因子(如上表所示)结合起来使实。实际上，在类 风湿性关节炎的抗体治疗的综述中，Taylor (Curr Opin Pharmacol 2003; 3:323-328)指出，除了 TNF之外，还可使用针对以下细胞因子 的其它抗体：IL-1、 IL-6、 IL-8、 IL-15、 IL-17和IL-18。
[0264]某些更优选靶标的组合包括下文所述的组合。这是优选 组合的实例，但并非是穷尽性的。table see original document page 84table see original document page 85table see original document page 86
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