富集和改变细胞和其他微粒的装置和方法
专利汇可以提供富集和改变细胞和其他微粒的装置和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于确定性微粒分离的装置和方法。示例性方法包括在所述装置中，样品里所需微粒的富集或者所需微粒的改造。所述装置和方法可有利地用于富集在样品例如母体血液中的稀有细胞例如 胎儿 细胞和稀有细胞成分例如胎儿细胞核。本发明进一步提供优先裂解样品中感兴趣的细胞的方法，例如从感兴趣的细胞的细胞成分诸如细胞核中提取临床信息。概述之，所述方法对样品中感兴趣的细胞和其他细胞(例如其他成核细胞)采用不同的细胞裂解。，下面是富集和改变细胞和其他微粒的装置和方法专利的具体信息内容。
1. 一种双路装置，所述双路装置包括具有第一部分的管道，所述第一部分包括第一和第二外部区域，每个区域包括一结构，其确定性地在所述部分中导流流体动力学尺寸在临界尺寸以上微粒沿第一方向，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒沿第二方向，其中所述第一和第二外部区域在所述管道中平行对齐。
2. 如权利要求1所述的装置，其中每种结构包括形成间隙网络的障碍物阵列，其中流经所述间隙的流体不均匀地分流为主要流和次要流，从而使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒在所述网络中不横向移动，其中在所述第一外部区域中的流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒或者被导向所述第二外部区域或者被导向远离所述第二外部区域。
3. 如权利要求2所述的装置，其中所述障碍物阵列包括第一和第二行，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行中的间隙的流体不均匀的分流入所述第二行的两个间隙。
4. 如权利要求1所述的装置，进一步包括设置于所述第一部分中的第一和第二外部区域之间的旁路通道，其中每个外部区域独立地将流体力学尺寸在所述临界尺寸以上的颗粒导向或者远离所述旁路通道。
5. 如权利要求4所述的装置，其中经设置与所述中央区域相邻的阵列的边缘包括液流导出边界，其中流体从所述中央区域导出使得在所述中央区域的液流基本恒定。
6. 如权利要求2所述的装置，进一步包括具有三个区域的第二部分：第一和第二外部区域，每一个包括形成间隙网络的障碍物阵列，其中流经所述间隙的流体不均匀地分流为主要流和次要流使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒在所述网络中不横向移动，其中在所述第一外部区域中的流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒或者被导向所述第二外部区域或者远离所述第二外部区域，以及第三区域，包括设置在所述第二部分的第一外部区域侧面的第一旁路通道，流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒被导入其中。
7. 如权利要求6所述的装置，进一步包括设置于所述第二部分的第二外部区域侧面的第二旁路通道，流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒导向其中，其中所述第一外部区域将流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒导向远离所述第二外部区域，而所述第二外部区域将流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒导向远离所述第一外部区域。
8. 如权利要求6所述的装置，其中所述第一旁路通道设置在所述第二部分的所述第一和第二外部区域之间，并且所述第一和第二区域将流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒导向所述第一旁路通道。
9. 如权利要求4所述的装置，其中在所述第一和第二区域中的所述微粒的方向是朝向所述第一旁路通道。
10. 如权利要求4所述的装置，其中所述结构能偏转成核血细胞进入所述旁路通道并将无核血细胞保留在所述第一或第二外部区域。
11. 一种多段式装置，包括：
(i)串联排列的第一和第二部分，其中每部分包括具有第一和第二边缘的结构，其中在所述部分内，所述结构确定性地将流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒导向第一方向，将流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒导向第二方向；和
(ii)第一旁路通道，经设置接收来自所述第一部分的第一或第二边缘的液流输出，其中所述液流输出不经过所述第二部分。
12. 如权利要求11所述的装置，其中每个结构包括具有形成间隙网络的障碍物阵列的通道，其中所述阵列具有第一和第二边缘，并且流经所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流，因此流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中朝向第一边缘横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒在所述网络中不朝向第一边缘横向移动。
13. 如权利要求12所述的装置，其中每部分中的所述障碍物的阵列包括第一行和第二行，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行间隙的液流不均匀的分流入所述第二行的两个间隙中。
14. 如权利要求11所述的装置，其中所述第一部分和第二部分具有不同的临界尺寸。
15. 如权利要求11所述的装置，其中所述第一旁路通道经设置接收来自所述第一和第二部分的第一或第二边缘的液流输出。
16. 如权利要求15所述的装置，其中与每个部分相邻的所述旁路通道的宽度经调节使之具有与所述部分中的阵列基本相同的流体阻力。
17. 如权利要求11的装置，进一步包括第二旁路通道，其中所述第一旁路通道经设置以接收来自所述第一部分的第一或第二边缘的流体输出，而所述第二旁路通道经设置以接收来自所述第二部分的第一或第二边缘的流体输出。
18. 如权利要求12所述的装置，进一步包括第三部分，其中所述第三部分包括具有形成间隙网络的障碍物阵列的通道，其中所述阵列具有与液流流向平行的第一和第二边缘，并且流经所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流，因此流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中朝向第一边缘横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒在所述网络中不朝向第一边缘横向移动。
19. 如权利要求18所述的装置，其中所述第一部分具有比所述第二部分大的临界尺寸，并且所述第二部分具有比所述第三部分大的临界尺寸。
20. 如权利要求11所述的装置，其中所述第二部分和所述第一旁路通道经调整大小以保持在所述第一和第二部分中基本恒定的液流。
21. 一种包括多条通道的多路装置，每条通道包括入口、出口和结构，在所述通道中，所述结构确定性地将流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒导向第一方向，将流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒导向第二方向。
22. 如权利要求21所述的装置，其中所述结构包括形成间隙网络的障碍物阵列，其中流经所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒在所述网络中不横向移动。
23. 如权利要求21所述的装置，其中多个入口是液流相连的。
24. 如权利要求21所述的装置，其中多个出口是液流相连的。
25. 如权利要求22所述的装置，其中所述障碍物的阵列包括第一行和第二行，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行间隙的液流不均匀的分流入所述第二行的两个间隙。
26. 如权利要求21所述的装置，进一步包括位于两个所述结构之间并与其液流连接的旁路通道。
27. 如权利要求21所述的装置，其中每个结构是包括连续排列的第一部分和第二部分的多段式结构，其中每个部分包括具有第一和第二边缘的结构，其中在所述部分中所述结构确定性地将流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒导向第一方向，将流体动力学尺寸在临界尺寸以下的微粒导向第二方向，以及第一旁路通道经设置以接收来自所述第一部分的第一或第二边缘的液流输出，其中所述液流输出不流过所述第二部分。
28. 一种包括通道的装置，所述通道包括形成间隙网络的障碍物阵列，所述间隙具有10μm～30μm的基本恒定的宽度，其中流经所述间隙的血液中的流体不均匀地分流为主要流和次要流使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的细胞在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的细胞在所述网络中不横向移动。
29. 如权利要求28所述的装置，其中所述障碍物阵列包括第一和第二行，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行间隙的流体不均匀的分流入所述第二行的两个间隙，因此液流中的微粒根据其尺寸导向不同方向。
30. 如权利要求28所述的装置，其中所述间隙的宽度是18μm～24μm。
31. 如权利要求28所述的装置，其中所述通道具有一条液流导入边缘和一条液流导出边缘，以及所述间隙的宽度近似为18μm或20μm。
32. 一种包括通道的装置，所述通道包括形成间隙网络的障碍物阵列，所述间隙具有基本恒定的宽度，其中流经所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的来自体液的细胞在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的来自体液的细胞在所述网络中不横向移动。
33. 如权利要求32所述的装置，其中所述体液包括汗、眼泪、耳分泌物、痰、淋巴液、骨髓悬浮液、尿、唾液、精液、阴道分泌物、脑脊液、大脑液、腹水、乳汁、呼吸分泌物、肠道或泌尿生殖道或羊膜液。
34. 一种包括通道的装置，所述通道包括具有第一和第二边缘的结构，其中所述结构确定性地使流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒向所述第一边缘偏转，其中所述第一边缘或第二边缘包括液流导出或液流导入边界。
35. 如权利要求34所述的装置，其中所述结构包括形成间隙网络的障碍物阵列，其中所述阵列具有第一和第二边缘，并且流过所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒在所述网络中不横向移动。
36. 如权利要求35所述的装置，其中所述障碍物阵列包括第一和第二行，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行间隙的液流不均匀的分流入所述第二行的两个间隙。
37. 一种包括通道的装置，所述通道包括分离区域，所述分离区域经设置以确定性地使第一血液成分向第一方向偏转，第二血液成分向第二方向偏转。
38. 如权利要求37所述的装置，其中所述分离区域包括形成间隙网络的障碍物阵列，其中流过所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒在所述网络中不横向移动；其中所述第一血液成分具有在所述临界尺寸以上的流体动力学尺寸，而所述第二血液成分具有在所述临界尺寸以下的流体动力学尺寸。
39. 如权利要求39所述的装置，其中所述障碍物阵列包括第一和第二行，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行间隙的液流不均匀的分流入所述第二行的两个间隙。
40. 如权利要求37所述的装置，其中所述第一成分包括胎儿成核细胞，所述第二成分包括母体无核红血细胞。
41. 如权利要求40所述的装置，其中所述胎儿成核细胞包括成核胎儿红血细胞。
42. 如权利要求41所述的装置，其中所述第二成分包括母体无核红血细胞。
43. 一种包括通道的装置，所述通道包括连续排列的第一和第二部分，其中每部分包括具有结构的通道，所述结构具有第一和第二边缘，其中所述结构确定性地使流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒向所述第一边缘偏转，其中在所述第一和第二部分间的界面与液流方向不垂直。
44. 如权利要求43所述的装置，其中所述结构包括形成间隙网络的障碍物阵列，其中所述阵列具有第一和第二边缘，并且流过所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中朝向第一边缘横向移动。
45. 如权利要求44所述的装置，其中所述障碍物阵列包括第一和第二行，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行间隙的液流不均匀的分流入所述第二行的两个间隙。
46. 一种包括通道的装置，所述通道包括具有第一和第二行的障碍物阵列，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行中的间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流，因此流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在临界尺寸以下的微粒在所述网络中不横向移动，其中分流比最多为1/2。
47. 如权利要求46所述的装置，其中所述比例最多为1/60。
48. 如权利要求46所述的装置，其中与液流平均流向垂直的所述障碍物的横截面大于与液流平均流向平行的所述障碍物的横截面。
49. 如权利要求46所述的装置，其中红血细胞具有在所述临界尺寸以下的流体动力学尺寸，白血细胞具有在所述临界尺寸以上的流体动力学尺寸，并且所述白血细胞不阻塞所述阵列。
50. 一种包括通道的装置，所述通道包括第一和第二入口和形成间隙网络的障碍物阵列，其中流经所述间隙的液流不均匀的分流为主要流和次要流，从而使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒在所述网络中没有横向移动，其中所述第一和第二入口具有比所述阵列更大的流体阻力。
51. 如权利要求50的装置，其中所述障碍物阵列包括第一和第二行，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行间隙的液流不均匀的分流入所述第二行的两个间隙。
52. 一种包括通道的装置，所述通道包括位于形成间隙网络的障碍物阵列的下游的第一和第二出口，其中流经所述间隙的液流不均匀的分流为主要流和次要流，从而使得流体动力学尺寸在所述临界尺寸以上的微粒在所述网络中横向移动，而流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒在所述网络中没有横向移动，其中所述第一和第二出口具有比所述阵列更大的流体阻力。
53. 如权利要求52的装置，，其中所述障碍物阵列包括第一和第二行， 其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行间隙的液流不均匀的分流入所述第二行的两个间隙中。
54. 如权利要求1、11、21、28、34、37、46、50和52中任一项所述的装置，其中所述装置与将所述装置的输出进行成像的设备相偶连。
55. 一种包括通道的装置，所述通道包括一种结构，所述结构具有与第一通道壁相邻的第一边缘，与第二通道壁相邻的第二边缘，其中所述结构确定性地使流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒朝向所述第一边缘偏转，其中所述第一边缘或第二边缘与所述第一或第二通道壁相隔至少所述临界尺寸。
56. 如权利要求55所述的装置，其中所述结构包括形成间隙网络的障碍物阵列，其中所述阵列具有第一和第二边缘，并且流经所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流，因此流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒在所述网络中朝向所述第一边缘横向移动，而流体动力学尺寸在临界尺寸以下的微粒在所述网络中不朝向所述第一边缘横向移动。
57. 如权利要求56所述的装置，其中所述障碍物阵列包括第一和第二行，其中所述第二行相对于第一行横向移动，因此流经第一行间隙的液流不均匀的分流入所述第二行的两个间隙。
58. 一种制备富集第一生物微粒的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将生物样品导入权利要求1的装置的第一或第二外部区域；和
b.使所述生物样品流过所述装置，其中在所述生物样品中存在的所述第一生物微粒被导向所述第一或第二方向，从而制得富集了所述第一生物微粒的所述样品。
59. 如权利要求58所述的方法，其中所述装置是权利要求4的装置，并且所述第一和第二外部区域将流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒导向所述旁路通道，并且进一步包括使稀释溶液流入所述旁路通道，其中所述第一生物微粒被导入所述旁路通道。
60. 一种制备富集第一生物微粒的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将生物样品导入权利要求11的装置的第一部分；和
b.使所述生物样品流过所述装置，其中在所述生物样品中存在的任何所述第一生物微粒被导向所述第一部分的第一或第二方向，从而制得富集了所述第一生物微粒的样品。
61. 如权利要求60所述的方法，其中所述第一生物微粒被导向所述第一部分的所述第一方向，并导入所述第一旁路通道。
62. 如权利要求61所述的方法，进一步包括使未被导向所述第一部分的所述第一方向的液流流入所述第二部分，其中第二生物微粒被导向所述第二部分的第一方向。
63. 如权利要求62所述的方法，其中所述装置是权利要求17的装置，其中所述第二生物微粒被导向所述第二旁路通道。
64. 如权利要求63的方法，其中第三生物微粒被导向所述第二部分的第二方向。
65. 如权利要求64的方法，其中所述第一生物微粒包括白血细胞，所述第二生物微粒包括红血细胞，所述第三生物微粒包括血小板。
66. 一种制备富集第一生物微粒的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将生物样品导入权利要求21的装置的每个通道的入口；和
b.使所述生物样品流过所述装置，其中在所述生物样品中存在的任何所述第一生物微粒被导向所述第一或第二方向，从而制得富集了所述生物微粒的样品。
67. 如权利要求58、60和66中任一项所述的方法，进一步包括收集富集了所述第一生物微粒的所述样品。
68. 如权利要求58、60和66中任一项所述的方法，其中在所述富集样品中的所述第一生物微粒的浓度相对于所述生物样品得以提高。
69. 如权利要求58、60和66中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括细胞样品。
70. 如权利要求69所述的方法，其中所述细胞样品包括血液。
71. 如权利要求58、60和66中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括母体血液而所述第一微粒是胎儿细胞。
72. 如权利要求71所述的方法，其中所述胎儿细胞是成核红血细胞。
73. 如权利要求71所述的方法，进一步包括针对性别、非整倍性、蛋白质表达、编码或非编码核酸，或代谢状态分析所述胎儿细胞。
74. 一种制备富集第一生物微粒的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将生物样品导入权利要求28的装置；和
b.使所述生物样品流过所述间隙的网络，其中在所述生物样品中存在的任何所述第一生物微粒被导向所述第一或第二方向，从而制得富集了所述第一生物微粒的样品。
75. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，其中所述第一生物微粒是癌细胞、病原体、寄生虫、细菌、病毒、真菌细胞、宿主免疫细胞、干细胞、移植免疫细胞、树突细胞、结缔组织细胞或真核细胞成分。
76. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，其中所述生物样品获得自第一生物体，第一生物微粒来自第二生物体。
77. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，其中所述第一和第二生物体是不同的人。
78. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，进一步包括在步骤(b)之前或者在步骤(b)进行时使所述第一生物微粒与溶涨剂相接触以增加所述第一生物微粒的流体动力学半径。
79. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，包括在步骤(b)之前或者在步骤(b)进行时使所述第一生物微粒与收缩剂相接触以减小所述第一生物微粒的流体动力学半径。
80. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至多90％的液体。
81. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，其中所述富集样品包含至少75％的存在于所述生物样品中的第一生物微粒。
82. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，其中相对于所述生物样品，所述第一微粒富集至少2倍。
83. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，其中所述第一生物微粒不被稀释超过10倍。
84. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，进一步包括使富集了所述第一生物微粒的样品与结合部分相接触，所述结合部分选择性地与所述第一生物微粒相结合或者选择性地与第二生物微粒相结合。
85. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，进一步包括通过RNA FISH分析富集了所述第一生物样品的所述样品以检测胎儿细胞核。
86. 如权利要求58、60、66和74中任一项所述的方法，其中所述第一生物微粒是胎儿成核细胞。
87. 如权利要求86所述的方法，其中所述胎儿成核细胞是红血细胞、滋养层、内皮细胞或干细胞。
88. 一种改变第一生物微粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供其中包括通道的装置，所述通道包括第一入口、第二入口、第一出口、第二出口和形成间隙网络的障碍物阵列，其中所述阵列具有与液流流向平行的第一和第二边缘，并且流经所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流，因此所述主要流的平均流向是朝向所述第一边缘的，所述次要流的平均流向不朝向所述第一边缘；
(b)将所述生物样品导入所述第一入口并将改变液导入所述第二入口；以及
(c)使所述生物样品流过所述间隙网络，其中在所述细胞样品中存在的任何所述第一生物微粒被导向所述主要流并流入所述改变液，从而改变所述第一生物微粒。
89. 如权利要求88所述的方法，其中所述改变液包括稀释剂或标记试剂。
90. 如权利要求88所述的方法，其中所述标记试剂包括巨核细胞、放射性同位素、荧光团、小珠或抗体。
91. 如权利要求88所述的方法，其中所述改变液包括稳定剂。
92. 如权利要求91所述的方法，其中所述稳定剂包括细胞凋亡抑制剂、固定剂、抗氧化剂或糖。
93. 如权利要求92所述的方法，其中所述糖是蔗糖或海藻糖。
94. 如权利要求92所述的方法，其中所述固定剂是醛。
95. 如权利要求88所述的方法，其中所述装置是权利要求1、11、21、28、34、37、46、50和52的任一装置。
96. 一种制备第一细胞或其成分的经富集、未活化的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供其中包括通道的装置，所述通道包括形成间隙网络的障碍物阵列，其中所述阵列具有与液流流向平行的第一和第二边缘，并且流经所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流，因此所述主要流的平均流向是朝向所述第一边缘的，所述次要流的平均流向不朝向所述第一边缘；
(b)将细胞样品导入所述阵列；以及
(c)使所述细胞样品流过所述间隙网络，其中在所述细胞样品中存在的任何所述第一细胞或其成分被导入所述主要流，其中少于10％的所述第一细胞或其成分由于所述第一细胞或其成分与一个所述障碍物之间的碰撞而被细胞内活化，由此制备所述第一细胞或其成分的经富集、未被活化的样品。
97. 如权利要求96所述的方法，其中所述第一细胞是血小板、干细胞、粒细胞、单核细胞或内皮细胞。
98. 如权利要求96所述的方法，其中所述装置是权利要求1、11、21、28、34、37、46、50和52的任一装置。
99. 一种制备第一微粒经富集的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供其中包括通道的装置，所述通道包括形成间隙网络的障碍物阵列，其中所述阵列具有与液流流向平行的第一和第二边缘，并且流经所述间隙的液流不均匀地分流为主要流和次要流，因此所述主要流的平均流向是朝向所述第一边缘的，所述次要流的平均流向不朝向所述第一边缘；
(b)将含有至少0.1体积％的微粒的样品导入所述阵列；以及
(c)使所述样品流过所述间隙网络，其中在所述样品中存在的任何所述第一微粒被导入所述主要流，由此制备所述第一微粒经富集的样品。
100. 如权利要求99所述的方法，其中所述样品包括血液。
101. 如权利要求99所述的方法，其中所述装置是权利要求1.、11、21、28、34、37、46、50和52的任一装置。
102. 一种制备第一血液成分经富集的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供权利要求37的装置；
(b)将含有血液的样品导入所述阵列；以及
(c)使所述样品流过所述装置，使得所述第一血液成分确定性地与第二血液成分分离，从而制备所述第一血液成分经富集的样品。
103. 如权利要求102所述的方法，其中所述装置是权利要求38的装置。
104. 一种从感兴趣的细胞中收集细胞成分的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)处理含有感兴趣的细胞的样品以制得感兴趣的细胞经富集的样品；
(b)在经富集的样品中，相比其他细胞，优先裂解含有所述细胞成分或其对应物的感兴趣的细胞；以及
(c)从被裂解的感兴趣的细胞中收集所述细胞成分。
105. 如权利要求103所述的方法，进一步包括分析所述收集的细胞成分以进行鉴别、计数或疾病诊断。
106. 如权利要求103所述的方法，其中所述感兴趣的细胞是胎儿红血细胞。
107. 如权利要求106所述的方法，其中所述细胞成分是胎儿红血细胞核。
108. 如权利要求103所述的方法，其中所述样品是血液样品。
109. 如权利要求108所述的方法，其中所述样品是母体血液样品。
110. 如权利要求103所述的方法，其中所述感兴趣的细胞是癌细胞、病原体、寄生虫、细菌、病毒、真菌细胞、宿主免疫细胞、干细胞、移植免疫细胞、树突细胞、或结缔组织细胞。
111. 如权利要求103所述的方法，其中所述细胞成分是细胞器、聚合物或分子复合物、或细胞内化学物种。
112. 如权利要求111所述的方法，其中所述细胞器是细胞核、核周小室、核膜、线粒体、叶绿体、细胞膜或细胞内寄生物。
113. 如权利要求111所述的方法，其中所述聚合物或分子复合物是脂质、多糖、蛋白质、核酸、病毒颗粒或核糖体。
114. 如权利要求111所述的方法，其中所述细胞内化学物种是荷尔蒙、离子、辅助因子或药物。
115. 如权利要求103所述的方法，其中步骤(a)采用其中包括通道的装置，所述通道包括能确定性地使流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒偏转至与所述部分中的液流平均流向不平行的方向的结构。
116. 如权利要求115所述的方法，其中所述步骤(a)和(b)是相伴进行的。
117. 一种从血液样品中的循环细胞获取基因信息的方法，所述方法包括以下步骤：
a.处理所述血液样品以基本除去无核红血细胞和血小板以制得富集成核细胞的样品；
b.相比其他成核细胞，优先裂解感兴趣的成核细胞；
c.收集被裂解的感兴趣的细胞的含有核酸的细胞成分；以及
d.分析在所收集的细胞成分中的核酸，从而从感兴趣的细胞得到基因信息。
118. 如权利要求117所述的方法，其中所述感兴趣的细胞是胎儿红血细胞。
119. 如权利要求117所述的方法，其中所述感兴趣的细胞是癌细胞、病原体、寄生虫、细菌、病毒、真菌细胞、宿主免疫细胞、干细胞、移植免疫细胞、树突细胞、或结缔组织细胞。
120. 如权利要求117所述的方法，其中所述细胞成分是细胞器、聚合物或分子复合物、或细胞内化学物种。
121. 如权利要求120所述的方法，其中所述细胞器是细胞核、核周小室、核膜、线粒体、叶绿体、细胞膜或细胞内寄生物。
122. 如权利要求120所述的方法，其中所述聚合物或分子复合物是脂质、多糖、蛋白质、核酸、病毒颗粒或核糖体。
123. 如权利要求120所述的方法，其中所述细胞内化学物种是荷尔蒙、离子、辅助因子或药物。
124. 如权利要求117所述的方法，其中所述基因信息包括疾病状态、性别、亲子关系、非整倍性，或者存在或不存在突变。
125. 如权利要求117所述的方法，其中步骤(a)采用其中包括通道的装置，所述通道包括能确定性地使流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒偏转至与所述部分中的液流平均流向不平行的方向的结构。
126. 如权利要求125所述的方法，其中所述步骤(a)和(b)是相伴进行的。
127. 一种集流腔，所述集流腔包括：
(a)第一贮液室，与所述第一贮液室液流相通的第一入口，以及与所述第一贮液室液流相同的第一疏水排气口；和
(b)出口，
其中塑造所述集流腔的形状和尺寸以使其与微流装置相连，所述微流装置能根据尺寸、形状、形变度或亲合性相对于所述样品的第二成分富集样品中的第一微粒，其中当使用所述微流装置时，所述第一贮液室和出口是液流相通的，当未使用所述微流装置时，则不是液流相通的。
128. 如权利要求127所述的集流腔，进一步包括第二贮液室，与所述第二贮液室液流相通的第二入口，以及可选的与所述第二贮液室液流相通的第二疏水排气口，其中当使用所述微流装置时，所述第一贮液室、第二贮液室和出口是液流相通的，当未使用所述微流装置时，则不是液流相通的。
129. 如权利要求128所述的集流腔，其中所述第一或第二疏水排气口具有＜1μm的微孔。
130. 如权利要求127所述的集流腔，其中所述集流腔包括两半部分，其中所述微流装置能设置于所述两半部分之间而使用。
131. 如权利要求127所述的集流腔，其中所述第一贮液室与所述微流装置中的通道通过所述装置上的孔而液流相通。
132. 如权利要求128所述的集流腔，其中所述第一和第二贮液室与所述微流装置中的通道通过所述装置上的孔而液流相通。
133. 如权利要求127或128所述的集流腔，其中塑造所述集流腔的形状和尺寸使其与多个所述微流装置相连。
134. 如权利要求128所述的集流腔，其中所述微流装置包括具有结构的通道，所述结构能确定性地将流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒导向第一方向，将流体动力学尺寸在所述临界尺寸以下的微粒导向第二方向。
135. 如权利要求134所述的集流腔，其中所述微流装置是权利要求1～57中任一项的装置。
136. 如权利要求127或128所述的集流腔，进一步包括与之相连的所述微流装置。
137. 如权利要求127或128所述的集流腔，其中所述微流装置包括多条通道，每条通道能独立地根据尺寸、形状、形变度或亲合性相对于所述样品的第二成分富集样品中的第一微粒。
138. 如权利要求137所述的集流腔，其中所述多条通道为至少5、10、15、20、25或30。
139. 如权利要求137所述的集流腔，其中每条通道独立地通过所述装置中的孔与所述第一和/或第二贮液室相连。
140. 如权利要求127～139所述的集流腔，其中所述第一微粒包括癌细胞、病原体、寄生虫、细菌、病毒、真菌细胞、宿主免疫细胞、干细胞、移植免疫细胞、树突细胞、结缔组织细胞，或真核细胞成分。
141. 如权利要求127～139所述的集流腔，其中所述第一微粒包括成核红血细胞。
142. 如权利要求141所述的集流腔，其中所述第一微粒包括胎儿成核红血细胞。
143. 一种在样品中相对于第二成分富集第一微粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述样品通过第一入口导入与权利要求136的微流装置相连的集流腔，其中所述样品至少部分充满所述第一贮液室；以及
(b)使所述样品流过所述微流装置以根据尺寸、形状、形变度或亲合性相对于所述第二成分富集所述第一微粒。
144. 如权利要求143所述的方法，其中所述集流腔是权利要求128的集流腔，并且进一步包括在步骤(b)之前将第二液体通过第二入口导入所述集流腔，其中所述第二液体至少部分充满所述第二贮液室，其中在步骤(b)中，所述第二液体与所述样品相互作用。
145. 如权利要求144所述的方法，其中所述微流装置包括具有结构的通道，所述结构能确定性地将流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒导向第一方向，将流体动力学尺寸在临界尺寸以下的微粒导向第二方向。
146. 如权利要求145所述的方法，其中所述微流装置是权利要求1～57中任一项的装置。
147. 如权利要求143所述的方法，其中所述集流腔是权利要求129～142的集流腔。
148. 一种将液体导入集流腔的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供权利要求127的集流腔，所述集流腔进一步包括所述微流装置，其中所述集流腔和装置没有用液体充满；
(b)将液体通过第一入口导入所述集流腔，其中所述液体至少部分充满所述第一贮液室，并通过所述第一疏水排气口置换所述第一贮液室中存在的气体，其中在不足以使所述液体通过所述第一排气口的压力下进行所述导入；以及
(c)使所述液体进入所述微流装置并流过所述出口。
149. 如权利要求148所述的方法，其中所述集流腔是权利要求128的集流腔，其中在步骤(c)之前、之中或之后，来自所述第一贮液室的液体流过所述微流装置并流入所述第二贮液室，其中所述液体通过所述第二疏水排气口置换气体。
150. 如权利要求148所述的方法，其中所述集流腔是权利要求129～142的集流腔。
151. 一种在样品中相对于母体细胞富集胎儿细胞的方法，所述方法包括：
(a)将母体血液样品导入微流装置，所述微流装置能根据尺寸、形状、形变度或亲合性相对于母体细胞富集胎儿成核细胞以制得富集样品；
(b)裂解在所述富集样品中的胎儿成核细胞以释放胎儿细胞核；以及
(c)检测所述胎儿细胞核。
152. 如权利要求151所述的方法，其中步骤b包括裂解所述富集样品中的所有细胞并收集所述胎儿细胞核。
153. 如权利要求151所述的方法，其中步骤b包括相对于母体细胞选择性地裂解胎儿成核细胞。
154. 如权利要求151所述的方法，其中所述微流装置包括具有结构的通道，所述结构确定性地将胎儿成核细胞导向第一方向，将至少一些母体细胞根据确定性的横向移动导向第二方向。
155. 如权利要求154所述的方法，其中所述微流装置是权利要求1～57中任一项的装置。
156. 如权利要求151所述的方法，其中步骤c包括采用RNA FISH以正选择或负选择所述胎儿细胞核。
157. 一种富集母体血液样品中胎儿细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供所述母体血液样品；
(b)将所述样品与含有铵离子和碳酸氢根离子以及碳酸酐酶抑制剂的缓冲液相接触以诱导母体红血细胞相对于胎儿红血细胞的裂解；以及
(c)导入band 3阴离子转运蛋白抑制剂以终止裂解。
158. 如权利要求157所述的方法，其中在步骤a中的所述样品通过微流装置富集了所述胎儿细胞，所述微流装置能根据尺寸、形状、形变度或亲合性相对于母体细胞富集所述胎儿细胞。
159. 如权利要求158所述的方法，其中所述微流装置包括具有结构的通道，所述结构根据确定性的横向移动确定性地将胎儿成核细胞导向第一方向，将至少一些母体细胞导向第二方向。
160. 如权利要求159所述的方法，其中所述微流装置是权利要求1～57中任一项的装置。
161. 如权利要求157所述的方法，其中所述碳酸酐酶抑制剂包括乙酰唑胺。
162. 如权利要求157所述的方法，其中所述band 3阴离子转运蛋白抑制剂包括DIDS。
163. 一种富集母体血液样品中胎儿细胞的方法，所述方法包括：
a.提供所述母体血液样品；以及
b.将所述样品与一种或多种缓冲液接触，所述缓冲液能相对于胎儿红血细胞诱导母体红血细胞和白血细胞的选择性裂解。
164. 一种分析样品中胎儿细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供母体血液样品；
b.对所述样品进行以下裂解过程之一：
(i)相对于母体细胞选择性地裂解胎儿细胞并保持胎儿细胞核完整；
(ii)相对于胎儿细胞选择性地裂解母体细胞并保持母体细胞核完整；
(iii)裂解所有细胞并保持其细胞核完整；
(iv)裂解所有细胞和母体细胞核并保持胎儿细胞核完整；
(v)相对于胎儿细胞选择性地裂解母体细胞及其细胞核；
(vi)裂解所有细胞及其细胞核；以及
(vii)相对于母体细胞选择性地裂解胎儿细胞及其细胞核；和
c.分析步骤(b)释放的胎儿细胞核、胎儿核酸、胎儿蛋白质或胎儿代谢物。
165. 如权利要求164所述的方法，其中所述步骤(a)的样品通过微流装置富集所述胎儿细胞，所述微流装置能根据尺寸、形状、形变度或亲合性相对于母体细胞富集所述胎儿细胞。
166. 如权利要求165所述的方法，其中所述微流装置包括具有结构的通道，所述结构根据确定性的横向移动确定性地将胎儿成核细胞导向第一方向，将至少一些母体细胞导向第二方向。
167. 如权利要求165所述的方法，其中所述微流装置是权利要求1～57中任一项的装置。
168. 如权利要求164所述的方法，其中步骤(c)包括通过RNA或DNAFISH、PCR、端粒长度分析、基于亲和性的分析或者DNA或RNA杂交分析所述胎儿细胞核、胎儿核酸、胎儿蛋白质或胎儿代谢物。
本发明涉及细胞分离和液流装置领域。
在样品中经常存在临床或环境相关信息，但其量过低而难以被检测到。因此，经常采用各种富集或扩增方法以提高这些信息的可检测性。
对于细胞，可采用不同的流式细胞术和细胞分选法，但这些技术通常采用大型昂贵的设备，需要大量体积的样品和熟练的操作者。这些流式细胞计和分选器采用诸如静电偏转、离心、荧光活化细胞分选(FACS)和磁活化细胞分选(MACS)等方法实现细胞分离。这些方法通常不能充分地富集样品从而使之能对样品的稀有成分进行分析。此外，这些技术可使这些稀有成分不可接受的损失掉，例如通过低效率的分离或者所述成分的降解。
因此，需要用于富集样品的新装置和方法。
发明内容
本发明进一步公开了使用本发明的装置富集和改变样品的方法。
在优选实施方式中，本发明的装置包括微流通道。在另一优选实施方式中，本发明的装置配置用于从全血中分离血液成分，例如红血细胞、白血细胞或者血小板，从母体血液中分离稀有细胞例如成核(nucleated)红细胞，以及从血液中分离干细胞、病原体或寄生物，或者宿主或移植免疫细胞。所述方法也可用于从血浆中分离所有血细胞，或其部分，或者从悬浮液流中分离样品中的所有微粒，例如细胞成分或细胞内寄生物或其子集。其他可在本发明的装置中分离的微粒在此处进行描述。
所述发明进一步提供了用于优先裂解样品中感兴趣的细胞的方法，例如从细胞成分中提取临床信息，例如感兴趣的细胞的细胞核或核酸，例如成核胎儿红血细胞。通常而言，在样品中的感兴趣的细胞和其他细胞(例如其他成核细胞)之间，所述方法采用不同的细胞裂解。在某些实施方式中，优先的细胞裂解导致至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的感兴趣的细胞，例如红血细胞或胎儿成核红血细胞裂解，导致少于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的不需要的细胞例如母体白血细胞或母体成核红血细胞裂解。
″间隙″指液流和/或微粒可流过的开口。例如，间隙可以是液流可流经其中的毛细管、两个障碍物间的间隔，或者是在疏水表面上的亲水性图案，水性液流被限制其中。在本发明的优选实施方式中，所述间隙网络由障碍物阵列限定。在该实施方式中，所述间隔是相邻障碍物之间的间隔。在优选实施方式中，所述间隙网络由在基体表面上的障碍物阵列构建而成。
″障碍物″是指在通道中妨碍流动的障碍，例如一个表面上的突出。例如，障碍物可以指突出在底部基体上的立柱或者对于水性液流的疏水障碍。在一些实施方式中，所述障碍物可以是部分通透的。例如，障碍物可以是由多孔材料制成的立柱，其中所述小孔允许水性成分通过，但对于将被分离的颗粒而言太小而使之不能进入。
″流体动力学尺寸″是指当微粒与液流、立柱以及其他微粒相互作用时的有效尺寸。它用作液流中微粒体积、形状和形变度的一般性术语。
″液流导出边界″是指经设计用于从阵列中移除液流的边界。
″液流导入边界″是指经设计用于向阵列中添加液流的边界。
″溶涨剂″是指能增大微粒流体动力学半径的试剂。溶涨剂可通过增加体积、减小形变度或改变微粒形状起作用。
″收缩剂″是指能减小微粒流体动力学半径的试剂。收缩剂可通过减小体积、增加形变度或改变微粒形状起作用。
″标记试剂″是指能与微粒结合或者定位于微粒并能例如通过形状、形态、颜色、荧光、发光、磷光、吸光度、磁性性质或放射性等被检测到的试剂。
″通道″是指液流可流经的间隙。通道可以是毛细管、管道或者在疏水表面上的亲水性图案，水性液流被限制其中。
″微流″是指具有至少一个小于1mm的维度。
″富集样品″是指含有细胞或其他微粒的样品，其经过处理提高了感兴趣的细胞或微粒相对于其他在样品中通常存在的成分的相对量。例如，可通过提高感兴趣的微粒的相对量至少10％、25％、50％、75％、100％或提高至少1000倍、10,000倍、100,000倍或1,000,000倍使样品富集。
″细胞内激活″是指第二信使途径的激活，引起转录因子激活，或者激酶或其他代谢途径激活。通过调节外部细胞膜抗原的细胞内激活也可引起受体运输的变化。
″细胞样品″是指含有细胞或其成分的样品。这样的样品包括天然形成的流体(例如血液、淋巴、脑脊液、尿液、子宫灌洗液(cervical lavage)和水样)，以及细胞被引入其中的流体(例如培养基和液化组织样品)。所述术语也包括裂解产物。
″生物样品″是指源自生物的或含有，或可能含有生物微粒的任何样品。优选的生物样品是细胞样品。
″生物微粒″是指在水性介质中不溶的源自生物的任何物种。例子包括细胞、微粒状细胞成分、病毒和复合物包括蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物。
细胞的″成分″(或者“细胞成分“)是指能在细胞裂解时至少能被部分分离的细胞的任何成分。细胞成分可以是细胞器(例如细胞核、核周小室、核膜、线粒体、叶绿体或细胞膜)，高分子或分子复合物(例如，脂质、聚糖、蛋白质(膜蛋白、跨膜蛋白或胞质蛋白)、核酸(原生核酸、治疗性核酸或病原性核酸)，病毒微粒或核糖体)、细胞内寄生物或病原体，或其他分子(例如荷尔蒙、离子、辅助因子或药物)。
″血液成分″是指全血的任何成分，包括宿主红血细胞，白血细胞和血小板。血液成分也包括血浆成分，例如蛋白、脂质、核酸和糖类，以及可能存在于血液中的任何其他细胞，例如由于目前或过往的怀孕、器官移植或感染。
″对应物″(counterpart)是指虽然在细节水平(例如序列)不同但仍为相同类的细胞成分。例子包括来自不同细胞类型，例如胎儿红血细胞和母体白血细胞的细胞核、线粒体、mRNA和核糖体。
″优先裂解″是指在细胞裂解的时间量程内，相比不需要的细胞，更大程度地裂解感兴趣的细胞。不需要的细胞通常含有与在感兴趣的细胞中发现的相同的细胞成分或其对应物，或者破坏感兴趣的细胞内容物的细胞成分。例如，优先的细胞裂解导致至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的感兴趣的细胞裂解，同时导致少于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的不需要的细胞裂解。优先细胞裂解也可使感兴趣的细胞与不需要的细胞成比例地裂解。
其他特征和优点从以下描述和权利要求是显而易见的。
附图说明
图1A～1E是根据确定性横向偏移分离细胞的阵列的示意图：(A)描述随后行的横向偏移；(B)描述流经间隙的液流如何围绕随后行中的障碍物被不均匀的分流；(C)描述流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒如何在所述装置中横向偏移；(D)描述圆柱形障碍物阵列；以及(E)描述椭圆柱形障碍阵列。
图2是描述流经围绕随后行中障碍物的间隙的液流的不均匀分流的示意图。
图3是所述临界尺寸如何取决于液流剖面的示意图，在该例中所述液流剖面是抛物线。
图4是形状如何影响流经装置的微粒运动的示图。
图5是形变度如何影响流经装置的微粒运动的示图。
图6是确定性横向偏移的示意图。流体动力学尺寸在临界尺寸以上的微粒移动至所述阵列的边缘，而流体动力学尺寸在临界尺寸以下的微粒流过所述装置而没有横向偏移。
图7是三段式装置的示意图。
图8是图7的装置的最大尺寸和分离尺寸(即临界尺寸)的示意图。
图9是旁路通道的示意图。
图10旁路通道的示意图。
图11是具有共同旁路通道的三段式装置的示意图。
图12是具有共同旁路通道的三段双路式装置的示意图。
图13具有共同旁路通道的三段式装置的示意图，其中流过所述装置的液流基本是恒定的。
图14是具有共同旁路通道的三段双路式装置的示意图，其中流过所述装置的液流基本是恒定的。
图15是具有共同旁路通道的三段式装置的示意图，其中在所述旁路通道和相邻段中的流体阻力基本是恒定的。
图16是具有共同旁路通道的三段双路式装置的示意图，其中在所述旁路通道和相邻段中的流体阻力基本是恒定的。
图17是具有两条独立的旁路通道的三段式装置的示意图。
图18是具有两条独立的任意构造的旁路通道的三段式装置的示意图。
图19是具有三条独立的旁路通道的三段双路式装置的示意图。
图20是具有两条独立的旁路通道的三段式装置的示意图，其中流过每一段的液流是基本恒定的。
图21是具有三条独立的旁路通道的三段双路式装置的示意图，其中流过每一段的液流是基本恒定的。
图22是液流导出边界的示意图。
图23是液流导入边界的示意图。
图24是液流导入边界，包括旁路通道的示意图。
图25是位于中央旁路通道两侧的两条液流导入边界的示意图。
图26具有四条通道用作芯片上流阻的装置的示意图。
图27和28是芯片上流阻对在装置内流动的两股液流的相对宽度的作用的示意图。
图29是两个外部区域具有共同入口的双路装置的示意图。
图30A是在装置上多个阵列的示意图。图30B是在装置上具有共同的入口和产品出口的多个阵列的示意图。
图31是具有小底面积的多段式装置的示意图。
图32是血液流经装置的示意图。
图33是描述血细胞的流体动力学尺寸分布的图示。
图34A～34D是在一段式(A)、三段式(B)、双路式(C)或三段双路式(D)装置中将微粒从样品移动至缓冲液的示意图。
图35A是用于将微粒从血液移动至缓冲液从而制造三种产品的两段式装置的示意图。图35B所述两段的最大尺寸和分离尺寸的示意图。图35C是三种产品的组成的示意图。
图36是用于改造的两段式装置的示意图，其中每段都具有旁路通道。
图37是采用液流通道在装置中连接两段的示意图。
图38是采用液流通道在装置中连接两段的示意图，其中所述两段设置为小底面积阵列。
图39A是具有接受来自两段的输出的旁路通道的两段式装置的示意图。图39B利用此装置实现的产品尺寸范围的示意图。
图40是具有位于每段侧面并倒空入同一出口的旁路通道的用于改造的两段式装置的示意图。
图41用于连续移动并改变微粒的装置的示意图。
图42A是本发明的装置的照片。图42B～43E是用于制造本发明的装置的掩膜的描绘图。图42F是盛有血液和缓冲液的本发明的一系列照片。
图43A～43F是由血液样品，由图42的装置所形成的废弃物(缓冲液、血浆、红血细胞和血小板)和产品(缓冲液和成核细胞)的血液分析形成的典型柱状图
图44A～44D是用于制造本发明的装置的掩膜的描绘图。
图45A～45D是用于制造本发明的装置的掩膜的示意图。
图46A是富集胎儿红血细胞的样品的显微图。图46B是母体红血细胞废弃物的显微图。
图47是一系列显示男性胎儿细胞的正鉴定的显微图(蓝色＝细胞核，红色＝X染色体，绿色＝Y染色体)。
图48是一系列显示性和三染色体21的正鉴定的显微图。
图49A～49D是用于制造本发明的装置的掩膜的描绘图。
图50A～50G是图49的装置的电子显微图。
图51A～51D是用于制造本发明的装置的掩膜的描绘图。
图52A～52F是图51的装置的电子显微图。
图53A～53F是图45的电子显微图。
图54A～54D是用于制造本发明的装置的掩膜的描绘图。
图55A～55S是图54的装置的电子显微图。
图56A～56C是图44的装置的电子显微图。
图57是描述胎儿红血细胞核分离的流程图。
图58是在母体血液样品中细胞裂解过程的示意图。
图59是富集感兴趣的细胞并优先裂解在富集样品中的感兴趣的细胞的微流方法的示意图。所述样品首先通过将感兴趣的细胞根据尺寸进入优选通道而富集，然后感兴趣的细胞随之通过控制其在细胞裂解溶液中的滞留时间而选择性地裂解。
图60是根据尺寸将已细胞裂解细胞的细胞核与未细胞裂解的不感兴趣的完整细胞分离的微流法。不感兴趣的细胞被导入废弃物中，而所述细胞核保留在所需产品流中。
图61是描述用于从母体白色细胞中分离胎儿细胞核的替代方法的流程图。
图62是采用基本恒定的间隙宽度和液流输入和液流导出边界的本发明的装置的示意图。
图63a是本发明的集流腔的示意图。图63b是本发明的集流腔的照片。
图64是作为与低渗细胞裂解溶液进行接触的时间的函数的活细胞百分比图。
图65是在细胞裂解缓冲液中作为时间的函数的全血溶血图。
图66a是描述在使用此处所述的Carney′s fix溶液全细胞裂解过程之后的细胞核收集的表格。
图66b是一系列荧光显微图显示采用Carney’s fix调节的全细胞裂解的细胞核样品FISH结果。所述细胞核经FISHed，X(aqua)，Y(绿色)和Y(红色)并用DAPI复染。
图67是详细描述用于裂解细胞和细胞核的各种选项的流程图。
具体实施方式
普遍而言，所述装置包括一个或多个能使流体成分确定性地横向偏移的障碍物阵列。与本发明的装置不同但相类似的为所述目的使用了障碍物的现有技术的装置在例如Huang et al.Science 304，987-990(2004)和美国公开号20040144651中得以描述。根据尺寸分离颗粒的本发明的装置采用了间隙网络阵列，其中流过间隙(gap)的流体被不均匀地分流入随后的间隙中。该阵列包括间隙网络，其排列使得流过间隙的流体被不均匀地分流，即使这些间隙在尺度上是相同的。
所述装置使用液流(flow)携带需要被分离的细胞通过所述间隙阵列。所述液流相对于所述阵列的瞄准线(line-of-sight)成一较小的角度(液流角)。流体动力学尺寸在临界尺寸以上的细胞沿所述阵列的瞄准线迁移，而那些流体动力学尺寸在临界尺寸以下的细胞沿液流流向不同的方向。所述装置中的液流按层流条件形成。
所述临界尺寸是多个设计参数的函数。参考图1中的障碍物阵列，每行立柱(posts)相对于前一行平移Δλ，其中λ是立柱间中心至中心的距离(图1A)。参数Δλ/λ(“分流比”，ε)(bifurcation ratio)决定了分流至下一立柱左侧的液流的比例。在图1中，为描述方便，ε是1/3。概述而言，如果通过两根立柱之间间隙的流量是φ，次要流量是εφ，主要流量是(1-εφ)(图2)。在此例中，流过间隙的液流基本分流为三股(图1B)。虽然所述流过间隙的三股液流中的每一股迂回围绕所述立柱阵列，每股液流的平均方向仍在所述整体流向之中。图1C描述了尺寸在临界尺寸以上的微粒流过所述阵列的运动。这些微粒随所述主要流运动，依次转移至流过每个间隙的主要流(major flux)中。
参考图2，所述临界尺寸为大约2R临界，其中R临界是静止流径线(stagnantflow line)与立柱之间的距离。如果微粒例如细胞的质心与所述立柱相距至少R临界，则所述微粒将随主要流并沿所述阵列的瞄准线移动。如果所述微粒的质心在所述立柱的R临界范围之内，它将随次要流(minor flux)沿不同方向移动。如果已知流过所述间隙的液流剖面(flow profile)则可确定R临界(图3)；所述流体层的厚度将补足(make up)所述次要流。对于指定的间隙尺寸，d，R临界可根据分流比，ε进行调整。通常而言，ε越小则R临界越小。
在用于确定性地水平偏移的阵列中，不同形状的微粒表现为它们似乎具有不同的尺寸(图4)。例如，淋巴细胞为～5μm直径的球体，红血球是～7μm直径，～1.5μm厚的双凹圆盘。红血球的长轴(直径)长于淋巴细胞的直径，但短轴(厚度)却更短。如果由液流驱使流过立柱阵列时，红血球的长轴与液流对齐，其流体动力学尺寸有效地是其厚度(～1.5μm)，这较淋巴细胞更小。当红血球受流体动力学液流驱使通过立柱阵列时，其倾向于将其长轴与液流对齐并表现为类似于～1.5μm宽的微粒，其有效地“小于”淋巴细胞。所述方法和装置因此可根据细胞的形状将其分离，尽管所述细胞的体积可能相同。此外，具有不同形变度的微粒表现为它们似乎具有不同的尺寸(图5)。例如，由于具有更大形变度的细胞在与所述阵列中的障碍物相接触时可变形并改变形状，两种具有未形变形状的微粒可通过确定性地横向偏移而分离。因此，可根据任何影响流体动力学尺寸的参数，包括所述微粒的物理尺度、形状和形变度实现在所述装置中的分离。
参考图6和7，将具有不同流体动力学尺寸的微粒例如细胞的混合物注入所述阵列的顶部并在底物收集所述微粒；如示意图所示，获得两种产品，含有大于临界尺寸，2R临界的细胞的产物和含有小于临界尺寸的细胞的废弃物。虽然在图7中标识为“废弃物“，也可收集在所述临界尺寸以下的微粒而丢弃在所述临界尺寸以上的微粒。两种类型的产物也可都被收集，例如，当把样品细分为两个或两个以上的次级样品时。大于所述间隙尺寸的细胞将被截留在所述阵列中。因此，阵列具有工作尺寸范围。细胞需要大于临界尺寸(2R临界)并小于最大通过尺寸(阵列间隙尺寸)才能被导入所述主要流。
本发明的装置的用途
本发明披露了根据尺寸用于分离微粒，包括细菌、病毒、真菌、细胞、细胞成分、病毒、核酸、蛋白质和蛋白质复合物的改进装置。所述装置可用于对样品中的微粒进行各种处理。所述处理包括微粒的富集或浓缩，包括基于尺寸的分级，或者所述微粒自身的变化或者携带所述微粒的液流的变化。优选为，采用所述装置从不均匀混合物中富集稀有微粒或者改变稀有微粒，例如通过置换所述悬浮液中的液体或将微粒与试剂相接触。这些装置能进行高度富集而对细胞施加有限的影响，例如降低的机械性裂解或细胞的胞内活化。
虽然主要根据细胞进行描述，本发明的装置也可用于任何其他的其尺寸允许其在本发明的装置中进行分离的微粒。
阵列设计
单段式阵列(Single-stage array)。在一个实施方式中，单独的一段(stage)包含有障碍物例如圆柱形立柱(图1D)的阵列。在某些实施方式中，所述阵列具有比所述临界尺寸大数倍的最大通过尺寸，例如，当将红血细胞与白血细胞分离开时。使用较大间隙尺寸d和较小分流比ε可得到该结果。在优选实施方式总，所述ε至多为1/2，例如至多1/3、1/10、1/30、1/100、1/300或1/1000。在这些实施方式中，所述障碍物形状可影响间隙中的液流状态(flow profile)；然而，所述障碍物可在液流流向上被压缩以使所述阵列较短(图1E)。单段式阵列可包括此处描述的旁路通道(bypass channels)。
多段式阵列。在另一个实施方式中，采用多段以分离较宽范围尺寸的微粒。示例性装置在图7中示出。所示装置有三段，但可使用任意数量的段。典型为，在第一段中的截止尺寸(即临界尺寸)大于第二段的截止尺寸，而第一段截止尺寸小于第二段的最大通过尺寸(图8)。这适用于随后的各段。例如，所述第一段将使将在第二段中导致阻塞的微粒在其到达第二段之前偏转(并被移除)。类似地，所述第二段将使将在第三段中导致阻塞的微粒在其到达第三段之前偏转(并被移除)。通常阵列可根据需要具有许多段。
正如所述，在多段式阵列中，将在下游引起阻塞的大颗粒例如细胞首先被偏转，而这些被偏转的微粒需要绕过所述下游段以避免阻塞。因此，本发明的装置可包括旁路通道从阵列中移除产物。虽然此处描述的是移除临界尺寸以上的微粒，但旁路通道也可用于移除来自于阵列任何部分的产物。
如下是不同的旁路通道设计。
单旁路通道。在该设计中，所有段共享一条旁路通道，或者仅有一段。所述旁路通道的物理边界可由所述阵列的边界确定一侧，由侧壁确定另外一侧(图9～11)。单旁路通道也可与双路阵列(duplex arrays)一起使用，因此中央旁路通道将两个阵列分开(即两个外部区域)(图12)。
单旁路通道也可经设计与阵列相连以保持通过装置的恒定液流(图13)。所述旁路通道具有经设计的变化的宽度以使流过所有段的液流恒定，因此在通道中的液流不影响阵列中的液流。这样的设计也可与双路阵列一起使用(图14)。单旁路通道也可经设计与所述阵列相连以保持通过所有段的基本恒定的流体阻力(图15)。这样的设计也可与双路阵列一起使用(图16)。
多旁路通道。在该设计中(图17)，每段有其独有的旁路通道，并且通过侧壁使所述通道相互隔开，例如以防止不同通道内的内容物相混合。大微粒，例如细胞偏转入主要流至所述第一段的右下角然后进入旁路通道(图17中的旁路通道1)。不会在所述第二段中引起阻塞的更小的细胞进入第二段，在第二段的临界尺寸以上的细胞偏转至第二段的右下角并进入另一旁路通道(图17中的旁路通道2)。该设计可根据需要对许多段重复多次。在该实施方式中，所述旁路通道并非液流连通的，使之能分别收集以及进行其他处理。所述旁路通道不需要是直的或者相互平行(图18)，多旁路通道也可与双路阵列一起使用(图19)。
多旁路通道也可经设计与阵列相连以保持通过装置的恒定液流(图20)。在该例中，旁路通道经设计移除一定量的液流，因此在阵列中的液流不受扰动，即基本恒定。这样的设计也可与双路阵列一起使用(图21)。在该设计中，中央旁路通道可由所述双路系统中的两个阵列共享。
最佳边界设计。如果所述阵列无限大，则在每个间隙的液流分布将是相同的。流过间隙的流量φ相同，对于每个间隙的次要流量为εφ。实际上，阵列的边界扰动了该无限流体模式。阵列的边界部分可经设计形成无限阵列的流动模式。边界可以是液流导入型，即所述边界将液流注入所述阵列，或者液流导出型，即所述边界从阵列中排出液体。
优选的液流导出边界逐渐加宽以从所述边界(d＝24μm，ε＝1/60)的每个间隙中导出εφ(由图22中的箭头表示)。例如，所述阵列和侧壁间的距离逐渐加大以使更多的εφ从沿着所述边界的每个间隙中进入边界。由于所述边界设计使得该阵列内的流动模式不受旁路通道的影响。
优选的液流导入边界逐渐变窄以将确切的εφ导入所述边界(d＝24μm，ε＝1/60)的每个间隙中(图23箭头所示)。例如，所述阵列和侧壁间的距离逐渐减小以允许εφ从所述边界加入沿着所述边界的每个间隙中。再次，由于所述边界设计使得该阵列内的流动模式不受旁路通道的影响。
液流导入边界可与阵列(图24)(d＝24μm，ε＝1/60)的间隙等宽或者更宽。如果所述边界用作旁路通道例如用于收集微粒，则需要较宽的边界。也可采用边界，用其整体液流的一部分导入所述阵列中，将εφ导入所述边界的每个间隙中(在图24中由箭头表示)。
图25显示在双路阵列(ε＝1/10，d＝8μm)中的单旁路通道。所述旁路通道包括两条液流导入边界。通过所述旁路通道中虚线1的流量是Φ旁路。液流φ从所述虚线左侧的间隙加入到Φ旁路中。在边界处的障碍物的形状经调整使得进入阵列的液流在边界的每个间隙处为εφ。在虚线2处的流量仍为Φ旁路。
装置设计
用于限定和稳定液流的on-chip液体阻碍物
本发明的装置也可采用液体阻碍物(fluidic resistors)以限定和稳定阵列内的液流并且也可限定从所述阵列中收集的液流。图26显示了平面装置的示意图；样品如血液，入口通道，缓冲液入口通道，废弃物出口通道和产品出口通道分别与阵列相连。所述入口和出口用作液流阻碍物(f1owresistors)。图26还显示这些不同装置部分的流体阻力(fluidic resistances)。
所述阵列内的液流确定
图27和28显示当所述装置具有恒定的深度并在指定压降下运行时在所述阵列内的样品和缓冲液流的的流向及其相应宽度。由所述压降除以所述阻力确定液流。在该特定装置中，I血液和I缓冲液是相同的，这确定了在所述阵列中的血液和缓冲液流的相同宽度。
收集部分的确定
通过控制所述产品和废弃物出口通道的相对阻力，可以调节每个部分(fraction)的收集容许量(collection tolerance)。例如，在该套特定的示意中，当R产品大于R废弃物时，将得到更浓缩的产品部分，其代价为潜在增加的进入废弃物部分的损失以及废弃物部分的稀释。相反地，当R产品小于R废弃物时，将得到更加稀释以及更高产率的产品部分，其代价为来自废弃物流的潜在污染。
液流稳定
每条入口和出口通道可经设计使得通过所述通道的压降是可测量的，或者大于整体驱动压力的波动。在典型情况下，所述入口和出口的压降为驱动压力的0.001～0.99倍。
多路阵列
本发明公开了多路阵列。在装置中放置多个阵列提高样品处理量并可为不同部分或操作进行多个样品或样品部分的平行处理。对于制备装置，进一步需要多路化。最简单的多路装置包括依次相连，即级联的两个装置。例如，一个装置的主要流的输出可与第二装置的输入相偶连。作为另外一种选择，一个装置的次要流的输出可与第二装置的输入相偶连。
多路化。两个阵列可并行放置，例如如镜像一样(图29)。在这样的排列中，所述两个阵列的临界尺寸可以是相同或者不同。此外，所述阵列可经放置使得所述主要流流向所述两个阵列的边界，流向每个阵列的边缘，或其组合。所述双路阵列也可包括放置在所述阵列间的中央旁路通道，例如以收集在临界尺寸以上的微粒或者例如通过缓冲液交换、反应或标记改变所述样品。
同一装置中的多路。除形成双路外，具有分开的输入的两个或多个阵列可放置在同一装置上(图30A)。这样的配置可用于多个样品，或者多个阵列可与同一入口相连以平行处理相同的样品。在同一样品的平行处理中，所述出口可以是或者可以不是液流连通的。例如，当多个阵列具有相同的临界尺寸时，所述出口可以连通以获得高流量的产品处理。在另一例子中，所述阵列不是全部具有相同的临界尺寸或者在阵列中的微粒可以不全部按照相同的方式处理，所述出口可以不是液流连通的。
也可通过在单一装置上放置多个双路阵列实现多路化(图30B)。多个阵列，双路或单路，可以以相互之间的任何可能的三维关系放置。
本发明的装置还公开了小底面积型(small-footprint)。减小阵列的占用底面积(footprint)可降低成本，并减少与障碍物的碰撞数以消除任何潜在的对微粒的机械损伤或其他影响。如果各段之间的边界不与流向垂直，所述多段式阵列的长度可以缩短。当段数增加时，长度的缩减将变得明显。图31显示了小底部三段式阵列。
附加部分
除间隙阵列之外，本发明的装置可包括附加部件，例如用于分离、收集、处理或检测。这些部件在本领域中已知。也可在具有用于其他类型分离，包括亲合性、磁性、电泳、离心和双向电泳分离的部件的装置上采用阵列。本发明的装置也可以与用于对所述装置的输出进行二维成像的部件一同使用，例如孔阵列或平坦表面。优选为，此处描述的间隙阵列与亲合富集联合使用。
本发明也可与其他富集装置或者在同一装置中，或者在不同装置中联合使用。其他富集技术在例如国际公第2004/029221号和第2004/113877号，美国专利第6,692,952号，美国专利申请公开2005/0282293和2005/0266433，以及美国申请第60/668,415号得以描述，其中每一个均以引用的方式在此引入。
制造方法
本发明的装置可采用本领域内已知的方法制造。制造技术的选择取决于所述装置所用的材料和所述阵列的尺寸。用于制造本发明的装置的示例性材料包括玻璃、硅、钢、镍、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚烯烃、硅树脂(例如，聚(二甲基硅氧烷))，及其组合。其他材料在本领域内已知。例如，深反应离子蚀刻(DRIE)用于制造小间隙、小障碍物和大纵横比(障碍物高度与横向尺度之比)的基于硅的装置。可以使用塑料装置的热成型(模压、注射成型)，例如当最小横向部件是20微米并且这些部件的纵横比小于3时。其他方法包括光蚀刻法(例如光固化立体造型或X-光蚀刻法)、模制、模压、硅显微机械加工、湿法或干法化学蚀刻、轧制、钻石切割、光刻-电铸-复写技术(Lithographie Galvanoformung and Abformung(LIGA))和电镀。例如，对于玻璃，可采用传统的光蚀刻硅制造技术，随后进行湿法(KOH)或干法蚀刻(用氟或其他反应性气体的反应性离子蚀刻)。诸如激光显微机械加工等技术可用于具有高光子吸收效率的塑料材料。由于其过程的连续性，该技术适用于更低产量的制造。对于大规模制造的塑料装置，热塑注射成型和压缩成型可能是适用的。用于大规模制造致密碟片(其保留了亚微米尺度下的特征的保真度)的传统热塑注射成型也可用于制造本发明的装置。例如，通过传统光蚀刻在玻璃母版上复制所述装置特征形状。将所述玻璃母版电铸得到坚硬、耐热冲击、导热的硬模具。该模具用作将所述特征注射成型或压缩成型为塑料装置的母版。根据制造所述装置的塑料材料以及所完成产品的光学质量和产量要求，压缩成型或注射成型可选作为制造方法。压缩成型(也称为热凸凹压印或relief imprinting)的优势在于和高分子量聚合物相容，所述高分子量聚合物对于小型结构是优越的，但难以用于复制高纵横比结构，并且具有更长的循环次数。注射成型能很好地用于高纵横比结构但最适用于较低分子量的聚合物。
可先制造一个部分或者多个部分，然后进行组装以制造装置。装置的层可通过夹紧、粘合剂、热、anodic bonding或表面基团之间的反应(例如晶片键合)而结合在一起。作为另外一种选择，例如使用光固化立体造型(stereolithography)或其他三维制造技术能将在多于一个平面上具有通道的装置制成为单一一片。
为减少例如由被裂解的细胞所释放的或者在生物样品中所发现的细胞或化合物非特异性地吸附到通道壁上，一面或多面通道壁可被化学修饰为非粘附性的或者排斥性的。所述壁可用商业非粘性试剂，诸如用于形成水凝胶的试剂的薄膜涂层(例如单层)进行涂敷。能用于使所述通道壁改性的化学物种(chemical species)的更多例子包括寡聚乙二醇、氟化聚合物、有机硅烷、硫醇、聚乙二醇、透明质酸、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、黏蛋白、聚HEMA、甲基丙烯酸化PEG和琼脂糖。也可使用带有电荷的聚合物以排斥带有相反电荷的物种。用于排斥的化学物种的类型以及连接到所述通道壁上的方法取决于被排斥的物种的性质以及所述壁和所连接的物种(species)的性质。这些表面改性技术在本领域里已知。所述壁可在所述装置组装之前或之后被功能化。所述通道壁也可以为了俘获样品中的材料，例如膜片断或蛋白质而被涂敷。
运行方法
在任何其中需要产生富集临界尺寸以上或者以下的微粒的样品的应用中可采用本发明的装置。所述装置的优选用途是制备富集了细胞例如稀有细胞的样品。一旦制得富集样品，可进行收集以用于分析或者其他处理，例如通过进一步的富集。
本发明的方法使用液流携带需要被分离的细胞通过所述间隙阵列。所述液流相对于所述阵列的瞄准线成一较小的角度(液流角)。流体动力学尺寸在临界尺寸以上的细胞沿所述阵列的瞄准线迁移，而那些流体动力学尺寸在临界尺寸以下的细胞沿液流流向不同的方向。所述装置中的液流按层流条件发生。
本发明的方法可用于浓缩样品，例如其中微粒相互接触、流体动力学地相互作用，或者对围绕其他微粒的流体分布产生影响。例如，所述方法可将来自捐献者的全血中的白血细胞与红血细胞分离开。人类血液通常含有～45体积％的细胞。当其流过所述阵列时，细胞之间流体动力学地相互接触和/或结合。图32示意性地显示细胞紧密地挤在阵列中并且彼此之间能相互物理地作用。
富集
在一个实施方式中，本发明的方法用于制备其中具有所希望的流体动力学尺寸的微粒被富集的样品。这样的富集应用包括浓缩微粒如稀有细胞，尺寸分化(size fractionization)如尺寸过滤(size filtering)(选择在特定尺寸范围内的细胞)。所述方法还可用于富集细胞成分如细胞核。细胞核或其他细胞成分可通过处理所述样品，例如此处描述的裂解而得到，或者例如通过细胞凋亡或者坏死而天然存在于所述样品中。理想地是，与初始混合物相比，本发明的方法保留至少1％、10％、30％、50％、75％、80％、90％、95％、98％或99％的所需微粒，并且相对于一种或多种不想要的微粒，可能将想要的微粒富集至少1、10、100、1000、10,000、100,000或者甚至1,000,000倍。所述富集也可导致相对于原始样品的被分离微粒的稀释，尽管被分离微粒相对于样品中其他微粒的浓度得以提高。优选地，所述稀释至多为90％，例如至多75％、50％、33％、25％、10％或者1％。
在优选实施方式中，所述方法制备了其中稀有微粒如细胞被富集的样品。通常而言，稀有微粒是指以少于样品的10％而存在的微粒。取决于所述样品，示例性稀有微粒包括胎儿细胞、成核红细胞(例如胎儿的或者母体的)、干细胞(例如未分化的)、癌细胞、免疫系统细胞(宿主或移植物)、上皮细胞、结缔组织细胞、细菌、真菌、病毒、寄生物和病原体(例如细菌或原生动物)。这些稀有微粒可从样品中分离，所述样品包括体液例如血液，或者环境来源例如水样中的病原体。例如为了在正在发育的胎儿中确定性别和鉴别异倍体或者基因特征例如突变的目的，可从母体外周血液中富集胎儿细胞，例如成核RBC。为了诊断和监视治疗过程的目的，可从外周血液中富集癌细胞。体液或环境样品也可用于筛选病原体或寄生物例如大肠杆菌，血液传播疾病例如败血症，或者细菌性或病毒性脑膜炎。稀有细胞还包括来自一种生物体而存在于另一生物体中的细胞，例如来自移植器官的in细胞。
除稀有微粒的富集之外，本发明的方法还可用于制备性用途。示例性制备用途包括生成来自血液的细胞群(cell packs)。本发明的方法可经过设计以制备富集了血小板、红血细胞和白细胞的部分。通过使用多路装置或多段式装置，所有三种细胞部分能从相同样品中平行制备或顺序制备。在其他实施方式中，所述方法可用于从例如脐带血源中将无核细胞与成核细胞分离开。
在被富集的细胞需要经受破坏或其他降解的情况下使用本发明的方法是有利的。如此处所述，本发明的装置可经设计使细胞富集而所述细胞和障碍物之间的碰撞次数降至最低限度。该最小化减小了对细胞的机械损伤并且也防止了由于所述碰撞导致的细胞内活化。所述对细胞的温和操作保留了样品中有限数目的稀有细胞，防止了细胞破裂导致细胞内成分引起的污染或降解，并且防止了细胞例如干细胞或血小板的成熟化或活化。在优选实施方式中，细胞被富集使得少于30％、10％、5％、1％、0.1％或者甚至0.01％的细胞被活化或者机械性地被裂解。
图33显示在人类外周血液中细胞的典型尺寸分布。白血细胞从～4μm至～18μm，而红血细胞为～1.5μm(短轴)。经设计用于分离白血细胞和红血细胞的装置通常具有2μm～4μm的截止尺寸(即临界尺寸)和大于18μm的最大通过尺寸。
在可作为替换的实施方式中，所述装置可用作红血细胞异常的检测器。分类的确定性原理使得可预测在所述装置中被偏转的无核细胞的百分比结果。在疾病状态下，例如疟疾感染或镰状细胞性贫血，红血细胞的形状和柔性的变形将显著改变被偏转的细胞的百分比。该变化可被监测作为第一级的警告预示着潜在的疾病生理学状况，随后对红细胞的形状和尺寸进行显微检查以确定所述疾病。所述方法也通常可用于监测样品中微粒柔性的任何变化。
在可作为替换的实施方式中，所述装置可用作血小板凝结的检测器。分类的确定性原理使得可预测在所述装置中被偏转的游离血小板的百分比结果。活化的血小板将形成凝块，而所述凝块将发生偏转。该变化可被监测作为第一级的警告预示用于再输入的血小板群的效力降低。所述方法也通常可用于监测样品中微粒尺寸的任何变化，例如经聚集发生的尺寸变化。
改变
在本发明的方法的其他实施方式中，感兴趣的细胞与改变剂相接触，所述改变剂能化学地或物理地改变所述悬浮液中的微粒或流体。如此的用途包括纯化、缓冲液置换、标记(例如免疫组织化学、磁性和组织化学标记，细胞染色，和流式原位荧光杂交(FISH))、细胞固定、细胞稳定、细胞裂解和细胞活化。
这些方法可将样品中的微粒转移至不同的液体中。图34A示意性地显示了单段式装置的这种作用效果，图34B显示了多段式装置的这种作用效果。图34C显示了双路阵列的这种作用效果，以及图34D显示了多段式双路阵列的这种作用效果。通过使用所述方法，可从血浆中分离血细胞。所述将微粒从一种液体转移至另一液体也可用于形成一系列的变化，例如芯片上Wright血液染色。这样的顺序可包括使微粒与第一试剂反应，然后将所述微粒转移至洗涤缓冲液中，然后再转移至其他试剂。
图35A、35B、35C描述了在具有两条旁路通道的两段式装置中进行改变的另一个例子。在该例子中，将大血液微粒在第1段中从血液移至缓冲液中并收集，中等血液微粒在第2段中从血液移至缓冲液，然后收集在第1段和第2段中未被移除的小血液微粒。图35B描述了所述两段的截止尺寸，图35C描述收集的三种部分(fractions)的尺寸分布。
图36描述了在两段式装置中进行改变的例子，所述两段式装置具有放置在所述阵列的横向边缘和通道壁之间的旁路通道。除了所述两段由液流通道相连通之外，图37描述了与图36类似的装置。图38描述了在具有较小底面积(footprint)的两段的装置中进行的改变。图39A～39B描述了在其中第一段和第二段的输出在单一通道中俘获的装置中进行的改变。图40描述了用在本发明的方法中的另一装置。
图41描述了本发明的装置用于对微粒进行多重依次的改变。在该方法中，将血液微粒从血液中移至将与所述微粒发生反应的试剂中，然后将反应后的微粒移至缓冲液中，从而除去未反应的试剂或反应副产物。可增加更多步骤。
在另一实施方式中，可将试剂加入到样品中选择性地或非选择性地增加样品中微粒的流体动力学尺寸。该经过改变的样品随后泵入通过障碍物阵列。由于所述微粒溶胀并具有增加的流体动力学直径，因此可使用具有更大更容易制造的间隙尺寸的障碍物阵列。在优选实施方式中，所述溶胀步骤和基于尺寸的富集以集成的方式在装置中进行。合适的试剂包括任何低渗溶液例如去离子水、2％糖溶液或者纯非水溶剂。其他试剂包括能选择性(例如通过抗体或抗生物素蛋白-生物素)或非选择性结合的小珠，例如磁性的或聚合物。
在可以作为替换的实施方式中，加入到样品中的试剂选择性地或非选择性地减小样品中微粒的流体动力学尺寸。样品中微粒的非均一减小增加了微粒间流体动力学尺寸的差异。例如，通过高渗收缩所述细胞可将成核细胞与无核细胞分离。所述无核细胞能缩至非常小的微粒，而所述成核细胞不能缩小至细胞核的尺寸以下。示例性的收缩剂包括高渗溶液。
在另一实施方式中，相对于样品中其他微粒，亲合功能化的小珠可用以提高感兴趣的微粒的体积，从而可以使用具有更大更易于制造的间隙尺寸的障碍物阵列。
富集和改变也可以相结合，例如当所需要的细胞与裂解剂相接触时，并根据尺寸富集细胞成分例如细胞核。在另一例子中，微粒可与微粒性标记例如磁性小珠相接触，所述磁性小珠将与所述微粒相结合。根据尺寸可移除未结合的微粒性标记。
与其他富集技术相结合
采用本发明的装置的富集和改变方法可与其他微粒样品处理技术相结合。具体而言，可能需要微粒的进一步富集或纯化。进一步富集可通过任何技术进行，包括亲合富集。适宜的亲合富集技术包括将感兴趣的微粒与连接在通道壁或障碍物阵列上的亲合试剂相接触。
流体可主动地或被动地通过装置驱动。可使用电场、离心场、压力驱动液流和电-渗透液流和毛细管作用将流体泵入。在优选实施方式中，所述场的平均方向将与含有所述阵列的通道壁相平行。
优先裂解的方法
本发明进一步提供用于优先裂解样品中感兴趣的细胞的方法，例如从感兴趣的细胞的细胞成分如细胞核中提取临床信息。概述之，所述方法在所述样品中的感兴趣的细胞和其他细胞(例如其他成核细胞)之间采用有差别的裂解。
裂解
可使用任何适合的方法对感兴趣的细胞进行裂解。在本发明的方法的一个实施方式中，可通过将细胞与能引起优先裂解的溶液相接触而使细胞裂解。用于这些细胞的裂解溶液可包括细胞特异性IgM分子和补体级联中的蛋白质以启始补体调节的裂解。其他类型的裂解溶液可包括感染特定细胞类型并由于复制而导致裂解的病毒(参见例如Pawlik et al.Cancer 2002，95：1171-81)。其他裂解溶液包括破坏细胞渗透平衡而导致裂解的溶液，例如低渗溶液或高渗溶液(例如蒸馏水)。其他裂解溶液在本领域内已知。裂解也可通过机械方式发生，例如通过使细胞穿过滤网或其他能机械性地破坏所述细胞的结构，通过施加热能、声能或光能以裂解所述细胞，或者通过细胞调控过程诸如细胞凋亡和细胞坏死。也可通过使细胞经受一个或多个冷冻融解循环使其裂解。此外，也可采用去污剂使所述细胞膜溶解，使所述细胞溶解以释放其内容物。
在一个实施方式中，感兴趣的细胞是稀有细胞，例如循环癌细胞、胎儿细胞(例如胎儿成核红血细胞)、血液细胞(例如成核红血细胞，包括母体和/或胎儿成核红血细胞)、免疫细胞、结缔组织细胞、寄生物或病原体(例如细菌、原生动物和真菌)。大多数感兴趣的循环稀有细胞具有受损的膜整体性，这是被宿主RES(网状-内皮-系统)免疫攻击的结果，并因此更容易被裂解。
在一个实施方式中，当感兴趣的细胞流过微流装置时被裂解，例如在国际公开WO 2004/029221和WO 2004/113877中或者在此处所描述的。在另一实施方式中，感兴趣的细胞首先与微流装置中的障碍物相结合，例如在美国专利第5,837,115号中所述，然后再被裂解。在该实施方式中，感兴趣的细胞的细胞成分从所述障碍物释放，而不需要的细胞的细胞成分保持结合。
细胞成分的收集
可通过任何适宜的方法将所需要的细胞成分与细胞裂解产物相分离，例如根据尺寸、重量、形状、电荷、亲水性/疏水性、化学反应性或惰性、或者亲和性。例如，核酸、离子、蛋白质和其他带电荷的物种(species)可通过离子交换树脂俘获或者通过电泳分离。根据尺寸或重量，通过尺寸排阻色谱、离心或过滤也可分离细胞成分。细胞成分也可通过亲合机制(即特异性的结合相互作用，诸如抗体-抗原以及核酸互补相互作用)进行分离，例如亲合色谱，与结合在表面上的亲合物种相结合，以及基于亲和性的沉淀。特别是，核酸例如基因组DNA可通过与例如与小珠或阵列相连的序列特异性探针的杂交而分离。也可通过根据形状或形变度或非特异性化学相互作用收集细胞成分，例如色谱或者反相色谱或者用盐或其他试剂如有机溶剂进行沉淀。也可根据化学反应收集细胞成分，例如与游离胺或硫醇相结合。在收集前，可改变细胞成分使得能进行或者增强特定模式的收集，例如通过变形、酶切割(例如蛋白酶、核酸内切酶、核酸外切酶或限制性核酸内切酶)或者标记或者其他化学反应。
所收集的细胞成分要求的纯度水平取决于采用的具体处理并可由有经验的技术人员确定。在某些实施方式中，所述细胞成分可能并不需要从所述细胞裂解产物中分离，例如当感兴趣的细胞成分可被分析或被进行其他处理而不受其他细胞成分的干扰时。基于亲合性的处理(例如与带有或不带有可探测标记的核酸探针或引物、适体(aptamers)、抗体或者序列特异性嵌入剂反应)能被使用而不进行所述细胞成分的纯化。
在一个实施方式中，例如在美国申请公开2004/0144651或此处所描述的装置被用于根据尺寸从细胞裂解产物中分离感兴趣的微粒细胞成分，例如细胞核。在该实施方式中，使用所述装置可将所述感兴趣的微粒细胞成分与其他微粒细胞成分和完整的细胞分离开。
细胞成分的处理
一旦通过裂解而被释放或者通过其他方式获得，例如通过此处描述的基于尺寸的分离方法得到，所需要的细胞成分可进行进一步的处理，例如鉴别、计数、反应、分离或被破坏。在一个实施方式中，所述细胞成分包含核酸，例如细胞核、线粒体、和核或细胞质DNA或RNA。具体而言，核酸可包括RNA例如mRNA或rRNA，或DNA例如染色体DNA，诸如已被切割的，或者经历细胞凋亡过程的DNA。在细胞成分中的核酸的基因分析可通过任何适宜的方法进行，例如PCR、FISH和测序。基因信息可用于诊断疾病，作为遗传病携带者的状态，或者病原体或寄生物感染。如果得自于胎儿细胞，可以得到与性别、亲子关系、突变(例如囊肿性纤维化)和异倍体(例如三染色体21)相关的基因信息。在一些实施方式中，胎儿细胞或其成分的分析用以确定是否存在基因异常，诸如染色体、DNA或RNA异常。常染色体异常的例子包括但不局限于Angleman综合征(15ql1.2-ql3)、猫哭综合征(cri-du-chat syndrome)(5p-)、迪乔治综合征(DiGeorgesyndrome)和Velo-cardiofacial综合征(22ql1.2)、Miller-Dieker综合征(17pl3.3)、普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome)(15ql1.2-ql3)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)(13ql4)、史密斯-马坚尼斯综合征(Smith-Magenis syndrome)(17pl1.2)、三染色体13(trisomy 13)、三染色体16、三染色体18、三染色体21(唐氏综合征(Down syndrome))、三倍体、威廉综合征(Williams syndrome)(7ql1.23)和Wolf-Hirschhorn(4p-)。性染色体异常的例子包括但不局限于卡尔曼氏综合征(Kallman syndrome)(Xp22.3)、类固醇硫酸盐缺乏(STS)(Xp22.3)、X-连锁的ichthiosis(Xp22.3)、克兰费尔特氏综合征(Klinefelter syndrome)(XXY)；脆性X综合征(fragile Xsyndrome)；特纳综合征(Turner syndrome)；超雌或三X染色体；和单X染色体。能由此处的系统分析的其他更不常见的染色体异常包括，但不局限于缺失(小的缺少节段)；微型缺失(微小量的缺少材料，可仅仅包括单个基因)；易位(一段染色体与另一染色体相连)；以及倒位(一段染色体断裂并重新倒置插入)。在一些实施方式中，胎儿细胞或其成分的分析用于分析SNP并根据这些SNP预测胎儿的状况。如果得自癌症细胞，可以获得与致瘤特性相关的基因信息。如果得自病毒或细菌细胞，可获得与病原性和分类学相关的基因信息。对于非基因细胞成分，所述成分可经分析以诊断疾病或者监测健康状况。例如，来自稀有细胞如胎儿细胞的蛋白质或代谢物可由任何适宜的方法分析，包括基于亲合性的分析(例如ELISA)或其他分析技术，例如色谱和质谱。
一般性考量
在此处描述的方法中可使用的样品可经过或不经过纯化，例如稳定化和移除某些成分。一些样品可在加入所述装置之前被稀释或者浓缩。
在本发明的方法的另一实施方式中，样品与例如美国专利第5,837,115号或此处所描述的含有多个障碍物的微流装置相接触。感兴趣的细胞与连接在所述装置中障碍物上的亲合性部分相结合，并因此相对于不需要的细胞而得以富集，例如在WO 2004/029221中所描述。
在本发明的方法的另一实施方式中采用相似的装置，不感兴趣的细胞与连接在所述障碍物上的亲和性部分相结合，而使感兴趣的细胞流过，得到富集了感兴趣的细胞的样品，例如在WO 2004/029221中所述。在两步法中可以联合使用基于尺寸的方法和基于亲合性的方法以进一步富集样品中感兴趣的细胞。
在本发明的另一实施方式中，通过与含有多个障碍物的微流装置接触而使细胞样品预过滤，所述多个障碍物经放置使得在某个尺寸以上的微粒偏转至沿与液流平均流向不平行的方向前进，例如在美国申请公开2004/0144651中或此处所描述。
实施例
实施例1多路化14个三段式阵列双路的硅装置(A silicon devicemultiplexing 14 3-stage array duplexes)
图42A～42E显示本发明的示例性装置，其特征如下。
尺寸：90mm×34mm×1mm
阵列设计：3段式，对于第一、第二、第三段，间隙大小分别＝18μm、12μm、8μm。分流比＝1/10。双路；单旁路通道
装置设计：多路化14个阵列双路；用于液流稳定的液流阻碍物
装置制造：使用标准光蚀刻和深硅反应性蚀刻技术在硅里制造所述阵列和通道。蚀刻深度为150μm。使用KOH湿法蚀刻制造让液流通过的穿孔。使用与血液相容的压力敏感性粘合剂(9795，3M，St Paul，MN)在蚀刻面密封所述硅基材以形成封闭流体通道。
装置装配：将所述装置与带有外部流体贮液室的塑料集流腔(manifold)机械性地相连以向所述装置输送血液和缓冲液并导出所生成的部分。
装置运行：使用外压力源以施加2.4PSI的压力至所述缓冲液和血液贮液室(reservoir)以调节液流输送和从所述装配好的装置中导出。
实验条件：来自知情同意的成年捐献者的人类血液经收集入K2EDTA真空管(366643，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。在室温下，在抽血后9小时之内，用上述示例性装置处理所述未稀释的血液(图42F)。来自所述血液的成核细胞与无核细胞(红血细胞和血小板)分开，而血浆被输送至不含钙和镁的Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(14190-144，Invitrogen，Carlsbad，CA)的缓冲液流中，所述Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水含有1％的牛血清白蛋白(BSA)(A8412-100ML，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)。
测量技术：使用Coulter阻抗血液分析仪(COULTERAc·T diffTM，Beckman Coulter，Fullerton，CA)测定完全血液计数。
结果：图43A～43F显示由所述血液分析仪生成的由所述装置制备的血液样品和废弃物(缓冲液、血浆、红血细胞和血小板)和产物(缓冲液和成核细胞)部分的典型柱状图。下表显示5种不同血液样品的执行结果：
样品编号 流量 执行结果 RBC 移除 血小板 移除 WBC 损失
1 2 3 4 5 4mL/hr 6mL/hr 6mL/hr 6mL/hr 6mL/hr 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 99％ 99％ 99％ 97％ 98％ ＜1％ ＜1％ ＜1％ ＜1％ ＜1％
实施例2 多路化14个单段式阵列双路的硅装置(A silicon devicemultiplexing 14 single-stage array duplexes)
图44显示本发明的示例性装置，其特征如下：
尺寸：90mm×34mm×1mm
阵列设计：1段式，间隙＝24μm。分流比＝1/60。双路；双旁路通道。
装置设计：多路化14阵列双路；用于液流稳定的液流阻碍物
装置制造：使用标准光蚀刻和深硅反应性蚀刻技术在硅里制造所述阵列和通道。蚀刻深度为150μm。使用KOH湿法蚀刻制造让液流通过的穿孔。使用与血液相容的压力敏感性粘合剂(9795，3M，St Paul，MN)在蚀刻面密封所述硅基材以形成封闭流体通道。
装置装配：将所述装置与带有外部流体贮液室的塑料集流腔机械性地相连以向所述装置输送血液和缓冲液并导出所生成的部分。
装置运行：使用外压力源以施加2.4 PSI的压力至所述缓冲液和血液贮液室以调节液流输送和从所述装配好的装置中的导出。
实验条件：来自知情同意成年捐献者的人类血液经收集入K2EDTAvacutainers(366643，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。在室温下，在抽血后9小时之内，用上述示例性装置处理所述未稀释的血液。来自所述血液的成核细胞与无核细胞(红血细胞和血小板)分离，而血浆被输送至不含钙和镁的Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(14190-144，Invitrogen，Carlsbad，CA)的缓冲液流中，所述Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水含有1％的牛血清白蛋白(BSA)(A8412-100ML，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)。
测量技术：使用Coulter阻抗血液分析仪(COULTERAc·T diffTM，Beckman Coulter，Fullerton，CA)测定完全血液计数。
执行结果：所述装置运行在17mL/hr并实现＞99％的红血细胞移除，＞95％的成核细胞保留，和＞98％的血小板移除。
实施例3.胎儿脐带血的分离
图45显示用于分离来自胎儿脐带血的成核细胞的装置的示意图。
尺寸：100mm×28mm×1mm
阵列设计：3段式，对于第一、第二、第三段，间隙大小分别＝18μm、12μm、8μm。分流比＝1/10。双路；单旁路通道。
装置设计：多路化10阵列双路；用于液流稳定的液流阻碍物
装置制造：使用标准光蚀刻和深硅反应性蚀刻技术在硅里制造所述阵列和通道。蚀刻深度为140μm。使用KOH湿法蚀刻制造让液流通过的穿孔。使用与血液相容的压力敏感性粘合剂(9795，3M，St Paul，MN)在蚀刻面密封所述硅基材以形成封闭流体通道。
装置装配：将所述装置与带有外流体贮液室的塑料集流腔机械性地相连以向所述装置输送血液和缓冲液并导出所生成的部分。
装置运行：使用外压力源以施加2.0PSI的压力至所述缓冲液和血液贮液室以调节液流输送和从所述装配好的装置中导出。
实验条件：将人类胎儿脐带血吸入含有酸性柠檬酸盐葡萄糖(Acid Citrate Dextrose)抗凝剂的磷酸盐缓冲盐水中。在室温下，在抽血后48小时之内，用上述装置以3ml/hr处理一毫升血液。来自所述血液的成核细胞与无核细胞(红血细胞和血小板)分开，而血浆被输送至不含钙和镁的Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(14190-144，Invitrogen，Carlsbad，CA)的缓冲液流中，所述Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水含有1％的牛血清白蛋白(BSA)(A8412-100ML，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和2mM EDTA(15575-020，Invitrogen，Carlsbad，CA)。
测量技术：使用改进的的Wright-Giemsa(WG16，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)制备产物和废弃物部分(图46A～46B)的细胞抹片并染色。
执行结果：在产物部分中观察到胎儿成核红血细胞(图46A)，在废弃物部分不存在胎儿成核红血细胞(图46B)。
实施例4.从母体血液中分离胎儿细胞
在实施例1中详细描述的装置和步骤与免疫磁性亲合性富集技术联合使用以证明从母体血液中分离胎儿细胞的可行性。
实验条件：在选择终止妊娠之后立即将来自怀有男性胎儿的知情同意母亲捐献者的血液收集入K2EDTA真空管(366643，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。在室温下，在抽血后9小时之内采用在实施例1中描述的装置处理所述未稀释的血液。来自所述血液的成核细胞与无核细胞相分离(红血细胞和血小板)，而血浆被输送至不含钙和镁的Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(14190-144，Invitrogen，Carlsbad，CA)的缓冲液流中，所述Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水含有1％的牛血清白蛋白(BSA)(A8412-100ML，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)。随后，用抗-CD71微型珠(130-046-201，Miltenyi Biotech Inc.，Auburn，CA)标记所述成核细胞部分并使用MiniMACSTM MS column(130-042-201，Miltenyi Biotech Inc.，Auburn，CA)按照制造商的说明进行富集。最终，将CD71-阳性部分滴在载玻片上。
测量技术：根据制造商的说明采用Vysis探针(Abbott Laboratories，Downer′s Grove，IL)，用荧光原位杂交(FISH)技术对涂有样品的载玻片进行染色。由于存在X和Y染色体而使样品染色。在一种情况下，由已知的三染色体21妊娠制得的样品也可由于染色体21而染色。
执行结果：通过在由所述成核细胞部分(图47)制备的CD71-阳性群体里雄性细胞确实存在可以确定分离了胎儿细胞。在所测试的唯一异常的情况中，也鉴别出所述三染色体21病理(图48)。
以下实施例显示了本发明装置的具体实施方式。每个装置的描述提供了依次的段编号、每段的间隙尺寸、ε(液流角)和每个装置的通道数(阵列/芯片)。采用DRTE由硅制造了每个装置，并且每个装置都具有热氧化物层。
实施例5
该装置包括在单一阵列中的五段。
阵列设计： 5段，非对称阵列
间隙尺寸： 第1段：8μm
第2段：10μm
第3段：12μm
第4段：14μm
第5段：16μm
液流角： 1/10
阵列/芯片： 1
实施例6
本装置包括三段，其中每一段是具有旁路通道的双路。所述装置的高度为125μm。
阵列设计： 具有中央收集通道的对称3段式阵列
间隙尺寸： 第1段：8μm
第2段：12μm
第3段：18μm
第4段：
第5段：
液流角： 1/10
阵列/芯片： 1
其他： 中央收集通道
图49A显示用于制造所述装置的掩膜。图49B～49D是勾画出了入口、阵列和出口的掩膜局部放大图。图50A～50G显示了实际装置的SEM。
实施例7
该装置包括三段，其中每一段是具有旁路通道的双路。“鳍”(Fins)经设计位于所述旁路通道侧面以防止所述旁路通道中的流体再次进入所述阵列。所述芯片还包括芯片上的液流阻碍物，即所述入口和出口具有比所述阵列更大的流体阻力。所述装置的高度为117μm。
阵列设计： 3段式对称阵列
间隙尺寸： 第1段：8μm
第2段：12μm
第3段：18μm
第4段：
第5段：
液流角： 1/10
阵列/芯片： 10
其他： 大型鳍状中央收集通道
芯片上的液流阻碍物
图51A显示用于制造所述装置的掩膜。图51B～51D是勾画出了入口、阵列和出口的掩膜局部放大图。图52A～52F显示了实际装置的SEM。
实施例8
该装置包括三段，其中每一段是具有旁路通道的双路。“鳍”经设计位于所述旁路通道侧面以防止所述旁路通道中的流体再次进入所述阵列。与所述阵列最接近的鳍的边缘经设计以模拟所述阵列的形状。所述芯片还包括芯片上的液流阻碍物，即所述入口和出口具有比所述阵列更大的流体阻力。所述装置的高度为138μm。
阵列设计： 3段式对称阵列
间隙尺寸： 第1段：8μm
第2段：12μm
第3段：18μm
第4段：
第5段：
液流角： 1/10
阵列/芯片： 10
其他： 替代性的大型鳍状中央收集通道
芯片上的液流阻碍物
图45A显示用于制造所述装置的掩膜。图45B～45D是勾画出了入口、阵列和出口的掩膜局部放大图。图532A～532F显示了实际装置的SEM。
实施例9
该装置包括三段，其中每一段是具有旁路通道的双路。使用Femlab对“鳍”进行优化使之位于所述旁路通道侧面以防止所述旁路通道中的流体再次进入所述阵列。与所述阵列最接近的鳍的边缘经设计以模拟所述阵列的形状。所述芯片还包括芯片上的液流阻碍物，即所述入口和出口具有比所述阵列更大的流体阻力。所述装置的高度为139μm或者142μm。
阵列设计： 3段式对称阵列
间隙尺寸： 第1段：8μm
第2段：12μm
第3段：18μm
第4段：
第5段：
液流角： 1/10
阵列/芯片： 10
其他： Femlab优化的中央收集通道(Femlab I)
芯片上的液流阻碍物
图54A显示用于制造所述装置的掩膜。图54B～54D是勾画出了入口、阵列和出口的掩膜局部放大图。图55A～55S显示了实际装置的SEM。
实施例10
该装置包括单独一个段，双路装置，其具有经设置从两个阵列的末端接收输出的旁路通道。在该装置中的障碍物是椭圆形的。所述阵列边界在Femlab中进行模制。所述芯片还包括芯片上的液流阻碍物，即所述入口和出口具有比所述阵列更大的流体阻力。所述装置的高度为152μm。
阵列设计： 单段式对称阵列
间隙尺寸： 第1段：24μm
第2段：
第3段：
第4段：
第5段：
液流角： 1/60
阵列/芯片： 14
其他： 中央屏障
椭圆形立柱
芯片上的液流阻碍物
Femlab模制阵列边界
图44A显示用于制造所述装置的掩膜。图44B～44D是勾画出了入口、阵列和出口的掩膜局部放大图。图56A～56C显示了实际装置的SEM。
实施例11
虽然以下实施例着眼于从全母体血液中提取经纯化的的循环胎儿细胞的细胞核群体，但所描述的方法普遍适用于从其他细胞中分离细胞成分。
胎儿细胞核的分离
图57显示的是用于从母体血液样品中分离胎儿细胞核的方法的流程图。所述方法导致红血细胞的优先裂解(图58)。
从全血中，将经纯化的细胞核群体从感兴趣的循环细胞中分离处理以进行基因组分析的方法的几个实施方式描述如下：
a)所述方法包括如此处所述的全血的微流处理以1)通过除去1～3log的无核的红血细胞和血小板数目从而制得成核细胞的富集样品，2)通过所述富集成核细胞样品的微流处理使残留的无核红细胞、无核网状细胞和成核红血球优先于成核母体白血细胞裂解从而释放胎儿细胞核，3)经过基于尺寸的装置通过微流处理从母体成核白血细胞中分离细胞核，以及4)用商售基因分析工具进行胎儿基因组分析。
b)所述方法可经设计使实施方式1的步骤1和2通过微流体装置一步完成，随后使用下游装置或更大型装置的部件进行步骤3(参见图59&60)。图59显示了形成伴生富集和细胞裂解的微流装置的示意图。所述装置采用两个障碍物区域以使更大的细胞从所述装置的边缘偏转进入含有细胞裂解溶液的中央通道，样品在所述装置的边缘处导入(例如此处所描述的双路装置)。对于母体血液，所述障碍物区域经放置使得母体无核红血细胞和血小板保留在所述装置的边缘，而胎儿成核红血细胞和其他成核细胞偏转进入中央通道。一旦被偏转进入所述中央通道，所述胎儿红血细胞(感兴趣的细胞)被裂解。图60显示用于从未裂解的细胞中分离细胞核(感兴趣的细胞成分)的微流装置的示意图。所述装置类似于图59的装置，除了所述障碍物经放置使得细胞核保留在所述装置的边缘，而更大的微粒偏转进入所述中央通道。
c)基于微流的在母体血液样品中得到胎儿细胞核的组合方法，随后通过批量处理技术如密度梯度离心将所述胎儿细胞核从母体细胞中分离出来(参见图61)。
d)方法及原理证明
选择性细胞裂解和成核红血球的区分。用两种方法裂解在掺杂有全脐带血的捐献血液样品中的污染红血细胞：低渗裂解和氯化铵裂解。由于无核红细胞在低渗溶液中的裂解快于成核细胞，因此控制所述混合细胞群体在所述低渗溶液中的接触时间可形成根据该时间的差异性细胞群体裂解。在此方法中，所述细胞沉积形成小球，而小球之上的血浆被吸走。随之加入去离子水，并将所述小球与水混合。15秒的接触时间足以裂解＞95％的所述无核红血细胞而同时尽可能少地使成核红血细胞裂解，15～30秒的接触足以裂解大于＞70％的所述成核红血细胞而＜15％的其他成核细胞裂解，而＞30秒将提高其他成核细胞裂解的百分比。在所需要的接触时间之后，加入10×HBSS(高渗平衡盐)溶液使所述溶液恢复等渗状态。接触标准浓度(例如0.15M等渗溶液)的氯化铵裂解溶液将裂解大部分红血细胞而对成核细胞的影响很小。当所述裂解溶液的摩尔渗透压浓度降低制得低渗氯化铵溶液时，大部分成核红血细胞连同成熟红血细胞一起裂解。
密度离心法用于获得淋巴细胞富集群体。将这些淋巴细胞的等分试样接触低渗氯化铵溶液足够长的时间以裂解＞95％的细胞。随后这些细胞核用Hoechst 33342(双苯酰亚胺H33342)，双链DNA的富含AT的区域的特异性染色剂，标记并加入到原始的淋巴细胞群体中制得90∶10(细胞∶细胞核)混合物。该混合物放入能根据尺寸将细胞和细胞核分离的装置中，如图60所描述，然后收集废弃物和产品部分并测量在每个部分中所含有的细胞∶细胞核之比。
裂解产物的密度梯度离心。已经过差异性裂解过程处理的混合细胞悬浮液的裂解细胞核能通过向裂解产物中加入蔗糖缓冲液(sucrose cushionsolution)而富集。该混合物在纯蔗糖缓冲液上成层，然后离心形成细胞核富集小球。未裂解的细胞和碎片从上清液中吸走；所述细胞核小球重新悬浮在缓冲液中并随后细胞离心涂片到玻璃载玻片上。
用于鉴定目标细胞的酸性醇全细胞裂解和核RNA FISH。由如图60所描述的根据尺寸分离细胞的装置得到的产品与酸性醇溶液(甲醇∶乙酸3∶1v/v)在冰上接触30分钟导致＞99％的无核细胞和＞99.0％的成核细胞裂解。也可包括在酸性醇裂解之前进行的通过使所述细胞与盐溶液(0.6％NaCl)接触30分钟以使细胞膨胀的低渗处理。通过细胞离心和FISHed(图66a和66b)可将所释放的细胞核定量地沉积在载玻片上。感兴趣的细胞诸如胎儿成核红血球能使用RNA-FISH进行鉴别，其中采用阳性筛选的探针诸如zeta-、ε-、γ-球蛋白，和阴性筛选的探针诸如β-球蛋白，或者通过分析端粒长度进行鉴别。其他区分胎儿和非胎儿细胞的方法在本领域内已知，例如美国专利第5,766,843号。
实施例12
图62显示经优化用于分离血液中微粒的装置。其是具有固定间隙宽度22μm和48路阵列的用于平行样品处理的单段式装置。所述装置的参数如下：
阵列设计： L5 间隙尺寸： 第一段：22μm
液流角： 1/50 阵列/芯片： 48 标称深度 150μm 装置底面积 32mm×64mm 设计特征 ·多路单阵列·最优化的旁路通道·液流稳定·液流导入和液流导出边界
血液获取自怀孕的自愿捐献者，并用Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(不含钙和镁)(iDPBS)进行1∶1的稀释。血液和Running缓冲液(含有1％BSA和2mM EDTA的iDPBS)用0.8PSI的主动压力输送至如实施例13所述的连接有集流腔的装置。血液被分为两种成分，在Running缓冲液中的成核细胞和在Running缓冲液中的无核细胞和血浆蛋白质。用标准阻抗计数器对两成分进行分析。用碘化丙啶染色溶液和标准Nageotte计数腔对含有成核细胞的成分进行进一步的表征以测定成核细胞总损失。收集的数据用于确定血液处理体积(mL)、血液处理速率(mL/hr)、RBC/血小板去除以及保留的成核细胞。以下表格提供了使用该装置进行的细胞富集的结果。
处理的体积(mL) 26.5 8 15.4 17 19 流量(mL/h) 10.6 10.0 11.8 9.8 9.8 废弃物中的WBC/输入的WBC(Nageotte) 0.013％ 0.012％ 0 005％ 0.014％ 0.030％ RBC去除 99.993 99.992 99.997 99.995 99.999 血小板去除 ＞99.6％ ＞99.7％ ＞99.7％ ＞99.7％ ＞99.7％
实施例13
将本发明的微流装置装入其中的示例性集流腔(manifold)显示在图63中。所述集流腔具有两半部分，在其间放置本发明的微流装置。所述集流腔的一半包括血液和缓冲液用的分离的入口，每一个入口与相应的流体贮液室相连。所述装置中的通道经导向使得它们通过装置的贯穿孔与所述贮液室相连。典型地是，所述装置垂直放置，当血液从产物出口滴下时收集经处理的血液。在所述微流装置的产物出口周围的区域也可用例如来自于永久记号的疏水性物质进行标记以限制形成的液滴的尺寸。所述装置还包括两个疏水排气过滤器，例如0.2μm PTFE过滤器。这些过滤器可允许俘获在所述装置中的空气被水溶液所替代，但在低压例如＜5psi下不允许液体流过。
为灌注所述装置，缓冲液例如含有1％牛血清白蛋白(w/v)和2mMEDTA的Dulbecco′s PBS在减压下脱气5～10分钟，并同时进行搅动。然后将所述缓冲液通过所述集流腔中的缓冲液入口以＜5psi的压力泵入所述装置。随之通过将空气排出所述疏水排气过滤器使得所述缓冲液充满缓冲液室，并随之充满微流装置中的通道和血液室。与所述血液室相连的疏水排气过滤器允许进行所述室内的空气置换。一旦所述血液室被充满，缓冲液泵入所述血液入口。在某些实施方式中，在1psi下进行1分钟灌注之后，将所述血液入口夹住，然后将压力增加至3psi保持3分钟。
实施例14
通过加入大体积的低离子强度缓冲液例如去离子水，对通过此处所描述的任一装置富集的胎儿nRBC群体进行低渗冲击以选择性地裂解无核RBC和nRBC并释放其细胞核。然后通过加入等体积的高离子强度缓冲液终止所述低渗冲击。随后通过梯度离心诸如流过碘克沙醇的水溶液，p＝1.32g/mL进行收获的所释放的细胞核被用于分析。
图64描述了胎儿nRBC与母体nRBC的选择性裂解，其为与裂解条件相接触的持续时间的函数。该选择性裂解过程也可用于选择性地裂解由胎儿nRBC、母体nRBC、无核胎儿和母体RBC，以及胎儿和母体白血细胞组成的细胞群体中的胎儿nRBC。使用蒸馏水引起一定时间的低渗冲击，然后加入等体积的10×盐溶液，诸如PBS将其终止，胎儿nRBC和母体nRBC随时间裂解，期间裂解的(非存活的)胎儿nRBC的数量增加至10倍，而被裂解的母体nRBC的数量增加更小的倍数。在任意指定时间点，用碘化丙啶对所述裂解的细胞进行染色并通过梯度离心进行浓缩以确定裂解的胎儿nRBC与母体nRBC之比。可确定最佳持续时间并应用于选择性地富集胎儿nRBC。
实施例15
为选择性地裂解无核RBC和母体成核RBC，富集了胎儿nRBC的样品用RBC裂解缓冲液进行处理，例如用含有碳酸酐酶抑制剂如乙酰唑胺(例如0.1mM～100mM的浓度)的0.155M NH4Cl、0.01M KHCO3，2mMEDTA、1％BSA以促使裂解，随后用大量体积的平衡盐缓冲液诸如10X体积的1×PBS或者平衡盐缓冲液如1×PBS和离子交换通道抑制剂诸如4，4′-二异硫氰基均二苯代乙烯-2，2′-二磺酸(DIDS)终止所述裂解。依然存活的胎儿细胞可随后进行额外轮次的选择和分析。
用于模拟白血细胞的K562细胞用Hoechst和calcein AM在室温下标记30分钟(图65)。这些被标记的K562细胞被加入血液样品中，随后加入缓冲液(0.155M NH4Cl、0.01M KHCO3、2mM EDTA、1％BSA和10mM乙酰唑胺)(缓冲液体积与被进行掺杂的血液体积之比为3∶2)。被进行掺杂的血液样品在室温下温育4小时，伴随周期性的温和搅动。在每个进行掺杂的样品中的活细胞的部分通过在多个时间点测量在610nm的绿色荧光进行测定。仅在三分钟的处理之后就观察到细胞裂解(不存在DIDS)。
实施例16
例如通过此处讨论的任一装置或方法富集了胎儿nRBC的样品可被裂解并分析其基因内容。细胞裂解和所需要的细胞或细胞成分的分离的可能的方法包括：
a)富集了胎儿nRBC的样品可经过全细胞裂解以除去细胞质并分离细胞核。通过使用固定溶液诸如Carnoy′s fix的处理使细胞核固定并粘附在载玻片上。通过核蛋白和转录因子的免疫染色或通过差异性杂交，胎儿pre-mRNA的RNA FISH确定内生性胎儿靶的存在可确认所述胎儿细胞核。(Gribnau et al.Mol Cell 2000.377-86；Osborne et al.Nat Gene.2004.1065-71；Wang et al.Proc.Natl.Acad.Sci.1991.7391-7395；Alfonso-Pizarroet al.Nucleic Acids Research.1984.8363-8380)。这些内生性胎儿靶可包括球蛋白诸如ζ-、ε-、γ-、Δ-、β-、α-球蛋白以及非球蛋白靶诸如I-分枝酶(Yu et al.，Blood.2003 101：2081)、N-乙酰葡萄糖胺转移酶或IgnT。RNAFISH采用的寡聚核苷酸探针或者可用于内显子-外显子边界或者其他区域，所述寡聚核苷酸探针能唯一地鉴别所需要的靶，或者通过分析端粒的长度。
b)通过用实施例15所描述的缓冲液和离子交换抑制剂进行处理可选择性地裂解富集了胎儿nRBC的样品以分离胎儿细胞。依然存活的细胞可进一步通过是否存在细胞内标记诸如球蛋白和I-分枝β 1，6-N-乙酰葡萄糖胺转移酶或表面标记诸如抗原I进行筛选。在另一实施方式中，所富集的胎儿nRBC可经过选择性地裂解以除去如实施例15所述的无核RBC和母体nRBC，随后用抗CD45的抗体进行补体调节的细胞裂解，所述CD45是存在于所有成核白血细胞中的表面抗原。所得完整的胎儿nRBC应当不含有任何杂细胞。
c)富集了胎儿nRBC的样品可通过如实施例14所述的低渗冲击进行裂解以分离胎儿细胞核。细胞核可通过用固定溶液如Carnoy′s fix进行固定并粘附在载玻片上。
一旦分离，所需要的细胞或细胞成分(诸如细胞核)可用于分析基因内容。FISH可用于鉴别染色体13和18中的缺陷或者其他染色体异常诸如三染色体21或XXY。用诸如对比基因组杂交等方法也可检测染色体异倍体(aneuploidy)。此外，经鉴别的胎儿细胞可通过微解剖进行检查。在提取时，所述胎儿细胞的核酸可经过一次或多次的PCR或全基因组扩增，随后进行对比基因组杂交，或者短串联重复(STR)分析，基因突变分析诸如单核苷酸点突变(SNP)、缺失或易位。
实施例17
在如图60中描述的装置中获得的含有3ml在1×PBS中的红血球的产物用50mM亚硝酸钠/0.1mM乙酰唑胺处理10分钟。然后所述细胞与0.155M NH4CI、0.01M KHCO3、2mM EDTA、1％BSA和0.1mM乙酰唑胺的裂解缓冲液进行接触，然后通过直接滴入含有BAND 3离子交换通道抑制剂诸如4，4′-二异硫氰基均二苯代乙烯-2，2′-二磺酸(DIDS)停止所述裂解反应。在Wright-Giemsa染色后对无核RBC和成核RBC进行计数，而FISH用于对胎儿nRBC计数。随后将数据与未裂解的对照进行比较。一份如此的实验结果显示如下：
裂解前 裂解后 细胞回收％ eRBCs nRBCs fnRBCs 2.6×106 42 6 0.03×106 26 4 1％ 62％ 68％
实施例18
离液盐或去污剂调节的全裂解和寡聚核苷酸调节的来自胎儿成核RBC的凋亡DNA的富集。由如图60中所描述的装置得到的产物在离液盐溶液诸如缓冲盐酸胍溶液(至少4.0M)、硫氰胍盐(至少4.0M)或缓冲去污剂溶液诸如含有SDS的Tris缓冲液中裂解。所述细胞裂解物随之在55℃与10μl的50mg/ml蛋白酶K保温20分钟以除去蛋白质，随后在95℃保温5分钟以使蛋白酶失活。当进入母体血液循环时所述胎儿nRBC开始凋亡，而该凋亡过程导致胎儿nRBC DNA发生DNA片段化。利用所述胎儿nRBC DNA的减小的尺寸以及用寡聚核苷酸调节的富集方法分离较小DNA片段相对于完整的基因组DNA的更高效率，所述凋亡的胎儿nRBCDNA能选择性地通过与溶液中的寡聚核苷酸的杂交，粘附到小珠上，或者与阵列或其他表面相结合而富集，从而用于鉴别所述独一无二的的分子标记诸如短串联重复(STR)。在杂交后，用高盐缓冲溶液诸如在10mM TrisHCl中的150mM氯化钠，pH7.5冲洗掉不需要的核酸或其他杂质，然后所述被俘获的靶被释放至缓冲溶液中，诸如10mM Tris pH7.8或蒸馏水。所述凋亡DNA因此被富集，然后用例如在实施例16中所述的基因内容分析方法进行分析。
实施例19
图67显示了流程图详细描述了能对母体血液样品进行操作的裂解过程的变体。虽然描述的是由富集样品，例如用此处所描述的装置和方法制备的富集样品开始，但所述过程可应用于任何母体血液样品。所述图表描述了裂解可用于(i)选择性地裂解需要的细胞(例如胎儿细胞)，(ii)选择性地裂解需要的细胞及其细胞核，(iii)裂解所有细胞，(iv)裂解所有细胞及其细胞核，(v)裂解不需要的细胞(例如母体RBC、WBC、血小板或其组合)、(vi)裂解不需要的细胞或其细胞核和(vii)裂解所有细胞和选择性地裂解不需要的细胞的细胞核。所述图表还显示用于分离所释放的细胞核的示例性方法(本发明的装置和方法可用于该目的)和用于分析所述结果的方法。
实施例20
这是滴定在微流环境中的全细胞裂解的实施例。用如此处所述的基于尺寸的分离富集的血液样品被分成4份相同体积。三份经微流装置处理，所述微流装置能将细胞输送至所述装置内固定通道长度的第一预先确定的介质中，然后进入第二预先确定的介质中以进行收集。所述体积细胞悬浮液流速被改变以能够对在与第二预先确定的介质相接触之前沿固定通道长度与第一预先确定的介质的保温进行控制。在该实施例中，DI水用作第一预先确定的介质，2×PBS用作第二原先确定的介质。流速经调节使得在所述细胞与2×PBS相混合生成等渗溶液之前，在DI水中的温育时间为10秒、20秒或30秒。用血球计计算经处理的三份与余下未处理的一份的总细胞数。
样品 起始细胞计数 最终细胞计数 残留％ 1未处理 6.6×106 6.6×106 100％ 210秒接触 6.6×106 7.2×105 10.9％ 320秒接触 6.6×106 4.6×105 6.9％
430秒接触 6.6×106 3.4×105 5.2％
其他实施例
在以上说明中提到的所有公报、专利和专利申请在此以引用的方式引入。未背离本发明的范围和精神的所述本发明的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。虽然结合具体的实施方式对本发明进行描述，但应当理解所主张的本发明不应当受限于这些具体实施方式。实际上，对于本领域技术人员显而易见的能实现本发明的各种所述方式的修改变化均在本发明的范围之内。
其他实施方式在权利要求之中。
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