重组人乳头瘤病毒52亚型蛋白表达
阅读：1035发布：2020-06-06
专利汇可以提供重组人乳头瘤病毒52亚型蛋白表达专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一类经密码子优化而适于在毕赤 酵母 中表达HPV52型人 乳头 瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，以及含有该基因的载体、菌株及表达该基因的方法。本发明还公开了一种具有免疫原性的大分子，其主要由所述经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因在酵母细胞中表达产生。本发明还公开了所述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。，下面是重组人乳头瘤病毒52亚型蛋白表达专利的具体信息内容。
1.一种分离的基因，其编码人乳头瘤主要衣壳蛋白L1，其特征在于，所述的基因具有酵母偏爱的密码子，所述的基因具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。
2.一种表达载体，所述的表达载体中含有权利要求1中所述的基因的序列。
3.一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有权利要求2所述的表达载体，或基因组中整合有权利要求1所述的基因。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞是毕赤酵母。
5.一种具有免疫原性的大分子，由人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1自我装配而成，所述的人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1是毕赤酵母表达的。
6.根据权利要求5所述的大分子，其特征在于，所述的具有免疫原性的大分子通过以下方法制备获得：
(1)培养权利要求3所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子；
(2)分离所述的具有免疫原性的大分子。
7.一种制备权利要求5所述的具有免疫原性的大分子的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1)培养权利要求3所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子；
(2)分离所述的具有免疫原性的大分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中包括：
(a)破碎所述步骤(1)获得的宿主细胞，获得含有具有免疫原性的大分子的上清液；和(b)将所述步骤(a)获得的上清液采用阳离子交换柱层析和羟基磷灰石柱层析进行纯化，从而获得所述的具有免疫原性的大分子。
9.一种具有免疫原性的组合物，其特征在于，所述组合物中含有：
(1)有效剂量的权利要求5所述的具有免疫原性的大分子；和
(2)药学上可接受的的载体。
10.一种疫苗，其特征在于所述疫苗包含：
(1)有效剂量的权利要求5所述的具有免疫原性的大分子；和
(2)佐剂。
11.根据权利要求5所述的具有免疫原性的大分子的用途，其特征在于，用于预防或治疗人乳头瘤病毒相关疾病。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的疾病选自：肿瘤、宫颈上皮内瘤样病变、外生殖器疣。
重组人乳头瘤病毒52亚型蛋白表达
技术领域
背景技术
[0002] 宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤，全球每年有超过50万的妇女被诊断出患有宫颈癌，27万妇女死于此病，年龄标准化感染率达10.5％。早在80年代初，Harald zur Hausen就发现人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的感染与宫颈癌发病有关，后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止，已发现了百余种HPV基因型，其中约40种可以感染生殖道粘膜。其中高危型HPV型别为HPV16、18、31、33、45、52和58，90％以上的宫颈癌与它们有关。
[0003] 根据2010年WHO的报告，HPV52是世界范围内宫颈癌中检测率占第7位的高危型别，主要与亚洲地区的宫颈癌相关，而在宫颈高度病变中检出率排在第3位。与HPV16和HPV18型不同的是HPV52的分布有一定的地理偏向性。亚洲HPV感染型别中，HPV52型检出率较高，我国进行的多项研究表明HPV52型也属比较常见的型别。
[0004] HPV是无包膜二十面体对称病毒，其病毒基因组DNA为闭合环状，长度约7200-8000bp，由早期编码区(early region)、晚期编码区(late region)和位于两者之间的长调控区(long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框(ORF)，编码病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋白分子量约55kDa，为主要衣壳蛋白，以72个五聚体的形式支撑整个病毒衣壳结构，在不同型别中氨基酸序列高度保守，能够刺激机体产生保护性抗体。L2蛋白分子量较小，多位于L1蛋白内部。
[0005] 昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒(VLP)。L1单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似，可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。
[0006] 因此，鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守，并且能够单独表达形成VLP，以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过，以表达重组病毒蛋白得到的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题，其中首先需要解决的技术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而L1蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒等表达系统中，往往受到这些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低甚至无表达。如Merck公司的美国专利No.7,498,036中记载，野生型VLP蛋白在酿酒酵母中的表达量为35μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)左右。
[0007] 因此，本领域中需要一种高水平在毕赤酵母中表达HPV52L1基因的方法，所述方法应该能够高水平地、操作简便和低成本地表达HPV52L1基因。
发明内容
[0008] 为了解决上述技术问题，根据本发明的第一方面，提供了一种能够在毕赤酵母中高效表达的HPV52基因，所述基因具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
[0009] 利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统，具有表达量高、操作简便、成本低等特点，并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于大规模工业化生产。由于不同物种间氨基酸密码子使用频率不一，在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候，往往根据目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此，本发明的经过密码子优化后的HPV52基因在毕赤酵母中可以获得较高的表达水平，更有利于针对HPV52的预防性疫苗的研发与生产。如本申请实施例所示，本发明的密码子优化过的HPV52基因在毕赤酵母中的表达量分别可最高达约78.47μg/mg(ugVLP/mg总蛋白)。
[0010] 根据本发明的第二方面，提供了一种在毕赤酵母中表达HPV L1基因的方法，包括下述步骤：
[0011] (1)将本发明的HPV52L1基因分别各自克隆入表达载体中；
[0012] (2)将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中；
[0013] (3)使用抗生素对步骤(2)所得的转化菌株进行筛选，获得生长情况最好的一个或多个菌株；
[0014] (4)通过测试HPV52L1基因的表达量对步骤(3)所得的菌株进行进一步筛选，获得表达量最高的一个或多个菌株；
[0015] (5)使用步骤(4)所得的菌株进行表达，分别获得HPV52L1蛋白。
[0016] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(1)中所述的表达载体为pPICZαB载体，并且所述步骤(3)中使用的抗生素为Zeocin。
[0017] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(2)中使用的毕赤酵母菌株为毕赤酵母GS115菌株。
[0018] 根据本发明的一个具体实施方案，所述步骤(4)中测试HPV52L1基因的表达量的操作是通过Western blot方法进行的。
[0020] 根据本发明的第三方面，提供了含有本发明的HPV52L1基因的表达载体。
[0021] 根据本发明的一个具体实施方案，所述含有本发明的HPV52L1基因的表达载体来源于pPICZαB载体。
[0022] 根据本发明的第四方面，提供了含有本发明的HPV52L1基因或表达载体的毕赤酵母菌株，所述菌株能够高水平地表达生产HPV52L1蛋白，更利于针对HPV52的预防性疫苗的研发与生产。
[0023] 根据本发明的第五方面，提供了一种含有本发明前述表达载体，或基因组中整合有本发明的HPV52L1基因的宿主细胞。根据本发明的一个具体实施方案，宿主细胞为毕赤酵母。
[0024] 根据本发明的第六方面，提供了一种具有免疫原性的大分子，由人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1自我装配而成，且人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1是毕赤酵母表达的。根据本发明的一个具体实施方案，具有免疫原性的大分子通过以下方法制备获得：
[0025] (1)培养前述宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子；
[0026] (2)分离所述的具有免疫原性的大分子。
[0027] 根据本发明的第七方面，提供了一种制备前述具有免疫原性的大分子的方法，其特征在于，所述的方法包括：
[0028] (1)培养前述宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子；
[0029] (2)分离所述的具有免疫原性的大分子。
[0030] 根据本发明的一个具体实施方案，以上步骤(2)中包括：
[0031] (a)破碎步骤(1)获得的宿主细胞，获得含有具有免疫原性的大分子的上清液；和[0032] (b)将步骤(a)获得的上清液采用阳离子交换柱层析和羟基磷灰石柱层析进行纯化，从而获得所述的具有免疫原性的大分子。
[0033] 根据本发明的第八方面，提供了一种具有免疫原性的组合物，其中含有：(1)有效剂量的前述具有免疫原性的大分子；和(2)药学上可接受的的载体。
[0034] 根据本发明的第九方面，提供了一种疫苗，其中疫苗包含：(1)有效剂量的前述具有免疫原性的大分子；和(2)佐剂。
[0036] 本发明具有以下优点：
[0037] 1.经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求，需要特别说明的是，本申请密码子优化的方法和一般文献中公开的方法存在不同，本申请在一些关键位点上采用了次优密码子。在这些关键位点上的密码子替换避开了数个内含子识别序列和可能的转录因子的结合位点，并有利于mRNA结构的稳定。这种密码子优化后可以有以下两个优点：a,表达收获量高，具有明显的工业化优势；b,密码子优化时除了表达量外，还兼顾了mRNA的结构稳定性和翻译的完整性，使蛋白表达后更易正确折叠，体现在形成的VLP颗粒更加均匀，VLP颗粒的基本结构单元清晰可见(见图4)，更加适合做成疫苗成品。
[0039] 图1显示了HPV52L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。其中条带1：表达质粒；2:HindIII+KpnI双酶切后的结果，其中条带M为Marker自上而下分别对应10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp以及250bp。
[0040] 图2显示了破菌后的HPV52L1上清液Western-blot鉴定。
[0041] 图3显示了HPV52L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图，M：Marker；1-3HPV 52L1最终纯化后病毒样颗粒，其中条带M为Marker，自上而下分别对应116.0kDa、66.2kDa、45.0kDa、35.0kDa以及25.0kDa.
[0042] 图4显示了HPV52L1蛋白样品中呈现病毒样颗粒电镜照片。
[0043] 序列说明
[0044] SEQ ID NO：1为野生型HPV52L1氨基酸序列。
[0045] SEQ ID NO：2为本发明所使用的截短型HPV52L1氨基酸序列。
[0046] SEQ ID NO：3为本发明所使用的HPV52L1基因的核苷酸序列。
[0047] SEQ ID NO：4HPV52L1基因的核苷酸序列正向引物。
[0048] SEQ ID NO：5HPV52L1基因的核苷酸序列反向引物。
具体实施方式
[0049] 通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，温度以℃为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。除非另有说明，在下述各实施例中用到的限制性内切酶均购自New England Biolab公司。应当理解的是，除非另有说明，下述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备。除非另有说明，所使用的培养基均为市售可得的常规培养基，本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。为了简便起见，在本文中有可能使用各种通用的缩写，本领域技术人员完全能够理解其含义。
[0050] 实施例1：HPV52L1密码子优化设计
[0051] 全长的HPV 52L1共529个氨基酸序列，与HPV L1家族的其他基因相似，也有两个翻译起始位点，分别对应全长HPV 52L1(529个氨基酸)与HPV 52L1(503个氨基酸)。分析全长HPV52L1前27个氨基酸，大多为疏水性氨基酸，较有可能是跨膜区域，会对表达造成一定影响。早期的HPV 16L1表达研究表明，在各种表达系统中，HPV 16L1(505个氨基酸)可以形成VLP，而全长的HPV 16L1(531个氨基酸)没有观察到VLP的形成。所以推测高危型HPV L1的两个翻译起始点可能和子宫颈癌的病理进程有关。在最后的病毒组装过程，表达出505个氨基酸的L1外壳蛋白(Virus Genes.2005；30(1):31-35)。参考HPV 16L1基因后一个ATG表达产生的L1蛋白也能形成VLP，我们选取了HPV 52L1(即第二个ATG起始的ORF)表达，作为疫苗抗原候选序列，相应的氨基酸个数为503。
[0052] 根据野生型HPV52L1氨基酸序列(GenBank：CAA52590.1，SEQ ID NO：1)，我们设计出截短型的HPV 52L1的序列，(SEQ ID NO：2)，根据截短型HPV 52L1的序列和毕赤酵母偏爱性密码子，合成52L1序列。将野生型HPV 52L1DNA序列进行改造，所有密码子均采用毕赤酵母中使用频率较高或最高的密码子，并考虑二级结构的形成以及酶切位点的选择，最终得到本发明的HPV52L1基因的核苷酸序列SEQ ID NO:3。需要说明的是，SEQ ID NO:3的序列对应SEQ ID NO：2全长，本领域技术人员可在SEQ ID NO:3以及表1的基础上，选择合适的终止子(前端“atg”即为启动子)。作为一个优选案例，可在SEQ ID NO:3的末端，设计“taatag”双终止子。采用这样的设计，可以达到较高的表达效果。
[0053] 表1 Pichia酵母密码子表
[0054]
[0055] 实施例2：HPV52L1重组表达载体构建
[0056] 合成所得的52L1序列通过下列方法克隆入pPICZalphaB载体。以PCR的方式扩增得到两端分别带有BstBI和KpnI的52L1DNA片段，PCR引物：正向引物：5’CAGGTGATCTTCGAAACGATGTCCGTTTGGAGAC3’(BstBI)(SEQ ID NO：4)；反向引物：5’ATTGGTACC CTATTATCTCTTGACT 3’(KpnI)(SEQ ID NO：5)。PCR程序：94℃5分钟，94℃30秒、55℃30秒、72℃1分50秒循环30次，72℃10分钟，10℃10分钟，运行结束。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1500bp处条带(Qiagen gel extraction kit)。回收片段与pPICZalphaB以BstBI和KpnI(New England Biolab)联合酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收约1500bp和3600bp片段。回收后52L1与pPICZalphaB以摩尔比为5:1的比例用T4连接酶(Takara)16℃过夜连接，第二天连接产物转化入E.coli DH5α，涂布于低盐LB平板(含25ug/mL Zeocin)，37℃过夜培养。挑取部分转化后克隆抽提质粒，双酶切(HindIII+KpnI)鉴定，琼脂糖电泳检测(图
1)。鉴定所得阳性重组克隆经DNA测序验证正确后保存，此重组载体命名为pPICZ52L1。
1)。鉴定所得阳性重组克隆经DNA测序验证正确后保存，此重组载体命名为pPICZ52L1。
[0057] 实施例3：HPV52L1重组表达菌株构建与表达
[0058] 以SacI线性化pPICZ52L1，酶切反应结束后酚：氯仿去除蛋白，再加入2.5倍体积无水乙醇，1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA，所得沉淀经75％乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH2O溶解沉淀，电转毕赤酵母宿主菌，涂布于YPDS平板(含180μg/mL Zeocin)，30℃培养3天，得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mL Zeocin)，筛选质粒高拷贝菌株，30℃培养2天。部分克隆生长较快，挑取生长情况最好的数个克隆接种于5mL YPD液体培养基，24小时后更换BMMY培养基，0.5％甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后，离心所得上清液以Western-blot鉴定(图2)，可知相应菌株以表达HPV 52L1蛋白，所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-80℃，作为发酵罐培养工作种子。
[0059] 实施例4：HPV52L1重组蛋白的发酵罐培养
[0060] 从工作种子库取1支菌种甘油冻存管，即实施例3所得的表达HPV52L1的基因工程菌，融化后吸取100μL接入5mL YPD培养基，280转/分钟(rpm)，30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1mL接入500mL YPD培养基，280rpm，30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2-6。镜检无杂菌污染。发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4 273g，MgSO4 109g，CaSO4·2H2O 17.6g，H3PO4 400.5mL，KOH 62g，甘油600g，PTM1 60mL，泡敌
1mL，去离子水加至15L)，不含有抗生素，配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃，30分钟，消后冷至30℃。将上述活化后种液以1:15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃，初始pH5.00±0.05，起始转速300rpm培养，通气量0.5vvm，DO(溶氧值)100％，添加PTM1(CuSO4·5H2O 6.0g，NaI 0.008g，MnSO4 3.0g，NaMoO4 0.2g，H3BO3
0.02g，ZnSO4 20.0g，CoCl2 0.5g，FeSO4·7H2O 65.0g，biotin 0.2g，H2SO4 5.0mL，去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右，维持溶氧值不低于20％，当碳源消耗完毕时，溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50％的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30％以上。补加约4小时，菌体湿重约200g/L时，停止补料，溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05，开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量，甲醇诱导
4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20％，温度维持在30℃，pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体，菌体湿重达
390g/L。
1mL，去离子水加至15L)，不含有抗生素，配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃，30分钟，消后冷至30℃。将上述活化后种液以1:15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃，初始pH5.00±0.05，起始转速300rpm培养，通气量0.5vvm，DO(溶氧值)100％，添加PTM1(CuSO4·5H2O 6.0g，NaI 0.008g，MnSO4 3.0g，NaMoO4 0.2g，H3BO3
0.02g，ZnSO4 20.0g，CoCl2 0.5g，FeSO4·7H2O 65.0g，biotin 0.2g，H2SO4 5.0mL，去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右，维持溶氧值不低于20％，当碳源消耗完毕时，溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50％的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30％以上。补加约4小时，菌体湿重约200g/L时，停止补料，溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05，开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量，甲醇诱导
4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20％，温度维持在30℃，pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体，菌体湿重达
390g/L。
[0061] 实施例5：HPV52L1蛋白纯化
[0062] 收集的菌体破菌(破菌缓冲液：200mM MOPS，pH7.0，0.7NaCl，0.05％Tween-80)离心后，取破菌后上清液经过层析方法纯化，得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白，具体步骤如下：将表达HPV52L1VLP的毕赤酵母细胞，按1：5加入破菌缓冲液混合，充分混匀后，高压破碎以上细胞悬液，并重复操作，使90％的细胞破碎。将高压破碎的破菌液，于9000rpm，30min，10℃离心分离，收集离心后上清液。将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS50HS(Applied Biosystems公司)层析柱进行初步纯化，洗脱方式为：100％缓冲液A(0.5M NaCl，50mM MOPS pH7.0，0.05％Tween-80)至100％的缓冲液B(1.5M NaCl，50mM MOPS pH7.0，0.05％Tween-
80)的线性梯度洗脱，收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE，Western-blot检测。
80)的线性梯度洗脱，收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE，Western-blot检测。
[0063] 将含有HPV52L1蛋白的洗脱组分合并后，使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化，洗脱方式为：100％缓冲液A(5mM PB,0.6M NaCl,50mM MOPSpH6.5,0.05％Tween-80)至100％的缓冲液B(200mM PB，0.6M NaCl,pH6.5，0.05％Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE和Western-blot检测，将含有HPV52L1VLP的组分合并，即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度，扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度较高(图3)。经过电镜(上海复旦大学化学系电镜室)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图4)，结果显示颗粒直径在60-100nm之间。
[0064] 实施例6：本发明的HPV52L1重组蛋白的表达量测定
[0065] 本实施例根据Bradford法测得的发酵后菌体破菌上清液中总蛋白含量和Elisa夹心法测得的HPV52L1VLP的表达量，计算得到HPV52L1VLP在破菌后总蛋白中的含量。具体步骤如下：
[0066] 1.使用Bradford法测定发酵菌体破菌上清液中总蛋白含量
[0068] 在7支1.5ml EP管内一次加0μl，10μl，20μl，40μl，80μl，100μl BSA标准品(0.5mg/ml)和实施例4中获得的发酵菌体的破菌上清液40μl(稀释100倍)，用水补足至总体积为100μl，混匀。每一浓度设3个平行样。每管加入900μl Bradford solution，立即混匀，室温放置10分钟后分别测定OD595光吸收值。根据6组BSA标准品作出蛋白浓度对吸光值标准曲线并计算得到线性方程式，再根据破菌上清液所得光吸收值与标准曲线线性方程式计算出发酵菌体破菌上清液的总蛋白含量。
[0069] 2.用Elisa夹心法测定HPV52L1VLP在发酵后菌体破菌上清液中的含量
[0070] 使用纯化的HPV52L1VLP做标准蛋白浓度曲线，诱导前的菌体作为阴性对照。
[0071] 用包被液(1.6g Na2CO3，2.95g NaHCO3)将兔抗HPV52L1VLP多抗稀释2000倍，然后向酶标板的各凹孔中各加入0.1ml稀释后的兔多抗，4℃过夜。移去包被液，用0.3ml PBST(PBS，pH7.0，0.05％Tween-20)洗涤凹孔，再用0.3ml封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时。
[0072] 用稀释液(PBS，pH7.0)以连续二倍稀释的方式，将实施例5中获得的纯化HPV52L1VLP从浓度2μg/ml梯度稀释到0.0625μg/ml，以此作为标准样品。同时将实施例4中获得的发酵菌体的破菌上清液稀释200倍，然后分别向凹孔中加入0.1ml梯度稀释后的不同浓度的HPV52L1VLP溶液或稀释后的破菌上清液，于37℃保温1小时后，移去抗原液，并用0.3ml PBST洗涤凹孔。然后用抗体稀释缓冲液(PBS，pH7.0，2％脱脂奶粉)将MAB885鼠抗HPV52L1VLP单抗(购自CHEMICON公司)1000倍稀释后加入到凹孔中，每孔加0.1ml，37℃保温
1小时。移去单抗溶液，用0.3ml PBST洗涤凹孔。再向各凹孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释
5000倍的HRP标记的羊抗鼠IgG 0.1ml，37℃保温0.5小时。移去抗体溶液，并用0.3ml PBST洗涤凹孔，向凹孔中各加入0.1ml DAB显色液(购自Amresco公司)，室温作用20分钟。向每个凹孔中加入0.05ml 2M H2SO4终止液以终止反应，并用酶标比色仪测定OD450吸光值。
1小时。移去单抗溶液，用0.3ml PBST洗涤凹孔。再向各凹孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释
5000倍的HRP标记的羊抗鼠IgG 0.1ml，37℃保温0.5小时。移去抗体溶液，并用0.3ml PBST洗涤凹孔，向凹孔中各加入0.1ml DAB显色液(购自Amresco公司)，室温作用20分钟。向每个凹孔中加入0.05ml 2M H2SO4终止液以终止反应，并用酶标比色仪测定OD450吸光值。
[0073] 利用梯度稀释的HPV52L1VLP的OD450的检测结果，制作标准蛋白浓度曲线，再通过标准蛋白浓度曲线换算得HPV52L1蛋白的发酵表达量。
[0074] 本实施例的结果示于表2。由表2可以看出，本发明的HPV52L1基因的表达量最高可达到78.47μg/mg(ugVLP/mg总蛋白)。
[0075] 表2：本发明的HPV52L1基因的表达量
[0076]
[0077] 实施例7：HPV52L1疫苗制备
[0079] 实施例8：HPV52L1基因表达产物免疫原性的测定
[0080] 选取6～8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司)，分为9组，每组10只小鼠。第1～8组分别注射0.0667ug,0.0333ug,0.0167ug,0.0083ug,0.0042ug,0.0021ug,0.0010ug,0.0005ug吸附铝佐剂的VLP(作为检测组)，第9组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲剂(0.32M氯化钠，0.01％吐温-80,0.01M组氨酸，pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)。于0天腹部皮下五点注射免疫一次，免疫后28天采血。将采集得到的血液于37℃放置
2h后，8000rpm离心5min，吸取上清，即得到鼠免疫血清，于-20℃存放，并检测鼠血清的阳转率，具体方法如下：用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV52L1至1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加0.1mL，4℃过夜。移去包被液，用0.3mLPBST清洗3次，然后用0.3mL封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时，清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)以
1:1000稀释被检血清，100μl/孔，双复孔加入酶标板，37℃孵育1小时。清洗6次，用稀释液1:
5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育0.5小时，清洗6次，然后加入100μl/孔TMB显色，37℃显色10分钟，加2M H2SO4 50μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数，OD450值如表3所示。9个检测组的转阳率结果如表4所示。
2h后，8000rpm离心5min，吸取上清，即得到鼠免疫血清，于-20℃存放，并检测鼠血清的阳转率，具体方法如下：用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV52L1至1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加0.1mL，4℃过夜。移去包被液，用0.3mLPBST清洗3次，然后用0.3mL封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时，清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2％脱脂奶粉+PBST)以
1:1000稀释被检血清，100μl/孔，双复孔加入酶标板，37℃孵育1小时。清洗6次，用稀释液1:
5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育0.5小时，清洗6次，然后加入100μl/孔TMB显色，37℃显色10分钟，加2M H2SO4 50μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数，OD450值如表3所示。9个检测组的转阳率结果如表4所示。
[0081] 表3 OD450值结果
[0082]
[0083] 表4 HPV52L1转阳率结果
[0084] 阴性平均值：0.0148；Cutoff值：0.03108
[0085] 注：Cutoff值为佐剂组被检血清抗体的OD450值的平均值乘以2.1,OD450值大于Cutoff值的小鼠血清判定为阳性，OD450值小于Cutoff值的小鼠血清判定为阴性。
[0086]检测组 剂量μg 样本数 阳性样本数 转阳率
1 0.0667 10 9 90％
2 0.0333 10 9 90％
3 0.0167 10 7 70％
4 0.0083 10 9 90％
5 0.0042 10 10 100％
6 0.0021 10 2 20％
7 0.0010 10 0 0％
8 0.0005 10 0 0％
9 0 10 0 0％
1 0.0667 10 9 90％
2 0.0333 10 9 90％
3 0.0167 10 7 70％
4 0.0083 10 9 90％
5 0.0042 10 10 100％
6 0.0021 10 2 20％
7 0.0010 10 0 0％
8 0.0005 10 0 0％
9 0 10 0 0％
[0087] 综上所述，本发明提供的52型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因是一种优化过的L1基因，具有以下优点：经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白，而且能够满足工业化生产的要求；同时，本发明提供的45型人乳头状瘤病毒疫苗，能够自组装形成VLPs结构，纯化的VLPs吸附佐剂后，通过血清转阳率的测定，说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性，而且由于采用毕赤酵母表达系统，因此该方法具有以下优点：成本低，产量高，产品性质更加均一稳定。
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