具有石油降解功能的细菌AW25和其用途及细菌载体
阅读：355发布：2020-05-13
专利汇可以提供具有石油降解功能的细菌AW25和其用途及细菌载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且具有石油降解功能的细菌AW25和其用途及细菌载体，属于 微 生物 技术领域， 发明 人 提供一株具有石油降解功能的细菌AW25，所述的具有石油降解功能的细菌AW25用途为以降解石油的方式进行石油污染的治理。该用途以菌剂颗粒的形式实现。本发明首次从海洋土著微生物中筛选出AW25；发明人研发的菌剂颗粒载体，制造成本低廉，使用效果好，有很强的应用价值。，下面是具有石油降解功能的细菌AW25和其用途及细菌载体专利的具体信息内容。
1.具有石油降解功能的细菌AW25，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.10351，其
16SrRNA序列如SEQ ID No.1所示；
其形态及生理生化特征如下：
(1)菌落形态特征
菌株AW25的菌落形态为：在LB培养基上培养7天后，菌落半透明无色，表面略有光泽，光滑，菌落边缘不清晰；
(2)菌株形态及其生理生化特性
革兰氏阴性好氧细菌，氧化酶阳性，无色素产生，菌体杆状，1.0-1.8*0.2-0.3μm，在NaCl浓度0-20％范围内均能生长，最适NaCl浓度4％，生长的温度范围10-45℃，最是温度范围28-35℃，pH范围5.5-10.5，最适pH7.5-8.5，明胶液化，不水解淀粉，不能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、甘露糖，硝酸还原酶阴性，产生吲哚，产生H2S。
2.如权利要求1所述的具有石油降解功能的细菌AW25以降解石油的方式进行海底石油污染的治理的用途。
具有石油降解功能的细菌AW25和其用途及细菌载体
技术领域
背景技术
[0002] 近年来，由于海上原油运输、近海采油平台及油港数量的急剧增加，以及各种石油泄漏的事故也频频发生，海洋石油污染日益加剧。由于海洋石油污染将造成生物多样性急剧下降，尤其是石油中所含的多种芳烃类有毒化合物，因其在环境中稳定、持久且具有生物累积和放大效应，以及某些化合物更是具有较强的致癌性、致突变性和致畸性。所以，其对生态环境特别是生物多样性的破坏将是致命的。同时，石油污染将降低海滨环境的使用价值、破坏海岸设施、影响局部地区的水文气象条件以及降低海洋的自净能力。同时，这些被污染环境的恢复以及生物种群的再恢复则需要漫长而艰难的过程。
[0003] 目前，针对于石油污染，尤其是大面积石油泄漏，通常采用的应急措施除了采油人工打捞等物理方法，还采用加入消油剂使石油乳化，迅速沉降的方法以恢复海面暂时的清洁，虽然这一方法短时看似起到了治理的效果，但背后却隐藏着危机，其会造成二次化学污染。
[0004] 因此，实施物理化学方法进行生态环境的重建几乎不可能实现，生物修复海洋污染成为唯一可行的途径。但相对于陆地，海洋植物相对匮乏，污染海洋的生物修复还主要依赖海洋微生物的降解作用，尤其依赖于已经适应海底环境的各种土著石油降解微生物。这些石油降解微生物在海底能够利用石油作为其唯一碳源，克服海底黑暗、低温、寡养、缺氧的极端条件，以石油为食，将石油进行分解转化，从而改变而海底荒漠化问题。
发明内容
[0005] 为解决上述海面石油污染处理的技术难题，本发明的第一个目的是提供一株具有石油降解功能的细菌AW25。发明人设法获得高效的海洋土著石油微生物并进行研究，最终得到了假单胞菌杆菌属菌株AW25(Pseudomonas indoloxydans，CGMCC No.10351)。发明人在要求保护此菌株的同时要求对其用途进行保护。本发明的第三个目的是提供一种具有营养功能载体，同时为上述具有凝聚和降解石油功能的细菌提供寄居场所的营养载体。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 具有石油降解功能的细菌AW25，其16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。
[0008] 具有石油降解功能的细菌AW25是发明人从自然界中分离得到的。具体是从大连新港石油污染海域采集的海底沉积物中分离获得。取泥样5克用无菌水稀释105倍,将原油均匀涂布到ASM培养基上，15℃培养7天分离得到菌株。菌株AW25从大连新港石油污染海域采集的海底沉积物中分离获得，采集者姓名刘长建、采集者联系方式0411-87656046。
[0009] 所述的具有石油降解功能的细菌AW25已提交保藏，具体保藏信息如下：
[0010] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
[0011] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
[0012] 保藏日期：2015年01月13日；
[0013] 保藏编号：CGMCC No.10351；
[0014] 分类命名：Pseudomonas indoloxydans
[0015] 所述的具有石油降解功能的细菌AW25的形态及生理生化特征为：
[0016] (1)菌落形态特征
[0017] 菌株AW25的菌落形态为：在LB培养基上培养7天后，菌落半透明无色，表面略有光泽，光滑，菌落边缘不清晰。
[0018] (2)菌株形态及其生理生化特性
[0019] 革兰氏阴性好氧细菌，氧化酶阳性，无色素产生，菌体杆状，1.0-1.8*0.2-0.3μm。在NaCl浓度0-20％范围内均能生长，最适NaCl浓度4％，生长的温度范围10-45℃，最是温度范围28-35℃，pH范围5.5-10.5，最适pH7.5-8.5，明胶液化，不水解淀粉，不能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、甘露糖。硝酸还原酶阴性，产生吲哚，产生H2S。
[0020] 所述的具有石油降解功能的细菌AW25用途为以降解石油的方式进行石油污染的治理。
[0021] 进一步的，所述的具有石油降解功能的细菌AW25用于将漂浮于海面的石油逐步降解，同时进行清理。
[0022] 本发明的有益效果在于：
[0023] 1.本发明首次从海洋土著微生物中筛选出具有石油降解功能的细菌AW25；
[0025] 图1菌株AW25的菌落形态图；
[0027] 图3菌株AW25的系统发育树；
[0028] 图4菌株AW25的石油降解性能测定；
[0029] 图5本发明菌株AW25菌剂颗粒形态图。
具体实施方式
[0030] 下面以具体实施的方式对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。
[0031] 一、实施例
[0032] 实施例1
[0034] 所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：
[0036] 进一步的，所述的菌种AW25的发酵料可采用本领域普通技术人员所公知的任意一种发酵方法来获得。但采用发明人所使用的以下方法生产发酵料，会取得更好的效果：
[0037] 菌种AW25的发酵料是将活化好的菌种AW25培养料与繁殖培养基按照1:10质量比，于50℃下固体发酵7天，得菌种AW25的发酵料，进一步的，使最终发酵料的活菌数1010cfu/g以上；
[0038] 所述的菌种AW25培养料是在LB斜面挑取待活化适于石油降解的菌株接入活化液体LB培养基中50℃下、优选37℃进行活化而得；从而得到活化后菌体浓度为1010cfu/ml的培养料；所述活化液体LB培养基为：蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,酵母膏5g/L，pH 7.0～7.5；121℃,30min灭菌；
[0039] 所述的繁殖培养基固态原料及配比：
[0040]腐殖酸 80wt％
花生饼粉 2wt％
麸皮 3wt％
膨润土 15wt％
花生饼粉 2wt％
麸皮 3wt％
膨润土 15wt％
[0041] 繁殖培养基成品的湿度优选55％。
[0042] 进一步的，所述的造粒烘干可按照常规方法造粒即可，但优选下述发明人采用的方法，可产生更优的效果：
[0043] 造粒烘干是将混合料加入搅拌机中并加入粘结剂搅拌，加水充分混合使含水量低于25wt％，挤压造粒，80℃以下顺流烘干10min以下；冷却后即得海底沉降石油降解菌剂，保证海底沉降石油降解菌剂中活菌数达到109cfu/ml；
[0045] 优选的，石油降解微生物载体的制备原料均为20目以下的细粉；
[0046] 优选的，繁殖培养基的制备原料均为20目以下的细粉。
[0047] 所述的烘干机可以选用任意一种能够完成烘干步骤的市售烘干机，但优选以下厂家生产的该型号的烘干机：章丘市宇龙机械有限公司，顺流滚筒式烘干机GHGф1.0*12*1。
[0048] 实施例2
[0049] 海底沉降石油降解菌剂，是将菌种AW25的发酵料与石油降解微生物载体的制备原料按照1:5的质量比混合后造粒烘干而得；进一步的，使最终的菌剂浓度为1010cfu/ml以上为佳；
[0050] 所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：
[0051]腐殖酸 53.1wt％
花生饼粉 5wt％
麸皮 2wt％
膨润土 39wt％
Na2HPO4 0.5wt％
KH2PO4 0.2wt％
NH4NO3 0.2wt％
花生饼粉 5wt％
麸皮 2wt％
膨润土 39wt％
Na2HPO4 0.5wt％
KH2PO4 0.2wt％
NH4NO3 0.2wt％
[0052] 进一步的，所述的菌种AW25的发酵料可采用本领域普通技术人员所公知的任意一种发酵方法来获得。但采用发明人所使用的以下方法生产发酵料，会取得更好的效果：
[0053] 菌种AW25的发酵料是将活化好的菌种AW25培养料与繁殖培养基按照1:5质量比混合；于20℃下固体发酵3天，优选发酵5天，得菌种AW25的发酵料，进一步的，使最终发酵料的活菌数1010cfu/g以上；
[0054] 所述的活化好菌种AW25培养料是在LB斜面挑取待活化适于石油降解的菌株接入活化液体LB培养基中25℃下进行活化而得；从而得到活化后菌体浓度为1010cfu/ml的培养料；所述活化液体LB培养基为：蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,酵母膏5g/L，pH 7.0～7.5；121℃,30min灭菌；
[0055] 所述的繁殖培养基固态原料及配比：
[0056]腐殖酸 55wt％
花生饼粉 5wt％
麸皮 3wt％
膨润土 37wt％
花生饼粉 5wt％
麸皮 3wt％
膨润土 37wt％
[0057] 繁殖培养基成品的湿度优选55％。
[0058] 进一步的，所述的造粒烘干可按照常规方法造粒即可，但优选下述发明人采用的方法，可产生更优的效果：
[0059] 造粒烘干是将混合料加入搅拌机中并加入粘结剂搅拌，加水充分混合使含水量低于25wt％，挤压造粒，80℃以下顺流烘干10min以下；冷却后即得海底沉降石油降解菌剂，保证海底沉降石油降解菌剂中活菌数达到109cfu/ml；
[0060] 优选的，所述的顺流烘干，具体是将湿颗粒通过烘干机前部的中间仓进入烘干筒内，与此同时热风以顺流方式进入烘干筒，在旋转筒体的内抄板带动下，物料被抄起，形成分撒均匀的较密集的料幕；
[0061] 优选的，石油降解微生物载体的制备原料均为20目以下的细粉；
[0062] 优选的，繁殖培养基的制备原料均为20目以下的细粉。
[0063] 所述的烘干机可以选用任意一种能够完成烘干步骤的市售烘干机，但优选以下厂家生产的该型号的烘干机：章丘市宇龙机械有限公司，顺流滚筒式烘干机GHGф1.0*12*1。
[0064] 实施例3
[0065] 海底沉降石油降解菌剂，是将菌种AW25的发酵料与石油降解微生物载体的制备原料按照1:10的质量比混合后造粒烘干而得；进一步的，使最终的菌剂浓度为1010cfu/ml以上为佳；
[0066] 所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：
[0067]腐殖酸 75wt％
花生饼粉 3wt％
麸皮 3wt％
膨润土 18wt％
Na2HPO4 0.5wt％
KH2PO4 0.2wt％
NH4NO3 0.3wt％
花生饼粉 3wt％
麸皮 3wt％
膨润土 18wt％
Na2HPO4 0.5wt％
KH2PO4 0.2wt％
NH4NO3 0.3wt％
[0068] 进一步的，所述的菌种AW25的发酵料可采用本领域普通技术人员所公知的任意一种发酵方法来获得。但采用发明人所使用的以下方法生产发酵料，会取得更好的效果：
[0069] 菌种AW25的发酵料是将活化好的菌种AW25培养料与繁殖培养基按照1:8质量比混合；于37℃下固体发酵5天，得菌种AW25的发酵料，进一步的，使最终发酵料的活菌数1010cfu/g以上；
[0070] 所述的活化好菌种AW25培养料是在LB斜面挑取待活化适于石油降解的菌株接入活化液体LB培养基中37℃进行活化而得；从而得到活化后菌体浓度为1010cfu/ml的培养料；所述活化液体LB培养基为：蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,酵母膏5g/L，pH 7.0～7.5；121℃,
30min灭菌；
30min灭菌；
[0071] 所述的繁殖培养基固态原料及配比：
[0072]腐殖酸 74wt％
花生饼粉 4wt％
麸皮 7wt％
膨润土 15wt％
花生饼粉 4wt％
麸皮 7wt％
膨润土 15wt％
[0073] 繁殖培养基成品的湿度优选55％。
[0074] 进一步的，所述的造粒烘干可按照常规方法造粒即可，但优选下述发明人采用的方法，可产生更优的效果：
[0075] 造粒烘干是将混合料加入搅拌机中并加入粘结剂搅拌，加水充分混合使含水量低于25wt％，挤压造粒，80℃以下顺流烘干10min以下；冷却后即得海底沉降石油降解菌剂，保9
证海底沉降石油降解菌剂中活菌数达到10cfu/ml；
证海底沉降石油降解菌剂中活菌数达到10cfu/ml；
[0076] 优选的，所述的顺流烘干，具体是将湿颗粒通过烘干机前部的中间仓进入烘干筒内，与此同时热风以顺流方式进入烘干筒，在旋转筒体的内抄板带动下，物料被抄起，形成分撒均匀的较密集的料幕；
[0077] 优选的，石油降解微生物载体的制备原料均为20目以下的细粉；
[0078] 优选的，繁殖培养基的制备原料均为20目以下的细粉。
[0079] 所述的烘干机可以选用任意一种能够完成烘干步骤的市售烘干机，但优选以下厂家生产的该型号的烘干机：章丘市宇龙机械有限公司，顺流滚筒式烘干机GHGф1.0*12*1。
[0080] 二、菌株菌株AW25石油降解性能测定
[0081] (1)150ml的锥形瓶加入ASM培养基50ml/瓶121℃灭菌30min；ASM培养基配方：
[0082] NaCl：30g，NH4NO3：1g，KH2PO4：0.2245g，Na2HPO4·12H2O：5g，天然海水1000ml，微量溶液：10ml，pH 7.5。灭菌温度121℃30min。
[0083] 微量溶液配方：
[0084]CaCl2 FeCl.6H2O CuSO4 MnCl.4H2O ZnSO4·7H2O 蒸馏水
2mg 50mg 0.5mg 0.5mg 10mg 1000ml
2mg 50mg 0.5mg 0.5mg 10mg 1000ml
[0085] (2)将灭好菌的培养基中加入250ul原油及微量溶液0.5ml。
[0086] (3)控制菌株的菌体浓度108cfu/ml，分别加入1ml菌悬液于锥形瓶中。
[0087] (4)以不加菌的空白ASM培养基(添加了250ul原油)为对照。
[0088] (5)15℃静置培养7d，实验重复三次。
[0089] (6)石油降解率的测定方法：采用萃取和比色的方法:
[0090] A:将上述培养7d的添加菌株和不添加菌株的各锥形瓶中的培养液，分别加入石油醚20ml后，倒入分液漏斗中充分混匀，然后静置15min。
[0092] C:将B中分离得到的水相再倒入15ml石油醚，再进行第2次萃取，静置15min，重复B程序。
[0093] D:最后，取10ml石油醚清洗分液漏斗，并将所有上清液及分液漏斗清洗液全部导入上述50ml容量瓶中。
[0094] E：将容量瓶液体定容至50ml。然后作为比色测定的待测溶液。
[0095] (7)分光光度计比色测定
[0096] 石油降解率的检测方法：紫外分光光度法(波长225nm)测定降解率按下式定义：
[0097]
[0098] C0是对照样品中剩余的石油，C1是测定样品中剩余的石油。
[0099] 菌株AW25的石油降解率
[0100]
[0101] 三、菌株AW25菌剂颗粒的石油降解性能测评
[0102] 分别取制备好的活菌数达到109cfu/ml的菌剂颗粒0.2g、0.5g、1g、2g、4g，分别添加至装入100mL不含石油的ASM培养基的无菌三角瓶中，加入0.5mL的灭菌石油，混合摇匀，15℃静止培养9d后，测定石油降解率。以不加入菌剂颗粒的含石油ASM培养基作为对照。
[0103] 表2石油降解菌株AW25菌剂颗粒添加量对石油降解性能的影响(石油降解率％)[0104]
[0105]
[0106] 附件：
[0108] SEQ ID No.1(菌株AW25的16S rRNA核苷酸序列)：
[0109] AGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCCGAAAGGAACGCTAATACCGCGTACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCTGTAGGCTAATATCCTGCGGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCT
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