基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株
阅读：245发布：2023-02-25
专利汇可以提供基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种基于LuxS 缺陷 的变异链球菌AMC代谢恢复株，所述AMC代谢恢复株为StreptococcusmutansKO-SUA159：：△luxS,pIB-sahH，保藏编号为CCTCCM2013699。本发明通过在变异链球菌LuxS缺陷株中异源表达SahH，将LuxS介导的代谢与 密度 感应分离，有效克服了由LuxS缺失的双重缺陷效应引起的LuxS机制研究障碍，为变异链球菌LuxS调控机制的探讨提供了有效的分子 生物 学工具和实验对照。，下面是基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株专利的具体信息内容。
1.一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株，其特征在于，所述AMC代谢恢复株为Streptococcus mutans KO-S UA159：：△luxS, pIB-sahH，保藏编号为CCTCC M
2013699。
2.权利要求1所述一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达质粒pIB169，通过酶切、连接，将体外PCR扩增出的sahH和luxS基因片段连接到载体上，构建出大肠杆菌-变异链球菌SahH蛋白的穿梭表达质粒及作为阳性表达对照的LuxS蛋白表达质粒；
（2）质粒经序列鉴定后首先转化入大肠杆菌，通过western blot检测SahH和LuxS蛋白表达，验证载体和目的基因的表达能力；
（3）利用CSP诱导变异链球菌感受态形成，将质粒转化入变异链球菌，通过质粒抽提双酶切验证质粒转化成功；
（4）通过RNA抽提、反转录及PCR验证目的基因的成功转录；
（5）利用AI-2报告菌株哈维氏弧菌BB170对AI-2的分泌进行检测，以阳性表达对照的AI-2分泌阳性为证据，验证SahH蛋白在变异链球菌中的成功表达。
基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株
技术领域
背景技术
[0002] 生物膜是自然界中大多数微生物的存在形式，其形成可大大增强微生物的生存能力及抵抗来自环境、宿主和抗菌药物的能力，因此生物膜形成成为许多慢性顽固性感染疾病的主要发病因素。密度感应在生物膜的形成、发展和成熟中发挥重要作用。密度感应(quorum sensing,QS)是细菌的一种群体交流机制，即细菌通过合成、分泌并感知环境中的信号分子，以调节自身某些基因的表达。在已知的多种信号分子中，自诱导分子-2（autoinducer-2，AI-2）因其产生基因luxS保守存在于不同细菌中而其被认为参与了菌种间的信号传递。通过敲除luxS基因，许多研究表明LuxS/介导的密度感应缺陷会导致细菌许多生理表现损伤，包括生物膜形成障碍。但实质上，AI-2是细菌甲基循环（AMC）过程中的一种副产物（甲基循环过程见附图1），由其产生过程可知，LuxS同时催化AI-2和HCY的生成，因此，LuxS缺失不仅会导致AI-2介导的密度感应缺陷，同时会导致AMC通路障碍。因此，由LuxS缺失导致的功能障碍也有可能是由AMC障碍引起的。显然，LuxS缺失的密度感应和代谢双重缺陷效应，使得LuxS调控机制的研究变得困难，由此，在LuxS调控机制探讨中，密度感应和AMC代谢通路的分离变得至关重要。
[0003] 变异链球菌是已知的主要致龋菌之一，而生物膜即牙菌斑形成和耐酸性是其两大重要致龋因素。研究表明LuxS缺失会导致变异链球菌的许多生理障碍，包括许多龋病发生相关的致病特性变化。而在障碍发生机制的研究中，同样存在密度感应和代谢调控的争议。过去普遍认为LuxS/AI-2介导的密度感应机制在这些生理变化中发挥主要作用。但近年来，许多研究通过加入外源AI-2的方法，发现LuxS缺失导致的许多基因转录变化或生理特性改变并未得到恢复。由此LuxS/AI-2介导的密度感应在LuxS调控功能中的影响逐渐被削弱。显然，作为LuxS调控功能的另一贡献成员，代谢通路在变异链球菌LuxS相关生理特性中的调控作用值得重视。
[0004] 在一些缺乏luxS基因的细菌如绿脓杆菌中，AMC的完成主要依靠SahH完成。SahH直接催化SAH生成HCY而不会产生副产物DPD，因此为密度感应和代谢的分离提供有利工具。SahH恢复代谢的能力已被研究证明（Sylvio Redanz, Kerstin Standar, Andreas Podbielski, and Bernd Kreikemeyer. Heterologous Expression of Heterologous Expression of sahH Reveals That Biofilm Formation Is Autoinducer-2-independent in Streptococcus sanguinis but Is Associated with an Intact Activated Methionine Cycle [J]. J Biol Chem. 2012 October 19; 287(43): 36111–36122.），以此为基础，我们以变异链球菌LuxS缺陷株为模型，利用大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达载体引入外源SahH，构建了变异链球菌密度感应缺陷背景下的代谢恢复株，实现了代谢与密度感应的分离。为今后LuxS对变链菌功能调控机制的深入研究提供研究工具。 发明内容
[0005] 本发明的第一个目的在于提供基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株，从而实现LuxS介导的代谢途径与密度感应途径的分离。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株的构建方法。
[0007] 为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株，其特征在于，所述AMC代谢恢复株为Streptococcus mutans KO-S UA159：：△luxS, pIB-sahH，保藏编号为CCTCC M 2013699。
[0008] 为实现以上第二个目的，一种基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达质粒pIB169，通过酶切、连接，将体外PCR扩增出的sahH和luxS基因片段连接到载体上，构建出大肠杆菌-变异链球菌SahH蛋白的穿梭表达质粒及作为阳性表达对照的LuxS蛋白表达质粒；
（2）质粒经序列鉴定后首先转化入大肠杆菌，通过western blot检测SahH和LuxS蛋白表达，验证载体和目的基因的表达能力；
（3）利用CSP诱导变异链球菌感受态形成，将质粒转化入变异链球菌，通过质粒抽提双酶切验证质粒转化成功；
（4）通过RNA抽提、反转录及PCR验证目的基因的成功转录；
（5）利用AI-2报告菌株哈维氏弧菌BB170对AI-2的分泌进行检测，以阳性表达对照的AI-2分泌阳性为证据，验证SahH蛋白在变异链球菌中的成功表达。
（2）质粒经序列鉴定后首先转化入大肠杆菌，通过western blot检测SahH和LuxS蛋白表达，验证载体和目的基因的表达能力；
（3）利用CSP诱导变异链球菌感受态形成，将质粒转化入变异链球菌，通过质粒抽提双酶切验证质粒转化成功；
（4）通过RNA抽提、反转录及PCR验证目的基因的成功转录；
（5）利用AI-2报告菌株哈维氏弧菌BB170对AI-2的分泌进行检测，以阳性表达对照的AI-2分泌阳性为证据，验证SahH蛋白在变异链球菌中的成功表达。
[0009] 本发明基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株分类命名为：Streptococcus mutans KO-S UA159：：△luxS, pIB-sahH（下称KO-S），保藏编号为： CCTCC M 2013699，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心（保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号 武汉大学 中国典型培养物保藏中心 邮编 430072），保藏日期为：2013年12月24日。 [0010] 本发明的优点在于：本发明通过在变异链球菌LuxS缺陷株中异源表达SahH，将LuxS介导的代谢与密度感应分离，有效克服了由LuxS缺失的双重缺陷效应引起的LuxS机制研究障碍，为变异链球菌LuxS调控机制的探讨提供了有效的分子生物学工具和实验对照。
附图说明
[0011] 图1为甲基循环（AMC）过程及AI-2的产生。硫腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体为细菌DNA、RNA及蛋白合成等提供甲基，生成有毒性的硫腺苷同型半胱氨酸（SAH），在多数细菌中，毒性的SAH通过Pfs和LuxS两步催化途径生成同型半胱氨酸（HCY），同时产生信号分子AI-2的前体DPD，而在部分无luxS基因的细菌中，毒性SAH向HCY的转化则依赖SahH的一步催化而不产生AI-2。继而，HCY经甲硫氨酸（MET）最终生成SAM，完成甲基循环。 [0012] 图2为质粒pIB169图谱及酶切鉴定图。（A）为pIB169示意图，质粒pIB169大小约为4.6kb，带有外源强启动子Pveg、氯霉素抗性基因（Cmr）用于外源基因插入的多克隆位点(MCS)以及可与目的代表融合表达的His标签。其中，位点EcoRI和BamHI为目的基因插入位点。（B）为酶切鉴定图，目的条带大小约为4.6kb。（C）为质粒的多克隆位点序列。 [0013] 图3为质粒pIB-luxS和pIB-sahH构建示意图。目的基因luxS约为500bp，sahH约为1400bp。luxS，sahH和质粒pIB169均用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化，消化后的luxS与消化的pIB169连接，生成质粒pIB-luxS（大小约5.1kb）；消化的sahH与消化的pIB169连接，生成质粒pIB-sahH（大小约6.0kb）。
[0014] 图4为目的基因PCR扩增及质粒双酶切鉴定。（A）为luxS及sahH PCR扩增图，其中luxS大小约为500bp，sahH大小约为1400bp。（B）为质粒pIB-luxS和pIB-sahH的双酶切鉴定图，较大条带为质粒片段，大小约为4600bp，较小条带为目的基因片段，luxS大小约为500bp，sahH大小约为1400bp。
[0015] 图5为LuxS和SahH在大肠杆菌内的表达。质粒pIB-luxS和pIB-sahH转化入大肠杆菌BL21中，Western blot检测融合的His-LuxS蛋白和His-SahH蛋白的成功表达。His-LuxS大小约为18KD，His-SahH大小约为52KD。NC为阴性对照，BL21为未转质粒的细菌背景对照，L代表LuxS蛋白，S代表SahH蛋白。
[0016] 图6为 LuxS和SahH在变异链球菌内的表达验证。luxS和sahH在变异链球菌内转录mRNA和蛋白催化分泌AI-2的检测。(A)(B)分别为luxS和sahH的mRNA检测，KO-L，KO-S，KO-P为以各代表菌株的cDNA为模板的PCR产物，目的条带大小符合，表明目的基因在变异链球菌中成功转录成mRNA。(C)为变异链球菌各实验菌株和对照菌株分泌AI-2的检测。KO-L分泌AI-2阳性，KO-S分泌AI-2阴性，表明AMC代谢恢复株KO-S构建成功。 [0017] 图7为实时荧光定量PCR检测代谢恢复对基因表达水平的影响。选取与变异链球菌生物膜形成及耐酸相关的8个基因（smu44, smu46, ciaH, aguA, smu238, gtfD, gbpA, gbpC），通过real-time quantity PCR检测其在实验菌株和对照菌株内的转录水平，比较代谢恢复对基因转录水平的影响。结果表明代谢恢复可恢复大部分被检测基因的转录改变，表明代谢在这些基因的转录表达中发挥重要调节作用。
[0018] 图8为生物膜定量。利用结晶紫染色法检测各菌株生物膜形成的量，通过比较试验菌株和对照菌株生物膜形成的数量，研究代谢恢复对生物膜形成的影响。图示变异链球菌LuxS缺陷株内AMC代谢途径的恢复可使其生物膜形成数量达野生株水平，说明代谢在生物膜形成中发挥主要条件作用。
[0019] 图9为共聚焦显微镜观察生物膜结构。生物膜用活死菌试剂盒染色，活菌被染成绿色，制片封片后用共聚焦显微镜观察生物膜结构。图示变异链球菌野生株结构均有致密，而LuxS缺陷株及KO-P、KO-L对照株结构不连续，表现出沟回结构并出现许多狭长沟裂。AMC代谢恢复株生物膜沟裂减少，结构表现出恢复致密的趋势，细菌的团块也由大变成密集小颗粒，表明代谢的恢复可一定程度上改善缺陷株生物膜的不规则结构。 [0020] 图10为生物膜耐酸能力检测。生物膜初期形成后暴露于不同pH的酸性环境中，以中性培养环境为对照。继续培养至24h后结晶紫染色法定量，以相对于中性对照组的生物膜减少的量代表酸杀作用，耐酸能力与酸杀作用成反比。图示在pH为4.3和2.8时，菌株被耐酸能力分散为两组，表现为代谢恢复株与野生株组成的耐酸能力较强组，以及三个对照株组成的耐酸能力较弱组，表明AMC代谢恢复株提高了缺陷株的耐酸能力。 具体实施方式
[0021] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022] 1. 菌株，质粒与主要试剂菌株:变异链球菌（Streptococcus mutans）UA159（上海市口腔医学研究所提供）；
变异链球菌luxS缺陷株（上海市口腔医学研究所提供）；
绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1 （上海市口腔医学研究所提供）；
大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（上海市口腔医学研究所提供）；
感受态大肠杆菌TOP10（上海市口腔医学研究所提供）；
哈维氏弧菌BB170，BB152 （中国农科院韩先干馈赠）；
大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达载体pIB169（上海市口腔医学研究所提供）。
变异链球菌luxS缺陷株（上海市口腔医学研究所提供）；
绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1 （上海市口腔医学研究所提供）；
大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（上海市口腔医学研究所提供）；
感受态大肠杆菌TOP10（上海市口腔医学研究所提供）；
哈维氏弧菌BB170，BB152 （中国农科院韩先干馈赠）；
大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达载体pIB169（上海市口腔医学研究所提供）。
[0023] 培养基：LB, BHI, THB, AB, BMGS；酶： 内切酶： BamHI、EcoRI；
连接酶：T4 DNA Ligase；
主要试剂盒：1. 细菌基因组DNA提取试剂盒；
2. 质粒小提试剂盒；
3. DNA纯化试剂盒；
4. DNA凝胶回收试剂盒；
5. PrimerScript gDNA eraser RT reagent kit；
6. THUNDERBIRD SYBR®qPCR Mix；
7.LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit；
1、2、3为北京天根生化科技有限公司产品；4为北京博大泰克生物基因技术公司产品；
5为Takara公司产品；6为TOYOBO公司产品；7为 Molecular Probes公司产品。
连接酶：T4 DNA Ligase；
主要试剂盒：1. 细菌基因组DNA提取试剂盒；
2. 质粒小提试剂盒；
3. DNA纯化试剂盒；
4. DNA凝胶回收试剂盒；
5. PrimerScript gDNA eraser RT reagent kit；
6. THUNDERBIRD SYBR®qPCR Mix；
7.LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit；
1、2、3为北京天根生化科技有限公司产品；4为北京博大泰克生物基因技术公司产品；
5为Takara公司产品；6为TOYOBO公司产品；7为 Molecular Probes公司产品。
[0025] 2. 表达克隆的制备利用分子克隆方法，首先PCR扩增获得目的基因sahH, luxS完整序列，利用两种限制性内切酶EcoRI和BamHI同时消化目的片段和质粒，用T4 DNA连接酶将目的基因与质粒连接，即得到sahH, luxS的体外表达克隆载体pIB-sahH和pIB-luxS。
[0026] 2.1 luxS基因及sahH基因的扩增利用细菌基因组抽提试剂盒分别从变异链球菌UA159野生株和绿脓杆菌PAO1野生株中提取基因组DNA，以变异链球菌UA159野生株和绿脓杆菌PAO1野生株基因组DNA为模板，利用高保真的DNA聚合酶Primestar对目的基因luxS和sahH进行PCR扩增，其上下游引物分别为：luxS: LF (5‘-CCGGAATTCATGACAAAAGAAGTTACTG-3‘)（SEQ ID NO.1）， LR (5‘-CGCGGATCCTTACACTAGATGACGCTCAA-3‘)（SEQ ID NO.2）， sahH: SF (5‘-CCGGAATTCATGAGCGCTGTCATGACG-3‘) （SEQ ID NO.3），SR (5‘-CGCGGATCCTTAGTAGCGATAGGTGTCCGG-3‘) （SEQ ID NO.4）。将全部PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后利用DNA产物胶回收试剂盒回收目的片段。
[0027] 2.2 luxS基因及sahH基因连接入大肠杆菌-变异链球菌穿梭表达载体pIB169 用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分别消化目的片段luxS, sahH基因和质粒pIB169，37℃反应3h后，利用DNA产物纯化试剂盒对目的基因的酶切产物进行纯化回收，同时，将质粒pIB169的酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并利用胶回收试剂盒回收质粒的酶切片段。
利用T4连接酶将纯化回收后的酶切目的片段和质粒在4℃条件下连接过夜。通过CaCl2转化法将连接产物转化入感受态大肠杆菌TOP10，37℃低速复苏培养45min后涂于含氯霉素（20µg/ml）抗性的LB平板，37℃培养24h。
利用T4连接酶将纯化回收后的酶切目的片段和质粒在4℃条件下连接过夜。通过CaCl2转化法将连接产物转化入感受态大肠杆菌TOP10，37℃低速复苏培养45min后涂于含氯霉素（20µg/ml）抗性的LB平板，37℃培养24h。
[0028] 2.3 克隆载体的抽提与分子鉴定从转化平板上挑取单克隆5个于含氯霉素抗性的LB液体培养基中进行扩大培养，利用细菌质粒小抽试剂盒按其说明书进行质粒小量抽提，所得产物利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ于37℃消化2h后进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用凝胶成像分析系统对电泳结果进行成像分析。选取双酶切阳性组质粒送上海博尚生物技术公司进行DNA测序，测序结果与标准序列比对，将正确重组克隆载体分别命名为pIB-luxS和pIB-sahH保存。
[0029] 3. 克隆载体表达能力鉴定将pIB169, pIB-luxS和pIB-sahH分别转化入经氯化钙方法制备并冻存的感受态大肠杆菌BL21中，涂板培养后挑取单克隆培养过夜。取1ml菌液4℃离心弃上清，灭菌PBS洗菌
2次后加入200ul PBS重悬，加入等量2×蛋白上样缓冲液(SDS、Tris、甘油、水、溴酚兰、巯基乙醇)后100℃煮样15min收集蛋白样品。未转化质粒的大肠杆菌BL21 1ml菌液以相同方法收集样品后作为对照组。
2次后加入200ul PBS重悬，加入等量2×蛋白上样缓冲液(SDS、Tris、甘油、水、溴酚兰、巯基乙醇)后100℃煮样15min收集蛋白样品。未转化质粒的大肠杆菌BL21 1ml菌液以相同方法收集样品后作为对照组。
[0030] 配制12%SDS-PAGE胶，取适量样品上样后恒压 80V电泳至样品达分离胶底部。将PAGE胶上的蛋白转至硝酸纤维膜上，5%脱脂牛奶室温封闭处理1h，剪去多余膜区，目标膜区依次加鼠抗His单克隆抗体（1：3000稀释）以及带有荧光标记的抗鼠二抗（1：5000稀释）并分别室温孵育1h后TBST洗膜10min×3次。最终通过Odyssey成像系统进行扫描成像。 [0031] 4. 菌株构建及鉴定4.1 质粒pIB169, pIB-luxS和pIB-sahH转化入变异链球菌及转化鉴定
变异链球菌LuxS缺失株（KO）于THBYS培养基中培养过夜，用新鲜预温的THBYS以
1：20稀释，后继续培养至OD600=0.2~0.3，加入人工合成的感受态刺激肽（compeptence stimulating peptide, CSP）和质粒，其加入的浓度分别为：CSP（500-1000ng/ml），质粒（1ug/ml）。37℃继续培养2h后涂含红霉素（10ug/ml）和氯霉素（20ug/ml）双抗性的平板，并于37℃厌氧培养48h，挑取单克隆扩大培养并收集菌体沉淀，灭菌去离子水细菌2次，菌体用溶菌酶37℃破壁处理2h后利用质粒小抽试剂盒提取质粒，所抽质粒转化入感受态大肠杆菌TOP10进行扩增并提取质粒（方法同2），利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ于37℃消化质粒2h，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统对电泳结果进行成像分析。
将双酶切阳性的质粒送上海博尚生物技术公司进行测序，测序结果与标准序列进行比对。
质粒转化鉴定无误后，转化后的菌株分别命名为KO-P（变异链球菌LuxS缺失株转入空质粒pIB169），KO-L（变异链球菌LuxS缺失株转入质粒pIB-luxS），KO-S（变异链球菌LuxS缺失株转入质粒pIB-sahH）。
变异链球菌LuxS缺失株（KO）于THBYS培养基中培养过夜，用新鲜预温的THBYS以
1：20稀释，后继续培养至OD600=0.2~0.3，加入人工合成的感受态刺激肽（compeptence stimulating peptide, CSP）和质粒，其加入的浓度分别为：CSP（500-1000ng/ml），质粒（1ug/ml）。37℃继续培养2h后涂含红霉素（10ug/ml）和氯霉素（20ug/ml）双抗性的平板，并于37℃厌氧培养48h，挑取单克隆扩大培养并收集菌体沉淀，灭菌去离子水细菌2次，菌体用溶菌酶37℃破壁处理2h后利用质粒小抽试剂盒提取质粒，所抽质粒转化入感受态大肠杆菌TOP10进行扩增并提取质粒（方法同2），利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ于37℃消化质粒2h，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统对电泳结果进行成像分析。
将双酶切阳性的质粒送上海博尚生物技术公司进行测序，测序结果与标准序列进行比对。
质粒转化鉴定无误后，转化后的菌株分别命名为KO-P（变异链球菌LuxS缺失株转入空质粒pIB169），KO-L（变异链球菌LuxS缺失株转入质粒pIB-luxS），KO-S（变异链球菌LuxS缺失株转入质粒pIB-sahH）。
[0032] 4.2 luxS和sahH基因转录mRNA的验证菌株于BHI培养基中培养过夜，1:10稀释后于10cm平皿中37℃培养16-24h形成生物膜，弃上清并用无菌PBS洗3次，生物膜用1ml PBS洗下并转入1.5ml EP管中，离心弃上清，沉淀用溶菌酶37℃水浴处理10min，离心弃上清，所得沉淀用1ml TRIZOL试剂重悬，按TRIZOL Reagent说明书操作提取各菌株总RNA。所得RNA经浓度测定后，取1ug，利用反转录试剂盒按说明书操作反转录得到单链的cDNA，将反转录所得的cDNA用DEPC-水稀释10倍，取1ul稀释液作为模板，LF/LR和SF/SR分别为引物，进行PCR，所得PCR产物进行进行
1%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统对电泳结果进行成像分析，验证目的基因的成功转录。
1%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统对电泳结果进行成像分析，验证目的基因的成功转录。
[0033] 4.3目的基因在变异链球菌中的表达检测以变异链球菌UA159野生株（WT）为阳性对照，luxS缺陷株（KO）为阴性对照，利用AI-2报告菌株哈维氏弧菌BB170对实验菌株进行AI-2分泌的检测，并将KO-L成功分泌AI-2作为蛋白阳性表达的依据。变异链球菌于BHI培养基中培养至稳定期后低速离心，弃上清。沉淀用AB培养基洗1次，并用AB培养基重悬，调节重悬液的OD至0.4，并于37℃培养4h后高速离心，收集上清并用0.22um滤器过滤除菌。所得无菌上清立即用于AI-2检测或储存于-80℃。哈维氏弧菌BB170及BB152于AB培养基中28℃培养过夜，BB152上清收集同前，BB170菌液用新鲜AB培养基以1:5000稀释，无菌上清与BB170稀释液按20/180的体积比例加入96孔板中，每个样品设三个平行，96孔板于28℃静置培养，每隔一小时用多功能酶标仪的生物发光模式测一次发光度，直至差异出现。
[0034] 5. 应用示例５.１代谢恢复对基因表达水平的影响
细菌总RNA提取及反转录见前述（4.2）。选取与变异链球菌生物膜形成及耐酸有关的
8个基因为检测对象，利用qPCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测。结果表明变异链球菌LuxS缺陷的代谢恢复株可恢复大部分被检测基因的转录改变。
细菌总RNA提取及反转录见前述（4.2）。选取与变异链球菌生物膜形成及耐酸有关的
8个基因为检测对象，利用qPCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测。结果表明变异链球菌LuxS缺陷的代谢恢复株可恢复大部分被检测基因的转录改变。
[0035] ５.２ 代谢恢复对生物膜形成的影响变异链球菌于BHI培养基中培养过夜，调节OD600于同一水平后，用BMGS培养基1:10稀释。取稀释菌液以200ul/孔的量加入96孔板中，于37℃有氧静置培养16-24小时后，吸去上清，生物膜用灭菌去离子水洗3次后每孔加入50ul 0.1%结晶紫（crystal violent, CV）于室温下固定染色15分钟，吸去多余染料，用无菌去离子水洗3次后室温干燥。每孔加入100ul无水乙醇，于摇床震荡5-10min后用多功能酶标仪检测波长570nm处的吸光度。
[0036] 变异链球菌用BMGS培养基于预置1.8cm×1.8cm盖玻片的24孔板中培养生物膜，生物膜培养方法如前述。生物膜用无菌去离子水洗并滤纸吸干多余水分后，用活死菌染色试剂盒避光染色15min，去除多余染料并滤纸吸干后用mounting oil将盖玻片固定于载玻片上，用指甲油封片，4℃放置2-3h后用共聚焦显微镜下观察生物膜结构。 [0037] ５.３代谢恢复对耐酸能力的影响生物膜培养方法如前述。生物膜培养6-8h后吸去上清，无菌去离子水洗3次后，加入如下pH的新鲜BMGS培养基：5.8、4.3、2.8，以未酸调的标准BMGS培养基为对照，继续培养至16-4h。吸去上清，水洗3次后，按生物膜定量试验中的方法进行结晶紫染色，并用多功能酶标仪检测波长570nm处的吸光度。在较低pH下生物膜相对于标准pH减少的量代表了酸杀作用，细菌耐酸能力则与该减少量成反比。
[0038] ６. 实验结果示例通过PCR的方法扩增变异链球菌UA159野生菌株的luxS基因及绿脓杆菌的sahH基因，并插入表达载体pIB169中，双酶切鉴定确认重组克隆构建成功（质粒图谱及鉴定见附图2，质粒构建流程见附图3，目的基因扩增图及质粒双酶切鉴定见附图4）。
[0039] 载体自带His标签，与目的蛋白融合表达，利用抗His标签的抗体，通过蛋白印记杂交方法，验证了His-LuxS融合蛋白及His-SahH融合蛋白在大肠杆菌中的表达（结果参见附图5）。
[0040] 用人工合成的CSP诱导变异链球菌感受态形成，并将质粒转化入变异链球菌，总RNA提取后反转录成cDNA，以cDNA为模板，克隆构建所用引物为引物进行PCR扩增及电泳，验证了目的基因的成功转录。（结果参见附图6A-B）；利用AB培养基重悬的方法获得试验菌株的上清，过滤除菌后将无菌上清加入用AB培养基培养并稀释的哈维氏弧菌BB170中，培养后利用多功能酶标仪检测发光度。哈维氏弧菌BB152为阳性对照，AB培养基加入BB170稀释液中作为背景发光对照。KO-L的上清中检测到AI-2而KO-S上清中未检测到，验证了目的基因的成功表达（结果参见附图6C）。
[0041] 利用构建成功的变异链球菌代谢分离菌株，通过定量PCR方法检测代谢恢复对变异链球菌生物膜形成及耐酸相关基因的转录水平的影响，检测结果表明，SahH实现的AMC代谢恢复可使大部分被检测基因的LuxS缺失性转录改变出现恢复表达。表明代谢途径在基因转录中发挥重要调节作用（结果参见附图7）。
[0042] 利用构建成功的变异链球菌代谢分离菌株，通过结晶紫染色方法观察代谢恢复对生物膜形成的影响。结果表明，代谢恢复可完全恢复LuxS缺失导致的生物膜数量的减少（结果参见附图8）。在生物膜定量的基础上利用共聚焦显微镜进一步观察代谢对生物膜结构的影响，结果表明，尽管未能完全恢复结构缺陷，但代谢恢复使LuxS缺失导致的结构缺陷出现一定程度的恢复趋势（结果参见附图9）。进一步验证了代谢途径在生物膜形成中的调节作用。
[0043] 利用构建成功的变异链球菌代谢分离菌株，研究代谢途径对生物膜耐酸能力的影响。结果表明，代谢恢复后，LuxS缺陷导致的耐酸能力缺陷被恢复。说明了代谢途径在变异链球菌耐酸能力中同样发挥重要的调节作用（结果参见附图10）。
[0044] 本发明所用的质粒在表达目的蛋白时不需诱导剂诱导，从而有效避免了诱导条件及诱导剂毒性对细菌的影响，提高了蛋白表达的稳定性及实验结果的可靠性。其次，本发明所构建的代谢分离菌株及阳性表达菌株均为目的结果菌株，且在生长及生理特性表现方面均稳定，可直接用于相关实验研究或对照。再次，本发明所采用的通过在变异链球菌LuxS缺失株中异源表达SahH单独弥合其代谢通路障碍的策略尚未被报导过，从而具有足够的创新性，同时也为其他细菌的类似研究提供研究思路。
[0045] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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