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用于制备核黄素的单细胞或多细胞生物

阅读:451发布:2023-02-28

专利汇可以提供用于制备核黄素的单细胞或多细胞生物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于在 生物 技术中制备核黄素的单细胞或多细胞生物体,特别是 微生物 。其特征在于,该生物体具有这样改变的甘 氨 酸物质代谢,以致在无外加的甘氨酸下它的核黄素合成效率至少与野生型的 棉 桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895的核黄素合成效率相同,其中野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895是在标准条件下在加入6克/升的外甘氨酸下培养的。,下面是用于制备核黄素的单细胞或多细胞生物专利的具体信息内容。

1、用于在生物技术中制备核黄素的单细胞或多细胞生物体,特别是微生物, 其特征在于,该生物体具有这样改变的甘酸物质代谢,以致在无外加的甘氨酸 下它的核黄素合成效率至少与野生型的桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895的核黄 素合成效率相同,其中野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895是在标准条件 下在加入6克/升的额外甘氨酸下培养的。
2、根据权利要求1的单细胞和多细胞生物体,其特征在于,在该生物体存 在下,提高了甘氨酸的合成和/或甘氨酸的细胞内分解和/或甘氨酸从细胞中的输出 至少部分被抑制。
3、根据权利要求1或2的单细胞或多细胞生物体,其特征在于,其具有提 高的苏氨酸缩酶活性。
4、根据权利要求1至3之一的单细胞或多细胞生物体,其特征在于,其中 至少部分抑制由甘氨酸形成细胞内丝氨酸。
5、根据权利要求4的单细胞或多细胞生物体,其特征在于,其中至少部分 抑制丝氨酸羟基甲基转移酶活性。
6、根据权利要求4或5的单细胞或多细胞生物体,其特征在于,它们对甘 氨酸抗代谢物具有抗性。
7、根据权利要求6的单细胞或多细胞生物体,其特征在于,它们是抗α-氨基 甲基膦酸或α-氨基磺酸,β-羟基-正缬氨酸和/或其它苏氨酸和/或赖氨酸类似物的。
8、根据权利要求1至7之一的单细胞或多细胞生物体,其特征在于,它们 是真菌,优选来自阿舒氏囊霉菌属的真菌。
9、根据权利要求1至8之一的单细胞或多细胞生物体,其特征在于,它们 是棉桃阿舒氏囊霉菌属的真菌。
10、具有附图2b中给出的氨基酸序列和等位基因变异编码的核苷酸序列的 苏氨酸醛缩酶基因。
11、根据权利要求10的苏氨酸醛缩酶基因,它们具有附图2b的核苷酸1至 1149的核苷酸的核苷酸序列或基本上起相同作用的DNA序列。
12、根据权利要求10或11的苏氨酸醛缩酶基因,它们具有前接的附图2b 的核苷酸-1231至1的核苷酸的核苷酸序列或基本上起相同作用的DNA序列的前 接启动子。
13、根据权利要求10至12之一的苏氨酸醛缩酶基因,它们具有对应的可调 节的基因序列。
14、包括权利要求10至13之一的苏氨酸醛缩酶基因的基因结构。
15、包括权利要求10至13的苏氨酸醛缩酶基因或权利要求14的基因结构 的载体。
16、用于制备核黄素的转化生物体,它们包括权利要求10至13之一的可复 制型的苏氨酸醛缩酶基因或权利要求14的基因结构。
17、根据权利要求16的转化生物体,它们包括权利要求15的载体。
18、制备核黄素的方法,其特征在于使用权利要求1至9的生物体。
19、制备产生核黄素的单细胞或多细胞生物体的方法,其特征在于,这样改 变该生物体,即使该生物体具有这样改变的甘氨酸物质代谢,以致在无外加的甘 氨酸下它的核黄素合成效率至少与野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895的 核黄素合成效率相同,其中野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895是在标准 条件下在加入6克/升的额外甘氨酸下培养的。
20、根据权利要求19的方法,其特征在于,借助于基因技术方法进行生物 体的改变。
21、根据权利要求19或20的方法,其特征在于,通过启动子的交换和/或基 因拷贝数目的提高来实现生物体的改变。
22、根据权利要求19至21之一的方法,其特征在于,通过内苏氨酸醛缩酶 基因的改变产生具有高活性的酶。
23、根据权利要求19至22的方法,其特征在于,通过内丝氨酸羟基甲基转 移酶的改变来至少部分地抑制丝氨酸羟基甲基转移酶的活性。
24、权利要求1至9以及16和17之一的生物体的用途,用于制备核黄素。
25、权利要求10至13之一的苏氨酸醛缩酶基因和权利要求14的基因结构 的用途,用于制备权利要求1至9以及16和17之一的生物体。
26、权利要求15的载体的应用,其用于制备权利要求1至9以及16和17 的生物体。

说明书全文

发明涉及一种用于借助生物制备核黄素的单细胞或多细胞生物体。

维生素B2,也被称为核黄素,是人体和动物体必需的。在缺乏维生素B2时, 会出现口腔粘膜和咽粘膜发炎,口开裂,皮肤褶皱处瘙痒和发炎以及皮肤损伤, 结膜炎,减弱的视觉锐度和角膜浊度。对于婴儿和儿童可能出现生长停止和体重 减轻。因此,维生素B2特别是作为维生素缺乏时的维生素制剂以及作为饲料添加 剂在经济上具有意义。此外,它同样可以作为食品染料,特别是在蛋黄酱、淇 淋和布丁等中使用。

核黄素的制备或者按照化学或者按照微生物方法进行。在化学制备方法中, 一般在多步骤工序中核黄素作为纯的最终产物获得,然而其中同样必须使用相对 昂贵的原料如D-核糖。因此,考虑核黄素的化学合成仅用于这样的应用目的,例 如在人类医学,这对于纯的核黄素是必需的。

除核黄素的化学制备方法外的其它方法是通过微生物制备该物质。核黄素的 微生物制备方法特别适合于这种情况,即其中不需要该物质具有高的纯度。此外, 另一种情况是当核黄素作为添加剂被用于饲料产品中。在这种情况下,核黄素的 微生物制备方法的优点在于,在一步工序中即可获得该物质。同样可以使用生长 的原始材料例如植物油作为微生物合成的原材料。

通过真菌如或假囊酵母属的发酵制备核黄素是已知的(The Merck Index,Windholz等,eds.Merck&Co.,1183页,1983, A.Bacher,F.Lingens,Augen.Chem.1969,393页);但是酵母,如念珠菌属或酵母菌属, 和细菌如梭状芽孢杆菌属也适合于核黄素制备。

此外,例如在US05231007中描述了借助于酵母famata念珠菌属的制备方法。

核黄素过量生产的菌株例如描述在EP405370、GB1434299、DE3420310和 EP0821063中,其中通过核黄素生物合成基因的转变由枯草杆菌获得该菌株。但 是原核基因不适合于用真核细胞如啤酒糖酵母或桃阿舒氏囊霉菌属制备重组体 的核黄素的方法。因此,根据WO93/03183,从真核细胞,即从啤酒糖酵母中分 离出用于核黄素生物合成的特异基因,以便为在真核细胞的生产性生物体中核黄 素的重组体制备作好制备。然而,当不能充分对特定的参与核黄素生物合成的酶 提供底物时,对于核黄素的生产,该重组体制备方法没有或只获得有限的成功。

1967年Hanson(HansonAM,1967,在《微生物技术》中,Peppler,HJ,222-250 页,纽约)发现,加入基酸甘氨酸可以调节棉桃阿舒氏囊霉菌属的核黄素的形 成。然而,该方法存在缺陷,因为甘氨酸是一种非常昂贵的原材料。基于该理由, 人们致于通过突变的产生来使核黄素的生产达到最佳化。

由德国专利说明书19525281已知一种制备核黄素的方法,其中温育微生物, 它对阻碍异柠檬酸酯裂解酶的活性物质有抵抗作用。

由德国专利公开说明书19545468.5-41已知另一种微生物制备核黄素的方法, 其中产生的微生物提高了核黄素的异柠檬酸酯裂解酶的活性或异柠檬酸酯的基因 表达。但是,同样与该方法相比,仍然需要进一步使核黄素的制备达到最佳化。

因此,本发明的目的是提供一种用于核黄素微生物制备的单核或多核有机 体,优选微生物体,它们使核黄素形成的进一步最佳化成为可能。特别地,应该 提供一种生物体,其在节约原材料的条件下适合于制备核黄素,并因此使生产成 为可能,与迄今为止的现有技术相比,它是经济的。首先该生物体与到目前为止 的生物体相比应该使核黄素的加快形成成为可能,而无需添加甘氨酸。

本发明的目的是通过单核细胞或多核细胞生物体解决的,该生物体具有这样 改变的甘氨酸物质代谢,以致在无外加的甘氨酸下它的核黄素合成效率至少是与 野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895的核黄素合成效率相同,其中野生型 的棉桃阿舒氏囊霉菌属ATCC10895是在标准条件下在加入6克/升的额外的甘氨 酸下培养的。

在标准条件下的培养是指在120RpM和30℃下,在500毫升具有二挡板的 振动式烧瓶中进行温育。每个烧瓶中使用的介质是50毫升的或者具有10克/升葡 萄糖或者具有10克/升大豆油的10克/升的酵母抽提物的溶液。在相同的条件下采 用1%的16h培养物进行接种。

所力求达到的胞内甘氨酸物质代谢的改变的目标可以借助于已知的生物体的 菌株改善的方法实现。也就是说在最简单的情况下,应该借助于筛选在微生物中 进行常规选择之后制备相应的菌株。同样,可利用接着进行选择的突变。这里该 突变不但可以借助于化学而且可以借助于物理诱变完成。另一方法是选择和接着 进行重组的突变。最后应该借助于基因处理制备本发明的生物体。

根据本发明这样改变生物体,即它产生比维持其新陈代谢所需量大的胞内甘 氨酸。根据本发明,胞内甘氨酸产生的提高优选是这样实现的,即制备一种生物 体,其中提高了苏氨酸缩酶的酶活性。举例来说可如此实现,通过改变催化中 心,提高物质的转化或者借助于酶抑制剂的作用抵消提高的物质转化。同样可以 通过酶合成的加快例如通过基因扩增或者通过因子分离(其阻遏酶生物合成)来 提高苏氨酸醛缩酶的酶活性。

根据本发明优选通过内苏氨酸醛缩酶基因的突变提高内苏氨酸醛缩酶的活 度。这样的突变或者不采用常规方法进行,例如通过紫外线照射或者引起突变的 化学药品,或者借助于基因技术方法,例如缺失、插入和/或核苷酸交换来进行。

苏氨酸醛缩酶基因表达可以通过苏氨酸醛缩酶基因复制的插入和/或通过调节 因子的扩增(其对苏氨酸醛缩酶基因表达起积极影响)实现。特别地通过增强转 录信号使调节元素的扩增优选在转录平面上进行。此外,例如通过m-RNA稳定 性的改善同样可以使转录的增强成为可能。

为了提高基因复制数目,例如可以在基因结构或在载体中插入苏氨酸醛缩酶 基因,其优选包括归入苏氨酸醛缩酶基因的调节基因序列,特别是增强基因表达 的那些。接着通过产生核黄素的微生物转化包含苏氨酸醛缩酶基因的基因结构。

根据本发明,同样可以通过促进剂的替换获得苏氨酸醛缩酶的超量表达。因 此交替地通过基因复制的插入或通过促进剂的替换获得较高的酶活性是可能的。 然而,同样地可以通过同时进行促进剂的替换和基因复制的插入获得所希望的酶 活性改变。

因为其中这样改变的生物体有限地影响苏氨酸,所以在使用本发明的细胞时 要求辅助地加入苏氨酸。改善的吸收和苏氨酸几乎定量地反应使得甘氨酸令人惊 奇地加快了核黄素的形成,而迄今为止通过辅助加入甘氨酸是不能实现的。另外, 有机体的内苏氨酸形成例如可以通过消除天冬氨酸激酶的抗反馈性来提高。

苏氨酸醛缩酶基因优选从微生物,特别优选从真菌中分离出。因此,阿舒氏 囊霉菌属的真菌又是优选的。最优选棉桃阿舒氏囊霉菌属。

为了分离基因,所有其细胞包括用于形成苏氨酸醛缩酶的序列的其它生物 体、植物和动物细胞均在考虑范围中。基因的分离可以通过苏氨酸醛缩酶基因中 有缺陷的突变体的同源或异源互补作用或者通过同源探测或具有同源基因的PCR 进行。最后,为了进行亚克隆,通过合适的具有限制酶的片断在尺寸上将互补质 粒的插入减低至最小。在被假定的基因编序和识别之后,通过融合PCR进行配合 精确的亚克隆。携带这样获得的片断作为插入片断的质粒被引入苏氨酸醛缩酶基 因缺陷突变体中测试苏氨酸醛缩酶基因的功能。最后官能结构被用于转化核黄素 产物(Produzentenz)。

在分离和编序之后,获得具有核苷酸序列的苏氨酸醛缩酶基因,其用于编码 上述氨基酸序列或其等位变体。等位变体特别地包括通过核苷酸的缺失、插入和 取代由相应序列获得的衍生物,其中还保持了苏氨酸醛缩酶活性。在附图2b中给 出核苷酸1至1149的相应序列。

将核苷酸-1231至-1的核苷酸序列或上述序列的启动子或者基本上起相同作用 的DNA序列接在苏氨酸醛缩酶基因之前。这样例如可以将启动子接在基因之前, 通过一种或多种核苷酸交换,通过插入和/或通过缺失使启动子与具有上述核苷酸 序列的启动子不同,并且不会影响启动子的功能和活性。此外,通过改变它们的 序列可以提高它们的活性或者完全被活性启动子替换。

此外,将调节基因序列和调节基因附加在苏氨酸醛缩酶基因上,其特别地提 高苏氨酸醛缩酶基因的活性。所以例如可以在苏氨酸醛缩酶基因上附加所谓的增 强子,它们通过RNA聚合酶和DNA之间改善的相互作用来影响提高的苏氨酸醛 缩酶基因表达。

具有或者无前接启动子的苏氨酸醛缩酶基因和具有或无调节基因的苏氨酸醛 缩酶基因可以前接和/或后接一个或多个DNA序列,这样在基因结构中获得基 因。通过苏氨酸醛缩酶基因的克隆获得质粒和载体,其包含苏氨酸醛缩酶基因并 适合于转化核黄素产物。通过转化获得的细胞包括以复制形式存在的基因,也就 是附加地复制在染色体上,这里通过在基因组的任意位置上的同源重组使基因复 制一体化。

部分或完全在细胞内形成甘氨酸的本发明的目可以这样实现,即制备生物 体,其中至少部分阻断甘氨酸在细胞内分解。正如上面所描述的一样,这样的突 变可以不采用常规方法通过物理或化学诱变,而是例如通过紫外线照射或者突变 引起的化学药品,或者借助于基因技术方法来进行。

根据本发明,提高细胞内甘氨酸形成的目的优选通过改变丝氨酸羟甲基转移 酶的基因改变而实现。这样的改变例如是通过突变例如在结构基因中的插入、缺 失或取代实现,或者通过因此结合的调节元素例如启动子和转录因子实现。

根据本发明,令人惊奇地发现,突变体是抗甘氨酸抗代谢物的。优选地,涉 及这样的单细胞或多细胞生物体,它们是抗α-氨基甲基膦酸和/或α-氨基磺酸的。

同样,这点可以例如通过突变体的选择来实现,其中该突变体被苏氨酸结构 模型β-羟基-突变体交换和/或在苏氨酸和/或赖氨酸模型上进行交换。

因此,根据本发明可使用的突变体同样可以通过相应的选择来制备。因此这 样的抗性单细胞或多细胞生物体的制备应该通过常规筛选方法实现,例如它们在 微生物学中是常用的。

当至少部分地阻断细胞内形成的甘氨酸输出到介质中时,在描述的生物体的 条件下可以进一步加速核黄素的形成。在最简单的情况下,对此补加甘氨酸就足 够了。另外,可以通过基因的破裂消除负责输出的载体。

此外,可以通过改变乙醇酸盐的物质交换例如通过提高乙醇酸盐氨基转移酶 的活性来实现细胞内甘氨酸浓度的提高。另一种可能性是使由二和氨合成 细胞内甘氨酸最佳化。

总而言之,已发现,本发明目的优选是通过加快细胞内甘氨酸的合成,至少 部分阻断甘氨酸的分解,至少部分阻止从细胞中输送甘氨酸,改变乙醇酸盐物质 交换和使由二氧化碳和氨合成甘氨酸最佳化来解决的。可以交替地、累积地或随 意组合地使用这些解决方法。

通过在培养介质中加入甘氨酸可以进步加快核黄素的形成。

根据本发明获得的单细胞或多细胞生物体是任意的可用于生物技术方法的细 胞。对此例如是真菌、酵母、细菌以及植物和动物细胞。根据本发明优选是真菌 的转化细胞,特别优选阿舒氏囊霉菌属真菌。因此棉桃阿舒氏囊霉菌属是特别优 选的。

下面进一步借助于实施例描述本发明,但是本发明并不是只限于实施例的内 容。

实施例1

抗α-氨基甲基膦酸(AMPS)的突变体的选择

借助于紫外线光诱变棉桃阿舒氏囊霉菌的孢子。施于装有70mMα-氨基甲基膦 酸的平板上。如下观察对核黄素形成的抑制,即无抑制剂的真菌形成黄色菌落, 含抑制剂的真菌形成白色菌落。因此,零星地产生黄色也就是说抗抑制剂的生物 体。以这种方式获得抗性菌株AMPS-NM-01。

对具有200mM AMPS的平板所进行的试验表明,与仍然完全是白色的初始菌 株相反该菌株仍然具有黄色菌落颜色。深层培养中无甘氨酸的突变体形成的核黄 素与含甘氨酸的野生型相同(参见附图1)。

野生型和突变体的特异酶活性的检验结果表明,丝氨酸羟基甲基转移酶的活 性降低至50%(附图7)。因为通过13C-示踪苏氨酸的营养可以表明,由甘氨酸 形成丝氨酸(丝氨酸羟基甲基转移酶可以催化丝氨酸的形成)(表1),所以可 以通过甘氨酸向丝氨酸中的排出的减少来解释加快的核黄素形成。

按照表1使用的极限培养基总结如下:

溶液A:    KH2PO4         200       g/l pH6.7含KOH

(100倍)

溶液B:    NH4Cl           15        g/l

(10倍)     天冬酰胺          5         g/l

           NaCl              2         g/l

           MgSO4×7H2O    4         g/l

           MnSO4×H2O     0.5       g/l

           CaCl2×2H2O    0.4       g/l

           肌醇              1.0       g/l

           烟酰胺            2.5       g/l

           酵母抽提物        2         g/l

C-源       葡萄糖或大豆油    2.5       g/l

为了制备培养基,简单地在浓缩溶液B中加入碳源,并通过高压灭菌器灭菌。 在培养基冷却之后,加入1/100体积分离的高压灭菌的溶液A。

实施例2

从棉桃阿舒氏囊霉菌中分离GLY1-基因

为了分离用于苏氨酸醛缩酶的基因,在氟赤藓酸抗体上选择之后,用棉桃阿 舒氏囊霉菌的基因库转化啤酒糖酵母YM13F(SHM1∷HIS3 shm2∷LEO2gly1∷URA3)甘氨酸营养缺陷型突变体。该基因库由被Sau3A部分吸 收的基因组DNA组成,经密度梯度离心从该DNA中分离出尺寸为8-16kb的片 断,并且压在用BamH1断开的载体Yep352中。首先在尿嘧啶原养型上选择转化 体。在第二步骤中,在复制平板培养之后,在甘氨酸原养型上进行选择。从约70,000 尿嘧啶原养型克隆中可以分离出25甘氨酸原养型克隆。转化体的治愈以及通过分 离质粒的再转化表明,互补作用被质粒编码。在甘氨酸营养缺陷型酵母菌属菌株 中未检测到苏氨酸醛缩酶活性时(<0.1mU/mg蛋白质),在用分离的基因库质粒 转化的菌株中可以测量到明显的酶活性(25mU/mg蛋白质)。表明互补作用的亚 克隆的3.7kb HindⅢ-片断被编序(附图2)。来自啤酒糖酵母的同源基因GLY1 中的一种被发现用于编码苏氨酸醛缩酶。

实施例3

在棉桃阿舒氏囊霉菌中GLY1-基因的超量表达

为了超量表达GLY1基因,在表达载体pAG203中克隆它(参见 WO9200379)。在该质粒中,该基因受TEF-启动子和TEF终止子的控制(附图3)。 在棉桃阿舒氏囊霉菌中使G418抗性基因作为选择标记。在用该质粒转化棉桃阿 舒氏囊霉菌和接着分离单孢子克隆之后,因为孢子是单核和单倍体的,所以测量 原始提取物中苏氨酸醛缩酶的活性。与用空质粒pAG203转化的菌株比较在 A.g.p.AG203GLY1的情况下,不但在葡萄糖上生长而且在大豆油上生长时均可以 测量到至少10倍的超量表达(附图4)。

实施例4

通过GLY1-超量表达和苏氨酸的营养加快核黄素的形成

为了试验在细胞中形成的苏氨酸是否限制由过量压出的苏氨酸醛缩酶形成甘 氨酸,在培养基中加入苏氨酸。在加入6克/升苏氨酸时,在作为A,g.pAG203GLY1 的碳源的葡萄糖上的生长时,核黄素的形成比加入6克/升甘氨酸的约大一倍(附 图5)。用野生型和用空质粒转化的对照菌株未表现出这样的效果。培养基中氨 基酸的分析表明,在GLY1-过量压出时,营养的52mM苏氨酸还剩约6mM,并 且令人惊奇地,2mM的甘氨酸浓度提高至42mM。该结果表明,通过苏氨酸限制 甘氨酸的形成,过量压出苏氨酸醛缩酶具有官能作用,细胞内形成的甘氨酸作用 比细胞外营养的高并且通过真菌细胞输出大量的甘氨酸。

实施例5

甘氨酸输出的抑制

如果在大豆油上而不是如实施例4一样在葡萄糖上栽培苏氨酸醛缩酶过量压 出的菌株A.g.pAG203GLY1,那么在苏氨酸营养时核黄素的形成没有被加快,但 其超过使用甘氨酸的(附图6)。但是培养基的分析表明,苏氨酸分解至约13mM。 同样不可以进行苏氨酸中的限制。同时发现,细胞内甘氨酸从2提高至约44mM。 所有形成的甘氨酸从真菌中输出进入培养基中。该输出通过在培养基中加A.-H-氨 酸来抑制,在同时加入苏氨酸下在明显加快的核黄素形成中起作用(表2)。为 了避免加入的甘氨酸只对加快的生产负责,在对照物中加入如此多的甘氨酸,如 在用甘氨酸和苏氨酸进行的试验中,最后出现甘氨酸。该检验结果表明,细胞内 形成的甘氨酸比细胞外的甘氨酸的活性高。

实施例6

通过选择D.羟基正缬氨酸抗性突变体来加快核黄素的形成

因为不但苏氨酸转化成甘氨酸,而且苏氨酸合成作为第一次限制甘氨酸的形 成,所以在抗性突变体之后借助于苏氨酸模型研郊.羟基.正缬氨酸。在琼脂平板 上,包括2.SmMlB-羟基正缬氨酸的极限培养基明显地抑制放射生长。在菌落变化 时形成能更好生长的自发突变体。通过孢子的分离和再选择产生稳定的突变体, 其在极限培养基β-羟基正缬氨酸上比起始菌株明显更好地生长(附图8)。核黄 素形成的研究表明生产率明显提高。这样具有大豆油的极限培养基中菌株UNY- TB-25产生41±1leg/1核黄素,而起始菌株仅产生18+_3mgq核黄素。同样衍生物 HNV-TB-29的生产率明显加快至116±4mg/1,而其原始菌株Ita-GS-01仅产生 62±10m刚。

表1:在棉桃阿舒氏囊霉菌ATCl0895在给定的培养基上生长并按着所产生的生物体全部工 解之后丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸的C原子中的13C-提高(MM:极限培养基;HE:酵母提取 物;YNB:酵母基氮;呐:未确定)     培养基 MM+O.2g/lHE+1g/l乙醇 +2.7mg/l13C2-丝氨酸 MM+O.2g/l YNB+1g/l乙醇 +2.6mg/13Cl苏氨酸   丝氨酸     Cl     G2     C3     11     59     11     49     1.1     11   苏氨酸     Cl     C2     C3     C4     n-b     390     11     11     11 甘氨酸     C1     C2     11     4.3     7.1     1.1

    表2:在GLYl的同时超量表达下补充苏所酸和甘氨酸对核黄素形成的影响联     菌株     碳源   t=0补充     t=72h 核黄素[mg/1]     t=72h     C-tv     [mM]     t=72h     Thr     [mM]     WT   大豆油   80mMGlv   50mMGtv     22±1     80±2     42±O  130mMOy     18±3     129±2     rLd   葡萄糖   80mM Gly   50mMGtv     5±1     80±O     35±0  130mM Gly     7±1   126±2     nd  AgpAG203G     LYl     大豆油   80mMGtv   50mMsty     3l±O     117±2     11±l  13(hum G1y     20±3     129±l     nd   葡萄糖   80mMGtv   50mMOv     40±1     113±2     12±07  130mM Gty     9±l     129±3     nd     nd.=未发现

附图说明

附图1:在具有10克/升大豆油作为碳源的全培养基(Vollmedium)上生长之后, 在6克例.甘氨酸存在或不存在下,棉桃阿舒氏囊霉菌株ATCCl0895(野生型, WT)和AMPS抗体突变体AMPS-MN-01的核黄素的形成。测量值来源于三个独 立的试验。
附图2a:在棉桃阿舒氏囊霉菌基因组中的Sly 1-Lokus。克隆GB7.1和GB2&9以 及3.7kb HinaU亚E隆GB-26-9—6补充啤酒糖酵母突变体。GB-26-9-6完整地编序 GB7.1以补充GLYl的C.末端。
附图2b:棉桃阿舒氏囊霉菌GLYl-基因的核苷酸序列和由此导出的氨基酸序列以 及置于二侧的核苷酸序列。
附图3:用于超量表达棉桃阿舒氏囊霉菌中GLYl-基因的载体pAG203GLYl结构 的示意图。
附图4:在含10克/升大豆油的全培养基中培养期间,棉桃阿舒氏囊霉菌野生型(实 心符号)和A.g.pAG203GLY1(空心符号)关于生长、核黄素形成和苏氨酸醛缩 酶的特异活性的对比。 附图5:在含10克/升葡萄糖作为碳源和补充甘氨酸或苏氨酸的HA全培养基上培 时,棉桃阿舒氏囊霉菌菌株ATCC10895(野生型)、pAG203和pAG203GLY1 的生长和核黄素形成。该表表明在培养之前和之后各自培养基中甘氨酸和苏氨酸0 的浓度。给出的平均值和标准偏差是三个独立试验的结果。 附图6:在含10克/升葡萄糖作为碳源和补充甘氨酸或苏氨酸的HA完整培养基上 培养时,棉桃阿舒氏囊霉菌菌株ATCC10895(野生型)、pAG203和pAG203GLY1 的生长和核黄素形成。该表表明在培养之前和之后各自培养基中甘氨酸和苏氨酸 的浓度。给出的平均值和标准偏差是三个独立试验的结果。 附图7:在含10克/升大豆油的全培养基中培养期间,棉桃阿舒氏囊霉菌野生型(实 心符号)和AMPS抗体突变体AMPS-NM-01关于生长、核黄素形成和苏氨酸醛 缩酶、丝氨酸羟基甲基转移酶和谷氨酸乙醛酸氨基转移酶的特异活性的对比。测 量值来源于三个独立的试验。 附图8:β-羟基-正缬氨酸对野生型(W)和HNV-TB-25(H)在具有极限培养基 (包括2.5克/升葡萄糖和2.5mMβ-羟基-正缬氨酸)的琼脂平板上的棉桃阿舒氏囊霉生长的影响。
序列
                               T TGCCATTAAT GACCGGGAGC CTGAAGGTGT   -1201
GTGATGAACA AGCCAGTCTT CCCCGCGCGT CGCCAACTGC TCGTCATATA ATCCCGGAAA   -1141
AGCTCGCATT AGGTGAAATT TTTCTTAGGA ATTACATCTG CTACTGACAA AACTAAGTAA   -1031
AAGCTCCGAT AGGTAGCCGT GCTGCCGAGC ACCTGCCTAA TACACGCAGG CGCCATACAC   -1021
TATTTAAGCA CAATGTTATC GCCCCGCAGC TTGAGGTATT CCTGGTCGAT GCCAGGTGTC    -961
ATAGGCTTGA TCACCAGCGA GTAGACCTCA CTATTGTAGA AGCGCAGCCC GTTGCTGGGG    -901
GACTTGTAGC GCGCCTTGAG CCCCGTGATG TCGCAGTAGC GTTTCACGGG ATACTGCGAT    -841
GGTGGCGCCT GAATGTTGAA GTATGTCAGC TTCGTGCGCC CTGCGTCACG CCCGGCTTCC    -781
GACTGTGCCT CTGTCGTGAG CCGTTTCCAC TCGTCTGTCA GAAGCTGACG TGTCGGCTTG    -721
TGGCGGCGCG TGGGTTTCTT CCACGTGGGC GACTTGAAGT CGCTACGACT GGTATCATTA    -661
CGTGCTGCAA TCGCTCGGAG GTTCTCCATC TGGGGTCCAC GGTCGCTCGT TGATCTGTCT    -601
ATCTCGAAAT CCCTGCCCAG ATGTACTCCC ATGTTATCAC GTGACCACAC GCCGTTTTCG    -541
TGTGTAGTGA TGCAGATGGT TCTAGAGCAT CACGTGGCTT ACATAGCTTT GTTACATAAT    -481
CGATTTTCCG CAGGAGCGTT ACGTCCAACG GTCGTTCTGT GCCAAAAGCA ACAACTGAGC    -421
GTCAGGCGGC CGTCTCCCCA GACACGCTCC GCCCCAAACT GAGCTCCACG CGGCCTTCTG    -361
TCCGAGTTAA GTTCCTCCCC GCTCGTCAGC ACGGGGTCTT TCGTCGCCTA TCCTCCTGCA    -301
GCGTTCGCTA CTGCAGATCG TGAGCAGTGG CACCCGCGAC CAAAAAAAGA AATTATGTTC    -241
CTTACGCAAG GAATATGCCT CGCGCCATGC CATCGCAAAG AGTGATGCCG CAGAGGTTGC    -181
TTCTGCGAGG CAACTCCTGG GCAATAGGGT GGAAAATTCA GCTTGGGCTT ATATAAAAGA    -121
AACCGTTCGA GCTCGTCGGA GCCAGGTGGA AAATTTTTCG TAACGTAGGT AGAGGTTATA     -61
GTTAGCGTCA GTCTCTTTTC TGCCAAGCTG CTACAGTTGA CTACAAGTAA CAAACCCAGG      -1
  ATG AAT CAG GAT ATG GAA CTA CCA GAG GCG TAC ACG TCG GCT TCG AAC      48   1   Met Asn Gln Asp Met Glu Leu Pro Glu Ala Tyr Thr Ser Ala Ser Asn
  GAC TTC CGT TCG GAC ACG TTC ACC ACT CCA ACG CGC GAA ATG ATC GAG      96  17   Asp Phe Arg Ser Asp Thr Phe Thr Thr Pro Thr Arg Glu Met Ile Glu
  GCT GCG CTA ACG GCG ACC ATC GGT GAC GCC GTC TAC CAA GAG GAC ATC     144  33   Ala Ala Leu Thr Ala Thr Ile Gly Asp Ala Val Tyr Gln Glu Asp Ile
  GAC ACG TTG AAG CTA GAA CAG CAC GTC GCC AAG CTG GCC GGC ATG GAG     192  49   Asp Thr Leu Lys Leu Glu Gln His Val Ala Lys Leu Ala Gly Met Glu
  GCC GGT ATG TTC TGC GTA TCT GGT ACT TTG TCC AAC CAG ATT GCT TTG     240  65   Ala Gly Met Phe Cys Val Ser Gly Thr Leu Ser Asn Gln Ile Ala Leu
  CGG ACC CAC CTA ACT CAG CCA CCA TAT TCG ATT CTT TGC GAC TAC GGT     288  81   Arg Thr Gly Leu Thr Gln Pro Pro Tyr Ser Ile Leu Cys Asp Tyr Arg
  GCG CAT GTG TAC ACG CAC GAG GCT GCG GGG TTG GCA ATT TTG TCC CAG     336  97   Ala Mis Val Tyr Thr His Glu Ala Ala Gly Leu Ala Ile Leu Ser Gln
  GCC ATG GTG ACA CCT GTC ATT CCT TCC AAC GGC AAC TAC TTG ACT TTG     384 113   Ala Met Val Thr Pro Val Ile Pro Ser Asn Gly Asn Tyr Leu Thr Leu
  GAA GAC ATC AAG AAG CAC TAC ATT CCT GAT GAT GGC GAC ATC CAC GGT     432 129   Glu Asp Ile Lys Lys His Tyr Ile Pro Asp Asp Gly Asp Ile His Gly
  GCT CCA ACA AAG GTT ATC TCG TTG GAA AAC ACC TTG CAC GGT ATC ATT     480 145   Ala Pro Thr Lys Val Ile Ser Leu Glu Asn Thr Leu His Gly Ile Ile
  CAC CCA CTA GAG GAG CTT GTT CGG ATC AAG GCT TGG TGT ATG GAG AAC     528 161   His Pro Leu Glu Glu Leu Val Arg Ile Lys Ala Trp Cys Met Glu Asn
  GAC CTC AGA CTA CAC TGC GAT GGT GCG AGA ATC TGG AAC GCG TCC GCA     576 177   Asp Leu Arg Leu His Cys Asp Gly Ala Arg Ile Trp Asn Ala Set Ala
  GAA TCC GGT GTG CCT CTA AAA CAG TAC GGA GAG CTA TTC GAC TCC ATT     624 193   Glu Set Gly Val Pro Leu Lys Gln Tyr Gly Glu Leu Phe Asp Ser Ile
  TCC ATC TGC TTG TCC AAG TCC ATG GGT GCC CCA ATG GGC TCC ATT GTC     672 209   Ser Ile Cys Leu Ser Lys Ser Met Gly Ala Pro Met Gly Ser Ile Leu
  GTC GGG TCG CAC AAG TTC ATA AAG AAG GCG AAC CAC TTC AGA AAG CAG        720 225   Val Gly Ser His Lys Phe Ile Lys Lys Ala Asn His Phe Arg Lys Gln
  CAA GGT GGT GGT GTC AGA CAG TCT GGT ATG ATG TGC AAG ATG GCG ATG        768 241   Gln Gly Gly Gly Val Arg Gln Ser Gly Met Met Cys Lys Met Ala Met
  GTG GCT ATC CAG GGT GAC TGG AAG GGC AAG ATG AGG CGT TCG CAC AGA        816 257   Val Ala Ile Gln Gly Asp Trp Lys Gly Lys Met Arg Arg Ser His Arg 
  ATG GCT CAC GAG CTG GCC AGA TTT TGC GCA GAG CAC GGC ATC CCA TTG        864 273   Met Ala His Glu Leu Ala Arg Phe Cys Ala Glu Mis Gly Ile Pro Leu 
  GAG TCG CCT GCT GAC ACC AAC TTT GTC TTT TTG GAC TTG CAG AAG AGC        912 289   Glu Ser Pro Ala Asp Thr Asn Phe Val Phe Leu Asp Leu Gln Lys Ser
  AAG ATG AAC CCT GAC GTG CTC GTC AAG AAG AGT TTG AAG TAC GGC TGC        960 305   Lys Met Asn Pro Asp Val Leu Val Lys Lys Ser Leu Lys Tyr Gly Cys
  AAG CTA ATG GGC GGG CGT GTC TCC TTC CAC TAC CAG ATA TCT GAG GAG       1008 321   Lys Leu Met Gly Gly Arg Val Ser Phe His Tyr Gln Ile Ser Glu Glu
  TCC CTT GAG AAG ATC AAG CAG GCC ATC CTA GAG GCG TTC GAG TAC TCG       1056 337   Ser Leu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Ile Leu Glu Ala Phe Glu Tyr Ser
  AAG AAG AAC CCT TAC GAT GAA AAC GGC CCC ACG AAG ATC TAC AGA AGT       1104 353   Lys Lys Asn Pro Tyr Asp Glu Asn Gly Pro Thr Lys Ile Tyr Arg Ser
  GAG TCC GCT GAC GCT GTG GGT GAG ATC AAG ACC TAC AAG TAT TAA           1149 369   Glu Ser Ala Asp Ala Val Gly Glu Ile Lys Thr Tyr Lys Tyr     GGGATTTCGA TGATGACATG AAAAATTACA TATTGGCACG GCATAGGCAT TGGGTAATAT       1209
TAAGCATATG GTTGAGATGA ATTACTGTTC GGGTACCGGT ATTTCCAAAG TGCTGTCGAC       1269
TTTTGCAAGA GATGGCTATG AATGGGGCAC GCTCCATCAC CTCTCTGCGA GCCGGACTCA       1329
GCATTATATC CATCTCAAAA CCTAATATCA AATGGGATTG TGGTGCGCAG TACATGCGCA       1389
GTGCTGCACA TTTGAGGATC AATGGGTTTT TCCAGGCACT GCCTGGGTCA CTCACCCTAT       1449
TGCGGAGGGA CTAGTAGCTC TACCATTCTG AGCTGACTAA AATGTTTGAT TCTTTTGGTA       1509
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