一种牦牛乳外泌体的提取方法及其应用
阅读：19发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种牦牛乳外泌体的提取方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种牦 牛 乳外泌体的提取方法及其应用。首先，提取得到牦牛乳来源外泌体和荷斯坦 奶牛 牛乳来源外泌体，再利用高通量测序分析比较Yak-Exo和Cow-Exo中miRNA，通过 生物 信息学方法对文库中小RNA的序列 质量 、类别、长度分布等进行分析，在此 基础 上筛选出表达显著的差异miRNA。采用加尾法和qRT-PCR验证高通量测序得到miRNA的可靠性。最终对差异表达的miRNA进行GO、KEGG富集分析和靶基因预测。Yak-Exo中与缺 氧 进程 相关bta-mi-RNA31和bta-mi-RNA34a，通过有效激活HIF缺氧 信号 通路和p53细胞凋亡信号通路，有效缓解缺氧条件下小肠上皮细胞的损伤。，下面是一种牦牛乳外泌体的提取方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种牦牛乳外泌体的应用，其特征在于，所述牦牛乳外泌体作为制备缺氧引起的肠道损伤的药物或食品的应用，所述牦牛乳外泌体中包含bta-miRNA31和bta-miRNA34a，所述两个miRNA的序列分别为：
bta-miRNA-31:AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU，和
bta-miRNA-34a:UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU。
2.根据权利要求1所述的牦牛乳外泌体的应用，其特征在于，所述牦牛乳外泌体作为制备激活HIF缺氧信号通路的药物的应用。
3.根据权利要求1所述的牦牛乳外泌体的应用，其特征在于，所述牦牛乳外泌体作为制备激活p53细胞凋亡信号通路的药物的应用。
4.根据权利要求1所述的牦牛乳外泌体的应用，其特征在于，所述牦牛乳外泌体作为制备激活VEGF缺氧信号通路的药物的应用。
5.根据权利要求1所述的牦牛乳外泌体的应用，其特征在于，所述食品包括乳饮料、干酪、酸奶。
6.一种改造后的牦牛乳外泌体，其特征在于，所述牦牛乳外泌体是miRNA-31和miRNA-
34a含量增加的外泌体。
7.一种牦牛乳外泌体来源的miRNA的应用，其特征在于，所述miRNA作为制备缺氧引起的肠道损伤的药物或食品的应用，所述miRNA为bta-mi-RNA31和/或bta-mi-RNA34a，所述两个miRNA的序列分别为：
bta-miRNA-31:AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU，和
bta-miRNA-34a:UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU。
8.一种牦牛乳外泌体的提取方法，其特征在于，所述提取方法包含以下步骤：牦牛乳在低温条件下，超速离心去除乳中脂肪和细胞碎片，脱脂乳上清在低温条件下，再次超速离心去除脱脂乳上清中剩余的脂肪和细胞碎片，然后在脱脂乳上清中添加凝乳酶，37℃孵育去除脱脂乳上清中的酪蛋白，所得到乳清经过滤膜过滤去除多余细胞碎片，在低温条件下，超高速离心弃上清，于底部可见微量淡黄色沉淀，即为牦牛乳外泌体初产品，所得到的牦牛乳外泌体初产品用PBS充分吹打重悬后，再经过超高速离心，所得到的沉淀用PBS充分吹打重悬后，再次依次经过0.45μm和0.22μm的过滤膜过滤，得到牦牛乳外泌体。
一种牦牛乳外泌体的提取方法及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 外泌体(Exosomes，Exo)是细胞处于生理状态下主动分泌产生的圆形或是椭圆形、直径大小分布在30-200nm、密度为1.13-1.19g/mL的膜结构囊泡。它存在于各种体液环境中，如血清、尿液、乳汁、羊水等。因为外泌体具有脂质双分子层膜结构，可以有效保护内部的核苷酸，不被RNA酶水解且被胃肠道所吸收，所以外泌体可能是机体转运生物活性核苷酸的主要形式。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种牦牛乳外泌体的的提取方法及其应用。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005] 一种牦牛乳外泌体的应用，所述牦牛乳外泌体作为制备缺氧引起的肠道损伤的药物或食品的应用，所述牦牛乳外泌体中包含bta-miRNA31和bta-miRNA34a，所述两个mi RNA的序列分别为：
[0006] bta-miRNA-31:AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU，和
[0007] bta-miRNA-34a:UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU。
[0009] 进一步的，所述牦牛乳外泌体作为制备激活p53细胞凋亡信号通路的药物的应用。
[0010] 进一步的，所述牦牛乳外泌体作为制备激活VEGF缺氧信号通路的药物的应用。
[0011] 进一步的，所述食品包括乳饮料、干酪、酸奶。
[0012] 一种改造后的牦牛乳外泌体，所述牦牛乳外泌体是miRNA-31和miRNA-34a含量增加的外泌体。
[0013] 一种牦牛乳外泌体来源的mi RNA的应用，所述mi RNA作为制备缺氧引起的肠道损伤的药物或食品的应用，所述mi RNA为bta-mi-RNA31和/或bta-mi-RNA34a，所述两个mi RNA的序列分别为：
[0014] bta-miRNA-31:AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU，和
[0015] bta-miRNA-34a:UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU。
[0016] 一种牦牛乳外泌体的提取方法，所述提取方法包含以下步骤：
[0017] 牦牛乳在低温条件下，超速离心去除乳中脂肪和细胞碎片，脱脂乳上清在低温条件下，再次超速离心去除脱脂乳上清中剩余的脂肪和细胞碎片，然后在脱脂乳上清中添加凝乳酶，37℃孵育去除脱脂乳上清中的酪蛋白，所得到乳清经过滤膜过滤去除多余细胞碎片，在低温条件下，超高速离心弃上清，于底部可见微量淡黄色沉淀，即为牦牛乳外泌体初产品，所得到的牦牛乳外泌体初产品用PBS充分吹打重悬后，再经过超高速离心，所得到的沉淀用PBS充分吹打重悬后，再次依次经过0.45μm和0.22μm的过滤膜过滤，得到牦牛乳外泌体。
[0018] 本发明相比现有技术的有益效果为：
[0019] 1、本发明通过优化的方法提取得到牦牛乳来源外泌体(Yak-Exo)和普通牛乳来源外泌体(Cow-Exo)，然后利用高通量测序分析比较Yak-Exo和Cow-Exo中miRNA，并通过生物信息学方法对文库中小RNA的序列质量、类别、长度分布等进行分析，在此基础上筛选出表达显著的差异mi RNA，与Cow-Exo相比，Yak-Exo中差异表达并且显著上调的miRNA共20个；
[0020] 2、采用加尾法和荧光定量PCR(qRT-PCR)验证高通量测序所得到miRNA的可靠性。最终对差异表达的miRNA进行GO、KEGG富集分析和靶基因预测。发现，Yak-Exo中与缺氧进程相关mi RNA——bta-mi-RNA31和bta-mi-RNA34a，bta-mi-RNA31和bta-mi-RNA34a均通过有效激活HIF缺氧信号通路，缓解缺氧下细胞的凋亡，从而有效缓解缺氧条件下小肠上皮细胞的损伤；
[0021] 3、本发明将bta-mi-RNA31和bta-mi-RNA34a，或含有bta-mi-RNA31和bta-mi-RNA34a的牦牛乳外泌体，制备治疗缺氧引起的肠道损伤的药物或食品，安全有效，无毒副作用，具有重要的意义；
[0023] 图1为Yak-Exo与Cow-Exo中小分子RNA的注释分类示意图；
[0024] 图2为Yak-Exo和Cow-Exo中差异miRNA韦恩图；
[0025] 图3为Yak-Exo和Cow-Exo中差异miRNA表达图；
[0026] 图4为Yak-Exo和Cow-Exo中miRNA表达聚类分析图；
[0027] 图5为靶基因的GO分析结果图；
[0028] 图6为靶基因的KEGG分析结果图；
[0029] 图7为mi RNA 31细胞转染效率的鉴定柱状分析图；
[0030] 图8为mi RNA 31细胞转染效率的鉴定结果图；
[0031] 图9为miRNA 31对缺氧条件下HIF相关信号蛋白的影响示意图；
[0032] 图10为miRNA 31对缺氧条件下细胞凋亡相关信号蛋白的影响示意图；
[0033] 图11为双荧光素酶试验报告过表达miR-31靶向Casp-9基因结果图；
[0034] 图12为mi RNA 34a细胞转染效率的鉴定柱状分析图；
[0035] 图13为mi RNA 34a细胞转染效率的鉴定结果图；
[0036] 图14为miRNA 34a对缺氧条件下细胞凋亡相关信号蛋白的影响示意图；
[0037] 图15为miRNA 34a对缺氧条件下HIF相关信号蛋白的影响示意图；
[0038] 图16为双荧光素酶试验报告过表达miR-34a靶向Casp-9基因结果图。
具体实施方式
[0039] 实施例1——牦牛乳外泌体的提取
[0040] 牦牛乳在4℃条件下，8,000×g，超速离心30min去除乳中脂肪和细胞碎片。脱脂乳上清在4℃条件下，13,200×g，超速离心1h去除脱脂乳上清中剩余的脂肪和细胞碎片。然后在脱脂乳上清中添加0.025g/L的凝乳酶，37℃孵育6h去除脱脂乳上清中的酪蛋白。所得到乳清经0.45μm过滤膜过滤去除多余细胞碎片，在4℃条件下，120,000×g，超高速离心90min，弃上清，于底部可见微量淡黄色沉淀，即为牦牛乳外泌体初产品。所得到的牦牛乳外泌体初产品用PBS充分吹打重悬后，再经过120,000×g，4℃，超高速离心90min。所得到的沉淀用PBS充分吹打重悬后，再次依次经过0.45μm和0.22μm的过滤膜过滤，得到牦牛乳外泌体(Yak-Exo)。
[0041] 实施例2——Yak-Exo和Cow-Exo测序结果生物学分析
[0042] Yak-Exo和Cow-Exo中small RNA分类注释：
[0043] Yak-Exo和Cow-Exo中RNA经小RNA长度筛选后的序列与奶牛基因组数据库、miRBase 20.0比对，其中将小RNA被注释到不同的分类中，结果由图1所示，纯净序列中的小RNA种类包括mi RNA，r RNAs，sno RNAs，sn RNAs，t RNA和其它s RNAs，其中无论是在Yak-Exo还是在Cow-Exo中miRNAs所占比例最大。r RNA总量作为一个样品的质控指标，在Yak-Exo和Cow-Exo中所占比例均低于40％，所以本研究样品均符合质控指标。
[0044] Yak-Exo和Cow-Exo中差异表达间共有序列：
[0045] 比较Yak-Exo和Cow-Exo组的miRNA表达谱，其分布如图2所示，其中28％miRNA仅在Cow-Exo(SY)组表达，63.7％miRNA仅在Yak-Exo(Yak)组表达，只有8.3％miRNA同时在两个组中表达。这些共有的差异表达miRNA的功能，值得进一步研究。
[0046] 差异表达miRNA分析：
[0047] 采用Expdiff法统计Yak-Exo和Cow-Exo中已知miRNA，确定样本间的miRNA表达量是否存在显著性差异，分别使用log2-ratio和Scatter plot比较，结果如图3所示，以|log2(Fold Change)|≥1为阈值，图中每一个点代表一个miRNA，X轴表示在Cow-Exo中的表达量，Y轴表示在Yak-Exo中的表达量；绿色点表示miRNA表达下调，灰色点表示miRNA表达没有变化，红色点表示miRNA表达上调。在高通量结果分析得到的794个miRNA中，一共存在130个差异表达的miRNA，其中51个miRNA在Yak-Exo中高表达，79个miRNA在Yak-Exo中低表达。
[0048] 差异表达miRNA聚类分析：
[0049] 为了深入研究Yak-Exo和Cow-Exo中差异表达的miRNA不同表达模式，根据测序结果，对Yak-Exo和Cow-Exo中miRNA进行层次聚类分析，结果如图4所示，每一行代表一种miRNA，每一列代表一个样本。每一小格的颜色显示一个miRNA在样品中的差异表达，红色代表miRNA在样本中高表达，绿色代表在样本中低表达。聚类分析图清楚的展现了Yak-Exo和Cow-Exo两个样本中miRNA表达变化。有差异明显的miRNA，也存在差异不明显的miRNA，而差异表达miRNA可能因为表达模式相近而具有相似的生物功能或者参与相同的生物学过程。Yak-Exo和Cow-Exo两组组内表达模式较好的聚类在一起，说明生物学重复间存在相对较好的一致性。
[0050] 实施例3——差异表达的mi RNA分析
[0051] 靶基因GO显著性分析：
[0052] 本实施例对实施例1分析得到的差异表达的mi RNA进行GO富集分析，如图5所示，在Yak-Exo中表达上调的51个miRNAs的靶基因主要参与了细胞内通讯传递(intracellular signal transduction)和膜泡运输(vacuolar transport)等多种生物学过程。绿色代表生物学进程，橘色代表细胞组成，黄色代表基因的分子功能。
[0053] 靶基因KEGG显著性分析：
[0054] 为了更加直观的显示Yak-Exo和Cow-Exo中差异显著的miRNA富集通路的显著程度，对其进行散点分析(如图6所示)，富集因子越大，表示富集越显著(P＜0.05)。KEGG富集分析得出，核糖体通路(Lysosome)为极显著富集项，富集到79个候选靶基因(P＜0.01)。肿瘤坏死因子信号通路(TNF signalingpathway)、丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)、突触长时程增强信号通路(Long-term potentiation)、癌症中的中心碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)、鞘脂类信号通路(Sphingolipid signaling pathway)、糖尿病并并发症的年龄愤怒信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、磷脂酰肌醇信号通路(Phosphatidylinositol signaling system)、神经激素信号通路(neurotrophin signaling pathway)为显著富集项(P＜0.05)。而缺氧信号通路(HIF-1 signaling pathway)可以从98个背景基因中富集到58个候选基因(P＝0.052)。
[0055] 差异表达miRNA靶基因验证：
[0056] 为了进一步研究样本间差异表达miRNA的生物学功能，采用miRanda、PITA和RNAhybrid软件预测取交集，从Yak-Exo和Cow-Exo库差异表达的miRNA中筛选可能与缺氧进程相关的已知miRNA，结果如表1/2所示：与Cow-Exo相比，在差异表达并且显著上调的前20个miRNAs中(如表3)，miR-31和miR-34a在Yak-Exo中高表达，且采用生物学分析综合评估预测miR31和miR34a靶基因。预测结果表明miR31和miR34a均与缺氧过程相关。其中miR-31与HIF信号通路相关(P＝0.0078<0.01)，miR-34a与VEGF信号通路相关(P＝0.018<0.05)，miR31和miR34a可能均通过影响VEGFA，在通过一系列信号级联反应影响HIF的活性与p53的合成。
[0057] 表1 miR-31靶基因预测
[0058]
[0059]
[0060] 表2 miR-34a靶基因预测
[0061]
[0062] 表3在Yak-Exo中高表达(TOP 20)差异miRNA
[0063]miRNA ID Yak-Exo Cow-Exo Log2(fold change) Significance-Lab
bta-miR-2284a 18.5567 0.5528 5.069 **
bta-miR-193b 2.2082 0.1162 4.2482 **
bta-miR-31 8.7238 0.5284 4.0453 **
bta-miR-2285o 5.1098 0.4122 3.6319 **
bta-miR-145 1.7935 0.2039 3.1368 **
bta-miR-199a-3p 3.6306 0.4485 3.017 **
bta-miR-451 4.5368 0.5978 2.9239
bta-miR-34a 13.9841 1.9224 2.8628 **
bta-miR-133a 5.4265 0.7787 2.8009 **
bta-miR-10b 59.8829 8.6626 2.7893 **
bta-miR-490 3.3888 0.4903 2.789 **
bta-miR-218 5.4395 1.0775 2.3358 **
bta-miR-29c 55.3679 11.7918 2.2313 **
bta-miR-135a 29.7527 6.7185 2.1468 **
bta-miR-143 240.963 59.5807 2.0159 **
bta-miR-381 4.5291 1.124 2.0106 **
bta-miR-500 30.6698 8.5888 1.8363 **
bta-miR-30b-5p 307.1827 90.9787 1.7555 **
bta-miR-1 85.3687 25.6055 1.7373
bta-miR-29b 65.9363 20.2159 1.7056 **
bta-miR-2284a 18.5567 0.5528 5.069 **
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[0064] 实施例4——mi RNA 31缓解缺氧条件下小肠上皮细胞损伤的作用机制[0065] 高通量测序结果分析表明：与Cow-Exo相比，在差异表达并且显著上调的前20个miRNAs中，miR-31和miR-34a在Yak-Exo中高表达，且采用生物学分析综合评估预测结果表明miR-31和miR-34a均与缺氧过程相关。其中miR-31与HIF信号通路相关(P＝0.0078<0.01)，miR-34a与VEGF信号通路相关(P＝0.018<0.05)。
[0066] 本实施例探究miR-31和miR-34a缓解缺氧造成的IEC-6细胞损伤的作用途径及机制。分别转染bta-miR-31过表达100pmol/well；bta-miR-31沉默100pmol/well；bta-miR-31沉默200pmol/well；bta-miR-34a过表达100pmol/well；bta-miR-34a沉默100pmol/well；bta-miR-34a沉默200pmol/well，利用qRT-PCR检测miRNA的转染效率，筛选mi RNAs过表达和沉默最优添加浓度。利用MTT和免疫荧光(IF)检测miR-31和miR-34a对IEC-6细胞存活率的影响。运用WB检测P53和HIF信号路径元件因子表达。运用双荧光素酶验证miR-31和miR-
34a与casp9之间的靶向关系，为高原缺氧的肠道损伤的治疗提供潜在靶点和理论基础。
34a与casp9之间的靶向关系，为高原缺氧的肠道损伤的治疗提供潜在靶点和理论基础。
[0067] miRNA 31对缺氧诱导下IEC-6细胞生存能力的影响：
[0068] 由图7所示，用MTT法检测IEC-6细胞分别转染miR-31mimic和miR-31inhibitor后缺氧12h和24h，在正常及缺氧条件下IEC-6细胞细胞存活率的情况。MTT结果显示：与常氧条件下IEC-6细胞存活率相比，缺氧12h和24h后，IEC-6细胞存活率显著减少(P<0.05)。当miR-31mimic转染后，缺氧12h和24h，与阴性对照组(缺氧组)和转染miR-31inhibitor组相比，IEC-6细胞存活率水平明显升高(P<0.05)。转染miR-31mimic后，相比缺氧24h，缺氧12h时IEC-6细胞存活率相对显著恢复。综上所述，miR-31可以有效缓解缺氧条件下IEC-6细胞损伤。
[0069] 由图8所示，为了进一步说明miR-31可以有效缓解缺氧条件下IEC-6细胞损伤，我们利用免疫荧光法检测Ki67蛋白表达量。Ki67是一种核蛋白，与核糖体RNA转录有关。可以作为一个细胞增殖的标记物。结果如图8所示，相比常氧下，缺氧12h时IEC-6细胞内Ki67的表达量减少。与阴性对照组(缺氧组)和转染miR-31inhibitor组相比，转染miR-31 mimic后，IEC-6细胞内Ki67蛋白表达量明显升高(P<0.05)。综上所述，miR-31可以有效缓解缺氧条件下IEC-6细胞损伤。其检测结果与MTT结果一致。
[0070] miRNA 31对缺氧诱导下抗凋亡HIF信号通路蛋白的调控作用：
[0071] 为了进一步研究miR-31缓解缺氧条件下小肠上皮细胞损伤的作用机理，利用WB法检测检测IEC-6细胞分别转染miR-31 mimic和miR-31 inhibitor后缺氧12h，正常及缺氧条件下IEC-6细胞种缺氧相关蛋白的表达。结果由图9所示，缺氧条件下，HIF-α和VEGF蛋白表达量高，而PHD-1蛋白表达量低。相比缺氧条件下和添加同样浓度的miR-31 inhibitor，添加miR-31 mimic会显著促进PHD-1蛋白的表达，降低HIF-α及下游因子VEGF蛋白的表达。综上所述，添加miR-31 mimic可能通过有效激活HIF缺氧信号通路，缓解缺氧下小肠上皮细胞的损伤。
[0072] miRNA 31对缺氧诱导下抗凋亡P53信号通路蛋白的调控作用：
[0073] 为了进一步研究miR-31缓解缺氧条件下小肠上皮细胞损伤的作用机理，利用WB法检测检测IEC-6细胞分别转染miR-31 mimic和miR-31 inhibitor后缺氧12h，正常及缺氧条件下IEC-6细胞种凋亡相关蛋白的表达。结果由图10所示，相比常氧条件下，缺氧条件下，p53蛋白，促凋亡相关蛋白Bax，Casp-9蛋白和Casp-3蛋白高表达。相比缺氧条件下和添加同样浓度的miR-31 inhibitor，当添加miR-31 mimic会显著减少p53蛋白，Bax蛋白，Casp-9蛋白和Casp-3蛋白的表达量。综上所述，添加miR-31有效缓解缺氧下细胞的凋亡。
[0074] miRNA-31靶基因预测：
[0075] miRNA通过结合与下游靶基因miRNA的3’-UTR位置负调控靶基因表达水平，从而发挥miRNA生物学功能。采用生物学软件对miR-31靶基因进行预测。初步确定了miR-31与调节缺氧过程相关。miR-31与HIF信号通路相关(P＝0.0078<0.01)。miR-31可能均通过调节缺氧和细胞凋亡通路，进而缓解缺氧条件下小肠上皮细胞的损伤。
[0076] 利用生物信息学软件预测发现miR-31存在多个靶基因。本研究主要探究缺氧环境下，小肠上皮细胞损伤恢复程度。我们选择Casp-9这个miR-31的靶基因。利用生物信息学软件预测发现bta-miR-31存在多个靶基因。本研究主要探究缺氧环境下，bta-miR-31对IEC-6细胞损伤后恢复程度。我们选择Caspase-9这个bta-miR-31的靶基因。结果如表4所示，bta-miR-31与Caspase-9间存在1个可能有效结合的位点。
[0077] 表4 miR-31靶基因结合位点序列
[0078]
[0079]
[0080] miRNA mimics跟NC对照相比，野生型载体(WT)荧光有所下调，突变型载体(MUT)荧光有所恢复，则认为miRNA对靶基因具有调节作用，荧光信号强弱可间接反映miRNA对靶基因序列的抑制效率。结果如图11所示，与bta-Casp 9-WT-NC相比，转染bta-miR-31后对bta-Casp 9-WT荧光表达无明显的影响。与bta-Casp 9-MUT1-NC相比，转染bta-miR-31后对bta-Casp 9-MUT1的荧光表达无明显的影响。转染bta-miR-31后的bta-Casp9-MUT1的荧光表达相对于转染bta-miR-31后的bta-Casp 9-WT的荧光表达无显著影响。该结果表明，bta-miR-31很可能与bta-Casp 9 3’UTR上的该位点没有明显的相互作用。结果只能说明bta-miR-31并不是通过bta-Casp9 3’UTR上的该位点调控靶基因的表达，并不能说明bta-miR-31与Casp9之间不存在靶向关系。
[0081] 实施例5——mi RNA 34a缓解缺氧条件下小肠上皮细胞损伤的作用机制[0082] miRNA-34a对缺氧诱导下IEC-6细胞生存能力的影响：
[0083] 由图12所示，用MTT法检测IEC-6细胞分别转染miR-34a mimic和miR-34inhibitor后缺氧12h和24h，在正常及缺氧条件下IEC-6细胞细胞存活率的情况。MTT结果显示：与常氧条件下IEC-6细胞存活率相比，缺氧12h和24h后，IEC-6细胞存活率显著减少(P<0.05)。当miR-34a mimic转染后，缺氧12h和24h，与阴性对照组(缺氧组空白组)相比，IEC-6细胞存活率水平明显升高(P<0.05)。转染miR-34a mimic后，相比缺氧24h，缺氧12h时IEC-6细胞存活率相对显著恢复。综上所述，miR-34可以有效缓解缺氧条件下IEC-6细胞损伤。
[0084] 为了进一步说明miR-34a可以有效缓解缺氧条件下IEC-6细胞损伤，我们利用免疫荧光法检测Ki67蛋白表达量。Ki67是一种核蛋白，与核糖体RNA转录有关。可以作为一个细胞增殖的标记物。结果由图13所示，相比常氧下，缺氧12h时IEC-6细胞内Ki67的表达量减少。与阴性对照组(缺氧组)和转染miR-34a inhibitor组相比，转染miR-34a mimic后，IEC-6细胞内Ki67蛋白表达量明显升高(P<0.05)。综上所述，miR-34a可以有效缓解缺氧条件下IEC-6细胞损伤。其检测结果与MTT结果一致。
[0085] miRNA 34a对缺氧诱导下抗凋亡HIF信号通路蛋白的调控作用
[0086] 为了进一步研究miR-34a缓解缺氧条件下小肠上皮细胞损伤的作用机理，利用WB法检测检测IEC-6细胞分别转染miR-34a mimic和miR-34 inhibitor后缺氧12h，正常及缺氧条件下IEC-6细胞种缺氧相关蛋白的表达。结果由图14所示，缺氧条件下，HIF-α和VEGF蛋白表达量高，而PHD-1蛋白表达量低。相比缺氧条件下和添加同样浓度的miR-34a inhibitor，添加miR-34a mimic会显著促进PHD-1蛋白的表达，降低HIF-α及下游因子VEGF蛋白的表达。综上所述，添加miR-34a mimic更有效激活HIF缺氧信号通路，缓解缺氧下小肠上皮细胞的损伤。
[0087] miRNA 34a对缺氧诱导下抗凋亡p53信号通路蛋白的调控作用
[0088] 为了进一步研究miR-34a缓解缺氧条件下小肠上皮细胞损伤的作用机理，利用WB法检测检测IEC-6细胞分别转染miRNA-34a mimic和miRNA-34 inhibitor后缺氧12h，正常及缺氧条件下IEC-6细胞种凋亡相关蛋白的表达。结果由图15所示，相比常氧条件下，缺氧条件下，p53蛋白，Bax蛋白，Casp-9蛋白和Casp-3蛋白表达量高。相比缺氧条件下和添加同样浓度的miRNA-34a inhibitor，当添加miRNA-34a mimic会显著减少p53蛋白Bax蛋白，Casp-9蛋白和Casp-3蛋白表达量。综上所述，添加miRNA-34a有效缓解缺氧下细胞的凋亡。
[0089] miR-34a靶基因预测：
[0090] miRNA通过结合与下游靶基因miRNA的3’-UTR位置负调控靶基因表达水平，从而发挥miRNA生物学功能。采用生物学软件对miR-34a靶基因进行预测。初步确定了miR-34a与调节缺氧过程相关。miR-34a与VEGF信号通路相关(P＝0.018<0.05)。miR-34a可能均通过调节缺氧和细胞凋亡通路，进而缓解缺氧条件下小肠上皮细胞的损伤。
[0091] 利用生物信息学软件预测发现bta-miR-34a存在多个靶基因。本研究主要探究缺氧环境下，小肠上皮细胞损伤恢复程度。利用软件预测bta-miR-34a靶基因Caspase-9结合位点，结果如表5所示，bta-miR-34a与Caspase-9间存在5个可能有效结合的位点，根据folding energy绝对值越越低，P值越小，预测位点综合评分越高的原则选择相对合适位点。
[0092] 表5 miR-34a靶基因结合位点序列
[0093]
[0094]
[0095] 结果如图16所示，与bta-Casp9-WT-NC相比，转染bta-miR-34a后显著上调bta-Casp 9-WT荧光表达。与bta-Casp9-MUT2-NC相比，转染bta-miR-34a后显著上调bta-Casp 9-MUT2的荧光表达。转染bta-miR-34a后的bta-Casp9-MUT2的荧光表达显著高于转染bta-miR-34a后的bta-Casp9-WT的荧光表达，且荧光值相对增加了26％，其变化趋势符合miRNA调控基因表达的作用。结果说明bta-miR-34a可以调节bta-Casp 9 3'-UTR上位点调控靶基因的表达。
[0096] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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