富含和缺乏玉米醇溶蛋白的蛋白质
阅读：785发布：2020-05-08
专利汇可以提供富含和缺乏玉米醇溶蛋白的蛋白质专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述了一种玉米蛋白产品以及获得所述玉米蛋白产品的方法，所述玉米蛋白产品包含：包含75重量％至95重量％(干固体) 蛋白质 的第一级分和包含60重量％至80重量％(干固体)蛋白质的第二级分，其中所述第一级分是富含玉米醇溶蛋白的级分，并且所述第二级分是缺乏玉米醇溶蛋白的级分。本文进一步描述了一种源自脱 淀粉 的玉米麸质粉的玉米蛋白产品，其包含：包含78重量％至83重量％(干固体)蛋白质的第一级分和包含70重量％至80重量％(干固体)蛋白质的第二级分，其中所述第一级分是富含玉米醇溶蛋白的级分，并且所述第二级分是缺乏玉米醇溶蛋白的级分。，下面是富含和缺乏玉米醇溶蛋白的蛋白质专利的具体信息内容。
1.一种玉米蛋白产品，其包含：
包含75重量％至95重量％(干固体)蛋白质的第一级分和包含60重量％至80重量％(干固体)蛋白质的第二级分。
2.如权利要求1所述的玉米蛋白产品，其中所述第一级分和第二级分具有不同的氨基酸分布。
3.如权利要求1所述的玉米蛋白产品，其中所述第二级分具有低于1.5％的脂肪含量。
4.如权利要求1所述的玉米蛋白产品，其中所述第一级分是富含玉米醇溶蛋白的级分，并且所述第二级分是缺乏玉米醇溶蛋白的级分。
5.如权利要求1所述的玉米蛋白产品，其中所述第一级分具有至少50％或至少55％的蛋白质产率。
6.如权利要求1所述的玉米蛋白产品，其中所述第一级分具有至少30％或至少40％的蛋白质产率。
7.如权利要求1所述的玉米蛋白产品，其中所述玉米蛋白产品源自脱淀粉的玉米麸质粉。
8.如权利要求1所述的玉米蛋白产品，其中所述第二级分用于食品应用。
9.如权利要求1所述的玉米蛋白产品，其中所述第二级分包含15-20％的具有在17-
20kDa范围内的分子量分布谱的蛋白质。
10.一种获得如权利要求1所述的玉米蛋白产品的方法，其包括用包含55-80重量％乙醇的乙醇-水溶剂处理脱淀粉的玉米麸质粉。
11.如权利要求10所述的方法，其包括在乙醇处理之后的任选的脱脂步骤。
12.如权利要求10所述的方法，其包括在乙醇处理之前的任选的脱脂步骤。
13.一种源自脱淀粉的玉米麸质粉的玉米蛋白产品，其包含：包含78重量％至83重量％(干固体)蛋白质的第一级分和包含70重量％至80重量％(干固体)蛋白质的第二级分。
14.如权利要求13所述的玉米蛋白产品，其中所述第一级分和第二级分具有不同的氨基酸分布。
15.如权利要求13所述的玉米蛋白产品，其中所述第一级分和第二级分具有不同的脂肪酸谱。
16.如权利要求13所述的玉米蛋白产品，其中所述第二级分用于食品应用。
17.如权利要求13所述的玉米蛋白产品，其中所述第一级分具有至少50％或至少55％的蛋白质产率。
18.如权利要求13所述的玉米蛋白产品，其中所述第一级分具有至少30％或至少40％的蛋白质产率。
19.如权利要求13所述的玉米产品，其中所述第一级分是富含玉米醇溶蛋白的级分，并且所述第二级分是缺乏玉米醇溶蛋白的级分。
20.如权利要求13所述的玉米蛋白产品，其中所述第二级分包含15-20％的具有在17-
20kDa范围内的分子量分布谱的蛋白质。
21.如权利要求13所述的玉米蛋白产品，其中以蛋白质计，所述第二级分包含高于
11.5％的亮氨酸、高于5.0％的酪氨酸和低于4.0％的赖氨酸。
富含和缺乏玉米醇溶蛋白的蛋白质
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
[0003] 本申请涉及产生富含玉米醇溶蛋白和缺乏玉米醇溶蛋白的玉米蛋白级分的方法。
背景技术
[0004] 与用于多种工业用途的玉米醇溶蛋白分离有关的工艺开发已有很长的历史。玉米醇溶蛋白的分离通常涉及使用含水乙醇溶解玉米麸质粉中的玉米醇溶蛋白，随后去除溶剂和“污染物”，其中玉米醇溶蛋白的非蛋白质成分的主要部分是脂质。已经开发出该工艺的变化形式，但总是从玉米麸质粉开始。尽管有商业化的玉米醇溶蛋白生产商，但玉米醇溶蛋白昂贵，因此通常不适合于食品使用。此外，缺乏玉米醇溶蛋白的级分似乎没有用于食品中。因此，食品配方师无法获得两种潜在的高蛋白成分。发明内容
[0005] 本文描述了玉米蛋白产品以及获得所述玉米蛋白产品的方法，所述玉米蛋白产品包含：包含75重量％至95重量％(干固体)蛋白质的第一级分和包含60重量％至80重量％(干固体)蛋白质的第二级分，其中所述第一级分是富含玉米醇溶蛋白的级分，并且所述第二级分是缺乏玉米醇溶蛋白的级分。本文进一步描述了源自脱淀粉的玉米麸质粉的玉米蛋白产品，其包含：包含78重量％至83重量％(干固体)蛋白质的第一级分和包含70重量％至80重量％(干固体)蛋白质的第二级分，其中所述第一级分是富含玉米醇溶蛋白的级分，并且所述第二级分是缺乏玉米醇溶蛋白的级分。
[0007] 图1示出了在一系列EtOH浓度下来自 或玉米麸质粉(CGM)的提取物中所含的固体，其以总溶解固体(A)或占从所述提取物中回收的初始固体的百分比(B)来表示。在一系列EtOH浓度下来自Empyreal或CGM的经提取的残渣中所含的固体以总固体(C)或占所述残渣中的初始固体的百分比(D)来表示。
[0008] 图2示出了来自提取物(A)或残渣(B)的固体中的蛋白质浓度随原料和乙醇浓度的变化。
[0009] 图3示出了通过SDS凝胶电泳分离后，对来自Empyreal提取物(E10提取物)和CGM提取物(G10提取物)的三重条带和40kDa条带的定量。误差棒表示标准偏差。
[0010] 图4示出了通过SDS凝胶电泳分离后，对来自Empyreal和CGM的残渣的五个不同分子量条带的定量。
具体实施方式
[0011] 美国专利第9,226,515号中公开了将玉米麸质粉中的淀粉去除从而产生具有约75％蛋白质的产品的工艺，如国际申请PCT/2016/024020中公开的，该产品被进一步加工成去除了脂质和色素并且具有高于85％的蛋白质。在该工艺中，目的是使蛋白质产率最大化，因此确定并采用了使蛋白质溶解最小化的条件。所述工艺也非常具有成本效益。
[0012] 本文所述的本发明的方面探索了使用高水溶剂是否可能产生一种新的玉米蛋白的分级分离。例如，溶解的玉米醇溶蛋白与总蛋白的比率可能根据是否使用玉米麸质粉(“CGM”)或脱淀粉的CGM(根据美国专利第9,226,515号，下文称为 )而变化。类似地，由于先前的热处理和酶处理，可能会有其它蛋白质优先溶解或保留。
[0013] 的加工历程产生对乙醇提取的响应不同于玉米麸质粉的物质。这种差异影响产率、第一提取物纯度以及蛋白质和氨基酸分布。令人惊讶的是，提取的富含玉米醇溶蛋白的蛋白质与从CGM提取的富含玉米醇溶蛋白的物质不同。
[0014] 实际上，倾向于推动更高纯度的材料的技术性能和追求高纯度的经济后果之间存在着矛盾。这种技术开发的重点和意图在于纯度较低的蛋白质，同时注意降低成本。在这些方面，使用 而不是CGM作为原料的益处变得突出。已经发现，从 提取的残渣含有以干基计接近70％的蛋白质，相比之下，从CGM提取的残渣则含有约40％的蛋白质(这两个值在进一步脱脂后均略有上升)。这对这两种蛋白质级分的价值有巨大影响，因为在蛋白质低于50％的情况下，饲料是最有可能的结果。在蛋白质超过70％的情况下，食品是更有可能和更有价值的用途。
[0015] 本文公开了玉米蛋白产品，其包含富含玉米醇溶蛋白的级分(在本文中也称为“第一级分”和“提取物”)和缺乏玉米醇溶蛋白的级分(在本文中也称为“第二级分”和“残渣)。在此，令人惊讶的是，富含玉米醇溶蛋白的级分包含75重量％至95重量％(干固体)蛋白质，而缺乏玉米醇溶蛋白的级分包含60重量％至80重量％(干固体)蛋白质。此外，在一些方面，富含玉米醇溶蛋白的级分包含78重量％至83重量％(干固体)蛋白质，并且缺乏玉米醇溶蛋白的级分包含70重量％至80重量％(干固体)蛋白质。出乎意料的是，缺乏玉米醇溶蛋白的级分包含足够高的蛋白质含量，以至于它也可以(与富含玉米醇溶蛋白的级分一起)用于食品应用。
[0016] 为了获得这样的玉米产品，本发明的方面以脱淀粉的玉米麸质粉(例如但不限于)为起始物。已经发现，与玉米麸质粉相比，脱淀粉的玉米麸质粉获得具有比玉米麸质粉更高的蛋白质含量的缺乏玉米醇溶蛋白的级分。使用醇例如乙醇或异丙醇的水溶液实现了富含玉米醇溶蛋白的级分和缺乏玉米醇溶蛋白的级分的分离。在优选的方面，有机溶剂是包含55-80重量％乙醇的乙醇-水溶剂。将有机溶剂加入到脱淀粉的玉米麸质粉中后，进行一系列本领域技术人员通常已知的固液分离(例如过滤或离心分离)和匀化技术，以回收富含玉米醇溶蛋白的级分和缺乏玉米醇溶蛋白的级分。值得注意的是，较高的乙醇浓度会增加缺乏玉米醇溶蛋白的级分中存在的蛋白质的量。此外，结果表明，使用脱淀粉的玉米麸质粉与玉米麸质粉相比产生具有更高纯度的蛋白质的富含玉米醇溶蛋白的级分，并且缺乏玉米醇溶蛋白的级分可具有高出高达1.75倍的蛋白质浓度。
[0017] 还值得注意的是，取决于是使用玉米麸质粉作为原料，还是使用 作为原料，富含玉米醇溶蛋白的级分和缺乏玉米醇溶蛋白的级分具有不同的氨基酸分布，这表明该级分的蛋白质组成并不相同。进一步地，富含玉米醇溶蛋白的级分和缺乏玉米醇溶蛋白的级分具有不同的脂肪酸谱。
[0018] 此外，蛋白质产量百分比也是令人关注的。在优选的方面，富含玉米醇溶蛋白的级分占原料中存在的蛋白质的至少50％，更优选至少55％。在优选的方面，缺乏玉米醇溶蛋白的级分占原料中存在的蛋白质的至少30％，更优选至少40％。应当认识到，在该工艺中可能会损失一些蛋白质。此外，任选的脱脂步骤提高了缺乏玉米醇溶蛋白的级分中的蛋白质纯度。用有机溶剂诸如乙醇、己烷和乙酸乙酯处理富含玉米醇溶蛋白的级分和缺乏玉米醇溶蛋白的级分，以去除脂质和色素。
[0019] 实施例
[0020] 材料和方法
[0021] 在其余的实施例中使用了下列材料和方法。
[0022] 在Blair,Nebraska的Cargill Starch and Sweeteners玉米湿磨机中将CGM和Empyreal作为湿滤饼收集。将滤饼冷冻，运输，并冷冻储存直至使用前不久。将湿滤饼用约200ppm H2O2处理以氧化游离亚硫酸根，但CGM未进行此项处理。
[0024] 为了确定原料的固体含量，在Sartorius水分天平上干燥一式两份或一式三份样品。为了确定最终样品的固体含量，将约1g滤饼或10g提取剂称取到配衡铝盘中，并在80-100℃下真空干燥至少过夜。
[0025] 实施例1
[0026] 该实施例表明，CGM和 具有彼此不同的分级分离特征，并产生不同的接近的残渣组合物。将10g CGM或Empyreal滤饼称取到50mL离心管中。根据表1制备提取剂并将其加入到管中。
[0027] 表1.提取剂组成和以w/w表示的估计的溶剂浓度。
[0028] EtOH(g) 固有水(g) 加入的水(g) [EtOH]％24 6.2 0 80
22.5 6.2 1.5 75
21.5 6.2 2.5 72
20 6.2 4 67
18 6.2 6 60
16.5 6.2 7.5 55
22.5 6.2 1.5 75
21.5 6.2 2.5 72
20 6.2 4 67
18 6.2 6 60
16.5 6.2 7.5 55
[0029] 用手摇动管，然后用手持匀化器混合内容物。然后将管置于60℃水浴中。定期摇动管，并在30分钟后，将管以10000rpm离心2分钟。将上清液倒入单独的管中，再加入10g提取剂，并再匀化。在60℃下再过30分钟后，在以10000rpm离心后再次收集上清液。合并上清液。
[0031] 发现在使用约65重量％EtOH时经提取的物料具有最高的产率(图1A)。提取物比CGM提取物具有更高的固体含量(图1B)。
[0032] 当提取 时，经提取的固体(残渣)表现出大体上相反的行为，在使用约65重量％EtOH时残余固体最少(图1C和图1D)。在CGM的情况下，减少乙醇导致残余固体更少。在去除溶剂之前，可见固体级分具有相同的形态。
[0033] 源自Empyreal和CGM的提取物在其干固体中具有相似浓度的蛋白质，其为富含玉米醇溶蛋白的级分(图2A)。相比之下，Empyreal提取后的残渣具有含量比来自CGM的可比提取物高得多的蛋白质，其为缺乏玉米醇溶蛋白的级分(图2B)。鉴于 的蛋白质浓度更高，这一观察结果实际上非常重要。 的分级分离产生两种含有以干基计高于70％的蛋白质的级分。CGM的分级分离产生两种具有不同的蛋白质浓度，因此具有不同的用途和价值的级分。
[0034] 实施例2
[0035] 将实施例1中所述的在60℃和67重量％EtOH下分级分离得到的提取物和残渣的代表性样品进行SDS凝胶电泳。基于蛋白质浓度，称取含有计算的28mg蛋白质的样品，并将其与10mL含有1重量％SDS的0.1N NaOH混合。将其放置过夜，以使其水合和溶解。将含有100μL含1mM二硫苏糖醇的Laemmli缓冲液的等分试样加入到100μL碱性提取物中，并暴露于沸水浴中5分钟。将样品冷却，并以13000g离心5分钟以去除颗粒。将20μL等分试样加载到AnykDTMMini- TGXTM预制凝胶的孔中，并在Mini- 系统上进行解析。进行跑胶，直至标记染料到达凝胶底部。将凝胶用Bio-SafeTM考马斯亮蓝G-250染色，并在水中脱色。
[0036] 将每个样品(CGM和 提取物(“富含玉米醇溶蛋白”))上样4次，以提供定量评估的机会。使用Licor Odessey扫描仪，利用Image Studio 2.0版软件创建脱色凝胶的图像。定量是通过在Image Studio 2.0版软件中手动分析完成的。
[0037] 提取物样品产生允许进行定量分析的相对清晰的条带。玉米醇溶蛋白在约25kDa处形成在图谱中占主导地位的三重条带。该三重条带占 提取物的约76％，而占CGM提取物的约57％。使用两样本T检验，这些具有统计学差异(p＝0.003)。
[0038] 在约40kDa处也可见第二条带。与CGM提取物(1.0％)相比，该条带在提取物中几乎是两倍突出(2.48％)，这也具有统计学差异(p＝0.016)。该比较示于图3中。
[0039] 总之，实施例1和2的结果表明，与使用CGM相比，使用 作为原料实际上在提取中产生具有更高纯度的蛋白质，并且残余物质具有高出1.75倍的蛋白质浓度。合乎逻辑地推断，残渣中的蛋白质分布也随原料的不同而不同。
[0040] 实施例3
[0041] 使用与实施例1相同的程序，从 和CGM湿滤饼制备富含玉米醇溶蛋白的提取物和缺乏玉米醇溶蛋白的残渣。Empyreal滤饼的固体含量为39.7％，而CGM滤饼的固体含量为38.9％。将240g69重量％EtOH加入到100g解冻滤饼中，并用手持匀化器匀化。将混合物在60℃下放置30分钟，同时定期地摇动。通过在布氏漏斗上用18.5cm Whatman 113滤纸过滤来回收提取物。将残渣再悬浮于250g66重量％EtOH中，并重复提取和过滤。将固体第三次再悬浮于250g66重量％EtOH中，并重复分离。
[0043] 在使样品在真空下于110℃下在6N HCl中过夜水解后进行氨基酸分析。冷却后，用6N KOH中和样品。使初级氨基酸在2％乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯的甲醇溶液和1M碳酸氢铯缓冲液中衍生化。将1μL等分试样注射到安装在Agilent 1290超高效液相色谱仪中的Waters Acquity CORTECS反相C18柱(100×2.1mm，1.6um)上。将衍生化的氨基酸通过线性梯度进行洗脱，所述线性梯度包含95％流动相A(20mM甲酸铵加0.1％甲酸)至95％流动相B(乙腈)。然后通过282nm处的UV吸收来检测分析物。通过与从Sigma获得的标准品(A9781)进行比较来定量峰。氨基酸分析以每种氨基酸占所检测的所有氨基酸的百分比来报告。
[0044] 主要有两个比较。表2显示了来自 的提取物中的氨基酸分布与源自CGM的提取物中的氨基酸分布不同。
[0045] 表2.来自 和CGM的65重量％EtOH提取物固体的氨基酸分布。结果以回收的氨基酸加铵的百分比表示。最右列给出了 /麸质比率。
[0046]
[0047] 通过针对每种氨基酸将源自 的氨基酸浓度除以源自CGM的浓度来比较两种提取物的组成。 提取物蛋白质中的氨(源自谷氨酰胺和天冬酰胺)和甘氨酸含量相对较低。源自 的提取物富含天冬氨酸、异亮氨酸，尤其是赖氨酸。
[0048] 表3.来自Empyreal和CGM的65重量％EtOH残渣固体的氨基酸分布。结果以回收的氨基酸加铵的百分比表示。最右列给出了Empyreal/麸质比率。
[0049] CGM Empyreal Empyreal/麸质
丙氨酸％ 7.19 7.71 1.07
氯化铵％ 7.30 6.12 0.84
精氨酸％ 7.12 6.14 0.86
天冬氨酸％ 7.72 6.52 0.84
谷氨酸％ 17.84 19.74 1.11
甘氨酸％ 5.05 4.52 0.90
组氨酸％ 2.85 2.56 0.90
异亮氨酸％ 3.76 3.52 0.94
亮氨酸％ 10.87 12.83 1.18
赖氨酸％ 4.78 3.34 0.70
苯丙氨酸％ 4.87 5.37 1.10
丝氨酸％ 5.21 5.29 1.02
苏氨酸％ 4.39 4.10 0.93
酪氨酸％ 4.72 5.58 1.18
缬氨酸％ 5.50 4.94 0.90
丙氨酸％ 7.19 7.71 1.07
氯化铵％ 7.30 6.12 0.84
精氨酸％ 7.12 6.14 0.86
天冬氨酸％ 7.72 6.52 0.84
谷氨酸％ 17.84 19.74 1.11
甘氨酸％ 5.05 4.52 0.90
组氨酸％ 2.85 2.56 0.90
异亮氨酸％ 3.76 3.52 0.94
亮氨酸％ 10.87 12.83 1.18
赖氨酸％ 4.78 3.34 0.70
苯丙氨酸％ 4.87 5.37 1.10
丝氨酸％ 5.21 5.29 1.02
苏氨酸％ 4.39 4.10 0.93
酪氨酸％ 4.72 5.58 1.18
缬氨酸％ 5.50 4.94 0.90
[0050] 提取后残渣的类似分析(表3)显示， 残渣相对缺乏铵、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸和缬氨酸。
[0051] 值得注意的是，以蛋白质计，残渣包含高于11.5％的亮氨酸、高于5.0％的酪氨酸和低于4.0％的赖氨酸。
[0052] 源自 的级分富含谷氨酸、亮氨酸和酪氨酸。
[0053] 不受任何特定理论的约束，不同氨基酸组成的影响并不明显，但其强烈表明级分的蛋白质组成是不同的。相同的蛋白质组成将具有相同的氨基酸组成。一组蛋白质比例的改变可导致氨基酸分布的改变。SDS凝胶电泳的结果确实提示组成蛋白质比例的改变。氨基酸分析与该观测结果一致。
[0054] 实施例4
[0055] 将250g解冻的 滤饼样品(62.77％水分)置于1000mL瓶中。将乙醇(424g)和水(70g)加入瓶中，并将混合物用手持匀化器匀化。将瓶子置于60℃水浴中，并在
30分钟内定期搅拌。通过用一张18.5cm Whatman 113滤纸过滤混合物来回收固体。将滤饼再悬浮于300g 66重量％EtOH中，并放回到水浴中保持30分钟，同时定期摇动。如前所述，将滤饼部分收集在滤纸上。过滤效果不佳，因此将未过滤的悬浮液以6000rpm(约5500g)离心3分钟。将沉淀与滤饼合并，并再悬浮于300g 66重量％EtOH中。将瓶子放回到水浴中保持30分钟，同时定期摇动。如前所述通过离心来回收固体。将固体再悬浮，并如前一步骤一样重复整个过程。
30分钟内定期搅拌。通过用一张18.5cm Whatman 113滤纸过滤混合物来回收固体。将滤饼再悬浮于300g 66重量％EtOH中，并放回到水浴中保持30分钟，同时定期摇动。如前所述，将滤饼部分收集在滤纸上。过滤效果不佳，因此将未过滤的悬浮液以6000rpm(约5500g)离心3分钟。将沉淀与滤饼合并，并再悬浮于300g 66重量％EtOH中。将瓶子放回到水浴中保持30分钟，同时定期摇动。如前所述通过离心来回收固体。将固体再悬浮，并如前一步骤一样重复整个过程。
[0056] 从离心瓶中回收固体，并将其破碎成小块，将其放置在铝盘中，以在部分真空下在温暖的条件下干燥。合并滤液和上清液，并通过在50℃和24in真空下旋转蒸发来进行浓缩。当去除足够的EtOH时，蛋白质聚结，停止蒸发。蛋白质沉降，从胶状块中倒出富含水的流体。
将软块置于铝盘中，并在温暖的条件下真空干燥。干燥的提取物固体包含约93重量％的蛋白质，干燥的残渣固体包含约79重量％的蛋白质，两者均以干基计。
将软块置于铝盘中，并在温暖的条件下真空干燥。干燥的提取物固体包含约93重量％的蛋白质，干燥的残渣固体包含约79重量％的蛋白质，两者均以干基计。
[0057] 通过用有机溶剂：无水乙醇、己烷和乙酸乙酯连续提取，使富含玉米醇溶蛋白的提取物固体和缺乏玉米醇溶蛋白的残渣固体的样品脱脂。将1克干磨的提取物和残渣的样品置于15mL塑料离心管中。向每个管中加入3mL溶剂，并混合。将样品在室温下在持续不断地倒置的情况下孵育10分钟。通过将样品以2000g离心3分钟，然后用移液管抽出游离液体，来回收溶剂。再重复提取3次，总共提取4次。将样品在N2流下干燥过夜。使用AOCS Ce-1h-05测量级分的脂质含量。
[0058] 该实施例中级分的脂质含量示于表4中。
[0059] 表4.在用脱脂溶剂提取前后脂质含量的比较。结果在上部分中以“原样”脂肪酸百分比表示。
[0060]
[0061] 残渣样品中的总脂肪和每种亚型的脂肪浓度比提取物高得多。不受任何特定理论的约束，这可能反映了含有35重量％水的含水EtOH的脂质溶解能力较差。用含有最少量水的溶剂的进一步提取进一步降低了总脂肪酸浓度。结果还表明，并非所有溶剂都同样有效地去除存在于这两个蛋白质级分中的脂质。
[0062] 实施例5
[0063] 通过如下方式对大量缺乏玉米醇溶蛋白的样品进行脱脂：首先在咖啡研磨机中研磨蛋白质，直至整个样品通过425μm的筛网。将25g材料和125g无水乙醇称取到五个250mL聚乙烯瓶中。用手摇动瓶子，并将其置于设定为40℃的水浴中。在整个30分钟的加热期间定期用手摇动瓶子，并当将其从水浴中取出时，以9000rpm离心5分钟。倒出上清液，并向含有剩余固体的每个瓶中加入75g乙醇。通过用手摇动使固体再悬浮，并重复加热和离心。第一次和第二次脱脂提取耗时且效率低，因此决定应该对样品进行过滤而不是离心。第三次和第四次脱脂提取通过如下方式进行：向剩余固体中加入50g绝对乙醇，摇动，并如上所述在水浴中加热。30分钟后，摇动瓶子以使材料再悬浮，并使用布氏漏斗和Whatman 1滤纸过滤。将固体转移至铝盘中，并在设定为40℃的真空烘箱中干燥过夜。使用AOCS Ce-1h-05方法来确定脂肪含量的结果。
[0064] 为了获得脱脂的富含玉米醇溶蛋白的样品，应当理解，需要额外的搅拌。结果示于表5中。
[0065] 表5.
[0066]
[0067] 在该实施例中，脱脂的缺乏玉米醇溶蛋白的级分展现出小于1.5重量％(db)的总脂肪含量。
[0068] 实施例6
[0069] 将根据PCT/US2016/024020制备的100克玉米分离蛋白(注意，使用玉米分离蛋白是因为其分级分离类似于 的分级分离，并且使用玉米分离蛋白来举例说明分级分离之前的脱脂)置于1L塑料瓶中。以干基计，干燥失重为7.57％，蛋白质占88.4％。加入含水乙醇(65重量％)并将悬浮液匀化，然后于50℃下放置75分钟，同时定期混合。通过在布氏漏斗上的VWR 417纸上过滤来收集固体。将固体再悬浮于400g 65重量％EtOH中，并在50℃下继续孵育30分钟。如上所述再次收集固体，并在50℃下在400g 65重量％EtOH中再悬浮30分钟。如上所述收集固体，并将其置于铝盘中以在烘箱中干燥；这代表残渣。合并滤液，并保持在室温下直至开始浓缩。在旋转蒸发器中浓缩合并的滤液以去除约一半的溶剂。将浓缩物在约4℃下储存三天，在此期间形成软沉淀物。通过离心(3000g，5分钟，环境温度)来收集沉淀。进一步浓缩未能使更多的物质沉淀，蒸发液体以得到固体物质。对回收的提取物和残渣级分进行蛋白质和干燥失重分析。约15.5％的初始蛋白质下落不明。回收的蛋白质中约45％在提取物中。表6给出了结果。
[0070] 表6.在50℃下在使用65重量％含水EtOH时从玉米分离蛋白分配到提取物和残渣中的蛋白质。
[0071] 固体(g) 蛋白质(g) 占初始蛋白质的百分比初始 92.4 81.7
提取物 45.5 36.8 45.1
残渣 29.8 32.2 39.4
提取物 45.5 36.8 45.1
残渣 29.8 32.2 39.4
[0072] 实施例7
[0073] 根据PCT PCT/US2016/024020制备400克玉米分离蛋白，但在去除溶剂之前将其收集起来，并置于1L塑料瓶中。以干基计，干燥失重为75％，并且蛋白质为84.3％。此时的溶剂组成为98-100重量％EtOH。加入去离子水(161g)，将悬浮液匀化，然后于50℃下放置30分钟，同时定期混合。通过在布氏漏斗上的Whatman 113纸上过滤来收集固体。将固体再悬浮于260g绝对EtOH加140g去离子水中，并在50℃下继续孵育30分钟。如上所述再次收集固体，并将其在50℃下再悬浮在260g绝对EtOH加140g去离子水中30分钟。如上所述收集固体，并将其短暂悬浮在绝对EtOH中，之后进行最终过滤和固体回收。
[0074] 将固体置于铝盘中以在烘箱中干燥。这代表提取的残渣。合并滤液，并保持在室温下直至开始浓缩。在旋转蒸发器中浓缩合并的滤液以去除约三分之二的溶剂。将浓缩物在约4℃下储存五天，在此期间形成软沉淀形式。如上所述通过过滤来收集沉淀。对回收的提取物和残渣级分进行蛋白质和干燥失重分析。回收的蛋白质中约57％在提取物中。总回收蛋白质超过初始蛋白质这一事实证明了这些分析中存在可变性的迹象。表7给出了结果。
[0075] 表7.在50℃下在使用65重量％含水EtOH时从预脱溶剂的玉米分离蛋白分配到提取物和残渣中的蛋白质。
[0076] 固体(g) 蛋白质(g) 占初始蛋白质的百分比
初始 100 84.3
提取物 50.8 48.3 57.2
残渣 31.9 37.0 43.8
初始 100 84.3
提取物 50.8 48.3 57.2
残渣 31.9 37.0 43.8
[0077] 实施例8
[0078] 将10g湿的脱淀粉的玉米麸质粉滤饼样品称取到50mL离心管中。加入NaOH(0.11g 1M溶液)，以将pH调节至约6.0。制备二十四克(24g)89重量％EtOH提取剂，并加入滤饼中。摇动滤饼和提取剂，然后使用手持混合器匀化，并在60℃水浴中放置30分钟，同时定期混合。
将悬浮液以10000rpm(TA10.25i转子)离心2分钟。将提取物倾析到单独的管中。将10克65重量％EtOH加入管中，再混合，并在60℃下再继续孵育15分钟。如上所述通过离心来分离固体和液体。将所得滤饼置于铝盘中，并在真空烘箱中干燥。合并滤液并称重。将约10g滤液置于预先称重的盘中，风干以去除相当大一部分溶剂，然后在真空烘箱中干燥。确定这两者的干燥失重和蛋白质浓度。在提取物中发现了约53％的蛋白质。结果示于表8中。
将悬浮液以10000rpm(TA10.25i转子)离心2分钟。将提取物倾析到单独的管中。将10克65重量％EtOH加入管中，再混合，并在60℃下再继续孵育15分钟。如上所述通过离心来分离固体和液体。将所得滤饼置于铝盘中，并在真空烘箱中干燥。合并滤液并称重。将约10g滤液置于预先称重的盘中，风干以去除相当大一部分溶剂，然后在真空烘箱中干燥。确定这两者的干燥失重和蛋白质浓度。在提取物中发现了约53％的蛋白质。结果示于表8中。
[0079] 表8.在60℃下在使用65重量％含水EtOH时从约pH 6下的脱淀粉的玉米麸质粉和分配到提取物和残渣中的蛋白质。
[0080] 固体(g) 蛋白质(g) 占初始蛋白质的百分比
初始 3.97 2.98
提取物 1.95 1.58 53.0
残渣 1.82 1.40 47.0
初始 3.97 2.98
提取物 1.95 1.58 53.0
残渣 1.82 1.40 47.0
[0081] 前述实施例的比较表明，脱脂对随后进入提取物中的蛋白质的份额具有极小影响。同样，去除溶剂前后的分级分离类似。
[0082] 实施例9
[0083] 将10g湿的玉米麸质粉滤饼样品称取到50mL离心管中。加入NaOH(0.326g 1M溶液)，以将pH调节至约6.0，与 的pH类似。制备24克(24g)89重量％EtOH提取剂，并加入滤饼中。摇动滤饼和提取剂，然后使用手持混合器匀化，并在60℃水浴中放置30分钟，同时定期混合。将悬浮液以10000rpm(TA10.25i转子)离心2分钟。将提取物倾析到单独的管中。将10克65重量％EtOH加入管中，再混合，并在60℃下再继续孵育15分钟。如上所述通过离心来分离固体和液体。将所得滤饼置于铝盘中，并在真空烘箱中干燥。合并滤液并称重。将约10g滤液置于预先称重的盘中，风干以去除相当大一部分溶剂，然后在真空烘箱中干燥。确定两者的干燥失重和蛋白质浓度。在提取物中发现了约70％的蛋白质。结果示于表9中。
[0084] 表9.在60℃下在使用65重量％含水EtOH时从约pH 6下的玉米麸质粉分配到提取物和残渣中的蛋白质。
[0085] 固体(g) 蛋白质(g) 占初始蛋白质的百分比
初始 3.785 2.45
提取物 2.03 1.71 69.8
残渣 1.89 0.74 30.2
初始 3.785 2.45
提取物 2.03 1.71 69.8
残渣 1.89 0.74 30.2
[0086] 实施例10
[0087] 将40mg缺乏玉米醇溶蛋白的材料样品称取到2mL微量离心管中，该缺乏玉米醇溶蛋白的材料样品与实施例2中的富含玉米醇溶蛋白的样品匹配，并且源自从实施例1获得的脱淀粉的玉米麸质粉。将60mg缺乏玉米醇溶蛋白的材料样品称取到2mL微量离心管中，该缺乏玉米醇溶蛋白的材料样品与实施例2中的缺乏玉米醇溶蛋白的样品匹配，并且源自实施例1的玉米麸质粉。目的是使加载到凝胶上的最终蛋白质浓度相等。向每个管中加入2毫米绝对EtOH并剧烈混合，然后在55℃下放置2.5小时以去除脂质物质。通过以13,000g离心3分钟来分离固体和液体。用移液管抽出溶剂。向每个管中加入2mL EtOH:乙酸乙酯的50:50w/w混合物，并在55℃下孵育30分钟。通过以13,000g离心3分钟来分离固体和液体。用移液管抽出溶剂。让样品在通风橱中蒸发至干。
[0088] 向每个样品中加入1000微升6M尿素加100微升1N NaOH，在振荡器上以1000rpm混合1小时，然后置于室温下孵育以使其水合和溶解。将含有100μL含1mM二硫苏糖醇的Laemmli缓冲液的等分试样加入到100μL碱性尿素提取物中，并暴露于沸水浴5分钟。将样品冷却，并以13000g离心5分钟以去除颗粒。将20μL等分试样加载到AnykDTMMini-TGXTM预制凝胶的孔中，并在Mini- 系统上进行解析。进行跑TM
胶，直至标记染料到达凝胶底部。将凝胶用Bio-Safe 考马斯亮蓝G-250染色，并在水中脱色。扫描并定量脱色的凝胶。表10和图4比较并展示了与各个MW条带相关的总信号比例。
胶，直至标记染料到达凝胶底部。将凝胶用Bio-Safe 考马斯亮蓝G-250染色，并在水中脱色。扫描并定量脱色的凝胶。表10和图4比较并展示了与各个MW条带相关的总信号比例。
[0089] 表10.在源自 或玉米麸质粉的残渣样品的SDS凝胶电泳后与选择的分子量条带相关的总蛋白质信号的百分比。
[0090] 近似MW(kDa) 源自Empyreal 源自CGM17-20 18.4 8.1
37 2.2 3.0
40 2.7 4.4
110-140 2.7 6.3
250 3.0 8.0
37 2.2 3.0
40 2.7 4.4
110-140 2.7 6.3
250 3.0 8.0
[0091] 实施例11
[0092] 为了在牛肉香肠(beef frank)应用中测试缺乏玉米醇溶蛋白的蛋白质，将表11中列出的成分称取到一次性塑料容器中，并储存在冰箱中直至使用。两名分析人员使用带有刀片附件的Cuisinart食品加工机，一式两份地制备了对照和缺乏玉米醇溶蛋白的牛肉香肠。每名分析人员制备一个对照和一个样品牛肉香肠。
[0093] 表11.
[0094]
[0095] 通过向Cuisinart碗中加入碎牛肉、盐、水(第一份去离子水和第二份去离子水合并)以及猪油来制备对照。在每次加入成分之间，将混合器快速脉动5次。加入猪油后，将混合器快速脉动，然后以稳定功率运行1分钟。初始混合后，取下盖子，并使用橡胶刮刀刮盖子、碗的侧面和刀片下方，以确保所有成分匀化。将混合器再次以稳定功率运行1分钟。将30g混合物一式两份称取到两个配衡的50mL离心管中。针对总共4个对照，第二名分析人员使用干净/干燥的Cuisinart碗重复此程序。
[0096] 缺乏玉米醇溶蛋白的牛肉香肠通过如下方式来制备：将蛋白质加入50mL离心管中的第一份去离子水(25g)中。用手摇动管，搁置一旁进行初始平衡。将牛肉和盐加入干净/干燥的Cuisinart碗中，每次加入后快速脉动5次。将水/蛋白质悬浮液倒入碗中，并使用第二份水(35g)将管内容物冲洗到碗中。将混合器脉动5次并加入猪油。该程序的其余部分与对照相同。
[0097] 将含有对照和缺乏玉米醇溶蛋白的样品的离心管以3000g离心1分钟，以将混合物均匀地压紧在管中。然后将管在设定为75℃的水浴中放置35分钟。一旦从水浴中取出，使用刮铲将牛肉香肠从管上剥离来将液体排干。将牛肉香肠从管中完全取出，并在纸巾上滚动，直至表面看起来干燥。称重牛肉香肠以确定产率和损失。如表12中所示，与不含植物蛋白的对照相比，在牛肉香肠应用中加入缺乏玉米醇溶蛋白的蛋白质使产品产率增加了8.5％。
[0098] 表12.
[0099]
[0100] 实施例12
[0101] 将缺乏玉米醇溶蛋白的蛋白质纳入在营养棒模型应用中，以与大豆分离蛋白(Supro 620，批号M310014220)进行比较。制备427g Clearsweet 43/43糖浆、150g Isoclear 55和100g甘油的混合物，并在连续搅拌下在炉顶燃烧器上的蒸煮锅中将糖浆加热至50℃。然后在烧杯中称取18.5g糖浆，加入6.25g蛋白质成分(大豆或玉米)，并用刚性金属刮铲混合直至均匀。棒的最终组成是45％糖、25％植物蛋白和15％水。制备了四个大豆蛋白样品。一式两份制备两种粒度的缺乏玉米醇溶蛋白的样品，即<105μm和>105μm。
[0102] 将匀化的混合物倒入1盎司样品杯中，盖上盖子，并在工作台上轻拍以除去任何空气。将样品储存在密封的盒子中，并在加入蛋白质后24-72小时使用质构分析仪测量抗压缩性。如表13中所示，缺乏玉米醇溶蛋白的蛋白质比大豆分离蛋白制得的棒更软。
[0103] 表13.
[0104]
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