一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用
阅读：1045发布：2020-06-29
专利汇可以提供一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用，所述重组结节链霉菌是敲除结节链霉菌ZJB2016050(Streptomyces nodosus ZJB2016050)内两性霉素B的竞争支路后，再将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示功能基因 串联 序列导入获得的；通过导入功能基因，使两性霉素B骨架合成前体供给量全面提升，提高菌种对营养物质的利用率，改变目标产物的营养物质流向。通过敲除竞争支路提高AmB产量约20％，副产物两性霉素A降低40％，通过过表达串联功能基因验证提高三类前体乙酰辅酶A，丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A大幅提升两性霉素B的产量，最终在5L 发酵 罐发酵，两性霉素B产量可达到16g/L。，下面是一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌，由结节链霉菌ZJB2016050(Streptomyces nodosus ZJB2016050)基因敲除SEQ ID NO.6所示的PKS5基因簇后，再导入SEQ ID NO.1所示乙酰辅酶A羧化酶1基因、SEQ ID NO.2所示乙酰辅酶A羧化酶2基因、SEQ ID NO.3所示聚酮合酶PKSamphA基因、SEQ ID NO.4所示甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和SEQ ID NO.5所示甲基丙二酰辅酶A异构酶基因的串联基因获得。
2.如权利要求1所述的重组结节链霉菌，其特征在于所述重组结节链霉菌为结节链霉菌ZJB2016050-RAAAmm(Streptomyces nodosus ZJB2016050-RAAAmm)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2019341，保藏日期2019年05月09日。
3.权利要求1或2所述的重组结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素B中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述产两性霉素B的重组结节链霉菌接种至发酵培养基，25～30℃、200～500rpm发酵培养，获得含两性霉素B的发酵液，将发酵液分离纯化，得到所述两性霉素B；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖60～80g/L，牛肉膏5～10g/L，大豆蛋白粉5～10g/L，棉子粉8～12g/L，CaCO3 5～10g/L，KH2PO4 0.1～
0.4g/L，溶剂为水，pH 7.0。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述发酵培养在发酵罐中进行，发酵罐压力
0.05MPa，通气比0.08～1.5vvm。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述产两性霉素B的重组结节链霉菌在发酵培养前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度2～10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养为：将产两性霉素B的重组结节链霉菌接种至GYM平板，28℃培养7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，12000rpm离心5min后去上清液，沉淀加入无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液，将孢子悬液接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养
46h，获得种子液；所述GYM平板终浓度组成为：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物10g/L，碳酸钙2g/L，琼脂18g/L，溶剂为水，pH7.2；所述种子液培养基终浓度组成为：蛋白胨10～
20g/L，NaCl 5～10g/L，葡萄糖10～15g/L，酵母粉5～10g/L，CaCO3 0.5～1g/L，溶剂为水，pH 7.0。
一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用
(一)技术领域
[0001] 本发明涉及一种产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用。(二)背景技术
[0002] 两性霉素B(Amphotericin B，AmB)是一种多烯类广谱抗真菌抗生素，由结节链霉菌(Streptomyces nodosus)产生，其菌株于1955年从委内瑞拉奥里诺科河三角洲的土样中收集分离获得。1966年开始上市，是第一个用于深部真菌感染的药物，已使用近半个世纪。AmB分子式C47H73NO17，AmB属于多稀大环内酯类抗生素，具有广谱性的对真菌抗性，特别是对于具有生命威胁性的全身性真菌感染例如白色念珠菌，曲霉属真菌等，同时还具有有效的抗病毒、寄生虫药性，例如阮病毒、利什曼原虫等，目前市场流通的两性霉素B药物包括注射液，药片等。AmB为黄色或橙黄色粉末，无味，有引湿性，在日光下易破坏失效。能溶解DMSO，在水，无水乙醇，三氯甲烷或乙醚中基本不溶，(pH 6-7)均少于1mg/L。AmB的抗真菌作用机制为：AmB能与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，在膜上形成微孔，使膜的通透性发生改变，最终导致重要的细胞内容物K离子、核苷酸、氨基酸等无节制的流失而造成菌体死亡。然而AmB也会在较小程度上与哺乳动物细胞膜上的胆固醇相互作用，造成一定的副作用，特别是肾毒性。虽然其具有一定的副作用，但AmB仍然是目前治疗人类深部全身性真菌感染的最重要一种抗生素。人们加强了对AmB新给药形式的研究，例如在20世纪90年代出现的Abelcet、Ambisome脂质体药物，为了降低毒性，提高药物到达作用区域的效率。也有发酵方向和传统诱变的研究进展，如2017年张博等对野生型结节链霉菌进行诱变，提高了两性霉素B的产量至5.02g/L，在诱变菌种的发酵进行优化，最终实现高产量两性霉素B的工业化。
[0003] 微生物代谢改造的方式有很多，其中常用的方法有过表达功能基因、敲除竞争支路、异源表达合成基因簇等。功能基因的过表达在菌种代谢改造中是主要的手段之一且见效快。结节链霉菌的主要遗传手段是接合转移，已有参考资料显示结节链霉菌的接合转移的结合率相比模式链霉菌较低，其中类似pSET152，PKC1139等整合型或温敏性质粒的成功率在操作和成功几率更加低。pJTU1278作为表达型质粒是目前本实验室唯一成功进行接合转移的质粒。
[0004] 两性霉素B骨架主要由18个合成前体和一个起始单元组成，起始单元由聚酮合酶模块amphA结合一个乙酰辅酶A构成，后续由15个丙二酰辅酶A和3个甲基丙二酰辅酶A逐步组成。其中乙酰辅酶A主要来源于葡糖糖的糖酵解路径，丙二酰辅酶A主要由乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶的作用下合成，甲基丙二酰辅酶A合成由两个路径，一条由琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰异构酶和变位酶作用下合成，一条由丙酰辅酶A在丙酰辅酶A羧化酶作用下合成。乙酰辅酶A是生物代谢的核心物质，在生物体内代谢支路复杂，是次级代谢产物的主要前体之一。
[0005] 链霉菌属是放线菌的一种，被称为次级代谢产物的天然宝库，一种链霉菌往往会带有多个次级代谢产物合成基因簇，有些可能是沉默基因簇，在特定的应激作用下才能实现表达。另一部分可能处于不同的表达状态，也有存在竞争性的作用。在结节链霉菌内存在5种PKS类型合成基因簇，其中两性美素B属于PKS I型。根据antiSMASH的预测结果及KEGG数据推论，发现PKS5的次级代谢产物可能会对两性美素B的合成具有竞争作用。
(三)发明内容
(三)发明内容
[0006] 本发明目的是提供高产两性霉素B(AmB)的重组结节链霉菌及其应用，通过在结节链霉菌中表达功能基因，提高结节链霉菌内前体物质的量或提高对前体物质的利用率，有效提升AmB的产量。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 一种产两性霉素B的重组结节链霉菌，由结节链霉菌ZJB2016050(Streptomyces nodosus ZJB2016050)(即CCTCC NO：M 2017426)基因敲除SEQ ID NO.6所示的PKS5基因簇后，再导入SEQ ID NO.1所示乙酰辅酶A羧化酶1基因、SEQ ID NO.2所示乙酰辅酶A羧化酶2基因、SEQ ID NO.3所示聚酮合酶PKSamphA基因、SEQ ID NO.4所示甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和SEQ ID NO.5所示甲基丙二酰辅酶A异构酶基因的串联基因获得。
[0009] 优选的，所述重组结节链霉菌为结节链霉菌ZJB2016050-RAAAmm(Streptomyces nodosus ZJB2016050-RAAAmm)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2019341，保藏日期2019年05月09日。
[0010] 本发明所述重组载体导入宿主菌方法为种属间接合转移方法，方法可如下：
[0011] 敲除步骤：
[0012] 1)通过PCR扩增敲除基因两边的同源臂片段(每个3000bp)，插入pJTU1278载体质粒多克隆位点处，得到复原载体pJTU1278-RE；
[0013] 2)克隆卡纳抗性基因插入pJTU1278-Re两个同源臂之间，作为敲除筛选标记，得到复原载体pJTU1278-DE。
[0014] 过表达步骤：
[0015] 1)将PCR克隆获得的乙酰辅酶A羧化酶1基因(acc1)及启动子插入pJTU1278载体质粒多克隆位点处，得到重组载体pJTU1278-acc1；
[0016] 2)将步骤1)中得到的重组载体转化入大肠杆菌JM109，对得到的转化子进行测序，将确认无误的载体导入供体菌大肠杆菌ET12567/pUZ8002；
[0017] 3)将步骤1)、2)所述依次在构建完的质粒上插入乙酰辅酶A羧化酶2基因(acc2)，聚酮合酶PKSamphA，甲基丙二酰辅酶A变位酶(mcm)，甲基丙二酰辅酶A异构酶(mme)。最终得到质粒pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme。
[0018] 4)将步骤3)中得到的含有重组载体的供体菌大肠杆菌ET12567/pUZ8002/pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme，通过接合转移方法将表达载体转化到受体菌(即CCTCC NO：M 2017426)中，得到高产两性霉素B的基因工程菌。
[0019] 本发明还涉及所述的重组结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素B中的应用。
[0020] 具体的，所述应用为：将所述产两性霉素B的重组结节链霉菌接种至发酵培养基，25～30℃、200～500rpm发酵培养，获得含两性霉素B的发酵液，将发酵液分离纯化，得到所述两性霉素B；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖60～80g/L，牛肉膏5～10g/L，大豆蛋白粉5～10g/L，棉子粉8～12g/L，CaCO3 5～10g/L，KH2PO4 0.1～0.4g/L，溶剂为水，pH 7.0。
[0022] 优选的，所述产两性霉素B的重组结节链霉菌在发酵培养前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度2～10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养为：将产两性霉素B的重组结节链霉菌接种至GYM平板，28℃培养7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，12000rpm离心5min后去上清液，沉淀加入无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液，将孢子悬液接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养46h，获得种子液；所述GYM平板终浓度组成为：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物10g/L，碳酸钙2g/L，琼脂18g/L，溶剂为水，pH7.2；所述种子液培养基终浓度组成为：蛋白胨10～20g/L，NaCl 5～10g/L，葡萄糖10～15g/L，酵母粉5～10g/L，CaCO3 0.5～1g/L，溶剂为水，pH 7.0。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
[0024] 1、在敲除菌种的基础上过表达前体供应相关功能蛋白，增加前体供给量，可提高两性霉素B产量20％。
[0027] 图1为本发明实施例1构建替换复原质粒图谱；
[0028] 图2为本发明实施例1构建kan抗性替换质粒图谱；
[0029] 图3为实施例4中功能基因串联构建示图；
[0030] 图4为实施例7中重组结节链霉菌5L发酵罐发酵结果；
[0031] 图5为实施例9中AmB高效液相色谱(HPLC)检测标准曲线。(五)具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0033] 实施例1：敲除载体构建
[0034] 1、同源臂1插入
[0035] 以结节链霉菌ATCC14899全基因组为模板，设计引物TYB1-F和TYB1-R，TYB1-F为针对同源臂1的正向引物，TYB1-R为针对同源臂1基因的反向引物，从模板中克隆扩增出同源臂1基因，片段大小3000bp左右，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与目的基因序列相同将此片段用核酸内切酶XbaI和BamHI酶切后，clean-up此片段备用，将载体pJTU1278也用同样的XbaI和BamHI核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278载体连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-TYB1。
[0036] 其中克隆PCR体系：加入结节链霉菌ATCC14899全基因组模板1μL，加入2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，TYB1正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
[0037] 其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55-60℃退火15s，72℃延伸3min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0038] 其中连接过程：将T4DNA连接酶buffer 1μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μl和载体DNA 1μl，加入T4DNA连接酶1μl，加入ddH2O 3μl，16℃反应20小时。将连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
[0039] 所用引物如下：
[0040]
[0041] 2、同源臂2插入
[0042] 以结节链霉菌ATCC14899全基因组为模板，设计引物TYB2-F和TYB2-R，TYB2-F为针对同源臂2的正向引物，TYB2-R为针对同源臂2基因的反向引物，从模板中克隆扩增出同源臂2基因，片段大小3000bp左右，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与目的基因序列相同将此片段用核酸内切酶HindIII和KpnI酶切后，clean-up此片段备用，将载体pJTU1278-TYB1也用同样的HindIII和KpnI核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278-TYB1载体连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-TYB1-TYB2，如图1所示。
[0043] 其中克隆PCR体系：加入结节链霉菌ATCC14899全基因组模板1μL，加入2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，TYB2正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
[0044] 其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55-60℃退火15s，72℃延伸3min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0045] 其中连接过程：将T4DNA连接酶buffer 1μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μl和载体DNA 1μl，加入T4DNA连接酶1μl，加入ddH2O 3μl，16℃反应20小时。将连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
[0046] 所用引物如下：
[0047]
[0048] 3、抗性筛选标签插入
[0049] 以pET28b为模板，设计引物kan-F和kan-R，kan-F为针对卡纳抗性基因的正向引物，kan-R为针对卡纳抗性基因的反向引物，从模板中克隆扩增出卡纳抗性基因，片段大小900bp左右，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与目的基因序列相同将此片段用核酸内切酶HindIII和BamHI酶切后，clean-up此片段备用，将载体pJTU1278-TYB1-TYB2也用同样的HindIII和BamHI核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278-TYB1-TYB2载体连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-TYB1-kan-TYB2，如图2所示。
[0050] 其中克隆PCR体系：加入结节链霉菌ATCC14899全基因组模板1μL，加入2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，卡纳抗性基因正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
[0051] 其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55-60℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0052] 其中连接过程：将T4DNA连接酶buffer 1μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μl和载体DNA1μl，加入T4DNA连接酶1μl，加入ddH2O 3μl，16℃反应20小时。将连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
[0053] 所用引物如下：
[0054]
[0055] 实施例2：抗性基因组替换
[0056] 重组载体pJTU1278-TYB1-kan-TYB2接合转移转化受体菌结节链霉菌
[0057] A)含重组载体pJTU1278-TYB1-kan-TYB2的E.coil ET12567/puz8002供体菌的准备：
[0058] 将构建好的重组载体pJTU1278-TYB1-kan-TYB2，导入E.coil ET12567/puz8002大+ + +肠杆菌感受态中，利用氨苄青霉素(Amp，50μg/mL)、氯霉素(Cm ，50μg/mL)、卡那霉素(Kan ，
50μg/mL)抗性筛选，挑取阳性转化子，通过M13上下游引物菌落PCR验证，结果证明重组载体pJTU1278-TYB1-kan-TYB2成功转化入E.coil ET12567/puz8002。具体操作如下：
50μg/mL)抗性筛选，挑取阳性转化子，通过M13上下游引物菌落PCR验证，结果证明重组载体pJTU1278-TYB1-kan-TYB2成功转化入E.coil ET12567/puz8002。具体操作如下：
[0059] E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态制备方法如下：
[0060] 从菌种的甘油冻存管中取E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌菌液在LB平板上分区划线，37℃培养至单菌落长出。挑取平板上的单菌落转移到2～5mL的LB培养基中37℃，200rpm过夜培养。取过夜培养的菌液200μL加入到20mL的LB培养基中37℃，200rpm培养至OD600为0.4～0.7。培养好的菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰上静置10min。离心4℃，
2500×g，5min。弃上清液，加入4mL 0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清，加入2mL 0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/tube，-80℃保藏。
2500×g，5min。弃上清液，加入4mL 0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清，加入2mL 0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/tube，-80℃保藏。
[0061] 含重组载体pJTU1278-TYB1-kan-TYB2的E.coil ET12567/puz8002供体菌的制备：
[0062] 取1支上述的E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞，冰浴5min，加入5μL浓度为200ng/μL的pJTU1278-TYB1-kan-TYB2载体质粒，冰浴30min，于42℃水浴，热激90s，放回冰浴1min，加入600μL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养1h。吸取200μL，均匀涂布于Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度5 0μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性的LB固体平板，于37℃培养箱培养14h。至长出含重组载体pJTU1278-TYB1-kan-TYB2的E.coil ET12567/puz8002单菌落。
[0063] M13验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴5～10min，12000rpm离心1min。取1μL上清液作为模板，加入10×pfu Buffer 1μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，M13正反引物各0.1μL，pfu DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
[0064] M13验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸8min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0065] M13引物如下：
[0066]M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R CAGGAAACAGCTATGAC
M13R CAGGAAACAGCTATGAC
[0067] 将已导入pJTU1278-TYB1-kan-TYB2质粒的ET12567/puz8002大肠杆菌，划线分离+单菌落，37℃培养，挑单菌落于装有5mL LB培养基试管，并同时加入Kan (终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗生素，37℃培养14h。转接500μL于50mL LB摇瓶中，同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性，37℃培养至OD600为0.35。用50mL离心管将供体菌离心，4000rpm，5min，再用50mL LB培养基洗两次，用5mL LB培养基重悬，4℃保存备用。
[0069] B)受体菌Streptomyces nodosus的制备
[0070] 将实验室菌种的Streptomyces nodosus ZJB2016050(CCTCC M 2017426)接种在GYM平板或斜面培养物上，28℃生长10d，获得灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL 2×YT培养基中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子
12000rpm，离心5min后去上清，加入10mL2×YT培养基重悬，12000rpm离心5min重新洗脱一次，最后用500μL 2×YT培养基重悬。将重悬好的孢子在50℃热激15～20min后，常温下备用。
12000rpm，离心5min后去上清，加入10mL2×YT培养基重悬，12000rpm离心5min重新洗脱一次，最后用500μL 2×YT培养基重悬。将重悬好的孢子在50℃热激15～20min后，常温下备用。
[0071] 其中2×YT培养基由以下方法制得：蛋白胨16g，酵母粉10g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
[0072] GYM固体培养基配制方法：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽提取物10g，碳酸钙2g，琼脂18g，自来水定容至1L，pH7.2，121度灭菌20min。
[0073] C)供、受体菌接合过程：
[0074] 将步骤B)500μL热激完的孢子悬液与步骤A)500μL供体大肠杆菌悬液混合重悬后，6000rpm离心2min，去掉800μL上清液，剩余上清将沉淀重悬涂布在含有10mM氯化镁的MS固体培养基平板上。28℃培养20h后，涂布1mL含0.5mg萘碇酸和0.5mg硫链丝菌素抗生素的水溶液，继续28℃培养10天，至出现转化子。
[0075] 将转化子在含有终浓度50μg/mL萘碇酸和终浓度50μg/mL卡那霉抗性的GYM固体平板上连续纯化3次，直至获得单一菌落，使用16S RNA上下游引物(16S-8和16S-1541)以及M13上下游引物(M13(-21)F、M13R)对转化子菌落PCR验证后，测序对比分析，证实质粒(pJTU1278-TYB1-kan-TYB2)已导入受体菌Streptomyces nodosus ZJB2016050中，最终获得产AmB的基因工程菌，即重组结节链霉菌pJTU1278-TYB1-kan-TYB2。通过几轮带抗性培养，加入Kan+(终浓度50μg/mL)得到最终替换成功的菌种Streptomyces nodosus ZJB2016050-De5。
[0077] 其中M13验证PCR操作如步骤A)所述。
[0078] 其中16sRNA验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴30min，12000rpm离心1min。取3μL上清液作为模板，加入2×Phanta Max Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，16S正反引物各0.1μL，Phanta Max DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
[0079] 其中16S RNA验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0080] 其中所用引物如下：
[0081]16S-8 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
16S-1541 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
16S-1541 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
[0082] 实施例3：敲除抗性标签复原
[0083] 重组载体pJTU1278-TYB1-TYB2接合转移转化受体菌结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-De5
[0084] A)含重组载体pJTU1278-TYB1-TYB2的E.coil ET12567/puz8002供体菌的准备：
[0085] 将构建好的重组载体pJTU1278-TYB1-TYB2，导入E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态中，利用氨苄青霉素(Amp+，50μg/mL)、氯霉素(Cm+，50μg/mL)、卡那霉素(Kan+，50μg/mL)抗性筛选，挑取阳性转化子，通过M13上下游引物菌落PCR验证，结果证明重组载体pJTU1278-TYB1-TYB2成功转化入E.coil ET12567/puz8002。具体操作如下：
[0086] E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态制备方法如下：
[0087] 从菌种的甘油冻存管中取E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌菌液在LB平板上分区划线，37℃培养至单菌落长出。挑取平板上的单菌落转移到2～5mL的LB培养基中37℃，200rpm过夜培养。取过夜培养的菌液200μL加入到20mL的LB培养基中37℃，200rpm培养至OD600为0.4～0.7。培养好的菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰上静置10min。离心4℃，
2500×g，5min。弃上清液，加入4mL 0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清，加入2mL0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/tube，-80℃保藏。
2500×g，5min。弃上清液，加入4mL 0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清，加入2mL0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/tube，-80℃保藏。
[0088] 含重组载体pJTU1278-TYB1-TYB2的E.coil ET12567/puz8002供体菌的制备：
[0089] 取1支上述的E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞，冰浴5min，加入5μL浓度为200ng/μL的pJTU1278-TYB1-TYB2载体质粒，冰浴30min，于42℃水浴，热激90s，放回冰浴1min，加入600μL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养1h。吸取200μL，均匀涂布于Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度5 0μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性的LB固体平板，于37℃培养箱培养14h。至长出含重组载体pJTU1278-TYB1-TYB2的E.coil ET12567/puz8002单菌落。
[0090] M13验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴5～10min，12000rpm离心1min。取1μL上清液作为模板，加入10×pfu Buffer 1μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，M13正反引物各0.1μL，pfu DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
[0091] M13验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸8min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0092] M13引物如下：
[0093]M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R CAGGAAACAGCTATGAC
M13R CAGGAAACAGCTATGAC
[0094] 将已导入pJTU1278-TYB1-TYB2质粒的ET12567/puz8002大肠杆菌，划线分离单菌落，37℃培养，挑单菌落于装有5mL LB培养基试管，并同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm++(终浓度50μg/mL)、Amp(终浓度50μg/mL)抗生素，37℃培养14h。转接500μL于50mL LB摇瓶中，同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性，37℃培养至OD600为0.35。用50mL离心管将供体菌离心，4000rpm，5min，再用50mL LB培养基洗两次，用5mL LB培养基重悬，4℃保存备用。
[0095] 其中LB培养基由以下方法制得：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
[0096] B)受体菌Streptomyces nodosus的制备
[0097] 将实验室菌种的Streptomyces nodosus ZJB2016050-De5接种在GYM平板或斜面培养物上，28℃生长10d，获得灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL2×YT培养基中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm，离心5min后去上清，加入10mL 2×YT培养基重悬，12000rpm离心5min重新洗脱一次，最后用500μL 2×YT培养基重悬。将重悬好的孢子在50℃热激15～20min后，常温下备用。
[0098] 其中2×YT培养基由以下方法制得：蛋白胨16g，酵母粉10g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
[0099] GYM固体培养基配制方法：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽提取物10g，碳酸钙2g，琼脂18g，自来水定容至1L，pH7.2，121度灭菌20min。
[0100] C)供、受体菌接合过程：
[0101] 将步骤B)500μL热激完的孢子悬液与步骤A)500μL供体大肠杆菌悬液混合重悬后，6000rpm离心2min，去掉800μL上清液，剩余上清将沉淀重悬涂布在含有10mM氯化镁的MS固体培养基平板上。28℃培养20h后，涂布1mL含0.5mg萘碇酸和0.5mg硫链丝菌素抗生素的水溶液，继续28℃培养10天，至出现转化子。
[0102] 将转化子在含有终浓度50μg/mL萘碇酸和终浓度50μg/mL卡那霉抗性的GYM固体平板上连续纯化3次，直至获得单一菌落，使用16S RNA上下游引物(16S-8和16S-1541)以及M13上下游引物(M13(-21)F、M13R)对转化子菌落PCR验证后，测序对比分析，证实质粒(pJTU1278-TYB1-TYB2)已导入受体菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-De5中，最终获得产AmB的基因工程菌，即重组结节链霉菌pJTU1278-TYB1-TYB2。通过几轮带抗性培养，加加入Kan+(终浓度50μg/mL)得到最终替换成功的菌种Streptomyces nodosus ZJB2016050-Re5。
[0103] 其中MS固体培养基由以下方法制得：黄豆粉20g，甘露醇20g，琼脂20g，自来水定容至1L，用氢氧化钠调至pH 7.2，121度灭菌20min。使用前加入终浓度10mM无菌氯化镁。
[0104] 其中M13验证PCR操作如步骤A)所述。
[0105] 其中16sRNA验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴30min，12000rpm离心1min。取3μL上清液作为模板，加入2×Phanta Max Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，16S正反引物各0.1μL，Phanta Max DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
[0106] 其中16S RNA验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0107] 实施例4：功能基因串联载体构建
[0108] 以结节链霉菌ATCC14899全基因组为模板，设计引物mcm-F和mcm-R，从模板中克隆扩增出乙酰辅酶A羧化酶1基因(acc1)，片段大小1776bp左右，乙酰辅酶A羧化酶2基因(acc2)，片段大小1941bp左右，聚酮合酶PKSamphA，片段大小4239bp左右，甲基丙二酰辅酶A变位酶(mcm)，片段大小1737bp左右，甲基丙二酰辅酶A异构酶(mme)片段大小441bp左右，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与目的基因序列相同，乙酰辅酶A羧化酶1(acc1)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，乙酰辅酶A羧化酶2基因(acc2)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，聚酮合酶PKSamphA的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，甲基丙二酰辅酶A变位酶(mcm)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，甲基丙二酰辅酶A异构酶基因(mme)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，。将此片段用核酸内切酶BamHI和HindIII酶切后，clean-up此片段备用，将载体pJTU1278也用同样的BamHI和HindIII核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278载体连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme，示意图见图3。
[0109] 其中克隆PCR体系：加入基因组模板1μL，加入2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，对应的正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
[0110] 其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0111] 其中连接过程：将T4DNA连接酶buffer 1μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μL和载体DNA1μL，加入T4DNA连接酶1μL，加入ddH2O 3μL，16℃反应20小时。将连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
[0112] 实施例5：功能基因表达
[0113] 将构建好的重组载体pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme，导入E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态中，利用氨苄青霉素(Amp+，50μg/mL)、氯霉素(Cm+，50μg/mL)、卡那霉素(Kan+，50μg/mL)抗性筛选，挑取阳性转化子，通过M13上下游引物菌落PCR验证，结果证明重组载体pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme成功转化入E.coil ET12567/puz8002。具体操作如下：
[0114] E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态制备方法如下：
[0115] 从菌种的甘油冻存管中取E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌菌液在LB平板上分区划线，37℃培养至单菌落长出。挑取平板上的单菌落转移到2～5mL的LB培养基中37℃，200rpm过夜培养。取过夜培养的菌液200μL加入到20mL的LB培养基中37℃，200rpm培养至OD600为0.4～0.7。培养好的菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰上静置10min。离心4℃，
2500×g，5min。弃上清液，加入4mL0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清，加入2mL 0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/tube，-80℃保藏。
2500×g，5min。弃上清液，加入4mL0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清，加入2mL 0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/tube，-80℃保藏。
[0116] 含重组载体pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme的E.coil ET12567/puz8002供体菌的制备：
[0117] 取1支上述的E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞，冰浴5min，加入5μL浓度为200ng/μL的pJTU1278-TYB1-TYB2载体质粒，冰浴30min，于42℃水浴，热激90s，放回冰浴1min，加入600μL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养1h。吸取200μL，均匀涂布于Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度5 0μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性的LB固体平板，于37℃培养箱培养14h。至长出含重组载体pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme的E.coil ET12567/puz8002单菌落。
[0118] M13验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴5～10min，12000rpm离心1min。取1μL上清液作为模板，加入10×pfu Buffer 1μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，M13正反引物各0.1μL，pfu DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
[0119] M13验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸8min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0120] M13引物如下：
[0121]M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R CAGGAAACAGCTATGAC
M13R CAGGAAACAGCTATGAC
[0122] 将已导入pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme质粒的ET12567/puz8002大肠杆菌，划线分离单菌落，37℃培养，挑单菌落于装有5mL LB培养基试管，并同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗生素，37℃培养14h。转接500μL于50mL LB摇瓶中，同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性，37℃培养至OD600为0.35。用50mL离心管将供体菌离心，4000rpm，5min，再用50mL LB培养基洗两次，用5mL LB培养基重悬，4℃保存备用。
[0123] 其中LB培养基由以下方法制得：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
[0124] B)受体菌Streptomyces nodosus的制备
[0125] 将实验室菌种的Streptomyces nodosus ZJB2016050-Re5接种在GYM平板或斜面培养物上，28℃生长10d，获得灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL2×YT培养基中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm，离心5min后去上清，加入10mL 2×YT培养基重悬，12000rpm离心5min重新洗脱一次，最后用500μL 2×YT培养基重悬。将重悬好的孢子在50℃热激15～20min后，常温下备用。
[0126] 其中2×YT培养基由以下方法制得：蛋白胨16g，酵母粉10g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
[0127] GYM固体培养基配制方法：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽提取物10g，碳酸钙2g，琼脂18g，自来水定容至1L，pH7.2，121度灭菌20min。
[0128] C)供、受体菌接合过程：
[0129] 将步骤B)500μL热激完的孢子悬液与步骤A)500μL供体大肠杆菌悬液混合重悬后，6000rpm离心2min，去掉800μL上清液，剩余上清将沉淀重悬涂布在含有10mM氯化镁的MS固体培养基平板上。28℃培养20h后，涂布1mL含0.5mg萘碇酸和0.5mg硫链丝菌素抗生素的水溶液，继续28℃培养10天，至出现转化子。
[0130] 将转化子在含有终浓度50μg/mL萘碇酸和终浓度50μg/mL卡那霉抗性的GYM固体平板上连续纯化3次，直至获得单一菌落，使用16S RNA上下游引物(16S-8和16S-1541)以及M13上下游引物(M13(-21)F、M13R)对转化子菌落PCR验证后，测序对比分析，证实质粒(pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme)已导入受体菌Streptomyces nodosus ZJB2016050-Re5中，最终获得产AmB的基因工程菌，即重组结节链霉菌pJTU1278-TYB1-TYB2。通过几轮带抗性培养，加加入Kan+(终浓度50μg/mL)得到最终替换成功的菌种Streptomyces nodosus ZJB2016050-De5-pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme(即CCTCC NO：M2019341)。
[0131] 其中MS固体培养基由以下方法制得：黄豆粉20g，甘露醇20g，琼脂20g，自来水定容至1L，用氢氧化钠调至pH 7.2，121度灭菌20min。使用前加入终浓度10mM无菌氯化镁。
[0132] 其中M13验证PCR操作如步骤A)所述。
[0133] 其中16sRNA验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴30min，12000rpm离心1min。取3μL上清液作为模板，加入2×Phanta Max Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，16S正反引物各0.1μL，Phanta Max DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
[0134] 其中16S RNA验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共30个循环。最后72℃延伸10min。
[0135] 实施例6：摇瓶发酵产AmB
[0136] (1)孢子悬液的制备：将实施例5制备的产AmB的重组结节链霉菌ZJB2016050-De5-pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme，接种至GYM平板，28℃培养7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm离心5min后去上清液，加入10mL无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用5mL无菌水重悬作为孢子悬液。
[0137] (2)种子液的制备：
[0138] 将步骤(1)孢子悬液接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养46h，获得种子液。
[0139] 种子培养基按以下方法制得：蛋白胨20g，NaCl 8g，葡萄糖15g，酵母粉10g，CaCO3 1g，加水定容至1L，pH 7.0，121度灭菌20min。
[0140] (3)发酵培养
[0141] 500mL规格摇瓶装样50mL发酵培养基，发酵时按体积浓度2％接种种子液，28℃，220rpm发酵培养168h。
[0142] 发酵培养基组成：葡萄糖70g/L，牛肉膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO3 10g/L，KH2PO4 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 7.0，121度灭菌20min。
[0143] 上述基因工程菌通过摇瓶发酵生产，按照实施例8方法检测，其中ZJB2016050-De5-pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme所得发酵液中AmB含量，为7.2g/L。
[0144] 实施例7：5L发酵罐发酵生产AmB
[0145] 将实施例5制备的产AmB基因工程菌(重组结节链霉菌ZJB2016050-De5-pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme)孢子悬液或斜面培养物接种种子培养基中，28℃，220rpm培养48h获得种子液。
[0146] 发酵条件：5L发酵罐中装发酵液量3L，接种量按体积浓度5％接种种子液，28℃，压力0.05MPa、通气比1.2vvm，转速400rpm，发酵培养100h，获得发酵液。
[0147] 种子培养基按以下方法制得：蛋白胨20g，NaCl 8g，葡萄糖15g，酵母粉10g，CaCO3 1g，加水定容至1L，pH 7.0，121度灭菌20min。
[0148] 5L发酵罐发酵培养基组成：葡萄糖70g/L，牛肉膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO3 10g/L，KH2PO4 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 7.0，121度灭菌20min。
[0149] 同样条件下，以重组结节链霉菌ZJB2016050(即CCTCC NO：M 2017426)为对照进行发酵培养。
[0150] 比较实施例5制备的产AmB基因工程菌(重组结节链霉菌ZJB2016050-De5-pJTU1278-acc1-acc2-amphA-mcm-mme)与对照菌(结节链霉菌ZJB2016050)在5L罐发酵情况。上述基因工程菌通过5L罐发酵生产，按照实施例8方法检测，基因工程菌所得发酵液中AmB含量为16.0g/L，如图4所示，而对照菌株AmB产量为13.6g/L。
[0151] 实施例8：AmB成品的制备
[0152] 取实施例7方法获得的发酵液500L。将发酵液经板框过滤得湿菌丝，烘干，得到8.1kg干菌重，把烘干的菌丝投入萃取罐中，加入70L甲醇，降温至4℃，用盐酸调至pH 3.0，稳定一小时，过滤得滤液。滤液进入结晶罐，加入纯化水10L，用碱液调pH至6.0，升温至25℃，保温一小时，结晶完成，静置分层。过滤得固体物(即AmB结晶粉)，不断加甲醇洗涤，除去杂质，最后烘干，粉碎，得AmB粗成品，粗成品通过实施例8所述液相色谱进行检测，产量为
14.6g/L，产品纯度为94％以上。
14.6g/L，产品纯度为94％以上。
[0153] 实施例9：AmB的HPLC检测方法
[0154] 取实施例5方法制备的发酵液，按发酵液：DMSO为1：9的体积比与DMSO混合，室温下萃取20～30分钟，12000rpm离心5min，取上清用0.45μm有机滤膜过膜后通过高效液相色谱(HPLC)检测。
[0155] 检测方法：色谱柱为C18柱(150×4.6mm)，柱温25℃，流速1mL/min，进样量20μL，色谱保留时间30min，检测波长为405nm。AmB的出峰时间为26.9min。
[0156] 其中流动相配制方法：1.1g EDTA-Na2和4.1g醋酸钠用蒸馏水定容至1L，取此溶液900mL与700mL乙腈、400mL甲醇混合，乙酸调至pH5.0；
[0157] AmB产量计算方法：从sigma公司购买AmB的标准品，用DMSO配制不同浓度(0mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L)的AmB标准溶液，分别将上述标准液用HPLC检测出峰面积，根据峰面积和AmB标准溶液的浓度计算出标准曲线为Y＝0.0123X+2539.9，R2＝0.999(其中Y为AmB的浓度，X为峰面积)。将未知浓度的AmB样品通过HPLC检测可以得到一个峰面积，带入上述标准曲线公式得出浓度，标准曲线结果如图5所示。
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