技术领域
[0001] 本
发明属于固定化细胞催化应用领域，具体涉及一种连续合成低聚异麦芽寡糖的方法。
背景技术
[0002] 聚异麦芽寡糖(IMOs)是分子内含有一个α-1,6糖苷键的低聚糖混合物其功能成分主要包括异麦芽糖，潘糖以及异麦芽三糖。IMOs能使得双歧杆菌在肠道内富集生长，使肠道系统运行更加健康，同时具有低热量、防龋齿、润滑肠道、提高人体免疫
力等功能，是重要的具有营养保健功能的新糖源。目前已广泛应用于保健品行业、食品行业和医疗行业。工业上主要通过
淀粉酶系将淀粉原料
水解成麦芽糖，然后通过α-
葡萄糖苷酶的转苷作用生成含有α-(1，6)键的低聚异麦芽糖。我国对低聚异麦芽糖的市场需求量很大，但国内的企业目前不能得到具有较高纯度的α-葡萄糖苷酶，国内生产低聚异麦芽糖所用酶基本依靠国外进口，使得IMOs的生产成本较高。
[0003]
酵母表面展示技术的基本原理是以细胞表面的蛋白(通常是细胞壁外层的甘露糖蛋白)作为锚定蛋白，通过基因工程手段，使外源蛋白或多肽与锚定蛋白以融合蛋白的形式展示在酵母细胞的表面，被展示的外源蛋白或多肽可保持相对独立的空间结构和
生物活性，并可使表达、纯化、固定于一体，从而省去提取纯化的繁琐工序，催化剂的回收及重复利用也更方便快捷。且相对于纯酶提高了催化剂的
稳定性，如
热稳定性、
有机溶剂耐受性或酶的自溶。细胞催化剂在酶催化生物转化领域是一种经济且适用的生物催化剂模式。
发明内容
[0004] 为克服
现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种固定化重组酵母的制备方法。
[0005] 本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备的固定化重组酵母。
[0006] 本发明的再一目的在于一种连续合成低聚异麦芽寡糖的方法。
[0007] 本方法以
微波合成
磁性壳聚糖微球的方法固定表面展示有α-葡萄糖苷酶的毕赤酵母，并将其应用于固定床上连续催化合成IMOs。该方法简化了固定化菌体的制备及连续化的操作步骤，可操作性强，稳定性高，为IMOs工业放大生产奠定了一定
基础。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] 一种固定化重组酵母的制备方法，包括如下步骤：首先制备高
顺磁性微球，而后以壳聚糖包裹磁性微球，再以戊二
醛处理包裹壳聚糖的磁性微球，在微球载体上接醛基，最终制备醛基修饰的包裹壳聚糖的高顺磁性载体；利用载体表面修饰的醛基与重组酵母表面的糖蛋白共价结合，同时，利用壳聚糖对酵母的
吸附作用，达到固定重组酵母的效果；最后冻干得到固定化菌体，即固定化重组酵母，简称为I-Pp-ANGL-GCW61。
[0010] 所述的重组酵母为表面展示有α-葡萄糖苷酶的重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-ANGL-GCW61，简称为Pp-ANGL-GCW61。且在文献“Synthesis of Isomalto-Oligosaccharides by Pichia pastoris Displaying the Aspergillus niger α-Glucosidase.J.Agric.Food Chem.2017,65,9468-9474.”中公开。
[0011] 所述的α-葡萄糖苷酶是黑曲霉Aspergillus niger来源的经密码子优化后的表达产物，锚定蛋白是毕赤酵母内源的GPI型细胞壁蛋白GCW61。
[0012] 所述的醛基修饰的包裹壳聚糖的高顺磁性载体的单位
质量载体的菌体固定化量为4.5～6.5g。
[0013] 所述的α-葡萄糖苷酶的优化核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0014] 具体包括如下步骤：
[0015] (1)在壳聚糖乙
酸溶液中加入亚
铁盐水溶液，然后慢慢调节pH值并搅拌，直至有墨绿色絮状物生成为止，得到絮凝液；再微波处理，清洗，得到包裹壳聚糖的高顺磁性微球；
[0016] (2)将步骤(1)制得的包裹壳聚糖的高顺磁性微球均质后加入戊二醛溶液，室温反应，清洗，得到醛基修饰的包裹壳聚糖的高顺磁性载体；
[0017] (3)将重组酵母加入至醛基修饰的包裹壳聚糖的高顺磁性载体的重悬液中，反应后进行清洗、冻干，得到固定化菌体，即固定化重组酵母，简称为I-Pp-ANGL-GCW61。
[0018] 步骤(1)中，
[0019] 优选的，所述的壳聚糖乙酸溶液中壳聚糖的浓度为1～4g/L；更优选为2g/L。
[0020] 优选的，所述的亚铁盐水溶液为FeSO4·7H2O水溶液，进一步为3～4％(w/v)的FeSO4·7H2O水溶液；更进一步为3.6％(w/v)的FeSO4·7H2O水溶液。
[0021] 优选的，所述的亚铁盐与壳聚糖的质量比为3～4：0.5～2，更优选为3.6：1。
[0022] 优选的，所述的微波处理的条件为500～1000W微波处理15～30min；更优选为700W微波处理20min。
[0023] 步骤(2)中，
[0024] 优选的，所述的戊二醛溶液为3％～6％(v/v)的戊二醛溶液，更优选为5％(v/v)。
[0025] 优选的，所述的室温反应的条件为70～100rpm室温反应1～3h后，20000rpm均质10～30s，再反应0.5～2h。
[0026] 更优选的，所述的室温反应的条件为90rpm室温反应2h后，20000rpm均质20s，再反应1h。
[0027] 步骤(3)中，
[0028] 优选的，所述的反应的条件为80～100rpm，25～35℃反应2.5～4h。
[0029] 更优选的，所述的反应的条件为90rpm，30℃反应3h。
[0030] 一种固定化重组酵母，通过上述制备方法制备得到。
[0031] 一种连续合成低聚异麦芽寡糖的方法，包括以下步骤：
[0032] 在固定床
生物反应器中填充一定量上述固定化菌体，床层上下固定滤膜以防固定化菌体渗漏；在一定反应
温度下，将适量底物麦芽糖，以恒流
泵由床层底部梯度流速泵入，固定化菌体与麦芽糖发生转糖苷反应，从而生成IMOs。
[0033] 优选的，所述的固定床生物反应器为亚克力材质，内径为60mm，填充层可拼接高50mm/100mm两种规格模
块。
[0034] 优选的，所述的固定床生物反应器不同模块间的滤膜材质为聚丙烯腈。
[0035] 优选的，所述的固定床生物反应器中固定化菌体填充量为50～150kg/m3，更优选的为106kg/m3。
[0036] 优选的，所述的底物为25％～40％(m/v)的麦芽糖；更优选为30％。
[0037] 优选的，所述的底物流速为0.9～2.0mL/min；更优选为1.94mL/min。
[0038] 优选的，所述的一定反应温度为50～65℃；更优选为55～65℃，最优选为55℃。
[0039] 本发明的机理是：
[0040] 固定床中连续化生产IMOs可以在很大程度上提高生产效率，降低生产成本。使用表面展示α-葡萄糖苷酶的重组毕赤酵母(Pp-ANGL-GCW61)为生物催化剂，若以
发酵得到的酵母细胞喷干后，固定床中直接用于连续催化合成IMOs，固定床中酵母不能快速沉降。在固定床中如不加处理，会均匀分散在水溶液中，不利于催化剂的回收及重复利用，无法完成连续催化过程。所以需要对菌体进行进一步的固定化，进而实现IMO生产过程的连续化操作。
[0041] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0042] 本发明采用醛基修饰壳聚糖磁性载体进一步固定化表面展示有α-葡萄糖苷酶的重组毕赤酵母。利用载体表面修饰的醛基与酵母表面的糖蛋白共价结合，同时，利用壳聚糖对酵母的吸附作用，达到固定毕赤酵母细胞催化剂的效果。利用载体的超顺磁特性，
磁场中能快速分离固定化菌体与反应底物，提高细胞催化剂的重复利用效率。该方法简单有效，可操作性好，实验室中通过常规方法可以批量制备该载体。固定化的菌体热稳定性良好，55℃时其合成活力
半衰期在36h以上。固定化菌体在经过四次以上重复利用后，反应曲线趋于稳定，反应在2～3h IMOs积累量达到最大值，为95g/L，具有良好的重复利用特性。同时本发明还涉及将固定化重组酵母加入固定床中直接用于连续催化合成IMOs，解决了因酵母细胞亲水，固定床中酵母不能快速沉降的问题，实现在固定床中连续化合成IMOs，进而获得较优的IMOs生产效率。本发明提供的毕赤酵母菌体固定化方法简单有效，可操作性好，易于实现菌体的重复利用，可以降低IMOs的生产成本。
附图说明
[0043] 图1是菌体固定化效率-单位质量载体菌体固定化量图。
[0044] 图2是不同温度固定化菌与游离菌体热稳定性图，图a-c分别表示在55℃、60℃、65℃三个温度下，测定一段时间内固定化菌体与游离菌体的合成活力变化。
[0045] 图3是固定化菌体重复利用性曲线。
[0046] 图4是固定床生物反应器实物图。
[0047] 图5是固定床中连续催化合成IMOs的工艺
流程图，A：产物储槽1，B：产物储槽2，C：30％(m/v)麦芽糖底物储槽。
[0048] 图6是恒流泵转速15rpm下不同出料口IMOs异麦芽糖质量分数。
具体实施方式
[0049] 下面结合
实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0050] 本发明所使用的实验材料若无特别说明均为市售购买产品。
[0051] 本发明采用醛基修饰壳聚糖磁性载体进一步固定化表面展示有α-葡萄糖苷酶的重组毕赤酵母(Pp-ANGL-GCW61)。利用载体的超顺磁特性，磁场中能快速分离固定化菌体与反应底物，提高细胞催化剂的重复利用效率。该方法简单有效，可操作性好，实验室中通过常规方法可以批量制备该载体。将固定化重组酵母加入固定床中直接用于连续催化合成IMOs，解决了因酵母细胞亲水，固定床中酵母不能快速沉降的问题。结果表明，固定化菌体热稳定性良好，55℃时其合成活力半衰期在36h以上；固定化菌体具有良好的重复利用性；在固定床体系中加入30g I-Pp-ANGL-GCW61，控制恒流泵转速15rpm时，可获得最大的IMOs产率为12.12g/h，IMOs的最大生成率为36.69％。
[0052] 实施例1表面展示有α-葡萄糖苷酶的毕赤酵母的固定化
[0053] 一、固定化重组酵母菌株的制备
[0054] 具体如下：首先将1g壳聚糖加入到250mL 5％(m/v)的乙酸水溶液中，充分溶解。而后在壳聚糖溶胶中加入250mL双蒸水进行稀释，后加入100mL3.6％(w/v)的FeSO4·7H2O水溶液。此时溶液显酸性，pH＜1，在
混合液中逐滴加入10％(w/v)NaOH水溶液，快速搅拌直至液体的pH＞10，有墨绿色絮状物生成为止。取上述絮凝液250mL于1000mL烧杯中，置于
微波炉700W处理20min。得到高顺磁性包裹壳聚糖的黑色磁性微球，以pH＞7.0水溶液洗上述载体三次。均质后得糊状磁性微粒，每20mL磁性微粒糊状物加入20mL 5％(v/v)的戊二醛溶液，摇床上90rpm(4000i control，IKA KS，Germany)，室温反应2h，而后均质器20000rpm均质
20s，摇床条件不变，再反应1h。反应完毕，以双蒸水洗上述磁性微粒3次。取210mL上述糊状载体加入经150mL Britton-Robinson(B-R)缓冲液重悬的15g上罐发酵后喷干的表面展示α-葡萄糖苷酶的重组毕赤酵母菌体，摇床90rpm，30℃，3h。B-R缓冲液洗上述固定化菌体3次以上，至上清澄清得到固定化菌体，冻干固定化菌体(I-Pp-ANGL-GCW61)。如图1所示，在固定化菌体添加量较低时，菌体可以被完全固定，固定化效率为100％，随着菌体添加量的增加，在菌体固定化量也随之增加的同时，菌体的固定化效率在不断的下降。该菌体可以通过常规发酵大批量制得，故而能有效降低催化剂的投资
费用。也因此，在确定菌体最优固定化量时，本文选择单位质量载体菌体固定化量为5.863g，此时的菌体固定化效率为51.83％。
[0055] 二、固定化菌体与游离菌体的热稳定性
[0056] 取10g冻干固定化菌体于玻璃皿中，保鲜膜封口。置玻璃皿于恒温摇床中，55℃、60℃、65℃三个温度梯度，200rpm。每3h取样0.5g，放到4℃
冰箱待测转苷活力。结果如图2a-2c所示，固定化菌体与游离菌体一样均表现出良好的热稳定性，恒温摇床中，55℃时在经过36h的处理后，细胞催化剂(游离菌体)的活力几乎没有下降。对固定化细胞催化剂(固定化菌体)以及细胞催化剂(游离菌体)温度每升高5℃，转苷活力都会提高10％。固定化菌良好的热稳定性为在固定床中连续合成IMOs提供了很好的基础。
[0057] 三、固定化菌体的重复利用
[0058] 在10mL反应瓶中加入0.16g固定化细胞催化剂(固定化菌体)，0.6g麦芽糖，2mL B-R缓冲液。55℃，恒温摇床200rpm，反应3h，第0.5h、1h、2h、3h取样50μL，每批次设三组平行，样品置于4℃冰箱待测。第一批反应完毕，磁场中分离固定化菌体，用5mL移液枪缓吸出反应液。10mL反应瓶中，用B-R缓冲液洗上述反应后的固定化菌体3次。保鲜膜封反应
瓶口，冻干。第二批次加入0.6g麦芽糖，2mL B-R缓冲液。55℃，恒温摇床200rpm，反应3h。其余操作与第一批次相同，重复5次。结果如图3所示，第一批次反应，IMOs积累量0.5h内达到最高值
94.4g/L，而后随着葡萄糖积累量的增大等反应动力学因素的影响，IMOs积累量开始下降。
第二批次反应，IMOs积累量在反应1h后达到最大值93.1g/L，而后开始下降。第三次重复利用中，IMOs积累量在2h达到最大值95.3g/L，而后开始下降。在第四、五次重复利用中，IMOs积累量均在反应进行2h后达到最高值95g/L，且能在最高值稳定一段时间。
[0059] 实施例2固定床中连续催化合成IMOs
[0060] 一、固定床生物反应器的设计
[0061] 设计制作了一套固定床生物反应器，反应器由透明亚克力管制作而成。反应器由三部分：上下堵头、底物均布模块、固定化细胞催化剂填充模块组成。固定化细胞催化剂填充模块开有取样口。反应器实物结构如图4所示，内径60mm，填充层可拼接高50mm/100mm两种规格模块，以研究不同固定化菌体填充量对产物分布以及产物产率的影响。床上下层各填充15g固定化菌体。不同模块间均有滤膜以防固定化菌体渗漏。固定床中固定化菌体(I-Pp-ANGL-GCW61)连续催化底物麦芽糖生成IMOs的工艺流程如图5所示。30％(m/v)质量浓度麦芽糖底物以恒流泵由固定床底部(进料口)泵入反应器，由反应器上段(上取样口)和中段(下取样口)、采出产品。
[0062] 二、固定床中连续催化合成IMOs
[0063] 固定化菌体合成活力为43U/g I-Pp-ANGL-GCW61。在反应器中部载酶段的两个模块中各填充15g I-Pp-ANGL-GCW61，也即填充固定化菌体的IMOs合成活力为1290U。恒流泵转速15rpm(1.94mL/min)泵入30％(m/v)质量浓度麦芽糖底物，底物的
停留时间为51.0min时取出反应液进行HPLC-ELSD检测。结果如图6所示，55℃固定床中，当I-Pp-ANGL-GCW61填充量为1290U(30g)，恒流泵转速15rpm时，该固定床体系获得最大的IMOs产率为12.12g/h，IMOs的最大生成率为36.69％。
[0064] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
