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一种可抑制副溶血弧菌的净水剂

阅读：57发布：2023-06-11

专利汇可以提供一种可抑制副溶血弧菌的净水剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种可抑制副溶血弧菌的净水剂，所述净水剂包括解淀粉芽孢杆菌培养液、解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物和纳米级腐殖质。本发明采用的纳米级腐殖质比表面积大，功能基团多，富含多种微量元素，能很好地活化和促进芽孢杆菌在其上面固着生长，生成大量抑菌活性物质。芽孢杆菌在生长繁殖过程中，可大量吸收养殖水体中的氮、磷、有机物等污染物，净化养殖水体。芽孢杆菌抑菌提取物比芽孢杆菌培养液具有更强的副溶血弧菌抑制能力，可以帮助解淀粉芽孢杆菌在与副溶血弧菌的竞争性生长中取得优势，显著抑制副溶血弧菌的生长。，下面是一种可抑制副溶血弧菌的净水剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种可抑制副溶血弧菌的净水剂，其特征在于，所述净水剂包括解淀粉芽孢杆菌培养液、解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物和纳米级腐殖质。
2.如权利要求1所述的可抑制副溶血弧菌的净水剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌培养液与解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物的体积比为：解淀粉芽孢杆菌培养液:解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物＝15～20:1～3。
3.如权利要求2所述的可抑制副溶血弧菌的净水剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌培养液与解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物的体积比为：解淀粉芽孢杆菌培养液:解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物＝19:1。
4.如权利要求1所述的可抑制副溶血弧菌的净水剂，其特征在于，优选地，所述纳米级腐殖质在所述净水剂中的质量浓度为10～25％。
5.如权利要求4所述的可抑制副溶血弧菌的净水剂，其特征在于，优选地，所述纳米级腐殖质在所述净水剂中的质量浓度为20％。
6.如权利要求1～4任一项所述的可抑制副溶血弧菌的净水剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为本发明筛选出的一株解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株命名为LBJK08，于2019年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60690。
7.一种可抑制副溶血弧菌的净水剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先将解淀粉芽孢杆菌培养液与纳米级腐殖质混合曝气培养，使其附着于纳米级腐殖质生长；然后加入解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物，将其混匀，即得本发明的可抑制副溶血弧菌的净水剂。
8.如权利要求7所述的可抑制副溶血弧菌的净水剂的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为本发明筛选出的一株解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株命名为LBJK08，于2019年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60690。
9.如权利要求7所述的可抑制副溶血弧菌的净水剂的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物采用以下方法制备：在解淀粉芽孢杆菌的培养液的上清液中加入HCl获得沉淀，将沉淀溶解于甲醇中，加入NaOH，搅拌离心，所得上清液过滤，滤液即为解淀粉芽孢杆菌LBJK08抑菌提取物。
10.如权利要求7所述的可抑制副溶血弧菌的净水剂的制备方法，其特征在于，所述纳米级腐殖质采用以下方法制备：取腐殖质原料进行破碎和干燥初处理，将腐殖质破碎至16目以下，含水量低于10％，将其研磨至粒径小于0.1微米的颗粒，即得纳米级腐殖质。

说明书全文

一种可抑制副溶血弧菌的净水剂

技术领域

[0001] 本发明涉及水产养殖领域，具体涉及一种含有淀粉芽孢杆菌的可抑制副溶血弧菌的净水剂。

背景技术

[0002] 副溶血弧菌被认为是对虾早死综合征和肝胰腺坏死综合症的主要病因。养殖户主要使用化学消毒剂、抗生素和益生菌抑制副溶血弧菌的生长。化学消毒剂对对虾会产生刺激，化学药剂残留还可能会产生二次污染。使用抗生素容易产生耐药性和药物残留，危害人体健康。副溶血弧菌可以利用水体的中的营养物迅速大量繁殖，现有的益生菌在真正使用过程中，难以形成竞争优势，无法有效抑制副溶血弧菌的生长。

[0003] 因此，益生菌在养殖水体中如何与副溶血弧菌竞争生长，抑制副溶血弧菌的成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

[0004] 本发明的第一个目的在于提供一种可抑制副溶血弧菌的净水剂，所述净水剂包括解淀粉芽孢杆菌培养液、解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物和纳米级腐殖质。

[0005] 优选地，所述解淀粉芽孢杆菌培养液与解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物的体积比为：解淀粉芽孢杆菌培养液:解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物＝15～20:1～3。

[0006] 优选地，所述解淀粉芽孢杆菌培养液与解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物的体积比为：解淀粉芽孢杆菌培养液:解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物＝19:1。

[0007] 优选地，所述纳米级腐殖质在所述净水剂中的质量浓度为10～25％。

[0008] 优选地，所述纳米级腐殖质在所述净水剂中的质量浓度为20％。

[0009] 优选地，所述解淀粉芽孢杆菌为本发明筛选出的一株解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株命名为LBJK08，于2019年6 月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国广东，保藏编号：GDMCC No:60690。

[0010] 本发明的第二个目的在于提供一种可抑制副溶血弧菌的净水剂的制备方法，包括以下步骤：首先将解淀粉芽孢杆菌培养液与纳米级腐殖质混合曝气培养，使其附着于纳米级腐殖质生长；然后加入解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物，将其混匀，即得本发明的可抑制副溶血弧菌的净水剂。

[0011] 优选地，所述解淀粉芽孢杆菌为本发明筛选出的一株解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株命名为LBJK08，于2019年6 月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国广东，保藏编号：GDMCC No:60690。

[0012] 优选地，所述解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物采用以下方法制备：在解淀粉芽孢杆菌的培养液的上清液中加入HCl获得沉淀，将沉淀溶解于甲醇中，加入 NaOH，搅拌离心，所得上清液过滤，滤液即为解淀粉芽孢杆菌LBJK08抑菌提取物。

[0013] 优选地，所述纳米级腐殖质采用以下方法制备：取腐殖质原料进行破碎和干燥初处理，将腐殖质破碎至16目以下，含水量低于10％，将其研磨至粒径小于0.1微米的颗粒，即得纳米级腐殖质。

[0014] 本发明的有益效果：本发明采用的纳米级腐殖质比表面积大，功能基团多，富含多种微量元素，能很好地活化和促进芽孢杆菌在其上面固着生长，生成大量抑菌活性物质。芽孢杆菌在生长繁殖过程中，可大量吸收养殖水体中的氮、磷、有机物等污染物，净化养殖水体。芽孢杆菌抑菌提取物比芽孢杆菌培养液具有更强的副溶血弧菌抑制能力，可以帮助解淀粉芽孢杆菌在与副溶血弧菌的竞争性生长中取得优势，显著抑制副溶血弧菌的生长。附图说明

[0015] 图1本发明解淀粉芽孢杆菌净水剂抑菌效果图(其中1表示解淀粉芽孢杆菌净水剂的抑菌圈；2表示氨苄西林的抑菌圈；3表示解淀粉芽孢杆菌培养液；4表示庆大霉素的抑菌圈)。

具体实施方式

[0016] 为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

[0017] 实施例1

[0018] 本实施例提供一种可抑制副溶血弧菌的净水剂的制备方法

[0019] 1、制备解淀粉芽孢杆菌LBJK08培养液

[0020] 取-20℃保存的解淀粉芽孢杆菌菌株LBJK08，以1％接种量接种于盐度为千分之二十的LB培养基(常见的培养基之一)中，在30℃、150rpm条件下培养 24h。取活化培养得到的菌液再次以1％接种量接种于上述培养基中，在30℃、 150rpm条件下培养24h，得到解淀粉芽孢杆菌LBJK08培养液。

[0021] 2、制备解淀粉芽孢杆菌LBJK08抑菌提取物

[0022] 取-20℃保存的解淀粉芽孢杆菌LBJK08，以1％接种量接种于LB培养基中，在30℃、150rpm条件下培养24h。取活化培养得到的菌液再次以1％接种量接种于LB培养基中，在30℃、150rpm条件下培养24h。将培养得到的菌液分装于100mL离心管中，4℃、10000rpm离心
16min除去菌体细胞，将上清液以1 M HCl溶液调节pH至2.0，4℃过夜。之后以4℃、10000rpm离心16min，取沉淀，每50mL菌液离心获得的沉淀以1mL甲醇(HPLC色谱纯)溶解，以1M MaOH调节pH至7.0，低温搅拌5h，之后以4℃、10000rpm离心16min，所得上清液以0.22μm 真空过滤器过滤，滤液即为解淀粉芽孢杆菌LBJK08抑菌提取物。

[0023] 3、制备纳米级腐殖质

[0024] 取腐殖质原料(购于济南东宙伟业化工有限公司)，放入原料处理器内进行破碎和干燥初处理，使得腐殖质破碎至16目以下，含水量低于10％。将初处理后腐殖质原料移入高速可控变轨多级球研磨机内，研磨至纳米级(粒径小于0.1 微米)，即得纳米级腐殖质。

[0025] 4、制备可抑制副溶血弧菌的净水剂

[0026] 首先将950ml解淀粉芽孢杆菌LBJK08培养液与200克纳米级腐殖质混合，曝气培养半小时，使得芽孢杆菌活化，并在纳米级腐殖质上附着繁殖生长，然后加入抑菌提取物50ml，混匀，制得可抑制副溶血弧菌的净水剂。

[0027] 实施例2

[0028] 将实施例1制备的可抑制副溶血弧菌的净水剂进行抑菌圈实验验证其对副溶血弧菌的抑制效果，结果如图1所示。从图1中可以看出，本发明的净水剂抑菌圈直径为20.00毫米，而解淀粉芽孢杆菌LBJK08培养液的抑菌圈直径为 14.00毫米，氨苄西林与庆大霉素的抑菌圈直径分别为17.43毫米和18.08毫米。因此，本发明的净水剂抑制副溶血弧菌的活性最强，氨苄西林与庆大霉素次之，而解淀粉芽孢杆菌LBJK08培养液的抑制效果最弱。可见本发明的净水剂可以替代抗生素，可以做为抑制副溶血弧菌的抗生素的替代品。

[0029] 实施例3

[0030] 本实施例与实施例1的唯一区别在于：所述解淀粉芽孢杆菌培养液与解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物的体积比为：解淀粉芽孢杆菌培养液:解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物＝15:1，所述纳米级腐殖质在所述净水剂中的质量浓度为25％。

[0031] 实施例4

[0032] 本实施例与实施例1的唯一区别在于：所述解淀粉芽孢杆菌培养液与解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物的体积比为：解淀粉芽孢杆菌培养液:解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物＝16:1，所述纳米级腐殖质在所述净水剂中的质量浓度为25％。

[0033] 实施例5

[0034] 本实施例与实施例1的唯一区别在于：所述解淀粉芽孢杆菌培养液与解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物的体积比为：解淀粉芽孢杆菌培养液:解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物＝17:2，所述纳米级腐殖质在所述净水剂中的质量浓度为20％。

[0035] 实施例6

[0036] 本实施例与实施例1的唯一区别在于：所述解淀粉芽孢杆菌培养液与解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物的体积比为：解淀粉芽孢杆菌培养液:解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物＝18:2，所述纳米级腐殖质在所述净水剂中的质量浓度为22％。

[0037] 实施例7

[0038] 本实施例与实施例1的唯一区别在于：所述解淀粉芽孢杆菌培养液与解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物的体积比为：解淀粉芽孢杆菌培养液:解淀粉芽孢杆菌抑菌提取物＝20:3，所述纳米级腐殖质在所述净水剂中的质量浓度为10％。

[0039] 将实施例1、3～6制备的净水剂进行抑菌圈实验，结果如表1所示：

[0040] 表1：

[0041]样品抑菌圈直径(mm)
实施例1 20.00
实施例3 18.22
实施例4 17.11
实施例5 18.65
实施例6 18.68
实施例7 19.22

[0042] 从表1可以看出，实施例1抑菌效果最佳，实施例3～7并没有随着其中单一的组份含量的增加而使其抑菌活性增强，因此，可以推测本发明中的各组组份的配伍具有一定的协同增效作用，其抑菌功效并非是单一组分功能的简单增加。

[0043] 实施例8

[0044] 本实施提供一种本发明的可抑制副溶血弧菌的净水剂的使用方法

[0045] 将本发明的可抑制副溶血弧菌的净水剂按2公升每亩泼洒入需处理的养殖塘内。

[0046] 实施例9解淀粉芽孢杆菌LBJK08菌种筛选与鉴定

[0047] 采用2216E培养基从阳江虾塘底水水样中分离出几株不同菌株，使用点种法筛选分离出其中具有最强副溶血弧菌拮抗能力的菌株，具体步骤如下：

[0048] 将底水水样用2216E培养基于30℃、150rpm条件下培养24h，用0.85％灭菌生理盐水逐级稀释后涂布于2216E琼脂培养基中，30℃下培养48h。用一次性接种环刮取单个菌落分别在在预先涂布了病原指示菌(以3％氯化钠碱性蛋白胨水培养基培养24h)的2216E琼脂培养基上点种，并分别对每个实验菌落编号标记。30℃恒温培养24h后进行抑菌圈的观察和测量，最终筛选出一株具有最强副溶血弧菌拮抗能力的菌株，将其命名为LBJK08。

[0049] 菌株LBJK08的形态特征：

[0050] 菌落特征：在2216E琼脂培养基表明，菌落扁平、圆形、边缘整齐，乳白色，不透明。

[0051] 细胞特征：革兰氏染色阳性，短杆状，可形成芽孢，大小0.6-0.7μm X 0.8-1.0 μm。

[0052] 生理生化特征：见表2。

[0053] 表2：解淀粉芽孢杆菌生理生化特征

[0054]

[0055]

[0056] 分子鉴定：

[0057] 多次重复培养筛选后，将筛选分离得到的具有稳定拮抗作用的拮抗菌菌株交由生工生物工程(上海)有限公司进行16S rDNA测序，所得序列提交至NCBI 进行Blast同源性比对，最终与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性达到99％，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。

[0058] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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