重组代谢微生物及其用途
阅读：367发布：2020-05-13
专利汇可以提供重组代谢微生物及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且萜烯是在多种产业中使用的有价值的商业产品。萜烯可以由石油化学来源和诸如松节油的萜烯原料产生。然而，这些生产方法昂贵，不可持续且常导致环境问题，包括促成 气候 变化 。 微 生物 发酵 为萜烯生产提供了一种替代性的选择。可以通过对包含CO的底物的微生物发酵而产生一种或多种萜烯和/或前体。重组微生物可用于此类方法中。一 氧 化 碳 营养产乙酸重组微生物可用于所述方法中。例如，所述重组微生物可含有外源性甲羟戊酸(MVA)途径的酶和/或DXS途径的酶。，下面是重组代谢微生物及其用途专利的具体信息内容。
1.一种通过微生物发酵产生一种或多种萜烯和/或其前体的方法，所述方法包括向包含重组的一氧化碳营养产乙酸细菌的培养物的生物反应器中提供包含CO的气态底物且在厌氧条件下发酵所述培养物以从所述气态底物产生一种或多种萜烯和/或其前体，其中所述细菌包含一种或多种编码以下酶的外源性核酸：
(a)甲羟戊酸途径中的酶，其选自硫解酶；HMG-CoA合酶；HMG-CoA还原酶；甲羟戊酸激酶；磷酸甲羟戊酸激酶；和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶；
(b)DXS途径中的酶，其选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR；2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE；2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF；4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG；和4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶；或(c)萜烯生物合成途径中的酶，其选自香叶基转移酶Fps；七异戊烯基二磷酸合酶；八异戊烯基二磷酸合酶；异戊二烯合酶；异戊烯基二磷酸δ-异构酶；和法呢烯合酶；
其中所述细菌为自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述萜烯或其前体选自甲羟戊酸、焦磷酸异戊烯酯(IPP)、焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)、异戊二烯、焦磷酸香叶酯(GPP)、焦磷酸法呢酯(FPP)和法呢烯。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述萜烯或其前体是异戊二烯，且所述细菌包含编码异戊二烯合酶的外源性核酸。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述异戊二烯合酶是美洲山杨(Populus tremuloides)异戊二烯合酶。
5.如权利要求1所述的方法，其中萜烯或其前体是焦磷酸异戊烯酯(IPP)，且其中所述细菌包含编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的外源性核酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述异戊烯基二磷酸δ-异构酶是拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)异戊烯基二磷酸δ异构酶。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌包含编码异戊二烯合酶、异戊烯基二磷酸δ异构酶和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS的外源性核酸。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物包含至少20％的CO。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物还包含CO2。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物还包含H2。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物来源于选自铁金属产品制备、石油精炼、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制备的工业过程。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物是合成气。
重组代谢微生物及其用途
技术领域
背景技术
[0003] 萜烯的例子包括：异戊二烯(C5半萜烯)、法呢烯(C15倍半萜烯)、青蒿素(C15倍半萜烯)、柠檬醛(C10单萜烯)、类胡萝卜素(C40四萜烯)、薄荷醇(C10单萜烯)、樟脑(C10单萜烯)和大麻素。
[0004] 萜烯是在多种行业中使用的有价值的商业产品。萜烯的最重要用途是作为树脂、溶剂、香料和维生素。举例来说，异戊二烯用于生产例如用于轮胎工业中的合成橡胶(顺-1,4-聚异戊二烯)；法呢烯用作用于运输的能源密集即用燃料(drop-in fuel)或用作喷气燃料；青蒿素用作疟疾药物；且柠檬醛、类胡萝卜素、薄荷醇、樟脑和大麻素用于制造药物丁二烯且作为芳族成分。
[0005] 萜烯可以由石油化学来源和萜烯原料(诸如松节油)产生。举例来说，异戊二烯在石油化学上作为乙烯生产中的石脑油或油裂解的副产品而产生。许多萜烯也以相对小的量从自然来源中提取。然而，这些生产方法代价昂贵，不可持续且常导致环境问题，包括引起气候变化。
[0006] 由于异戊二烯的极易燃性质，已知的生产方法需要广泛的保护来限制着火和爆炸的可能性。
[0007] 本发明的目标在于克服现有技术的一种或多种不足，或至少向公众提供用于生产萜烯和其它相关产品的替代方式。
发明内容
[0008] 微生物发酵提供了一种用于生产萜烯的替代选择。萜烯在自然界中普遍存在，例如涉及细菌细胞壁生物合成，且它们由一些树(例如白杨)产生用于保护叶片免受UV光暴露。然而，并非所有细菌都包含必要的细胞机制来产生萜烯和/或其前体作为代谢产物。举例来说，尚不知道能够将包含一氧化碳的底物发酵产生诸如乙醇的产物的一氧化碳营养型产乙酸菌(诸如自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)或杨氏梭菌(C.ljungdahlii))会产生且释放任何萜烯和/或其前体作为代谢产物。另外，尚不知道大多数细菌会产生具有商业价值的任何萜烯。
[0009] 本发明一般尤其提供通过将包含CO的底物微生物发酵来产生一种或多种萜烯和/或其前体的方法以及用于所述方法中的重组微生物。
[0010] 在第一方面，本发明提供能够通过将包含CO的底物发酵产生一种或多种萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产物的一氧化碳营养型产乙酸的重组微生物。
[0011] 在一个具体实施方案中，将所述微生物改造为适合于表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种在用于产生重组微生物的亲本微生物中不存在的酶(本文中可称为外源性酶)。在另一个实施方案中，将所述微生物改造为适合于过度表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种在用于产生重组微生物的亲本微生物中存在的酶(本文中可称为内源性酶)。
[0012] 在另一个实施方案中，将所述微生物改造为适合于：
[0013] a)表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种外源性酶和/或过度表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种内源性酶；和
[0014] b)表达DXS途径中的一种或多种外源性酶和/或过度表达DXS途径中的一种或多种内源性酶。
[0015] 在一个实施方案中，所述来自甲羟戊酸(MVA)途径的一种或多种酶选自：
[0016] a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
[0017] b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
[0018] c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
[0019] d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
[0020] e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
[0021] f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)，和
[0022] g)它们的任一种的功能等效变体。
[0023] 在另一个实施方案中，所述来自DXS途径的一种或多种酶选自：
[0024] a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
[0025] b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
[0026] c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、[0027] d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、[0028] e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
[0029] f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
[0030] g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
[0031] h)它们的任一种的功能等效变体。
[0032] 在另一个实施方案中，一种或多种其它外源性或内源性酶被表达或过度表达而导致产生萜烯化合物或其前体，其中经表达的外源性酶或经过度表达的内源性酶选自：
[0033] a)香叶基转移酶(geranyltransferase)Fps(EC:2.5.1.10)、
[0034] b)七异戊烯基二磷酸合酶(heptaprenyl diphosphate synthase)(EC:2.5.1.10)、
[0035] c)八异戊烯基二磷酸合酶(octaprenyl diphosphate synthase)(EC:2.5.1.90)、[0036] d)异戊二烯合酶(isoprene synthase)(EC 4.2.3.27)、
[0037] e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(isopentenyl diphosphate delta-isomerase)(EC 5.3.3.2)、
[0038] f)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)，和
[0039] g)它们的任一种的功能等效变体。
[0040] 在一个实施方案中，亲本微生物能够将包含CO的底物发酵以产生乙酰基CoA，但不能将乙酰基CoA转化成甲羟戊酸或异戊烯基焦磷酸(IPP)，且将重组微生物改造为适合于表达一种或多种在甲羟戊酸途径中所涉及的酶。
[0041] 在一个实施方案中，一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
[0042] 在一个实施方案中，微生物包含一种或多种被改造为适合于增加一种或多种内源性核酸的表达的外源性核酸且所述一种或多种内源性核酸编码一种或多种前文提到的酶。
[0043] 在一个实施方案中，被改造为适合于增加表达的一种或多种外源性核酸是调节元件。在一个实施方案中，调节元件是启动子。在一个实施方案中，启动子是组成型启动子。在一个实施方案中，启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。
[0044] 在一个实施方案中，微生物包含一种或多种编码且被改造为适合于表达一种或多种前文提到的酶的外源性核酸。在一个实施方案中，微生物包含一种或多种编码且被改造为适合于表达所述酶中至少两种的外源性核酸。在其它实施方案中，微生物包含一种或多种编码且被改造为适合于表达所述酶中至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或九种以上的外源性核酸。
[0045] 在一个实施方案中，一种或多种外源性核酸是核酸构建体或载体，在一个具体实施方案中是编码以任何组合形式的前文提到的一种或多种酶的质粒。
[0046] 在一个实施方案中，外源性核酸是表达质粒。
[0047] 在一个具体实施方案中，亲本微生物选自一氧化碳营养型产乙酸的细菌。在某些实施方案中，微生物选自：自产乙醇梭菌(Clostridium autoethan ogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdal ei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridi um drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium acet icum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium ma gnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(A cetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、延长布劳特氏菌(Blautia producta)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moor ella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、森林乙酸香蕉孢菌(Sporomusa silvacetica)、类球鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧杆状菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
[0048] 在一个实施方案中，亲本微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个具体实施方案中，微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个具体实施方案中，微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
[0049] 在一个实施方案中，亲本微生物缺少DXS途径和/或甲羟戊酸(MVA)途径中的一个或多个基因。在一个实施方案中，亲本微生物缺少一个或多个编码选自以下的酶的基因：
[0050] a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
[0051] b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
[0052] c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
[0053] d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
[0054] e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
[0055] f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)、
[0056] g)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
[0057] h)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
[0058] i)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、[0059] j)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、[0060] k)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
[0061] l)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
[0062] m)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
[0063] n)它们的任一种的功能等效变体。
[0064] 在第二方面，本发明提供编码一种或多种酶的核酸，所述酶在微生物中表达时使得所述微生物可以通过将包含CO的底物发酵而产生一种或多种萜烯和/或其前体。
[0065] 在一个实施方案中，核酸编码两种或两种以上酶，所述酶在微生物中表达时使得所述微生物可以通过将包含CO的底物发酵而产生一种或多种萜烯和/或其前体。在一个实施方案中，本发明的核酸编码所述酶中的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或九种以上。
[0066] 在一个实施方案中，核酸编码甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种酶。在一个实施方案中，一种或多种酶选自：
[0067] a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
[0068] b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
[0069] c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
[0070] d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
[0071] e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
[0072] f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)，和
[0073] g)它们的任一种的功能等效变体。
[0074] 在一个具体实施方案中，核酸编码硫解酶(可以是乙酰基CoA c-乙酰基转移酶)、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶。
[0075] 在另一个实施方案中，核酸编码甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种酶和DXS途径中的一种或多种其它核酸。在一个实施方案中，来自DXS途径的一种或多种酶选自：
[0076] a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
[0077] b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
[0078] c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、[0079] d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、[0080] e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
[0081] f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
[0082] g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
[0083] h)它们的任一种的功能等效变体。
[0084] 在另一个实施方案中，编码一种或多种其它外源性或内源性酶的核酸被表达或过度表达而导致产生萜烯化合物或其前体，其中经表达的外源性核酸或经过度表达的内源性酶编码选自以下的酶：
[0085] a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)、
[0086] b)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)、
[0087] c)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)、
[0088] d)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)、
[0089] e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2)、
[0090] f)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)，和
[0091] g)它们的任一种的功能等效变体。
[0092] 在一个实施方案中，编码硫解酶(EC 2.3.1.9)的核酸具有序列SEQ ID NO:40或是其功能等效变体。
[0093] 在一个实施方案中，编码硫解酶(EC 2.3.1.9)的核酸是具有序列SEQ ID NO:41的乙酰基CoA c-乙酰基转移酶或是其功能等效变体。
[0094] 在一个实施方案中，编码HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)的核酸具有序列SEQ ID NO:42或是其功能等效变体。
[0095] 在一个实施方案中，编码HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)的核酸具有序列SEQ ID NO:43或是其功能等效变体。
[0096] 在一个实施方案中，编码甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)的核酸具有序列SEQ ID NO:51或是其功能等效变体。
[0097] 在一个实施方案中，编码磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)的核酸具有序列SEQ ID NO:52或是其功能等效变体。
[0098] 在一个实施方案中，编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)的核酸具有序列SEQ ID NO:53或是其功能等效变体。
[0099] 在一个实施方案中，编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)的核酸具有序列SEQ ID NO:1或是其功能等效变体。
[0100] 在一个实施方案中，编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)的核酸具有序列SEQ ID NO:3或是其功能等效变体。
[0101] 在一个实施方案中，编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)的核酸具有序列SEQ ID NO:5或是其功能等效变体。
[0102] 在一个实施方案中，编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)的核酸具有序列SEQ ID NO:7或是其功能等效变体。
[0103] 在一个实施方案中，编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)的核酸具有序列SEQ ID NO:9或是其功能等效变体。
[0104] 在一个实施方案中，编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)的核酸具有序列SEQ ID NO:11或是其功能等效变体。
[0105] 在一个实施方案中，编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)的核酸具有序列SEQ ID NO:13或是其功能等效变体。
[0106] 在一个实施方案中，编码香叶基转移酶Fps的核酸具有序列SEQ ID NO:15或是其功能等效变体。
[0107] 在一个实施方案中，编码七异戊烯基二磷酸合酶的核酸具有序列SEQ ID NO:17或是其功能等效变体。
[0108] 在一个实施方案中，编码八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)的核酸(其中所述八异戊烯基二磷酸合酶是聚异戊烯基合成酶)由序列SEQ ID NO:19来编码或是其功能等效变体。
[0109] 在一个实施方案中，编码异戊二烯合酶(ispS)的核酸具有序列SEQ ID NO:21或是其功能等效变体。
[0110] 在一个实施方案中，编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)的核酸具有序列SEQ ID NO:54或是其功能等效变体。
[0111] 在一个实施方案中，编码法呢烯合酶的核酸具有序列SEQ ID NO:57或是其功能等效变体。
[0112] 在一个实施方案中，核酸编码以下酶：
[0113] a)异戊二烯合酶；
[0114] b)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)；和
[0115] c)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS；
[0116] 或其功能等效变体。
[0117] 在一个实施方案中，核酸编码以下酶：
[0118] a)硫解酶；
[0119] b)HMG-CoA合酶；
[0120] c)HMG-CoA还原酶；
[0121] d)甲羟戊酸激酶；
[0122] e)磷酸甲羟戊酸激酶；
[0123] f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶；
[0124] g)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)；和
[0125] h)异戊二烯合酶；
[0126] 或其功能等效变体。
[0127] 在一个实施方案中，核酸编码以下酶：
[0128] a)香叶基转移酶Fps；和
[0129] b)法呢烯合酶
[0130] 或其功能等效变体。
[0131] 在一个实施方案中，本发明的核酸还包含启动子。在一个实施方案中，启动子允许在其控制下所述基因的组成型表达。在一个具体实施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个具体实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个具体实施方案中，启动子来自自产乙醇梭菌。
[0132] 在第三方面，本发明提供包含第二方面的一种或多种核酸的核酸构建体或载体。
[0133] 在一个具体实施方案中，核酸构建体或载体是表达构建体或载体。在一个具体实施方案中，表达构建体或载体是质粒。
[0134] 在第四方面，本发明提供包含第二方面的任一种或多种核酸或者第三方面的载体或构建体的宿主生物体。
[0135] 在第五方面，本发明提供包含如本发明第三方面中提到的表达构建体或载体和甲基化构建体或载体的组合物。
[0136] 所述组合物优选地能够产生根据本发明第一方面的重组微生物。
[0137] 在一个具体实施方案中，所述表达构建体/载体和/或所述甲基化构建体/载体是质粒。
[0138] 在第六方面，本发明提供通过微生物发酵产生一种或多种萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产物的方法，其包括使用本发明第一方面的重组微生物发酵包含CO的底物。
[0139] 在一个实施方案中，此方法包括以下步骤：
[0140] (a)向含有本发明第一方面的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含CO的底物；和
[0141] (b)厌氧发酵生物反应器中的培养物以产生至少一种萜烯和/或其前体。
[0142] 在一个实施方案中，此方法包括以下步骤：
[0143] (a)捕获由工业过程产生的含CO的气体；
[0144] (b)通过含有本发明第一方面的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵含CO的气体以产生至少一种萜烯和/或其前体。
[0145] 在所述方法方面的特别实施方案中，微生物维持在水性培养基中。
[0146] 在所述方法方面的特别实施方案中，在生物反应器中发生底物的发酵。
[0147] 在一个实施方案中，所述一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
[0149] 在一个实施方案中，底物将通常含有较大比例的CO，诸如至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO和40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO、或约55体积％的CO或约60体积％的CO。
[0150] 在某些实施方案中，所述方法另外包括自发酵液中回收萜烯和/或其前体以及任选的一种或多种其它产物的步骤。
[0151] 在第七方面，本发明提供由第六方面的方法产生的一种或多种萜烯和/或其前体。在一个实施方案中，所述一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
[0152] 在另一方面，本发明提供产生本发明第一方面的微生物的方法，其包括通过引入一种或多种核酸转化一氧化碳营养型产乙酸的亲本微生物以使得所述微生物能够通过发酵包含CO的底物来产生一种或多种萜烯和/或其前体以及任选的一种或多种其它产物或增加其产量，其中所述亲本微生物无法通过发酵包含CO的底物来产生一种或多种萜烯和/或其前体或产生其的水平较低。
[0153] 在一个具体实施方案中，通过引入被改造为适合于表达甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中的一种或多种酶的一种或多种外源性核酸来转化亲本微生物。在另一个实施方案中，用被改造为适合于过度表达在亲本微生物中天然存在的甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中的一种或多种酶的一种或多种核酸来转化亲本微生物。
[0154] 在某些实施方案中，所述一种或多种酶为如前文中所描述。
[0155] 在一个实施方案中，提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码甲羟戊酸途径或DXS途径或萜烯生物合成途径中的酶的外源性核酸，由此细菌表达所述酶。此酶选自：
[0156] a)硫解酶(EC 2.3.1.9)；
[0157] b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)；
[0158] c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)；
[0159] d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)；
[0160] e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)；
[0161] f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)；
[0162] g)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)；
[0163] h)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)；
[0164] i)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)；
[0165] j)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2；4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)；
[0166] k)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)；
[0167] l)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)；香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)；
[0168] m)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)；
[0169] n)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)；
[0170] o)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)；
[0171] p)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2)；和
[0172] q)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)。
[0173] 在一些方面，在不存在所述核酸时，所述细菌不表达所述酶。在一些方面，所述细菌在厌氧条件下表达所述酶。
[0174] 一个实施方案提供可在一氧化碳营养型产乙酸的细菌中复制的质粒。质粒包含编码甲羟戊酸途径或DXS途径或萜烯生物合成途径中的酶的核酸，由此当质粒处于所述细菌中时，由所述细菌表达所述酶。此酶选自：
[0175] a)硫解酶(EC 2.3.1.9)；
[0176] b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)；
[0177] c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)；
[0178] d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)；
[0179] e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)；
[0180] f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)；
[0181] g)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)；
[0182] h)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)；
[0183] i)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)；
[0184] j)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2；4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)；
[0185] k)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)；
[0186] l)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)；香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)；
[0187] m)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)；
[0188] n)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)；
[0189] o)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)；
[0190] p)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2)；和
[0191] q)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)。
[0192] 在另一实施方案中提供用于将CO和/或CO2转化成异戊二烯的方法。此方法包括：将含CO和/或含CO2的气态底物传递到容纳有在培养基中的一氧化碳营养型产乙酸的细菌的培养物的生物反应器中以使得细菌将CO和/或CO2转化成异戊二烯，且自生物反应器回收异戊二烯。一氧化碳营养型产乙酸的细菌是经过遗传改造的来表达异戊二烯合酶。
[0193] 另一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码异戊二烯合酶的核酸。细菌表达异戊二烯合酶且细菌能够将二甲基烯丙基二磷酸转化成异戊二烯。在一方面，异戊二烯合酶是美洲山杨(Populus tremuloides)酶。在另一方面，核酸是经过密码子优化。在又一方面，异戊二烯合酶的表达是在来自自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶基因的启动子的转录控制下。
[0194] 另一实施方案提供用于将CO和/或CO2转化成异戊烯基二磷酸(IPP)的方法。此方法包括：将含CO和/或含CO2的气态底物传递到容纳有在培养基中的一氧化碳营养型产乙酸的细菌的培养物的生物反应器中以使得细菌将CO和/或CO2转化成异戊烯基二磷酸(IPP)，且自生物反应器回收IPP。一氧化碳营养型产乙酸的细菌是经过遗传改造的来表达异戊烯基二磷酸δ异构酶。
[0195] 又一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码异戊烯基二磷酸δ异构酶的核酸。细菌表达异戊烯基二磷酸δ异构酶且细菌能够将二甲基烯丙基二磷酸转化成异戊烯基二磷酸。在一些方面，核酸编码拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)异戊烯基二磷酸δ异构酶。在其它方面，核酸是在来自自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶基因的启动子的转录控制下。又在其它方面，核酸是在来自自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶基因的启动子的转录控制下且位于编码异戊二烯合酶的第二核酸的下游。
[0196] 又一实施方案提供一种用于将CO和/或CO2转化成异戊烯基二磷酸(IPP)和/或异戊二烯的方法。此方法包括：将含CO和/或含CO2的气态底物传递到容纳有在培养基中的一氧化碳营养型产乙酸的细菌的培养物的生物反应器中以使得细菌将CO和/或CO2转化成异戊烯基二磷酸(IPP)和/或异戊二烯，且自生物反应器回收IPP和/或异戊二烯。一氧化碳营养型产乙酸的细菌是经过遗传改造的以具有拷贝数增加的编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)酶的核酸，其中所述增加的拷贝数为大于1/基因组。
[0197] 又一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含拷贝数大于1/基因组的编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)酶的核酸。在一些方面，经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌可还包含编码异戊二烯合酶的核酸。在其它方面，经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌可还包含编码异戊烯基二磷酸δ异构酶的核酸。又在其它方面，经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌可还包含编码异戊烯基二磷酸δ异构酶的核酸和编码异戊二烯合酶的核酸。
[0198] 另一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的核酸。细菌表达所编码的酶且所述酶并非此细菌天然具有的。在一些方面，所述酶是金黄色葡萄球菌(Staphyloco ccus aureus)酶。在一些方面，所述酶是在一个或多个自产乙醇梭菌启动子的控制下进行表达。在一些方面，所述细菌还包含编码硫解酶(thlA/vraB)的核酸、编码HMG-CoA合酶(HMGS)的核酸和编码HMG-CoA还原酶(HMGR)的核酸。在一些方面，硫解酶是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)硫解酶。在一些方面，细菌还包含编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)的核酸。
[0199] 又一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码α-法呢烯合酶的外源性核酸。在一些方面，核酸是经过密码子优化以供在自产乙醇梭菌中表达。在一些方面，α-法呢烯合酶是苹果(Malus×domestica)α-法呢烯合酶。在一些方面，细菌还包含编码香叶基转移酶的核酸区段。在一些方面，香叶基转移酶是大肠杆菌(E.coli)香叶基转移酶。
[0200] 用于本发明的任何方面或实施方案的合适的经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌可选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、延长布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、森林乙酸香蕉孢菌、类球鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧杆状菌。
[0201] 本发明也可以在广义上被陈述成在于本申请的说明书中个别地或共同地提及或指出的部分、元素或特征，以及在于所述部分、元素和特征的两个或多个的任意或所有组合，且其中本文提到具有本发明所属领域中的已知等效物的具体整数时，所述已知等效物被认为如同单独陈述般纳入本文中。附图说明
[0202] 在所有新颖方面应该考虑的本发明的这些和其它方面将通过以下参考附图的描述而变得显而易见，以下描述仅作为示例给出。
[0203] 图1：用于产生萜烯的途径图，本申请中描述的基因靶标是以粗体箭头突出显示。
[0204] 图2：质粒pMTL 85146-ispS的遗传图谱。
[0205] 图3：质粒pMTL 85246-ispS-idi的遗传图谱。
[0206] 图4：质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的遗传图谱。
[0207] 图5：质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的测序结果。
[0208] 图6：通过DXS和甲羟戊酸途径自CO产生萜烯的能量学比较。
[0209] 图7：甲羟戊酸途径。
[0210] 图8：确认在自产乙醇梭菌转化体中存在异戊二烯表达质粒pMTL 85246-ispS-idi的琼脂糖凝胶电泳图像。泳道1和20示出了100bp Plus DNA Ladder。泳道3至6、9至12、15至18示出了以来自4种不同克隆的分离质粒作为模板的PCR，各自按照以下次序：colE1、ermB和idi。泳道2、8和14示出了无模板的PCR作为阴性对照，各自按照以下次序：colE1、ermB和idi。泳道7、13和19示出了具有来自大肠杆菌的pMTL 85246-ispS-idi的PCR作为阳性对照，各自按照以下次序：colE1、ermB和idi。
[0211] 图9-甲羟戊酸表达质粒pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR。
[0212] 图10-异戊二烯表达质粒pMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS。
[0213] 图11-法呢烯表达质粒pMTL8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS。
[0214] 图12-质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的遗传图谱。
[0215] 图13-用携带质粒pMTL 85146-ispS的自产乙醇梭菌进行基因表达实验的扩增图。
[0216] 图14-用携带质粒pMTL 85246-ispS-idi的自产乙醇梭菌进行基因表达实验的扩增图。
[0217] 图15-用携带质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的自产乙醇梭菌进行基因表达实验的扩增图。
[0218] 图16-PCR检查质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的存在。预期条带大小1584bp。DNA标记物Fermentas 1kb DNA Ladder。
[0219] 图17-携带质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的转化自产乙醇梭菌的生长曲线。
[0220] 图18-示出基因甲羟戊酸激酶(MK SEQ ID NO:51)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK SEQ ID NO:52)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD SEQ ID NO:53)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi SEQ ID NO:54)、香叶基转移酶(ispA SEQ ID NO:56)和法呢烯合酶(FS SEQ ID NO:57)的表达的RT-PRC数据。
[0221] 图19-GC-MS检测和证实在携带pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的1mM甲羟戊酸加料(spiked)培养物中法呢烯的存在。对含有质量为93的离子的峰的扫描的GC-MS色谱图。色谱图1和2是转化的自产乙醇梭菌，3是与自产乙醇梭菌样品同时运行的β-法呢烯标准物。4是在M9葡萄糖上生长的携带质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的大肠杆菌，显示α-法呢烯产量，且5是在大肠杆菌样品时运行的β-法呢烯标准物。
大肠杆菌与自产乙醇梭菌样品的滞留时间之间的差异是由于仪器的微小变化。然而，β-法呢烯标准物和所产生的α-法呢烯的滞留时间之间的差异在两种情形下完全相同，这与质谱中的匹配一起证实在自产乙醇梭菌中产生α-法呢烯。
大肠杆菌与自产乙醇梭菌样品的滞留时间之间的差异是由于仪器的微小变化。然而，β-法呢烯标准物和所产生的α-法呢烯的滞留时间之间的差异在两种情形下完全相同，这与质谱中的匹配一起证实在自产乙醇梭菌中产生α-法呢烯。
[0222] 图20-在图19中标记为1A和2A的峰的MS图谱。MS图谱与证实此峰是α-法呢烯的NIST数据库图谱(图21)匹配。
[0223] 图21-来自NIST质谱数据库的α-法呢烯的MS图谱。
具体实施方式
[0224] 下文是以广义上给出的关于本发明的描述，包括其优选的实施方案。由下文标题“实施例”下给出的公开内容进一步阐明本发明，提供了证实本发明的实验数据、本发明各个方面的具体实施例和进行本发明的方式。
[0225] 本发明人令人惊讶地能够通过发酵包含CO的底物来工程化一氧化碳营养型产乙酸的微生物从而产生萜烯及其前体，包括异戊二烯和法呢烯。这为生产这些产品提供了一种替代方式，可具有优于其目前生产方法的优势。另外，提供了使用来自工业过程的一氧化碳的方式，否则一氧化碳将释放到大气中且污染环境。
[0226] 如本文提到的“发酵液”是至少包含营养培养基和细菌细胞的培养基。
[0227] 如本文提到的“穿梭微生物”是在其中表达甲基转移酶且不同于目标微生物的微生物。
[0228] 如本文提到的“目标微生物”是在其中表达在表达构建体/载体上所包括的基因且不同于穿梭微生物的微生物。
[0229] 术语“主要发酵产物”打算意指以最高浓度和/或产率产生的一种发酵产物。
[0230] 与发酵过程相关使用的术语“增加效率”、“增加的效率”等包括(但不限于)增加以下中的一种或多种：催化发酵的微生物的生长速率、在产物浓度增加时的生长和/或产物生产速率、由每体积消耗的底物产生的所需产物的体积、所需产物的生产速率或产量水平以及所产生的所需产物与发酵的其它副产物相比的相对比例。
[0231] 短语“包含一氧化碳的底物”及类似术语应理解为包括其中一氧化碳例如可被一种或多种细菌菌株利用用于生长和/或发酵的任何底物。
[0232] 短语“包含一氧化碳的气态底物”及其类似短语和术语包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。在某些实施方案中，底物含有至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO和40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO，或约55体积％的CO，或约60体积％的CO。
[0233] 尽管底物不必要含有任何氢，但H2的存在不会对根据本发明的方法的产物形成不利。在具体实施方案中，氢的存在导致醇产生的总体效率改善。举例来说，在具体实施方案中，底物可包含大约2:1、或1:1、或1:2比率的H2:CO。在一个实施方案中，底物包含约30体积％或30体积％以下的H2、20体积％或20体积％以下的H2、约15体积％或15体积％以下的H2或，约10体积％或10体积％以下的H2。在其它实施方案中，底物流包含低浓度的H2，例如小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％、或小于1％、或基本上不含氢。底物也可例如含有一些CO2，诸如约1体积％至约80体积％的CO2，或1体积％至约30体积％的CO2。在一个实施方案中，底物包含小于或等于约20体积％的CO2。在具体实施方案中，底物包含小于或等于约15体积％的CO2、小于或等于约10体积％的CO2、小于或等于约5体积％的CO2，或基本上不含CO2。
[0234] 在下文的描述中，在递送和发酵“含有CO的气态底物”方面描述本发明的实施方案。然而应了解，可以替代形式提供气态底物。举例来说，含有CO的气态底物可溶解在液体中来提供。液体基本上是由含有一氧化碳的气体饱和且然后将此液体加入生物反应器中。这可以使用标准方法来实现。举例来说，可以使用微泡分散液产生器(Hensirisak等人，Scale-up of microbubbl e dispersion generator for aerobic fermentation；
Applied Biochemistry and Biotechnology第101卷，第3期/2002年10月)。进一步举例来说，含有CO的气态底物可被吸收到固体支撑物上。这些替代方法是通过使用术语“含有CO的底物”等所涵盖。
Applied Biochemistry and Biotechnology第101卷，第3期/2002年10月)。进一步举例来说，含有CO的气态底物可被吸收到固体支撑物上。这些替代方法是通过使用术语“含有CO的底物”等所涵盖。
[0235] 在本发明的特别实施方案中，含有CO的气态底物是工业尾气或废气。“工业废气或尾气”应被广泛地认为包括由工业过程产生的包含CO的任何气体且包括由以下产生的气体：铁金属产品制造、非铁产品制造、石油提炼过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、碳黑生产和焦炭制造。其它例子可在本文其它处提供。
[0236] 除非上下文中另外要求，否则如本文所用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等打算涵盖此过程的生长阶段和产物的生物合成阶段。如本文中将进一步描述，在一些实施方案中，生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，向发酵反应中加入金属或组合物应理解为包括加入到这些反应器的任一者或两者中。
[0237] 术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管路布置组成的发酵装置，包括连续搅拌槽式反应器(Continuous Stirred Tank Reactor，CSTR)、固定化细胞反应器(Immobilized Cell Reactor，ICR)、滴流床反应器(Trickle Bed Reactor，TBR)、鼓泡塔(Bubble Column)、气体提升发酵器(Gas Lift Fermenter)、静态混合器(Static Mixer)或适合气液接触的其它容器或其它装置。在一些实施方案中，生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到向生物反应器或发酵反应中加入底物时，应理解为包括适当时加入到这些反应器的任一者或两者中。
[0238] “外源性核酸”是来自引入其的微生物外部的核酸。外源性核酸可源自任何适当的来源，包括(但不限于)将引入其的微生物(例如，在产生重组微生物的亲本微生物中)、与将引入其的生物体不同的微生物的菌株或物种，或其可通过人为或重组方法产生。在一个实施方案中，外源性核酸代表在将引入其的微生物中天然存在的核酸序列，且引入其以增加特定基因的表达或过度表达特定基因(例如，通过增加序列(例如基因)的拷贝数或引入强的或组成型的启动子来增加表达)。在另一个实施方案中，外源性核酸代表并非在将引入其的微生物中天然存在的核酸序列，且允许表达并非在所述微生物中天然存在的产物或增加所述微生物天然包含的基因的表达(例如，在引入诸如启动子的调节元件的情形下)。外源性核酸可被改造为适合于整合入将引入其的微生物的基因组中或保持染色体外的状态。
[0239] “外源性”也可以用来指蛋白。这是指产生重组微生物的亲本微生物中不存在的蛋白。
[0240] 如本文中与重组微生物和核酸或蛋白关联使用的术语“内源性”是指在产生重组微生物的亲本微生物中存在的任何核酸或蛋白。
[0241] 应了解，可使用序列与本文特别例示的序列不同、但只要其功能基本相同的核酸来实施本发明。对于编码蛋白或肽的核酸序列来说，这意味着所编码的蛋白或肽具有基本上相同的功能。对于代表启动子序列的核酸序列来说，变体序列将具有促进一种或多种基因的表达的能力。所述核酸在本文中可称为“功能等效变体”。举例来说，核酸的功能等效变体包括等位基因变体、基因片段、包括突变(缺失、插入、核苷酸取代等等)和/或多态性的基因等等。来自其它微生物的同源基因也可以被认为是本文中特别例示的序列的功能等效变体的例子。这些同源基因包括诸如以下种中的同源基因：丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)，其详情在诸如Genbank或NCBI的网站上公开可得。短语“功能等效变体”也应被认为包括由于针对特别的生物体的密码子优化而发生序列变化的核酸。本文的核酸的“功能等效变体”将优选地与所识别的核酸具有至少约70％、优选约80％、更优选约85％、优选约90％、优选约95％或95％以上的核酸序列同一性。
[0242] 还应了解，可使用序列与本文特别例示的氨基酸序列不同的多肽来实践本发明。这些变体在本文中可称为“功能等效变体”。蛋白或肽的功能等效变体包括这样的蛋白或肽：即其与所识别的蛋白或肽共享至少40％、优选50％、优选60％、优选70％、优选75％、优选80％、优选85％、优选90％、优选95％或95％以上的氨基酸同一性，且与目的肽或蛋白具有基本上相同的功能。所述变体在其范畴内包括蛋白或肽的片段，其中所述片段包含以下截短形式的多肽：其中可缺失1至5个、至10个、至15个、至20个、至25个氨基酸且可在多肽的任一末端自残基1延伸至25，以及其中可在此区内缺失任意长度；或可位于内部位置。本文所述特定多肽的功能等效变体也应该认为包括由例如前一段落中所例示的其它细菌种中的同源基因表达的多肽。
[0243] 如本文所用的“基本上相同功能”打算意指作为核酸或多肽变体的核酸或多肽能执行所述核酸或多肽的功能。举例来说，本发明的酶的变体将能够与此酶催化相同的反应。然而，不应认为意指变体与产生所述变体的多肽或核酸具有相同水平的活性。
[0244] 人们能够使用任意数量的已知方法来估计功能等效变体是否与产生所述变体的核酸或多肽具有基本上相同的功能。然而，举例来说，Silver等人(1991,Plant Physiol.97:1588-1591)或Zhao等人(2011,Appl Microbiol Biotechnol,90:1915-1922)描述了关于异戊二烯合酶的方法、Green等人(2007,Phytochemistry；68:176-188)描述了关于法呢烯合酶的方法、Kuzuyama等人(2000,J.Bacteriol.182,891-897)描述了关于1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶Dxs的方法、Berndt和Schlegel(1975,Arch.Microbiol.103,21-30)或Stim-Herndon等人(1995,Gene 154:81-85)描述了关于硫解酶的方法、Cabano等人(1997,Insect Biochem.Mol.Biol.27:499-505)描述了关于HMG-CoA合酶的方法、Ma等人(2011,Metab.Engin.,13:588-597)描述了关于HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶的方法、Herdendorf和Miziorko(2007,Biochemistry,46:11780-8)描述了关于磷酸甲羟戊酸激酶的方法以及Krepkiy等人(2004,Protein Sci.13:1875-1881)描述了关于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的方法。也可能如Trutko等人(2005,Microbiology 74:153-158)所述使用如膦胺霉素(fosmidomycin)或美舒林(mevinoline)的抑制剂来识别DXS和甲羟戊酸途径的基因。
[0245] “过度表达(Over-express)”、“过度的表达(over expression)”等术语和短语在用于本发明时应被广义地认为包括与亲本微生物的蛋白(包括核酸)在相同条件下的表达水平相比，一种或多种蛋白的表达(包括一种或多种编码所述蛋白的核酸的表达)的任意增加。不应认为意指以任何特定水平表达所述蛋白(或核酸)。
[0246] “亲本微生物”是用于产生本发明的重组微生物的微生物。亲本微生物可为天然存在的微生物(即，野生型微生物)或先前经过修饰但不表达或不过度表达作为本发明主题的一种或多种酶的微生物。因此，本发明的重组微生物可经修饰来表达或过度表达一种或多种未在亲本微生物中表达或过度表达的酶。
[0247] 术语核酸“构建体”或“载体”等术语应被广义地认为包括适合用作用于将遗传物质转移至细胞中的载体的任何核酸(包括DNA和RNA)。术语应被认为包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在一个具体实施方案中，构建体或载体被改造为适合于允许表达一种或多种由所述构建体或载体编码的基因。核酸构建体或载体包括裸核酸以及与一种或多种试剂一起配制以有利于递送至细胞的核酸(例如，脂质体缀合的核酸，含有所述核酸的生物体)。
[0248] 如本文提到的“萜烯”应被广义地认为包括由连接在一起的C5异戊二烯单元组成的任何化合物，包括简单和复杂萜烯以及含氧萜烯化合物，诸如醇类、醛类和酮类。简单萜烯可在植物(诸如，针叶树)的精油和树脂中发现。更复杂的萜烯包括萜类化合物和维生素A、类胡萝卜素色素(诸如番茄红素)、角鲨烯和橡胶。单萜烯的例子包括(但不限于)异戊二烯、蒎烯、橙花醇、柠檬醛、樟脑、薄荷醇、柠檬烯。倍半萜烯的例子包括(但不限于)橙花叔醇、法尼醇。二萜烯的例子包括(但不限于)植醇、维生素A1。角鲨烯是三萜烯的例子且胡萝卜素(原维生素A1)是四萜烯。
[0249] “萜烯前体”是在由乙酰基CoA和任选的丙酮酸开始形成萜烯的反应期间产生的化合物或中间体。此术语是指在甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中发现的前体化合物或中间体以及较长链萜烯的下游前体，诸如FPP和GPP。在具体实施方案中，包括(但不限于)甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、香叶基焦磷酸(GPP)和法呢基焦磷酸(FPP)。
[0250] “DXS途径”是由丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸至DMAPP或IPP的酶促途径。也称为脱氧木酮糖5-磷酸(DXP/DXPS/DOXP或DXS)/甲基赤藻糖醇磷酸(MEP)途径。
[0251] “甲羟戊酸(MVA)途径”是由乙酰基-CoA至IPP的酶促途径。
[0252] 微生物
[0253] 已知两种产生萜烯的途径，由丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸(G3P)(这是糖酵解中的两种重要中间体)开始的脱氧木酮糖5-磷酸(DXP/DXPS/DOXP或DXS)/甲基赤藻糖醇磷酸(MEP)途径(Hunter等人,2007,J.Biol.chem.282:21573-77)，和由乙酰基-CoA开始的甲羟戊酸(MVA)途径(Miziorko,2011,Arch Biochem Biophys,505:131-143)。已研究许多不同种类的微生物中是否存在任一所述途径(Lange等人,2000,PNAS,97:13172-77；Trutko等人,2005,Microbiology,74:153-158；Julsing等人,2007,Appl Microbiol Biotechnol,75:1377-84)，但并非一氧化碳营养型产乙酸菌。例如发现在大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus)或分枝杆菌(Mycobacterium)中存在DXS途径，而在酵母酵母菌
(Saccharomyces)、绿曲挠菌(Cloroflexus)或粘球菌(Myxococcus)中存在甲羟戊酸途径。
(Saccharomyces)、绿曲挠菌(Cloroflexus)或粘球菌(Myxococcus)中存在甲羟戊酸途径。
[0254] 本发明人分析一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌、杨氏梭菌的基因组是否存在两种途径中的任一种。在自产乙醇梭菌和杨氏梭菌中识别到DXS途径的所有基因(表1)，而不存在甲羟戊酸途径。另外，尚不知诸如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌的一氧化碳营养型产乙酸菌产生任何萜烯作为代谢最终产物。
[0255] 表1：在自产乙醇梭菌和杨氏梭菌中识别的DXS途径的萜烯生物合成基因：
[0256]
[0257] 在两种生物体中也识别到自异戊二烯单元下游合成萜烯的基因(表2)。
[0258]
[0259]
[0260] 萜烯是能量密集型化合物，且其合成需要细胞以三磷酸核苷(诸如ATP)的形式投入能量。使用糖作为底物需要由糖酵解供应足够的能量以产生几个分子的ATP。通过使用糖作为底物的DXS途径进行的萜烯和/或其前体生产是由于丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸(G3P)的可用性而以相对直接的方式进行，G3P来源于C5戊糖和C6己糖。这些C5和C6分子因此被相对容易地转化成构成萜烯的C5异戊二烯单元。
[0261] 对于使用如CO或CO2的C1底物的厌氧产乙酸菌来说，更难由C1单元合成诸如半萜类化合物的长分子。对于如C10单萜烯、C15倍半萜烯或C40四萜烯的较长链萜烯来说尤其如此。迄今为止，在产乙酸菌(天然和重组生物体)中报道的具有最多碳原子的产物是C4化合物丁醇( 等人,2011,Curr.Opin.Biotechnol.22:320-325；Schiel-Bengelsdorf和Dürre,2012,FEBS Letters:10.1016/j.febslet.2012.04.043； 等人,2011,Proc.Nat.Sci.U.S.A.107:13087-92；美国专利2011/0236941)和2,3-丁二醇( 等人,
2011,Appl.Environ.Microbiol.77:5467-75)。本发明人已证实，可能令人惊讶地使用C1原料CO通过乙酰基CoA中间体以厌氧方法产生这些较长链得萜烯分子。
2011,Appl.Environ.Microbiol.77:5467-75)。本发明人已证实，可能令人惊讶地使用C1原料CO通过乙酰基CoA中间体以厌氧方法产生这些较长链得萜烯分子。
[0262] 厌氧产乙酸菌的Wood-Ljungdahl途径的能量学是刚刚兴起的，但与在需氧生长条件下或糖发酵生物体的糖酵解不同，在Wood-Ljungdahl途径中通过底物水平的磷酸化作用未获得ATP，实际上，将CO2活化为甲酸盐实际上需要一分子的ATP且需要膜梯度。本发明人注意到，重要的是用于形成产物的途径是节能的。本发明人注意到，在产乙酸菌中，底物CO或CO2被直接引入乙酰基-CoA中，这代表了产生萜烯和/或其前体的最直接途径，尤其在与糖基系统比较时，只需要六次反应(图1)。尽管在一氧化碳营养型产乙酸菌中可用较少的ATP，但本发明人相信这种更直接的途径可维持更高的代谢通量(由于中间体反应的较高化学动力)。高度有效的代谢通量是重要的，因为萜烯生物合成途径中的几种中间体(诸如重要中间体甲羟戊酸和FPP)在未被有效代谢回转时对大多数细菌有毒。
[0263] 尽管具有较高的ATP可用性，但此中间体毒性问题可成为由糖生产萜烯的瓶颈。
[0264] 在比较通过甲羟戊酸途径和DXS途径由CO生产萜烯前体IPP和DMAPP的能量学时(图6)，本发明人注意到甲羟戊酸途径与DXS途径相比需要较少的三磷酸核苷作为ATP、较少的还原当量而且也更直接，由乙酰基-CoA开始只有六个必要的反应步骤。这在反应速度和代谢通量方面提供了优势且增加了总体能量效率。另外，所需酶的较少数量简化了产生重组微生物所需的重组方法。
[0265] 未识别到具有甲羟戊酸途径的产乙酸菌，但本发明人已证实，可能向诸如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌的一氧化碳营养型产乙酸菌中引入甲羟戊酸途径和任选的DXS途径以由C1碳底物CO有效产生萜烯和/或其前体。预期此可适用于所有一氧化碳营养型产乙酸的微生物。
[0266] 另外，尚未证实可能使用重组微生物在厌氧条件下产生萜烯和/或其前体。厌氧产生异戊二烯具有提供更安全的操作环境的优势，因为异戊二烯在氧气存在下极易燃且在室温和大气压力下具有1.5-2.0％的可燃下限(LFL)和2.0-12％的可燃上限(UFL)。由于在不存在氧气时无法发生燃烧，因此本发明人相信厌氧发酵方法是合乎需要的，因为它在所有产物浓度、气体组成、温度和压力范围内将更安全。
[0267] 如前文论述，本发明提供能够通过发酵包含CO的底物产生一种或多种萜烯和/或其前体以及任选的一种或多种其它产物的重组微生物。
[0268] 在另一个实施方案中，将微生物改造为适合于：
[0269] 表达来自甲羟戊酸(MVA)途径的一种或多种外源性酶和/或过度表达来自甲羟戊酸(MVA)途径的一种或多种内源性酶；和
[0270] a)表达来自DXS途径的一种或多种外源性酶和/或过度表达来自DXS途径的一种或多种内源性酶。
[0271] 在一个实施方案中，产生重组微生物的亲本微生物能够发酵包含CO的底物而产生乙酰基CoA，但无法使乙酰基CoA转化成甲羟戊酸或异戊烯基焦磷酸(IPP)，且将重组微生物改造为适合于表达在甲羟戊酸途径中所涉及的一种或多种酶。
[0272] 微生物可被改造为适合于通过任意数量重组方法来表达或过度表达一种或多种酶，所述重组方法包括例如增加所述微生物中天然基因的表达(例如，通过引入更强或组成型的启动子来驱动基因的表达)、通过引入编码特定酶且被改造为适合于表达此酶的外源性核酸来增加编码此酶的基因的拷贝数、引入编码并非在亲本微生物中天然存在的酶且被改造为适合于表达此酶的外源性核酸。
[0273] 在一个实施方案中，所述一种或多种酶来自甲羟戊酸(MVA)途径且选自：
[0274] a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
[0275] b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
[0276] c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
[0277] d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
[0278] e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
[0279] f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)，和
[0280] g)它们的任一种的功能等效变体。
[0281] 在另一个实施方案中，任选的一种或多种酶来自DXS途径且选自：
[0282] a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
[0283] b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
[0284] c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、[0285] d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、[0286] e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
[0287] f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
[0288] g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
[0289] h)它们的任一种的功能等效变体。
[0290] 在另一个实施方案中，一种或多种外源性或内源性的其它酶被表达或过度表达以导致产生萜烯化合物和/或其前体，其中所表达的外源性酶或过度表达的内源性酶选自：
[0291] a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)、
[0292] b)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)、
[0293] c)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)、
[0294] d)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)、
[0295] e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC EC 5.3.3.2)、
[0296] f)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)，和
[0297] g)它们的任一种的功能等效变体。
[0298] 只举例来说，每种酶的序列信息列在本文的图中。
[0299] 在本发明的微生物中使用的酶可来源于任何适当来源，包括不同的细菌属和物种或其它生物体。然而，在一个实施方案中，所述酶源自金黄色葡萄球菌。
[0300] 在一个实施方案中，酶异戊二烯合酶(ispS)来源于山杨(Poplar tremuloides)。在另一个实施方案中，其具有下文SEQ ID NO:21中例示的核酸序列或是其功能等效变体。
[0301] 在一个实施方案中，酶脱氧木酮糖5-磷酸合酶来源于自产乙醇梭菌，由下文SEQ ID NO:1中例示的核酸序列编码和/或具有下文SEQ ID NO:2中例示的氨基酸序列，或是其功能等效变体。
[0302] 在一个实施方案中，酶1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:3中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0303] 在一个实施方案中，酶2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:5中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0304] 在一个实施方案中，酶4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:7中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0305] 在一个实施方案中，酶2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:9中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0306] 在一个实施方案中，酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:11中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0307] 在一个实施方案中，酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:13中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0308] 在一个实施方案中，酶甲羟戊酸激酶(MK)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:51中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0309] 在一个实施方案中，酶磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:52中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0310] 在一个实施方案中，酶二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:53中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0311] 在一个实施方案中，酶异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)来源于拜氏梭菌且由下文SEQ ID NO:54中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0312] 在一个实施方案中，酶硫解酶(thIA)来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824且由下文SEQ ID NO:40中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0313] 在一个实施方案中，酶是硫解酶，且是来源于金黄色葡萄球菌亚种金黄色类群Mu50的乙酰基-CoA c-乙酰基转移酶(vraB)且由下文SEQ ID NO:41中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0314] 在一个实施方案中，酶3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMGS)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:42中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0315] 在一个实施方案中，酶羟基甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGR)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:43中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0316] 在一个实施方案中，酶香叶基转移酶(ispA)来源于大肠杆菌菌株(Escherichia coli str.)K-12亚菌株(substr)MG1655，由下文SEQ ID NO:56中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0317] 在一个实施方案中，酶七异戊烯基二磷酸合酶来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:17中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0318] 在一个实施方案中，酶聚异戊烯基合酶来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:19中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0319] 在一个实施方案中，酶α-法呢烯合酶(FS)来源于苹果且由下文SEQ ID NO:57中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0320] 可通过本领域技术人员已知的测定法来识别在微生物中使用的酶和功能变体。在具体实施方案中，可通过Silver等人(1991,Plant Physiol.97:1588-1591)或Zhao等人(2011,Appl Microbiol Biotechnol,90:1915-1922)概述的方法来识别酶异戊二烯合酶。在另一具体实施方案中，可通过Green等人,2007,Phytochemistry；68:176-188中概述的方法来识别酶法呢烯合酶。在其它具体实施方案中，可通过Cabano等人(1997,Insect Biochem.Mol.Biol.27:499-505)关于HMG-CoA合酶、Ma等人(2011,Metab.Engin.,13:588-
597)关于HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶、Herdendorf和Miziorko(2007,Biochemistry,
46:11780-8)关于磷酸甲羟戊酸激酶以及Krepkiy等人(2004,Protein Sci.13:1875-1881)关于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶所概述的方法来识别来自甲羟戊酸途径的酶。Ma等人,2011,Metab.Engin.,13:588-597。可使用Kuzuyama等人(2000,J.Bacteriol.182,891-897)中概述的方法来测定DXS途径的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶。也可能如Trutko等人(2005,Microbiology 74:153-158)所述使用如膦胺霉素或美舒林的抑制剂来识别DXS和甲羟戊酸途径的基因。
597)关于HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶、Herdendorf和Miziorko(2007,Biochemistry,
46:11780-8)关于磷酸甲羟戊酸激酶以及Krepkiy等人(2004,Protein Sci.13:1875-1881)关于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶所概述的方法来识别来自甲羟戊酸途径的酶。Ma等人,2011,Metab.Engin.,13:588-597。可使用Kuzuyama等人(2000,J.Bacteriol.182,891-897)中概述的方法来测定DXS途径的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶。也可能如Trutko等人(2005,Microbiology 74:153-158)所述使用如膦胺霉素或美舒林的抑制剂来识别DXS和甲羟戊酸途径的基因。
[0321] 在一个实施方案中，微生物包含被改造为适合于增加一种或多种内源性核酸的表达的一种或多种外源性核酸，且所述一种或多种内源性核酸编码前文提到的一种或多种酶。在一个实施方案中，被改造为适合于增加表达的一种或多种外源性核酸是调节元件。在一个实施方案中，调节元件是启动子。在一个实施方案中，启动子是优选地在适当发酵条件下具有高度活性的组成型启动子。也可以使用诱导型启动子。在优选的实施方案中，启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。本领域技术人员将了解，可指导表达，优选地是在适当发酵条件下的高水平表达的其它启动子将有效作为所例示实施方案的替代方案。
[0322] 在一个实施方案中，微生物包含编码前文提到的一种或多种所述酶且被改造为适合于表达所述酶的一种或多种外源性核酸。在一个实施方案中，微生物包含编码至少两种所述酶且被改造为适合于表达所述酶的一种或多种外源性核酸。在其它实施方案中，微生物包含编码至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或九种以上所述酶且被改造为适合于表达所述酶的一种或多种外源性核酸。
[0323] 在一个具体实施方案中，微生物包含编码本发明的酶或其功能等效变体的一种或多种外源性核酸。
[0324] 微生物可包含一种或多种外源性核酸。当需要用两个或两个以上遗传元件(诸如基因或调节元件(例如启动子))转化亲本微生物时，它们可被包含在一种或多种外源性核酸上。
[0325] 在一个实施方案中，所述一种或多种外源性核酸是核酸构建体或载体，在一个具体实施方案中是编码任何组合形式的一种或多种前文提到的酶的质粒。
[0326] 外源性核酸在亲本微生物转化时可保持在染色体外，或可整合到亲本微生物的基因组中。因此，其可包括被改造为适合于辅助整合的额外核苷酸序列(例如，允许同源重组和靶向整合到宿主基因组中的区域)或被改造为适合于表达以及复制染色体外构建体的额外核苷酸序列(例如，复制起点、启动子和其它调节元件或序列)。
[0327] 在一个实施方案中，编码如前文提到的一种或多种酶的外源性核酸将还包含被改造为适合于促进由外源性核酸编码的一种或多种酶的表达的启动子。在一个实施方案中，启动子是优选地在适当发酵条件下具有高度活性的组成型启动子。也可以使用诱导型启动子。在优选的实施方案中，启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇和磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。本领域技术人员将了解，可指导表达，优选是在适当发酵条件下的高水平表达的其它启动子将有效作为所例示实施方案的替代方案。
[0328] 在一个实施方案中，外源性核酸是表达质粒。
[0329] 在一个具体实施方案中，亲本微生物选自一氧化碳营养型产乙酸的细菌。在某些实施方案中，微生物选自：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、延长布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、森林乙酸香蕉孢菌、类球鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧杆状菌。
[0330] 在一个具体实施方案中，亲本微生物选自产乙醇、产乙酸的梭菌属的簇，包含种自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌以及相关分离株。这些包括(但不限于)菌株自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)[Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351]、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)[Simpson SD,Forster RL,Tran PT,Rowe MJ,Warner IL:Novel bacteria and methods thereof.国际专利2009,WO/2009/064200]、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETCT(DSM13528＝ATCC 55383)[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236]、杨氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)[Gaddy JL:Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases.美国专利1997,5,593,886]、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth.美国专利,2002,6,368,819]、杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth.美国专利,2002,6,368,819]、拉氏梭菌P11T(ATCC BAA-622)[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO 2008/
028055]、相关分离株(诸如“C.coskatii”[Zahn等人-Novel ethanologenic species Clostridium coskatii(美国专利申请号US20110229947)]和“梭菌属种(Clostridium sp.)”(Tyurin等人,2012,J.Biotech Res.4:1-12))，或突变菌株(诸如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii.PhD论文，北卡罗莱纳州立大学(North Carolina State University),2010))。这些菌株形成梭菌属rRNA簇I中的亚簇，且其16S rRNA基因具有99％以上的同一性，及类似的约30％的低GC含量。然而，DNA-DNA重新缔合和DNA指纹实验证实这些菌株属于不同的种[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO 2008/028055]。
028055]、相关分离株(诸如“C.coskatii”[Zahn等人-Novel ethanologenic species Clostridium coskatii(美国专利申请号US20110229947)]和“梭菌属种(Clostridium sp.)”(Tyurin等人,2012,J.Biotech Res.4:1-12))，或突变菌株(诸如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii.PhD论文，北卡罗莱纳州立大学(North Carolina State University),2010))。这些菌株形成梭菌属rRNA簇I中的亚簇，且其16S rRNA基因具有99％以上的同一性，及类似的约30％的低GC含量。然而，DNA-DNA重新缔合和DNA指纹实验证实这些菌株属于不同的种[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO 2008/028055]。
[0331] 此簇的所有种具有类似的形态和大小(对数生长细胞在0.5-0.7x 3-5μm之间)，是嗜温性的(最佳生长温度在30至37℃之间)且严格的厌氧菌[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236；Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351；Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO 2008/028055]。此外，其全部共有相同的主要系统发育特征，诸如相同的pH范围(pH 4-7.5，最佳的初始pH为5.5至6)，以含CO气体的强烈自养生长(具有类似的生长速率)，以及类似的代谢分布，以乙醇和乙酸作为主要的发酵最终产物且在某些条件下形成小量2,3-丁二醇和乳酸[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236；Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351；Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO
2008/028055]。对于所有三种物种也观察到产生吲哚。然而，所述物种的不同在于各种糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的底物使用。此外，发现一些物种对某些维生素(例如，硫胺素、生物素)存在营养缺陷，而其它物种则不存在营养缺陷。
2008/028055]。对于所有三种物种也观察到产生吲哚。然而，所述物种的不同在于各种糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的底物使用。此外，发现一些物种对某些维生素(例如，硫胺素、生物素)存在营养缺陷，而其它物种则不存在营养缺陷。
[0332] 在一个实施方案中，亲本一氧化碳营养型产乙酸的微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、粘液丁酸杆菌(Butyribacterium limosum)、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、延长布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧杆状菌。
[0333] 在第一或第二方面的一个特别实施方案中，亲本微生物选自包含以下的一氧化碳营养型梭菌属：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌。
[0334] 在一个实施方案中，微生物选自包含以下种的一氧化碳营养型梭菌属的簇：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和“拉氏梭菌”以及相关分离株。这些梭菌包括(但不限于)菌株自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)(Abrini,Naveau,&Nyns,1994)、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETCT(DSM13528＝ATCC 55383)(Tanner,Miller,&Yang,1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886)、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6,368,819)、杨氏梭菌O-52T(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)或“拉氏梭菌P11“(ATCC BAA-622)(WO 2008/
028055)，以及相关分离株(诸如“C.coskatii”(美国专利2011/0229947)、“梭菌属种MT351”(Michael Tyurin&Kiriukhin,2012))及其突变菌株(诸如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol fr om Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii.PhD论文，北卡罗莱纳州立大学，2010))。
028055)，以及相关分离株(诸如“C.coskatii”(美国专利2011/0229947)、“梭菌属种MT351”(Michael Tyurin&Kiriukhin,2012))及其突变菌株(诸如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol fr om Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii.PhD论文，北卡罗莱纳州立大学，2010))。
[0335] 这些菌株形成梭菌属rRNA簇I中的亚簇(Collins等人，1994)，其在16S rRNA基因水平上具有至少99％的同一性，但是如由DNA-DNA重新缔合和DNA指纹实验所确定是不同的物种(WO 2008/028055，美国专利2011/0229947)。
[0336] 此簇的菌株是由共同特征来定义，具有类似的基因型和表型，且其全部共有相同的能量守恒和发酵性代谢模式。此簇的菌株缺少细胞色素且通过Rnf复合物保存能量。
[0337] 此簇的所有菌株都具有约4.2MBp的基因组大小( 等人,2010)和约32％mol的GC组成(Abrini等人,1994； 等人,2010；Tanner等人,1993)(WO 2008/028055；美国专利2011/0229947)，以及编码以下酶的保守性的必需关键基因操纵子：Wood-Ljungdahl途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰基-CoA合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合物(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶、醛:铁氧化还原蛋白氧化还原酶( 等人,2010,2011)。已发现负责气体吸收的Wood-Ljungdahl途径基因的组成和数量在所有物种中都相同，但核酸和氨基酸序列不同( 等人,2011)。
[0338] 菌株全部具有类似的形态和大小(对数生长细胞在0.5-0.7x 3-5μm之间)，是嗜温性的(最佳生长温度在30至37℃之间)且严格的厌氧菌(Abrini等人,1994；Tanner等人,1993)(WO 2008/028055)。此外，其全部共有相同的主要系统发育特征，诸如相同的pH范围(pH 4-7.5，最佳的初始pH为5.5至6)，以含CO气体的强烈自养生长(具有类似的生长速率)，和代谢分布，以乙醇和乙酸作为主要的发酵最终产物且在某些条件下形成小量2,3-丁二醇和乳酸(Abrini等人,1994； 等人,20121；Tanner等人,1993)。然而，所述物种的不同在于各种糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的底物使用。发现一些物种对某些维生素(例如，硫胺素、生物素)存在营养缺陷，而其它物种则不存在营养缺陷。已证实在许多这些生物体中羧酸被还原成其相应的醇(Perez,Richter,Loftus,&Angenent,2012)。
[0339] 因此，所述特征并非是如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌的一种生物体所特有，而是一氧化碳营养型乙醇合成的梭菌属的共同特征。因此，可预期本发明适用于所有这些菌株，尽管在性能方面可能存在差异。
[0340] 可使用本领域中已知的用于产生重组微生物的任意数量的技术，由亲本一氧化碳营养型产乙酸的微生物和一种或多种外源性核酸来制备本发明的重组的一氧化碳营养型产乙酸的微生物。仅举例来说，可通过电穿孔、电融合、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、接合或化学和天然感受态来实现转化(包括转导或转染)。合适的转化技术例如在Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989中描述。
[0341] 电穿孔已被记载用于以下数种一氧化碳营养型产乙酸菌：如杨氏梭菌( 等人,2010；Leang,Ueki,Nevin,&Lovley,2012)(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、自产乙醇梭菌(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、伍氏醋酸杆菌( Sauer,Kuhn,&Dürre,1994)或热醋穆尔氏菌(Kita等人,2012)，且其是在诸如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(Mermelstein,Welker,Bennett,&Papoutsakis,1992)、解纤维梭菌(C.cellulolyticum)(Jennert,Tardif,Young,&Young,2000)或热纤梭菌
(C.thermocellum)(MV Tyurin,Desai,&Lynd,2004)的多种梭菌属(Clostridia)中使用的标准方法。
(C.thermocellum)(MV Tyurin,Desai,&Lynd,2004)的多种梭菌属(Clostridia)中使用的标准方法。
[0342] 电融合已被记载用于产乙酸梭菌属种MT351(Tyurin和Kiriukhin,2012)。
[0343] 原噬菌体诱导已被记载用于一氧化碳营养型产乙酸菌以及在粪味梭菌(C.scatologenes)的情形下(Prasanna Tamarapu Parthasarathy,2010,Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775for Generation of Mutants,西肯塔基大学硕士项目(Masters Project Western Kentucky University))。
[0344] 接合已被记载作为选择用于产乙酸菌艰难梭菌(Clostridium difficile)(Herbert,O’Keeffe,Purdy,Elmore,&Minton,2003)和多种其它梭菌属(包括丙酮丁醇梭菌(C.acetobuylicum))(Williams,Young,&Young,1990)的方法。
[0345] 在一个实施方案中，亲本菌株使用CO作为其唯一的碳和能量来源。
[0346] 在一个实施方案中，亲本微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个具体实施方案中，微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个具体实施方案中，微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
[0347] 核酸
[0348] 本发明还提供用于产生本发明的重组微生物的一种或多种核酸或核酸构建体。
[0349] 在一个实施方案中，核酸包含编码甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中的一种或多种酶的序列，所述酶在微生物中表达时使得所述微生物可通过发酵包含CO的底物来产生一种或多种萜烯和/或其前体。在一个具体实施方案中，本发明提供编码两种或两种以上酶的核酸，所述酶在微生物中表达时使得所述微生物可通过发酵包含CO的底物来产生一种或多种萜烯和/或其前体。在一个实施方案中，本发明的核酸编码三种、四种、五种或五种以上所述酶。
[0350] 在一个实施方案中，核酸编码的一种或多种酶是来自甲羟戊酸(MVA)途径且选自：
[0351] a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
[0352] b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
[0353] c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
[0354] d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
[0355] e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
[0356] f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)，和
[0357] g)它们的任一种的功能等效变体。
[0358] 在另一个实施方案中，核酸编码的一种或多种任选的酶是来自DXS途径且选自：
[0359] a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
[0360] b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
[0361] c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、[0362] d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、[0363] e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
[0364] f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
[0365] g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
[0366] h)它们的任一种的功能等效变体。
[0367] 在另一个实施方案中，核酸编码被表达或过度表达的一种或多种其它酶以导致产生萜烯化合物和/或其前体，其中被表达的外源性酶或被过度表达的内源性酶选自：
[0368] a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)、
[0369] b)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)、
[0370] c)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)、
[0371] d)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)、
[0372] e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC EC 5.3.3.2)、
[0373] f)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)，和
[0374] g)它们的任一种的功能等效变体。
[0375] 编码上述每一种酶的例示性氨基酸序列和核酸序列在本文中被提供或可由如前文提到的GenBank获得。然而，考虑本文中所含的信息，本领域技术人员将易于了解GenBank和其它数据库中编码酶或其功能等效变体的替代核酸序列以及遗传密码。
[0376] 在另一个实施方案中，编码来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824的硫解酶(thIA)的核酸由下文SEQ ID NO:40中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0377] 在另一个实施方案中，编码硫解酶的核酸(其中硫解酶是来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的乙酰基-CoA c-乙酰基转移酶(vraB))由下文SEQ ID NO:41中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0378] 在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMGS)的核酸由下文SEQ ID NO:42中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0379] 在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的羟基甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGR)的核酸由下文SEQ ID NO:43中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0380] 在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的甲羟戊酸激酶(MK)的核酸由下文SEQ ID NO:51中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0381] 在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的核酸由下文SEQ ID NO:52中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0382] 在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)的核酸由下文SEQ ID NO:53中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0383] 在另一个实施方案中，编码来源于自产乙醇梭菌的脱氧木酮糖5-磷酸合酶的核酸由下文SEQ ID NO:1中例示的核酸序列编码和/或具有下文SEQ ID NO:2中例示的氨基酸序列或是其功能等效变体。
[0384] 在一个实施方案中，编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)的核酸具有序列SEQ ID NO:3或是其功能等效变体。
[0385] 在一个实施方案中，编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)的核酸具有序列SEQ ID NO:5或是其功能等效变体。
[0386] 在一个实施方案中，编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)的核酸具有序列SEQ ID NO:7或是其功能等效变体。
[0387] 在一个实施方案中，编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)的核酸具有序列SEQ ID NO:9或是其功能等效变体。
[0388] 在一个实施方案中，编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)的核酸具有序列SEQ ID NO:11或是其功能等效变体。
[0389] 在一个实施方案中，编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)的核酸具有序列SEQ ID NO:13或是其功能等效变体。
[0390] 在另一个实施方案中，编码来源于大肠杆菌菌株K-12亚菌株MG1655的香叶基转移酶(ispA)的核酸由下文SEQ ID NO:56中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0391] 在一个实施方案中，编码七异戊烯基二磷酸合酶的核酸具有序列SEQ ID NO:17或是其功能等效变体。
[0392] 在一个实施方案中，编码八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)的核酸(其中八异戊烯基二磷酸合酶是聚异戊烯基合成酶)由序列SEQ ID NO:19编码或是其功能等效变体。
[0393] 在一个实施方案中，编码来源于山杨的异戊二烯合酶(ispS)的核酸在下文SEQ ID NO:21中例示或是其功能等效变体。
[0394] 在另一个实施方案中，编码来源于拜氏梭菌的异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)的核酸由下文SEQ ID NO:54中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0395] 在另一个实施方案中，编码来源于苹果的α-法呢烯合酶(FS)的核酸由下文SEQ ID NO:57中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
[0396] 在一个实施方案中，本发明的核酸将还包含启动子。在一个实施方案中，启动子允许在其控制下的基因的组成型表达。然而，也可以采用诱导型启动子。本领域技术人员将易于了解在本发明中使用的启动子。启动子优选地可在适当发酵条件下指导高水平的表达。在一个具体实施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。在另一个实施方案中，丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子或ATP合酶操纵子启动子。在一个具体实施方案中，启动子来自自产乙醇梭菌。
[0397] 本发明的核酸在亲本微生物转化时可保持在染色体外，或可被改造为适合整合到微生物的基因组中。因此，本发明的核酸可包括被改造为适合于辅助整合的额外核苷酸序列(例如，允许同源重组和定点整合到宿主基因组中的区域)或被改造为适合于稳定表达和复制染色体外构建体的额外核苷酸序列(例如，复制起点、启动子和其它调节序列)。
[0398] 在一个实施方案中，核酸是核酸构建体或载体。在一个具体实施方案中，核酸构建体或载体是表达构建体或载体，然而本发明也涵盖其它构建体和载体，诸如用于克隆的那些。在一个具体实施方案中，表达构建体或载体是质粒。
[0399] 应了解，如果需要，本发明的表达构建体/载体除启动子以及适合表达其它蛋白的其它基因以外，还可含有任意数量的调节元件。在一个实施方案中，表达构建体/载体包括一个启动子。在另一个实施方案中，表达构建体/载体包括两个或两个以上启动子。在一个具体实施方案中，表达构建体/载体对于每个将要表达的基因包括一个启动子。在一个实施方案中，表达构建体/载体包括一个或多个核糖体结合位点，优选对于每个将要表达的基因包括一个核糖体结合位点。
[0400] 本领域技术人员应了解，本文所述的核酸序列和构建体/载体序列可含有标准接头核苷酸，诸如核糖体结合位点和/或限制位点需要的那些。所述接头序列不应被解释为是所需要的且不对所定义的序列施加限制。
[0401] 可使用本领域中标准的任意数量的技术来构建核酸和核酸构建体，包括本发明的表达构建体/载体。举例来说，可使用化学合成或重组技术。所述技术例如记载于Sambrook等人(Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)中。其它例示技术在下文实施例部分中描述。个别基因和调节元件基本上将可操作性地彼此连接以使得所述基因可被表达以形成所需蛋白。本领域技术人员将了解用于本发明的合适载体。然而，举例来说，以下载体可以是合适的：pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750和下文实施例部分中例示的质粒。
[0402] 应了解，本发明的核酸可以是任何适当的形式，包括RNA、DNA或cDNA。
[0403] 本发明还提供包含本文所述的任一种或多种核酸的宿主生物体，尤其是微生物且包括病毒、细菌和酵母。
[0404] 产生生物体的方法
[0405] 所述一种或多种外源性核酸可以裸核酸的形式递送至亲本微生物或可与一种或多种试剂一起配制以有利于转化过程(例如，脂质体缀合的核酸，其中含有核酸的生物体)。如果适当的话，一种或多种核酸可以是DNA、RNA或其组合。在某些实施方案中可使用限制性抑制剂；参考例如Murray,N.E.等人(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412)。
[0406] 可使用本领域中已知的用于产生重组微生物的任意数量技术，由亲本微生物和一种或多种外源性核酸来制备本发明的微生物。仅举例来说，可通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态或接合来实现转化(包括转导或转染)。合适的转化技术记载于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989中。
[0407] 在某些实施方案中，由于在将要转化的微生物中具有活性的限制性系统，有必要将待引入微生物中的核酸甲基化。这可以使用各种技术来进行，包括下文描述以及下文实施例部分中进一步例示的那些技术。
[0408] 举例来说，在一个实施方案中，本发明的重组微生物是由包括以下步骤的方法产生：
[0409] b)向穿梭微生物中引入(i)如本文所述的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体；
[0410] c)表达甲基转移酶基因；
[0411] d)自穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体；和，
[0412] e)将一种或多种构建体/载体引入目标微生物中。
[0413] 在一个实施方案中，组成型地表达步骤B的甲基转移酶基因。在另一个实施方案中，诱导步骤B的甲基转移酶基因的表达。
[0414] 穿梭微生物是微生物，优选地是限制性阴性微生物，其有利于构成表达构建体/载体的核酸序列的甲基化作用。在一个具体实施方案中，穿梭微生物是限制性阴性大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
[0415] 甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
[0416] 在将表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入穿梭微生物后，诱导甲基化构建体/载体上存在的甲基转移酶基因。诱导可以通过任何合适的启动子系统进行，但在本发明的一个具体实施方案中，甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子且是通过加入乳糖或其类似物(更优选地是异丙基-β-D-硫基-半乳糖苷(IPTG))来诱导。其它合适的启动子包括ara、tet或T7系统。在本发明的另一个实施方案中，甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。
[0417] 在一个具体实施方案中，甲基化构建体/载体具有对所述穿梭微生物的种类具有特异性的复制起点以使得在穿梭微生物中表达在甲基化构建体/载体上存在的任何基因。表达构建体/载体优选地具有对所述目标微生物的种类具有特异性的复制起点以使得在所述目标微生物中表达在表达构建体/载体上存在的任何基因。
[0418] 甲基转移酶的表达致使所述表达构建体/载体上存在的基因甲基化。然后可根据多种已知方法中的任一种自穿梭微生物分离表达构建体/载体。仅举例来说，下文所述实施例部分中所述的方法可用于分离表达构建体/载体。
[0419] 在一个具体实施方案中，构建体/载体被同时分离。
[0420] 可使用任意数量的已知方法将表达构建体/载体引入目标微生物中。然而，举例来说，可使用下文实施例部分中所述的方法。由于表达构建体/载体被甲基化，因此所述表达构建体/载体上存在的核酸序列能够被纳入至所述目标微生物中并被成功表达。
[0421] 应想到甲基转移酶基因可被引入穿梭微生物中且过度表达。因此，在一个实施方案中，可使用已知方法收集所得到的甲基转移酶并在体外用于将表达质粒甲基化。然后可将所述表达构建体/载体引入所述目标微生物中用于进行表达。在另一个实施方案中，将甲基转移酶基因引入所述穿梭微生物的基因组中、接着将所述表达构建体/载体引入所述穿梭微生物中、自所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体且然后将所述表达构建体/载体引入所述目标微生物中。
[0422] 应想到如上文定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体可被合并来提供物质组合物。所述组合物在回避限制性障碍机制中特别有用以产生本发明的重组微生物。
[0423] 在一个具体实施方案中，所述表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质粒。
[0424] 本领域技术人员将了解用于产生本发明的微生物的多种合适的甲基转移酶。然而，举例来说，可使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体ΦT1甲基转移酶和下文实施例中所述的甲基转移酶。在一个实施方案中，甲基转移酶具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列或是其功能等效变体。考虑所需甲基转移酶的序列和遗传密码，将易于了解编码合适甲基转移酶的核酸。在一个实施方案中，编码甲基转移酶的核酸是如下文实施例中所述(例如，SEQ ID NO:63的核酸或是其功能等效变体)。
[0425] 可使用被改造为适合于允许表达甲基转移酶基因的任意数量的构建体/载体来产生甲基化构建体/载体。然而，举例来说，可使用下文实施例部分中所述的质粒。
[0426] 产生方法
[0427] 本发明提供一种通过微生物发酵产生一种或多种萜烯和/或其前体以及任选的一种或多种其它产物的方法，其包括使用本发明的重组微生物发酵包含CO的底物。一种或多种萜烯和/或其前体优选地是主要的发酵产物。本发明的方法可用于减少来自工业过程的总体大气碳排放。
[0428] 所述发酵优选地包括使用本发明的重组微生物使底物在生物反应器中厌氧发酵以产生至少一种或多种萜烯和/或其前体的步骤。
[0429] 在一个实施方案中，一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
[0430] 与由萜类化合物关键中间体IPP和DMAPP直接产生异戊二烯，然后使用其来合成较长链的萜烯不同，也可能直接通过香叶基转移酶来合成较长链的萜烯，诸如C10单萜类化合物或C15倍半萜类化合物(参见表6)。由C15倍半萜类化合物构建单元法呢基-PP，可能产生法呢烯，它与乙醇类似可用作运输燃料。
[0431] 在一个实施方案中，此方法包括以下步骤：
[0432] (a)向含有本发明的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含CO的底物；和
[0433] (b)使所述培养物在生物反应器中厌氧发酵以产生至少一种或多种萜烯和/或其前体。
[0434] 在一个实施方案中，此方法包括以下步骤：
[0435] a)捕获由工业过程产生的含CO的气体；
[0436] b)通过含有本发明的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵含CO气体以产生至少一种或多种萜烯和/或其前体。
[0437] 在本发明的一个实施方案中，由所述微生物发酵的气态底物是含有CO的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程的副产物获得的或来自一些其它来源(诸如来自汽车废气)的含CO的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造(诸如钢铁厂)、非铁产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中，含CO的气体可在被排入大气之前使用任何便利方法从所述工业过程捕获。CO可以是合成气(包含一氧化碳和氢的气体)的组分。由工业过程产生的CO通常被燃烧掉以产生CO2且因此本发明在减少CO2温室气体排放和产生用作生物燃料的萜烯方面具有特别有用。视含CO的气态底物的组成而定，也可能需要对其进行处理以在将其引入所述发酵之前除去任何不需要的杂质，诸如尘粒。举例来说，气态底物可使用已知方法过滤或提纯。
[0438] 应了解，为了使细菌和CO至至少一种或多种萜烯和/或其前体的生长得以发生，除了含CO的底物气体以外，还将需要向生物反应器中进料合适的液体营养培养基。底物和培养基可以连续、分批或分批补料的方式给料至生物反应器中。营养培养基将含有足以允许所用微生物生长的维生素和矿物质。本领域中已知适合使用CO发酵产生萜烯和/或其前体的厌氧培养基。举例来说，Biebel(2001)描述合适的培养基。在本发明的一个实施方案中，培养基如下文实施例部分中所述。
[0439] 发酵应有利地在适合发生CO至至少一种或多种萜烯和/或其前体的发酵的条件下进行。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅动速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、确保液相中的CO不成为限制性的最大气体底物浓度以及避免产物抑制作用的最大产物浓度。
[0440] 另外，常需要增加底物流的CO浓度(或气态底物中的CO分压)且因此增加其中CO是底物的发酵反应的效率。在加压下的操作使得CO从气相转移至液相的速率显著增加，CO在液相中可被微生物作为碳源吸收用于产生至少一种或多种萜烯和/或其前体。这又意味着当生物反应器保持在高压而非大气压下时，滞留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以注入气体流速)可被减少。最佳反应条件将部分取决于本发明所用的特定微生物。然而一般来说，发酵优选在高于大气压力的压力下进行。因为给定的CO至至少一种或多种萜烯和/或其前体的转化的速率也部分地随底物滞留时间而变化，且实现所需的滞留时间又决定所需的生物反应器体积，因此使用加压系统可极大减少所需生物反应器的体积，且因此减少发酵设备的资金成本。根据美国专利号5,593,886给出的实施例，反应器体积的减小与反应器操作压力的增加成正比，即在10个大气压力下操作的生物反应器只需要是在1个大气压力下操作的生物反应器体积的十分之一。
[0441] 举例来说，已描述了在高压下进行气体至乙醇的发酵的益处。举例来说，WO 02/08438描述在30psig和75psig的压力下进行的气体至乙醇的发酵，分别产生150克/升/天和
369克/升/天的乙醇生产率。然而，发现在大气压力下使用类似培养基和注入气体组成进行的示例性发酵产生1/10-1/20的乙醇/升/天。
369克/升/天的乙醇生产率。然而，发现在大气压力下使用类似培养基和注入气体组成进行的示例性发酵产生1/10-1/20的乙醇/升/天。
[0442] 也需要含CO的气态底物的引入速率为例如确保液相中的CO浓度不成为限制性的。这是因为CO受限的条件的后果可能是所述培养物消耗一种或多种产物。
[0443] 用于进料给发酵反应的气流的组成可对该反应的效率和/或成本具有显著影响。举例来说，O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后发酵过程的各阶段中处理不想要或不必要的气体可增加这些阶段的负担(例如，当气流在进入生物反应器之前被压缩时，可能会使用不必要的能量来压缩发酵中不需要的气体)。因此，可能需要处理底物流(尤其是来自工业来源的底物流)以除去不想要的组分并增加所需组分的浓度。
[0444] 在某些实施方案中，使本发明的细菌培养物保持在水性培养基中。所述水性培养基优选地是最低厌氧微生物生长培养基。合适的培养基在本领域中是已知的且记载于例如美国专利No.5,173,429和5,593,886以及WO 02/08438中，且如下文实施例部分中所述。
[0446] 在本发明的某些优选实施方案中，通过自生物反应器连续除去一部分发酵液、自发酵液分离微生物细胞(便利地通过过滤)且自发酵液回收一种或多种产物来从所述发酵液回收一种或多种萜烯和/或其前体以及一种或多种产物。可便利地例如通过蒸馏回收醇类。可例如通过蒸馏回收丙酮。所产生的任何酸例如可通过吸附至活性炭上来回收。分离的微生物细胞优选地被返回至发酵生物反应器中。在除去任何醇和酸后留下的无细胞渗透物也优选地被返回至发酵生物反应器中。可以向无细胞渗透物中加入其它营养素(诸如维生素B)来在将其返回至生物反应器之前对营养培养基进行补充。
[0447] 如果如上文所述调整发酵液的pH来增强乙酸至活性炭的吸附，那么也应在返回至生物反应器之前将pH重新调整至与发酵生物反应器中的发酵液的pH类似的pH。
[0448] 实施例
[0449] 现将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。
[0450] 实施例1—在自产乙醇梭菌中表达异戊二烯合酶以用于自CO产生异戊二烯[0451] 本发明人已识别诸如自产乙醇梭菌和杨氏梭菌的一氧化碳营养型产乙酸菌中的萜烯生物合成基因。重组生物体是经工程化以产生异戊二烯。异戊二烯是由诸如白杨的一些植物天然排出以保护其叶片免受UV辐射。白杨的异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)基因是经过密码子优化并被引入一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌中以由CO产生异戊二烯。酶通过不可逆反应使萜类化合物生物合成的关键中间体DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)转化成异戊二烯(图1)。
[0452] 菌株和生长条件：
[0453] 如早前所述，使用标准菌株和生长条件在大肠杆菌中进行所有亚克隆步骤(Sambrook等人,Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989；Ausubel等人,Current protocols in molecular biology,John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987)。
[0454] 自产乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的一种衍生物)是由DSMZ获得(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany)。在37℃下使用严格的厌氧条件和技术进行生长(Hungate,
1969,Methods in Microbiology,第3B卷。Academic Press,New York:117-132；Wolfe,
1971,Adv.Microb.Physiol.,6:107-146)。使用化学上定义的无酵母提取物的PETC培养基(表1)和30psi含有一氧化碳的钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂(New Zealand Steel site)收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的碳和能量来源。
1969,Methods in Microbiology,第3B卷。Academic Press,New York:117-132；Wolfe,
1971,Adv.Microb.Physiol.,6:107-146)。使用化学上定义的无酵母提取物的PETC培养基(表1)和30psi含有一氧化碳的钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂(New Zealand Steel site)收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的碳和能量来源。
[0455] 表1
[0456]
[0457]
[0458]
[0459]
[0460]
[0461]
[0462] 构建表达质粒：
[0463] 在本发明中使用标准重组DNA和分子克隆技术(Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,1989；Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,Moore DD,Seidman JG,Smith JA,Struhl K:Current protocols in molecular biology.John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987)。山杨的异戊二烯合酶(AAQ16588.1；GI:33358229)是经过密码子优化(SEQ ID NO:21)和合成的。使用自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶的启动子区(SEQ ID NO:22)来表达所述基因。
[0464] 使用Bertram和Dürre(1989)的改进方法从自产乙醇梭菌DSM23693分离基因组DNA。收获100-ml过夜培养物(6,000×g,15min,4℃)、用磷酸钾缓冲液(10mM，pH 7.5)洗涤并悬浮在1.9ml STE缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、200mM蔗糖；pH 8.0)中。加入300μl溶菌酶(约100,000U)且将所得混合物在37℃下孵育30min，接着加入280μl 10％(w/v)SDS溶液且再孵育10min。在室温下通过加入240μl EDTA溶液(0.5M，pH 8)、20μl Tris-HCl(1M，pH 7.5)和10μl RNase A (Fermentas Life Sciences)消化RNA。然后加入100μl蛋白酶K(0.5U)且在37℃下发生蛋白水解，持续1至3h。最后加入600μl高氯酸钠(5M)，接着进行苯酚-氯仿提取和异丙醇沉淀。通过分光光度计检验DNA的数量和质量。通过使用寡核苷酸Ppfor-NotI-F(SEQ ID NO:23:AAGCGGCCGCAAAATAGTTGATAATAATGC)和Ppfor-NdeI-R(SEQ ID NO:24:TACGCATATGAATTCCTCTCCTTTTCAAGC)和使用iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad Laboratories)的PCR，和以下程式来扩增丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子序列：初始在98℃下变性30秒钟、接着进行32个循环：变性(98℃下持续10秒钟)、退火(50至62℃下持续30至120秒钟)和伸长(72℃下持续30至90秒钟)，之后是最后的延伸步骤(72℃下持续10分钟)。
[0465] 构建异戊二烯合酶表达质粒：
[0466] 在大肠杆菌DH5α-T1R(Invitrogen)和XL1-Blue MRF’Kan(Stratagene)中进行表达质粒的构建。在第一步骤中，使用NotI和NdeI限制性位点将扩增的Ppfor启动子区克隆到大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL85141(FJ797651.1；Nigel Minton,诺丁汉大学(University of Nottingham)；Heap等人,2009)中，产生质粒pMTL85146。作为第二步骤，使用限制性位点NdeI和EcoRI将ispS克隆到pMTL85146中，产生质粒pMTL 85146-ispS(图2，SEQ ID NO:25)。
[0467] 自产乙醇梭菌中的转化和表达
[0468] 如美国专利2011/0236941中所述，在转化之前，使用在由来自自产乙醇梭菌、拉氏梭菌和杨氏梭菌的甲基转移酶基因设计的甲基化质粒(SEQ ID NO:64)上共表达的合成混合II型甲基转移酶(SEQ ID NO:63)，在大肠杆菌中体内将DNA甲基化。
[0469] 将表达质粒和甲基化质粒转化到限制性阴性大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan(Stratagene)的相同细胞中，这因为它们的相容性革兰氏-(-)复制起点而成为可能(表达质粒中的高拷贝ColE1和甲基化质粒中的低拷贝p15A)。通过加入1mM IPTG诱导体内甲基化，且使用QIAGEN Plasmid Midi试剂盒(QIAGEN)分离甲基化质粒。所得到的混合物用于自产乙醇梭菌DSM23693的转化实验，但只有大量(高拷贝)表达质粒具有革兰氏-(+)复制起点(repL)，允许其可在梭菌属中复制。
[0470] 转化至自产乙醇梭菌中：
[0471] 在完整转化实验期间，使自产乙醇梭菌DSM23693在补充有1g/L酵母提取物和10g/l果糖的培养基(表1)以及作为碳源的30psi钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)中生长。
[0472] 为制造感受态细胞，将50ml自产乙醇梭菌DSM23693培养物在新鲜培养基中继代培养连续3天。这些细胞用于以0.05的OD600nm接种含有40mM DL-苏氨酸的50ml PETC培养基。当培养物达到0.4的OD600nm时，将细胞转移至厌氧室中且在4,700×g和4℃下收获。将培养物用冰冷却的电穿孔缓冲液(270mM蔗糖、1mM MgCl2、7mM磷酸钠，pH 7.4)洗涤两次，且最后悬浮在体积为600μl的新鲜电穿孔缓冲液中。将此混合物转移到含有1μg甲基化质粒混合物的具有0.4cm电极间隙的预冷却电穿孔杯中且立即使用具有以下设定的Gene脉冲发生器Xcell电穿孔系统(Bio-Rad)进行冲击：2.5kV，600Ω和25μF。达到3.7至4.0ms的时间常数。将培养物转移到5ml的新鲜培养基中。在600nm波长下使用装配有管架的Spectronic Helios Epsilon分光光度计(Thermo)监测细胞再生。生物量初始下降后，细胞再次开始生长。生物量由此点开始加倍后，收获细胞、悬浮于200μl新鲜培养基中且铺板于具有适当的抗生素4μg/ml克拉霉素(Clarithromycin)或15μg/ml甲砜霉素(thiamphenicol)的选择性的PETC板(含有1.2％BactoTMAgar(BD))上。在37℃下用30psi钢铁厂气体接种4至5天后，可见到菌落。
[0473] 使用菌落来接种具有抗生素的2ml PETC培养基。当发生生长时，使培养物按比例增加至5ml体积，且随后增加至50ml，以30psi钢铁厂气体作为唯一的碳源。
[0474] 证明成功转化：
[0475] 为证实DNA转移，使用Zyppy质粒小量提取试剂盒(Zymo)由10ml培养物体积进行质粒小量提取。由于分离的质粒的质量因梭菌属核酸外切酶活性而不足以用于限制性酶切消化[Burchhardt和Dürre,1990]，因此用寡核苷酸对colE1-F(SEQ ID NO:65:CGTCAGACCCCGTAGAAA)加上colE1-R(SEQ ID NO:66:CTCTCCTGTTCCGACCCT)对分离的质粒进行PCR。在以下条件下使用iNtRON Maximise Premix PCR试剂盒(Intron Bio Technol ogies)来进行PCR：初始在94℃下变性2分钟，接着进行35个循环：变性(94℃下持续20秒钟)、退火(55℃下持续20秒钟)和延伸(72℃下持续60秒钟)，之后是最后的延伸步骤(72℃下持续5分钟)。
[0476] 为证明克隆的种类，从50ml自产乙醇梭菌DSM23693培养物中分离基因组DNA(参考上文)。在以下条件下使用寡核苷酸fD1(SEQ ID NO:67:CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和rP2(SEQ ID NO:68:CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT)[Weisberg等人,1991]和iNtRON Maximise Premix PCR试剂盒(Intron Bio Technologies)针对16s rRNA基因进行PCR：初始在94℃下变性2分钟，接着进行35个循环：变性(94℃下持续20秒钟)、退火(55℃下持续20秒钟)和延伸(72℃下持续60秒钟)，之后是最后的延伸步骤(72℃下持续5分钟)。测序结果为与自产乙醇梭菌(Y18178，GI:7271109)的16s rRNA基因(rrsA)具有至少99.9％的同一性。
[0477] 异戊二烯合酶基因的表达
[0478] 进行qRT-PCR实验来确认引入的异戊二烯合酶基因在自产乙醇梭菌中的成功表达。
[0479] 使具有异戊二烯合酶质粒pMTL 85146-ispS的培养物和不含质粒的对照培养物在50mL血清瓶和PETC培养基(表1)中生长，以30psi钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的能量和碳来源。在对数生长期期间以约0.5的OD600nm取样0.8mL样本并与1.6mL RNA保护试剂(Qiagen)混合。使混合物离心(6,000×g，5min，4℃)，且将细胞沉积物在液氮中速冻并储存在-80℃下直到RNA提取。根据手册的实验方案5，使用RNeasy小量提取试剂盒(Qiagen)分离总RNA。通过使混合物穿过注射器10次对细胞进行破坏，并以50μL无RNase/DNase的水中洗脱。在使用DNA-freeTM试剂盒(Ambion)进行DNase I处理后，然后使用SuperScript III逆转录酶试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行逆转录步骤。使用Agilent生物分析仪2100(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)、Qubit荧光计(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)并通过凝胶电泳检查RNA。对每一对寡核苷酸进行非RT对照。所有qRT-PCR反应都使用MyiQTM单色检测系统(Bio-Rad Labratories,Carlsbad,CA,USA)一式两份进行，总反应体积为15μL，具有25ng cDNA模板、67nM每种寡核苷酸(表2)和1×iQTM Green Supermix(Bio-Rad Labratories,Carlsbad,CA,USA)。反应条件是95℃下持续3min，接着40个循环：95℃持续
15s、55℃持续15s和72℃持续30s。为检测寡核苷酸二聚化或扩增的其它伪像(artifact)，在qPCR完成后立刻进行熔融曲线分析(以1℃/s自58℃至95℃循环38次)。每种cDNA样本包括两个看家基因(鸟苷酸激酶和甲酸四氢叶酸连接酶)用于标准化。使用相对表达软件工具
20082.0.7版(38)进行相对基因表达的确定。使用横跨4个log单位连续稀释的cDNA产生标准曲线且所得到的扩增效率用来计算mRNA的浓度。
15s、55℃持续15s和72℃持续30s。为检测寡核苷酸二聚化或扩增的其它伪像(artifact)，在qPCR完成后立刻进行熔融曲线分析(以1℃/s自58℃至95℃循环38次)。每种cDNA样本包括两个看家基因(鸟苷酸激酶和甲酸四氢叶酸连接酶)用于标准化。使用相对表达软件工具
20082.0.7版(38)进行相对基因表达的确定。使用横跨4个log单位连续稀释的cDNA产生标准曲线且所得到的扩增效率用来计算mRNA的浓度。
[0480] 表2：用于qRT-PCR的寡核苷酸
[0481]
[0483] 实施例2—表达异戊烯基二磷酸δ-异构酶以在关键的萜烯前体DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)和IPP(异戊烯基二磷酸)之间转化
[0484] 前体DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)和IPP(异戊烯基二磷酸)的可用性和平衡对萜烯生产至关重要。尽管DXS途径同等地合成IPP和DMAPP，但在甲羟戊酸途径中，唯一的产物是IPP。异戊二烯生产只需要存在前体DMAPP与异戊二烯合酶，而对于高级萜烯和萜类化合物生产而言，则需要具有等量的IPP和DMAPP可用于通过香叶基转移酶产生香叶基-PP。
[0485] 构建异戊烯基二磷酸δ-异构酶表达质粒：
[0486] 编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶(YP_001310174.1)的来自拜氏梭菌(C.bei jerinckii)的异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi(基因ID:5294264)在ispS的下游被克隆。使用与如上文关于自产乙醇梭菌所述的相同方法获得，寡核苷酸Idi-Cbei-SacI-F(SEQ ID NO:26:GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG)和Idi-Cbei-KpnI-R(SEQ ID NO:27:
ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)从拜氏梭菌NCIMB8052的基因组DNA来扩增基因。使用SacI和KpnI限制性位点将PCR产物克隆到载体pMTL 85146-ispS中以产生质粒pMTL85146-ispS-idi(SEQ ID NO:28)。使用限制性酶PmeI和FseI将抗生素抗性标记物从catP交换到ermB(由载体pMTL82254(FJ797646.1)释放；Nigel Minton,诺丁汉大学；Heap等人,2009)以形成质粒pMTL85246-ispS-idi(图3)。
ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)从拜氏梭菌NCIMB8052的基因组DNA来扩增基因。使用SacI和KpnI限制性位点将PCR产物克隆到载体pMTL 85146-ispS中以产生质粒pMTL85146-ispS-idi(SEQ ID NO:28)。使用限制性酶PmeI和FseI将抗生素抗性标记物从catP交换到ermB(由载体pMTL82254(FJ797646.1)释放；Nigel Minton,诺丁汉大学；Heap等人,2009)以形成质粒pMTL85246-ispS-idi(图3)。
[0487] 如关于质粒pMTL 85146-ispS所述在自产乙醇梭菌中进行转化和表达。成功转化后，在50mL(50mL)血清瓶和PETC培养基(表1)中进行生长实验，以30psi钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的能量和碳来源。为确认已成功引入质粒，如前文所述由转化体进行质粒小量提取DNA。使用靶向colE1(colE1-F:SEQ ID NO:65:CGTCAGACCCCGTAGAAA和colE1-R:SEQ ID NO:66:CTCTCCTGTTCCGACCCT)、ermB(ermB-F:SEQ ID NO:106:TTTGTAATTAAGAAGGAG和ermB-R:SEQ ID NO:107:GTAGAATCCTTCTTCAAC)和idi(Idi-Cbei-SacI-F:SEQ ID NO:26:
GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG和Idi-Cbei-KpnI-R:SEQ ID NO:27:
ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)的寡核苷酸对针对分离的质粒进行的PCR确认转化成功(图8)。类似地，提取了这些转化体的基因组DNA，且得到的使用寡核苷酸fD1和rP2(参考上文)的16s rRNA扩增子确认与自产乙醇梭菌(Y18178，GI:7271109)的16S rRNA基因99.9％的同一性。
GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG和Idi-Cbei-KpnI-R:SEQ ID NO:27:
ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)的寡核苷酸对针对分离的质粒进行的PCR确认转化成功(图8)。类似地，提取了这些转化体的基因组DNA，且得到的使用寡核苷酸fD1和rP2(参考上文)的16s rRNA扩增子确认与自产乙醇梭菌(Y18178，GI:7271109)的16S rRNA基因99.9％的同一性。
[0488] 使用针对异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi的寡核苷酸对(idi-F,SEQ ID NO:71:ATA CGT GCT GTA GTC ATC CAA GAT A和idiR,SEQ ID NO:72:TCT TCA AGT TCA CAT GTA AAA CCC A)和来自用带有质粒pMTL 85146-ispS-idi的自产乙醇梭菌进行的血清瓶生长实验的样本来如上文所述进行基因表达的成功确认。也观察到异戊二烯合酶基因ispS的信号(图14)。
[0489] 实施例3—DXS途径的过度表达
[0490] 为改善通过DXS途径的流，过度表达此途径的基因。由脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)来催化此途径的初始步骤，将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成脱氧木酮糖5-磷酸(DXP/DXPS/DOXP)。
[0491] 构建DXS过度表达表达质粒：
[0492] 如上文关于其它基因所述，使用寡核苷酸Dxs-SalI-F(SEQ ID NO:29:GCAGTCGACTTTATTAAAGGGATAGATAA)和Dxs-XhoI-R(SEQ ID NO:30:
TGCTCGAGTTAAAATATATGACTTACCTCTG)从基因组DNA扩增自产乙醇梭菌的dxs基因。然后用SalI和XhoI将扩增的基因克隆到质粒pMTL85246-ispS-idi中以产生质粒pMTL85246-ispS-idi-dxs(SEQ ID NO:31和图4)。使用表3中给出的寡核苷酸进行的DNA测序确认了ispS、idi和dxs的成功克隆，无突变(图5)。ispS和idi基因分别如实施例1和2中所述。
TGCTCGAGTTAAAATATATGACTTACCTCTG)从基因组DNA扩增自产乙醇梭菌的dxs基因。然后用SalI和XhoI将扩增的基因克隆到质粒pMTL85246-ispS-idi中以产生质粒pMTL85246-ispS-idi-dxs(SEQ ID NO:31和图4)。使用表3中给出的寡核苷酸进行的DNA测序确认了ispS、idi和dxs的成功克隆，无突变(图5)。ispS和idi基因分别如实施例1和2中所述。
[0493] 表3：用于测序的寡核苷酸
[0494]寡核苷酸名称 DNA序列(5`至3`) SEQ ID NO:
M13R CAGGAAACAGCTATGAC 32
异戊二烯-seq1 GTTATTCAAGCTACACCTTT 33
异戊二烯-seq2 GATTGGTAAAGAATTAGCTG 34
异戊二烯-seq3 TCAAGAAGCTAAGTGGCT 35
异戊二烯-seq4 CTCACCGTAAAGGAACA 36
异戊二烯-seq5 GCTAGCTAGAGAAATTAGAA 37
异戊二烯-seq6 GGAATGGCAAAATATCTTGA 38
异戊二烯-seq7 GAAACACATCAGGGAATATT 39
M13R CAGGAAACAGCTATGAC 32
异戊二烯-seq1 GTTATTCAAGCTACACCTTT 33
异戊二烯-seq2 GATTGGTAAAGAATTAGCTG 34
异戊二烯-seq3 TCAAGAAGCTAAGTGGCT 35
异戊二烯-seq4 CTCACCGTAAAGGAACA 36
异戊二烯-seq5 GCTAGCTAGAGAAATTAGAA 37
异戊二烯-seq6 GGAATGGCAAAATATCTTGA 38
异戊二烯-seq7 GAAACACATCAGGGAATATT 39
[0495] 自产乙醇梭菌中的转化和表达
[0496] 如关于质粒pMTL 85146-ispS所述的在自产乙醇梭菌中进行转化和表达。成功转化后，在50mL(50mL)血清瓶和PETC培养基(表1)中进行生长实验，以30psi钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的能量和碳来源。如上文所述，由在OD600nm＝0.75下收集的样本进行基因表达的确认。使用寡核苷酸对dxs-F(SEQ ID NO:73:ACAAAGTATCTAAGACAGGAGGTCA)和dxs-R(SEQ ID NO:74:GATGTCCCACATCCCATATAAGTTT)来测量基因dxs在野生型菌株和带有质粒pMTL 85146-ispS-idi-dxs的菌株中的表达。发现带有所述质粒的菌株中的mRNA水平与野生型相比增加3倍以上(图15)。在RNA提取之前使生物量标准化。
[0497] 实施例4-甲羟戊酸途径的引入和表达
[0498] 由使两分子的乙酰基-CoA转化成乙酰乙酰基-CoA(和HS-CoA)的硫解酶催化甲羟戊酸途径的第一步骤(图7)。此酶由相同的发明人(美国专利2011/0236941)在一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌和杨氏梭菌中成功表达。已设计用于甲羟戊酸途径的剩余基因的构建体。
[0499] 构建甲羟戊酸表达质粒：
[0500] 使用标准重组DNA和分子克隆技术(Sambrook,J.和Russell,D.,Molecular cloning:A Laboratory Manual第3版,Cold Spring Harbour Lab Press,Cold Spring Harbour,NY,2001)。经由甲羟戊酸途径上部进行甲羟戊酸合成所需的三种基因(即硫解酶(thlA/vraB)、HMG-CoA合酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR))是经过密码子优化作为操纵子(Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp-HMGR)。
[0501] 使用自产乙醇梭菌的磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子(Ppta-ack)(SEQ ID NO:61)来表达硫解酶和HMG-CoA合酶，同时使用自产乙醇梭菌的ATP合酶(Patp)的启动子区来表达HMG-CoA还原酶。合成硫解酶的两种变体(来自丙酮丁醇梭菌的thlA和来自金黄色葡萄球菌的vraB)并将其侧接NdeI和EcoRI限制性位点以用于进一步亚克隆。HMG-CoA合酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)都是由金黄色葡萄球菌合成并分别将其侧接EcoRI-SacI和KpnI-XbaI限制性位点以用于进一步亚克隆。所用的所有优化DNA序列在表4中给出。
[0502] 表4：甲羟戊酸表达质粒的序列
[0503]
[0504] 使用寡核苷酸pUC57-F(SEQ ID NO:46:AGCAGATTGTACTGAGAGTGC)和pUC57-R(SEQ ID NO:47:ACAGCTATGACCATGATTACG)和以pUC57-Patp-HMGR作为模板扩增ATP合酶启动子(Patp)和羟基甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGR)。用SacI和XbaI消化2033bp扩增片段且连接到大肠杆菌-梭菌属穿梭载体pMTL 82151(FJ7976；Nigel Minton,英国诺丁汉大学(University of Nottingham,UK)；Heap等人,2009,J Microbiol Methods.78:79-85)中，产生质粒pMTL 82151-Patp-HMGR(SEQ ID NO:76)。
[0505] 使 用 寡 核 苷 酸 E c o R I - H M G S _ F ( S E Q I D N O : 7 7 :AGCCGTGAATTCGAGGCTTTTACTAAAAACA)和EcoRI-HMGS_R(SEQ ID NO:78:AGGCGTCTAGATGTTCGTCTCTACAAATAATT)，由密码子合成的质粒pGH-seq3.2来扩增3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMGS)。用SacI和EcoRI消化1391bp扩增片段且将其连接到先前产生的质粒pMTL 82151-Patp-HMGR中以产生pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:79)。所产生的质粒pMTL
82151-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:79)和Pptaack-thlA/vraB的1768bp经过密码子优化的操纵子都用NotI和EcoRI切割。进行连接且接着转化到大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan中，产生质粒pMTL8215-Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:50)。
82151-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:79)和Pptaack-thlA/vraB的1768bp经过密码子优化的操纵子都用NotI和EcoRI切割。进行连接且接着转化到大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan中，产生质粒pMTL8215-Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:50)。
[0506] 经由甲羟戊酸途径下部的从甲羟戊酸合成萜类化合物关键中间体所需的五种基因(即，甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)和异戊二烯合酶(ispS))是通过ATG:Biosynthetics GmbH(Merzhausen,Germany)进行密码子优化。甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)都是由金黄色葡萄球菌获得。
[0507] 使用自产乙醇梭菌的RNF复合物(Prnf)的启动子区(SEQ ID NO:62)来表达甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)，同时使用自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶(Pfor)的启动子区(SEQ ID NO:22)来表达异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)和异戊二烯合酶(ispS)。所用的所有DNA序列都在表5中给出。使用寡核苷酸NotI-XbaI-Prnf-MK_F(SEQ ID NO:80:ATGCGCGGCCGCTAGGTCTAGAATATCGATACAGATAAAAAAATATATAATACAG)和SalI-Prnf-MK_R(SEQ ID NO:81:TGGTTCTGTAACAGCGTATTCACCTGC)从合成质粒pGH-Prnf-MK-PMK-PMD扩增经过密码子优化的Prnf-MK。然后用NotI和SalI将所扩增的基因克隆到质粒pMTL83145(SEQ ID NO:49)中以产生质粒pMTL8314-Prnf-MK(SEQ ID NO:82)。接着用SalI和HindIII消化所得到的质粒和
2165bp经过密码子优化的片段PMK-PMD。进行连接，产生质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD(SEQ ID NO:83)。
2165bp经过密码子优化的片段PMK-PMD。进行连接，产生质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD(SEQ ID NO:83)。
[0508] 通过将侧接限制性位点AgeI和NheI的异戊二烯合酶(ispS)与先前产生的法呢烯质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)连接以产生质粒pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(SEQ ID NO:84)来制造无甲羟戊酸途径的异戊二烯表达质粒。通过使用限制性位点NotI和XbaI使来自pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:50)的4630bp Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR片段与pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(SEQ ID NO:84)连接来制造最终的异戊二烯表达质粒pMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(SEQ ID NO:58，图10)。
[0509] 表5：来自甲羟戊酸途径的异戊二烯表达质粒的序列
[0510]
[0511] 实施例5-在自产乙醇梭菌中引入法呢烯合酶以用于通过甲羟戊酸途径自CO产生法呢烯
[0512] 除了直接由萜类化合物关键中间体IPP和DMAPP产生异戊二烯，然后使用此异戊二烯合成较长链的萜烯以外，也可能直接通过香叶基转移酶(参见表6)来合成较长链的萜烯，诸如C10单萜类化合物或C15倍半萜类化合物。由C15倍半萜类化合物构建单元法呢基-PP可能产生法呢烯，其与乙醇类似可用作运输燃料。
[0513] 构建法呢烯表达质粒
[0514] 通过甲羟戊酸途径自IPP和DMAPP合成法呢烯所需的两种基因(即，香叶基转移酶(ispA)和α-法呢烯合酶(FS))是经过密码子优化的。香叶基转移酶(ispA)是由大肠杆菌菌株K-12亚菌株MG1655获得且α-法呢烯合酶(FS)是由苹果获得。所用的所有DNA序列在表6中给出。使用通过甲羟戊酸途径idi_F(SEQ ID NO:86:AGGCACTCGAGATGGCAGAGTATATAATAGCAGTAG)和idi_R2(SEQ ID NO:87:AGGCGCAAGCTTGGCGCACCGGTTTATTTAAATATCTTATTTTCAGC)从合成质粒pMTL83245-Pfor-FS-idi(SEQ ID NO:85)来扩增经过密码子优化的idi。然后将用XhoI和HindIII扩增的基因克隆到质粒pMTL83245-Pfor中以产生质粒pMTL83245-Pfor-idi(SEQ ID NO:88)。接着用HindIII和NheI消化此得到的质粒和法呢烯合酶(FS)的1754bp经过密码子优化的片段。进行连接产生质粒pMTL83245-Pfor-idi-FS(SEQ ID NO:89)。接着用AgeI和HindIII消化ispA的946bp片段和pMTL83245-Pfor-idi-FS且将其连接以产生得到的质粒pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:90)。通过将来自pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS的2516bp Pfor-idi-ispA-FS片段与pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD连接产生质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)来制造无上部甲羟戊酸途径的法呢烯表达质粒。通过使用限制性位点NotI和XbaI将来自pMTL 8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR的4630bp Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR片段(SEQ ID NO:50)与pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)连接来制造最终的法呢烯表达质粒pMTL83145-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:59和图18)。
[0515] 表6：来自甲羟戊酸途径的法呢烯表达质粒的序列
[0516]
[0517] 转化到自产乙醇梭菌中
[0518] 如实施例1中所述的在自产乙醇梭菌中进行转化和表达。
[0519] 确认成功转化：
[0520] 通过使用寡核苷酸repHF(SEQ ID NO:92:AAGAAGGGCGTATATGAAAACTTGT)和catR(SEQ ID NO:93:TTCGTTTACAAAACGGCAAATGTGA)选择性地扩增pMTL831xxx系列质粒上的一部分garm+ve perplicon和大部分cat基因的菌落PCR确认存在pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:59)。产生1584bp的条带(图16)。
[0521] 在自产乙醇梭菌中表达下部甲羟戊酸途径
[0522] 如实施例1中所述的对下部甲羟戊酸途径基因甲羟戊酸激酶(MK SEQ ID NO:51)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK SEQ ID NO:52)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD SEQ ID NO:53)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi；SEQ ID NO:54)、香叶基转移酶(ispA；SEQ ID NO:56)和法呢烯合酶(FS SEQ ID NO:57)的表达进行确认。使用表7中列举的寡核苷酸。
[0523] 表7：用于检测在质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)上所携带的下部甲羟戊酸途径中基因的表达的寡核苷酸清单
[0524]
[0525] 确认下部甲羟戊酸途径中的所有基因表达的Rt-PCR数据在图18中示出，此数据也概括在表8中。
[0526] 表8：基因甲羟戊酸激酶(MK SEQ ID NO:51)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK SEQ ID NO:52)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD SEQ ID NO:53)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi SEQ ID NO:54)、香叶基转移酶(ispA SEQ ID NO:56)和法呢烯合酶(FS SEQ ID NO:57)的平均CT值，对于从甲羟戊酸供给实验的两种起子培养物(starter cultures)取样的两种独立样本而言(参见下文)
[0527] 基因 样本1(Ct平均值) 样本2(Ct平均值)MK 21.9 20.82
PMK 23.64 22.81
PMD 24 22.83
Idi 24.23 27.54
ispA 23.92 23.22
FS 21.28(单独Ct) 21.95(单独Ct)
HK(rho) 31.5 28.88
PMK 23.64 22.81
PMD 24 22.83
Idi 24.23 27.54
ispA 23.92 23.22
FS 21.28(单独Ct) 21.95(单独Ct)
HK(rho) 31.5 28.88
[0528] 由甲羟戊酸产生α-法呢烯
[0529] 在确认质粒pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS成功转化之后，在250ml血清瓶中的50ml PETC培养基(表1)中进行生长实验，以30psi Real Mill气体(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的能量和碳来源。在37℃下在被改造为适合固定血清瓶的定轨振荡器(orbital shaker)中孵育所有培养物。首先使转化体生长至约0.4的OD600，然后在补充有1mM甲羟戊酸的新鲜培养基中继代培养。同时由同一培养物建立无甲羟戊酸的对照。在每个时间点取样用于GC-MS(气相色谱-质谱法)的样品。图17示出了2种对照培养物和供给有1mM甲羟戊酸的两种培养物的代表性生长曲线。在实验开始后66h和90h获取的样本中检测到法呢烯(图19至21)。
[0530] 通过气相色谱-质谱法检测α-法呢烯
[0531] 为对α-法呢烯进行GC-MS检测，通过加入2ml己烷并剧烈振荡以在密封的鲍尔奇玻璃管(glass balch tube)中混合而对5ml培养物进行己烷提取。然后将所述管在超声波水浴中孵育5min以促进相分离。将400μl己烷提取物转移到GC小瓶中并上样到自动上样器上。在具有EC-1000柱0.25μm膜厚度(Grace Davidson,OR,USA)、Varian MS工作台(Varian Inc,Ca.Now Agilent Technologies,CA,USA)和NIST MS Search 2.0(Agilent Technologies,CA,USA)的VARIAN GC3800MS4000离子捕集器GC/MS(Varian Inc,CA,USA.Now Agilent Technologies)上分析所述样本。注射体积为1μl，氦运载气体流速为
1ml/min。
1ml/min。
[0532] 本文已参考某些优选实施方案描述本发明以使得阅读者无需过度实验即可实施本发明。然而，本领域技术人员将易于意识到，许多组分和参数可在不偏离本发明范围的情况下可在一定程度上被变化或修改或者被置换为已知的等效物。应了解，所述修改和等效物如同单独提出一样被纳入本文中。提供标题、题目等以增强阅读者对此文本的理解，且其不应理解为限制本发明的范围。
[0533] 上下文中引用的所有申请、专利和公布的全部公开内容，如果存在，都以引用方式纳入本文中。然而，本说明书中对任何申请、专利和公布的参考并非且不应理解为承认或以任何形式建议其构成有效的现有技术或在世界上任何国家形成公知常识的一部分。
[0534] 在本说明书通篇和下文的任何权利要求中，除非文中另外要求，否则词汇“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等应以与排除含义相反的包涵含义理解，也就是说其含义是“包括(但不限于)”。
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