一种硫酸多黏菌素B生产菌株、硫酸多粘菌素B的制备方法及
应用
技术领域
背景技术
[0002] 多粘菌素是由多粘芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的一组多肽类抗生素。多粘菌素B供药用，常用其
硫酸盐。除
变形杆菌属外，硫酸多粘菌素B对几乎所有的革兰氏阴性细菌都有抗菌作用，对生长繁殖期和静止期的细菌都有效，临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染、以及眼、气管、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及
皮肤粘膜感染等。
[0003] 硫酸多粘菌素B主要采用
微生物发酵法生物合成，再经提取精制制备而成。关于
原料药中的硫酸多粘菌素B的
质量要求，USP/EP药典有明确规定：多粘菌素B含量≥80％，最大单杂≤3.0％、总杂≤17％、B3≤6.0％、B1-1≤15％。代表世界最高
水平的硫酸多黏菌素B生产厂家--阿尔法姆，其产品含量为87％-90％，而国内产品含量最高只能达到85％左右，含量虽然满足USP/EP药典要求，但与世界最高水平尚有差距。目前公开发表的硫酸多粘菌素B制备工艺均能达到80％以上的含量，但满足单个杂质控制要求的难度相对较大，尤其是最大单杂容易超标，使用常规的硫酸多黏菌素B生产菌株和分离纯化手段难以有效的降低最大单杂比例。
[0004] 如
申请号为200710036929.X的
专利《发酵法合成多粘菌素B的方法》，发酵单位最高为6534.5U/ml，并且专利未对产品组分情况进行说明。申请号为201110385129.5的专利《一种从发酵液中提取多粘菌素B的方法》，虽然效价可以达到8100U/mg以上，但其产品纯度只有85％左右。申请号为201310506594.9的专利《一种发酵法生产多粘菌素B的方法》，发酵单位最高为7500U/ml，并且专利未对产品组分情况进行说明。申请号为201610694064.5的专利《一种硫酸多粘菌素B结晶及其制备方法》，只是采用了结晶的办法生产硫酸多粘菌素B，并未对其组分进行控制和优化。申请号为201710280429.4的专利《发酵硫酸多粘菌素B用培养基及发酵生产硫酸多粘菌素B的方法》，虽然该发明对发酵组分进行了部分控制，但其产品纯度达不到90％。文献《响应面法优化多粘菌素B的发酵条件》中国农学通报2010，26(15)：57-53，其发酵单位915.77mg/ml。
发明内容
[0005] 针对
现有技术存在的问题，本发明提供了一种硫酸多黏菌素B生产菌株、硫酸多粘菌素B的制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
[0006] 本发明是这样实现的，一种硫酸多黏菌素B生产菌株，菌种名称为：Paenibacillus polymyxa DN8，保藏编号为CCTCC NO：M 2019994。已于2019年12月2日保藏至中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
[0007] 如上述的一种硫酸多黏菌素B生产菌株按以下方法制得：
[0008] 使用无菌水将长好的多粘菌素B菌种从斜面洗脱下来，然后用紫外灯诱变20～40s后，避光在含有甲基磺酸乙酯(DES)浓度0.05-0.5mol/L的无菌水里处理5～30min。然后避光涂布在含有多粘菌素B 0.6～1.0g/L斜面培养基(a)上，培养后挑取单菌落接种到摇瓶
种子培养基(b)中发酵，筛选出比对照单位高且单杂低的菌种，传至三代，菌种
稳定性较强，获得诱变多黏菌素B菌种，该菌种为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，单菌落形态是表面光滑，没有皱褶，乳白色，卵圆型或者圆形，在
显微镜下杆状，条件不好条件下形成芽孢，菌落及菌体形态图见图1和图2所示。通过诱变育种，多粘菌素B的产量可由1.2g/L提高到2.0g/L，比出发菌株提高了50％，也远高于目前公开资料的产量水平。
[0009] 其中：斜面培养基(a)，每100ml培养基含有以下组分：
蔗糖0.5～1.0，蛋白胨0.5～1.0，
酵母浸粉0.2～0.5，
磷酸二氢
钾0.05～0.1，琼脂2.0，余量为水。
[0010] 摇瓶种子培养基(b)，每100ml培养基含有以下组分：糊精5.0～8.0，酵母浸粉0.2～1.0，磷酸二氢钾0.05～0.2，硫酸铵0.2～0.6，硫酸
钙0.2～0.6，消泡剂0.05，余量为水。
[0011] 如上述的一种硫酸多黏菌素B生产菌株在生产硫酸多黏菌素B中的应用。
[0012] 一种硫酸多粘菌素B的制备方法，包括：利用
权利要求1中的硫酸多黏菌素B生产菌株进行微生物发酵获取发酵液，将发酵液进行过滤、大孔型离子交换
树脂处理、
解吸液脱色、大孔层析树脂处理、解吸液
碱结晶、溶解转盐、纳滤浓缩、
喷雾干燥，得到硫酸多粘菌素B。
[0013] 进一步地，利用权利要求1中的硫酸多黏菌素B生产菌株进行微生物发酵所用发酵培养基配方为：每100ml培养基含可溶性
淀粉5.0～7.0g，酵母粉0.5～0.8g，
磷酸氢二钾0.01～0.05g，硫酸铵0.2～0.4g，硫酸钙0.2～0.4g，消泡剂0.05ml，余量为水；发酵条件为：
温度28.0～29.5℃，罐压0.03～0.04MPa，流量0.6～0.8vvm，转速200～350rpm，培养周期38～43小时，接种量是5～8％。
[0014] 进一步地，对发酵液进行处理的过程包括以下步骤：
[0015] (1)用
草酸调节发酵液pH至2.5-3.5，搅拌30min-60min，降温至10-15℃，过滤，收集滤液；
[0016] (2)将步骤(1)的滤液用NaOH调节pH至6.0-6.5，上大孔型离子交换树脂柱
吸附，上柱完成后丢弃上柱透过液，用4-6倍树脂体积的纯化水洗柱，然后硫
酸溶液进行解吸，直至流出液小于1500单位停止解吸，得解吸液；
[0017] (3)步骤(2)的解吸液升温至40-50℃，加入
活性炭，保温搅拌，过滤，得到硫酸多黏菌素B脱色液；
[0018] (4)将步骤(3)中得到的硫酸多黏菌素B脱色液上大孔层析树脂吸附上柱完成后丢弃上柱透过液，用4-6倍树脂体积的纯化水洗柱，然后
乙醇水溶液进行解吸，直至流出液小于1500单位停止解吸，得解吸液；
[0019] (5)将步骤(4)得到的解吸液降温至5-10℃，用氢
氧化钠水溶液调节pH至12.5-13.0，然后升温至20-25℃，升温后继续搅拌1-2h，过滤，
滤饼用纯化水洗涤3次，得到多黏菌素B碱结晶；
[0020] (6)用2mol/L的硫酸溶解多黏菌素B碱结晶，完全溶解后，最终调节pH至5.0-5.5，得到硫酸多黏菌素B溶解液；
[0021] (7)将硫酸多粘菌素B溶解液进行纳滤浓缩，加压
泵压
力1.0-1.5MPa，纯化水顶洗，收集浓缩液，得到纳滤浓缩后硫酸多黏菌素B溶液；
[0022] (8)将步骤(7)得到的硫酸多黏菌素B溶解液依次过5μm和0.45μm的
滤芯，得到澄清过滤液，干燥后获得硫酸多黏菌素B喷干粉。
[0023] 进一步地，步骤(1)中使用100-200nm孔径的陶瓷
膜过滤。
[0024] 进一步地，步骤(2)中所用硫酸溶液浓度为0.2mol/L。
[0025] 进一步地，步骤(4)中所用乙醇水溶液的体积浓度为30-50％。
[0026] 如上述的一种硫酸多粘菌素B的制备方法在生产硫酸多黏菌素B中的应用。
[0027] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：
[0028] 1.利用本发明诱变得到的菌株产硫酸多黏菌素B能力强，放罐单位2.0g/L，超过行业平均水平20％。
[0029] 2.本发明通过对发酵培养基
碳源和氮源优化，对接种量、发酵温度、发酵时间、罐压等发酵条件进行精准调控，控制代谢产物的组分，放罐发酵液中USP/EP药典所规定的几种杂质峰的比例，远低于国内文献记载的水平。
[0030] 3.对发酵培养液进行分离纯化获得高纯度高含量的硫酸多黏菌素B，产品质量远高于USP/EP标准，纯度和含量均大于90％，单杂和组分均合格，总杂低于8％，生测效价大于8100u/mg。
附图说明
[0031] 图1是多粘菌素B菌种的菌落形态；
[0032] 图2是多粘菌素B菌种的菌体形态；
[0033] 图3是发酵液中各成分图谱；
[0034] 图4是硫酸多黏菌素B喷干粉的成分图谱。
具体实施方式
[0035] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合
实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和
试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0036] 本发明披露了一种硫酸多黏菌素B生产菌株、硫酸多粘菌素B的制备方法及应用，具体如下各实施例所示。
[0037] 实施例1生产菌株的获取
[0038] 使用无菌水将长好的多粘菌素B菌种从斜面洗脱下来，然后用紫外灯诱变20～40s，本实施例中选用40s后，避光在含有甲基磺酸乙酯(DES)浓度0.05-0.5mol/L，本实施例中选用0.25mol/L的无菌水里处理5～30min，本实施例中选用20min。然后避光涂布在含有多粘菌素B 0.6～1.0g/L，本实施例中选用0.7g/L斜面培养基(a)上，培养后挑取单菌落接种到摇瓶种子培养基(b)中发酵，筛选出比对照单位高且单杂低的菌种，传至三代，菌种稳定性较强，获得诱变多黏菌素B菌种，该菌种为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，单菌落形态是表面光滑，没有皱褶，乳白色，卵圆型，在显微镜下杆状。菌落及菌体形态图见图1和图2所示。
[0039] 其中：斜面培养基(a)，每100ml培养基含有以下组分：蔗糖0.5～1.0(本实施例中为0.8)，蛋白胨0.5～1.0(本实施例中为0.6)，酵母浸粉0.2～0.5(本实施例中为0.44)，磷酸二氢钾0.05～0.1(本实施例中为0.08)，琼脂2.0，余量为水。
[0040] 摇瓶种子培养基(b)，每100ml培养基含有以下组分：糊精6.0(本实施例中为6.0)，酵母浸粉0.8(本实施例中为0.8)，磷酸二氢钾0.1(本实施例中为0.1)，硫酸铵0.3(本实施例中为0.3)，硫酸钙0.4(本实施例中为0.4)，消泡剂0.05，余量为水。
[0041] 实施例2硫酸多粘菌素B的制备
[0042] 1、菌种发酵
[0043] (1)将实施例1中获得诱变多黏菌素B菌种接种到摇瓶种子培养基(b)里进行培养，得到摇瓶种子液。
[0044] (2)把摇瓶种子液接种到10L种子罐里进行培养，得到种子液。
[0045] (3)把种子罐种子液移种到50L
发酵罐里进行培养，得到发酵液。
[0046] 其中：步骤(2)种子罐培养基配方同摇瓶种子培养基(b)。步骤(3)发酵培养基配方：可溶性淀粉5.0～7.0(本实施例中为6.5)，酵母粉0.5～0.8(本实施例中为0.55)，磷酸氢二钾0.01～0.05(本实施例中为0.04)，硫酸铵0.2～0.4(本实施例中为0.3)，硫酸钙0.2～0.4(本实施例中为35)，消泡剂0.05，余量为水。
[0047] 碳源、氮源对发酵单位和杂质影响很大，对发酵培养基的碳源(糊精，可溶性淀粉，淀粉，面粉)、有机氮源(蛋白胨，酵母粉，
牛肉膏)进行筛选，碳源中可溶性淀粉和面粉较好，优选可溶性淀粉；氮源中酵母粉和牛肉膏较好，优选酵母粉。
[0048] 步骤(1)和(2)的发酵条件采用公知方法步骤(1)的发酵条件：温度28～30℃(本实施例中为29℃)，培养时间14～16h(本实施例中为15h)。步骤(2)的发酵条件：温度28～30℃(本实施例中为30℃)，培养时间10～14h(本实施例中为13h)，接种量1％。步骤(3)的发酵条件：温度28.0～29.5℃(本实施例中为29℃)，罐压0.03～0.04MPa，流量0.6～0.8vvm，转速200～350rpm(本实施例中为300rpm)，培养周期38～43小时(本实施例中为40h)，接种量是5～8％(本实施例中为6.5％)。
[0049] 利用诱变多黏菌素B菌种进行发酵，放罐单位在2.0g/L左右(参考文献:田东.硫酸多粘菌素B菌种选育与发酵工艺的研究[D]北京化工大学,2010.)，单杂小于2.0％。
[0050] 对发酵液进行色谱检测，结果如图3所示，结果显示，B3含量仅为2.90％、B1-1含量仅为3.81％，杂质含量相当低，只有在如此低的杂质含量情况下，才能获得高含量的有效成分。
[0051]
[0052] 对比发酵液组分，发现本工艺发酵液的有效组分比例比国内专利报道提高10.58％，大大提高分离纯化后产品的纯度和含量，并且对产品整体质量有比较大的提升。
[0053] 2、发酵液中硫酸多黏菌素B的提取精制
[0054] 将得到的诱变多黏菌素B菌种的发酵液进行过滤、大孔型离子交换树脂处理、解吸液脱色、大孔层析树脂处理、解吸液碱结晶、溶解转盐、纳滤浓缩、喷雾干燥，得到硫酸多粘菌素B。本发明中大孔型离子交换树脂包括D110、D113、D001、D151、SP112、NKC-9等型号树脂。具体过程如下：
[0055] (1)用草酸调节发酵液pH至2.5-3.5(本实施例中为3.0)，搅拌30min-60min(本实施例中为40min)，降温至10-15℃(本实施例中为10℃)。过滤(优选100-200nm孔径的陶瓷膜，本实施例中选用200nm)，收集滤液。该步骤收率控制在85％-95％。
[0056] (2)将步骤(1)的滤液用1-2M的NaOH水溶液调节PH至6.0-6.5(本实施例中为6.4)，上D001大孔型离子交换树脂柱吸附，上柱完成后丢弃上柱透过液，用4-6倍树脂体积的纯化水洗柱，然后用0.2mol/L的硫酸溶液进行解吸，直至流出液小于1500单位停止解吸，得解吸液。该步骤收率控制在85％-92％。
[0057] (3)步骤(2)的解吸液升温至40-50℃(本实施例中为42℃)，加入活性炭，保温搅拌30-60min(本实施例中为40min)，过滤，得到硫酸多黏菌素B脱色液。该步骤收率90％-95％。
[0058] (4)将步骤(3)中得到的硫酸多黏菌素B脱色液上HP20ss大孔层析树脂吸附上柱完成后丢弃上柱透过液，用4-6倍树脂体积的纯化水洗柱。然后用30％-50％的乙醇水溶液进行解吸，直至流出液小于1500单位停止解吸，得解吸液。该步骤收率87％-92％。
[0059] (5)将步骤(4)得到的解吸液降温至5-10℃，用2mol/L的氢氧化钠水溶液调节PH至12.5-13.0，然后升温至20-25℃，升温后继续搅拌1-2h，过滤，滤饼用适量纯化水洗涤3次，得到多黏菌素B碱结晶。该步骤收率为90％-95％。
[0060] (6)用2mol/L的硫酸溶解多黏菌素B碱结晶，完全溶解后，最终调节pH至5.0-5.5，得到硫酸多黏菌素B溶解液。
[0061] (7)将硫酸多粘菌素B溶解液进行纳滤浓缩，加压泵压力1.0-1.5MPa，顶洗0.5倍体积量的纯化水，收集浓缩液，得到纳滤浓缩后硫酸多黏菌素B溶液。
[0062] (8)将步骤(7)得到的硫酸多黏菌素B溶解液依次过5μm和0.45μm的滤芯，得到澄清过滤液，设置好喷雾干燥塔的进
风温度170-190℃，出风温度80-100℃，开始进溶解液进行喷干，收集喷干粉，最终得到高纯度高含量的硫酸多黏菌素B喷干粉。该步骤收率为95％-99％。
[0063] 对硫酸多黏菌素B喷干粉的成分进行色谱分析，结果如图4所示，通过对比多批次、不同来源喷干粉的全检结果(见下表)，本发明所制备的硫酸多黏菌素B各项指标均符合或者高于USP标准和标准品，与世界最高生产水平的阿尔法姆相比，本发明的总含量高(＞92％)、总杂低(＜8％)、灰分低，最大单杂含量相近，可以说本发明所制备的硫酸多黏菌素B整体质量已达到世界最高水平。
[0064] 将标准品、阿尔法姆生产样品以及本申请中的三个样品通过全检，进行质量比对，结果如下表所示：
[0065] 批号 USP标准 USP标准品 阿尔法姆 样品1 样品2 样品3pH 5.0-7.5 5.9 6.1 5.8 6.0 6.1
干燥失重 7.0％ 3.8 3.5 2.0 2.3 2.6
炽灼残渣 ≤0.75％ 0.38 0.36 0.25 0.13 0.20
硫酸盐 15.5％-17.5％ 16.5％ 15.9％ 16.1％ 15.8％ 16.3％
重金属 20ppm 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定
最大单杂 ≤3.0％ 2.88％ 2.17％ 2.26％ 2.16％ 2.35％
总杂 ≤17.0％ 15.17％ 10.44％ 5.37％ 6.76％ 7.11％
B3 ≤6.0％ 4.01％ 3.95％ 1.14％ 2.40％ 2.33％
B1-1 ≤15.0％ 7.91％ 8.36％ 9.58％ 12.73％ 11.00％
总含量 ≥80.0％ 88.1％ 87.0％ 94.5％ 94.1％ 92.5％
[0066] 本发明得到的硫酸多黏菌素B喷干粉总含量可达94.5％、总杂5.37％、最大单杂2.26％、B1为63.09％、B1-1为9.58％、B2为18.01％、B3为1.14％、硫酸盐含量16.1％。
[0067] 经过提取后，有效组分总比例达到94.63％，含量也达到94.5％。超出阿尔法姆的水平。
[0068] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
