技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体涉及一种脑胆固醇
代谢物27-羟基胆固醇(27OHC)在抗抑郁药疗效预测中的应用，以及制备相应的
试剂的应用。
背景技术
[0002]
抑郁症(Major depressive disorder，MDD)是由多种因素引起的以情绪持续低落为主要症状的情感障碍性精神
疾病。流行病学资料显示全球MDD的患病率高达5％-12％，大约15％的人一生中曾有抑郁发作，其中15％的MDD患者自杀身亡。世界卫生组织(WHO)预测到2020年MDD将成为继心
血管疾病之后世界第二大经济负担的疾病。作为一种高发病率、高死亡率和高致残率的全球性精神系统疾病，MDD已成为迫切需要解决的重大公共卫生问题。
[0003] 目前，抑郁症的诊治面临的主要困难在于：(1)发病机制尚不明确：抑郁症发病机制假说众多，主要包括神经营养因子缺乏、单胺类神经递质紊乱、
氧化应激障碍等。这些假说为揭示抑郁症的病理生理机制提供了一定的理论依据，但未获得广泛的认同。(2)缺乏客观的检验诊断方法：抑郁症的诊断主要依靠医生主观
鉴别患者临床症状。然而，抑郁症的临床表现异质性高，小部分患者以多动症、欣快感、幻觉、妄想为主要临床表现，易与其他精神疾病的症状混淆，如双相情感障碍以及
精神分裂症，使得基于症状的临床诊断方法准确率低。例如，一项meta分析发现MDD患者诊断正确率仅有47％，而DSM-5(美国
精神障碍诊断与统计手册第五版)现场测试发现抑郁症诊断一致性只有28％。(3)抗抑郁药起效较慢：以选择性5-羟色胺再摄取
抑制剂(SSRIs)和去甲肾上腺素再摄取抑制剂为代表的传统抗抑郁药一般需要2-4周才开始见效，这导致了部分患者在
治疗初期因主观感觉治疗无效而擅自减药、停药，甚至中断治疗，不仅增加了自杀
风险，同时也影响了远期
预后，给患者造成巨大的经济和社会负担。
[0004] 在抑郁症诊治标记物研究方面，血液指标易于获取，创伤较小，且价格便宜，易于自动化检测，所以得到了广泛的关注。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是，目前尚无血液生物标志物在抗抑郁药疗效预测方面得到一致认可，也就是说，
现有技术中缺乏客观判断抗抑郁药物治疗效果的方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，需要筛选抑郁症相关生物标志物，从而有助于揭示其潜在的病理生理机制，开发出客观的疗效预测方法。有研究提示外周血总胆固醇在抑郁症患者中出现异常变化，但结论不一致，因此仍然难以作为在疗效预测方面客观的生物标志物。
[0007] 本
发明人发现，由于血脑屏障的存在，外周胆固醇不能自由通过血脑屏障进入中枢，但胆固醇代谢产物27-羟基胆固醇(27-hydroxycholesterol,27OHC)可自由通过血脑屏障，其浓度变化也可以造成中枢胆固醇代谢紊乱。因此，外周血中胆固醇代谢产物27OHC具有作为抑郁症相关的生物标记物的潜能。
[0008] 本发明人进一步研究发现，对于接受抗抑郁药物治疗的抑郁症患者，将他们对于药物的反应分为治疗有效和治疗无效两组，通过组间比较发现，治疗有效组患者
血浆27OHC
水平略高于治疗无效患者，且随着治疗的进行，治疗有效患者中外周血中27OHC水平逐渐降低，而治疗无效患者中外周血中27OHC水平逐渐升高。因此血浆27OHC水平可用于抑郁症患者疗效预测的生物标记物。
[0009] 基于上述研究发现，本发明提出了如下技术方案：
[0010] 一方面，本发明提供了27-羟基胆固醇或检测27-羟基胆固醇的试剂在制备用于预测和/或判断抗抑郁药的治疗效果的试剂或
试剂盒中的用途。
[0011] 优选地，上述的用途，其中所述试剂盒选自生化
诊断试剂盒、免疫诊断试剂盒或
分子诊断试剂盒。
[0012] 优选地，上述的用途，其中所述试剂盒选自Western印迹试剂盒、酶联
免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、放射
免疫测定(RIA)试剂盒、放射免疫扩散试剂盒、二维双相免疫扩散试剂盒、火箭免疫
电泳试剂盒、免疫组织化学
染色试剂盒、免疫沉淀测定试剂盒、补体结合测定试剂盒、
荧光激活细胞分选(FACS)试剂盒、适体芯片试剂盒、微阵列试剂盒和
蛋白质芯片试剂盒中的一种或两种以上。
[0013] 优选地，上述的用途，其中所述试剂盒包含抑郁评价量表；优选地，所述抑郁评价量表选自汉密尔顿抑郁量表(HAMD)、蒙哥
马利抑郁量表(MADRS)、Zung抑郁自评量表(SDS)、Beck抑郁自评量表(BDI)、抑郁症状快速评定量表(QIDS)、轻躁狂症自评量表(HCL-32)、心境障碍问卷(MDQ)、杨氏躁狂量表(YMRS)和抑郁症筛查量表(PHQ9)中的一种或两种以上；更优选地，所述抑郁评价量表为汉密尔顿抑郁量表(HAMD)。
[0014] 优选地，上述的用途，其中，预测和/或判断抗抑郁药的治疗效果包括如下步骤：
[0015] 步骤1：在治疗的不同时间点测定受试者外周血中24-羟基胆固醇的浓度，比较在不同时间点测定的受试者外周血中24-羟基胆固醇的浓度；
[0016] 优选地，步骤1中，如果受试者外周血中24-羟基胆固醇的浓度随着治疗进行呈现升高的趋势，则提示药物治疗无效，如果受试者外周血中24-羟基胆固醇的浓度随着治疗进行呈现降低的趋势，则提示药物治疗有效。
[0017] 另一方面，本发明提供了用于预测和/或判断抗抑郁药的治疗效果的的试剂盒，所述试剂盒包含27-羟基胆固醇和抑郁评价量表；优选地，所述抑郁评价量表选自汉密尔顿抑郁量表(HAMD)、蒙哥马利抑郁量表(MADRS)、Zung抑郁自评量表(SDS)、Beck抑郁自评量表(BDI)、抑郁症状快速评定量表(QIDS)、轻躁狂症自评量表(HCL-32)、心境障碍问卷(MDQ)、杨氏躁狂量表(YMRS)和抑郁症筛查量表(PHQ9)中的一种或两种以上；更优选地，所述抑郁评价量表为汉密尔顿抑郁量表(HAMD)。
[0018] 另一方面，本发明提供了用于预测和/或判断抗抑郁药的治疗效果的的试剂盒，所述试剂盒包含检测27-羟基胆固醇的试剂和抑郁评价量表；优选地，所述抑郁评价量表选自汉密尔顿抑郁量表(HAMD)、蒙哥马利抑郁量表(MADRS)、Zung抑郁自评量表(SDS)、Beck抑郁自评量表(BDI)、抑郁症状快速评定量表(QIDS)、轻躁狂症自评量表(HCL-32)、心境障碍问卷(MDQ)、杨氏躁狂量表(YMRS)和抑郁症筛查量表(PHQ9)中的一种或两种以上；更优选地，所述抑郁评价量表为汉密尔顿抑郁量表(HAMD)。
[0019] 优选地，上述的用途或上述的试剂盒，其中所述检测27-羟基胆固醇的试剂选自27-羟基胆固醇配体或27-羟基胆固醇配体的
抗体、27-羟基胆固醇的抗体、显色试剂、发
光标志物、染料、荧光标志物、标准品、
碱性
水解试剂、衍生化试剂、内标物和外标物中的一种或两种以上。
[0020] 优选地，上述的用途或试剂盒，其中所述标准品选自血清
白蛋白；优选地，所述碱性水解试剂选自丁基羟基
甲苯、氢氧化
钾、
乙二胺四乙酸、
乙醇中的一种或以上；进一步优选地，所述衍生化试剂选自N’-二异丙基
碳酰亚胺、烟酰胺和4-二甲
氨基吡啶中的一种或两种以上；进一步优选地，所述内标物选自D5氘胆固醇和/或D7氘胆固醇；进一步优选地，所述外标物选自D5氘胆固醇和/或D7氘胆固醇。
[0021] 优选地，上述的用途或上述的试剂盒，其中所述试剂盒含有检测24-羟基胆固醇、血清
淀粉样蛋白P和/或血管细胞黏附分子的试剂。
[0022] 本发明的有益效果包括：
[0023] 本发明通过检测27OHC的水平作为疗效预测依据，并提供了相应的预测试剂，对抑郁症的疗效预测具有较高的特异性和灵敏度，能在用药前较好的区分抗抑郁药的疗效，从而进行选择性的使用抗抑郁药，能极大的提高治疗效果及缩短治疗周期。
[0024] 另一方面，27OHC生物标记为属于外周血指标，可方便获取，同时只需测定所述外周血27OHC水平一个指标，即可进行预测，方便推广使用。同时，所述以27OHC生物标记物作为疗效预测抑郁的方法，还可以联合其它检测方式得出更可靠的结果。
附图说明
[0025] 为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面对所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些
实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0026] 图1：健康对照和抑郁症患者治疗前血浆27OHC浓度。
[0027] 图2-1：抑郁症患者经12周抗抑郁治疗后汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分。
[0028] 图2-2：抑郁症患者经12周抗抑郁治疗后抑郁症状快速评定量表(QIDS)评分。
[0029] 图2-3：抑郁症患者经12周抗抑郁治疗后杨氏躁狂量表(YMRS)评分。
[0030] 图2-4：抑郁症患者经12周抗抑郁治疗后抑郁症筛查量表(PHQ9)评分。
[0031] 图3：血浆27OHC在各组人群治疗前后的浓度变化。
[0032] 图4：不同疗效患者12周治疗后血浆27OHC浓度的差值。
[0033] 图5-1：12周血浆27OHC的浓度差值与HAMD减分率的相关性。
[0034] 图5-2：12周疗效预测ROC曲线。
具体实施方式
[0035] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036] 本发明的一个实施方式中，以27OHC作为生物标记物，用于预测和/或判断抗抑郁药的治疗效果的试剂或试剂盒中。通过运用上述试剂或者试剂盒检测待测对象的外周血中27OHC浓度，来判断抗抑郁药的治疗效果。具体的，可以
抽取待测对象的外周血，分离血浆并测定27OHC浓度，抽血时间可以在接受治疗前和治疗过程中，以对对象的患病状态进行诊断，作为疗效预测的指标，以选择对于该患者适用的药物。
[0037] 本文中，术语“抑郁症”又称抑郁障碍，是一种以显著而持久的心境低落为主要临床特征的心境障碍。
[0038] 术语“抗抑郁药”(antidepressive drugs)是指一组主要用来治疗以情绪抑郁为突出症状的精神疾病的精神药物。现有技术已知的抗抑郁药包括单胺
氧化酶抑制剂(MAOI)、三环类抗抑郁药(TCA)、选择性5-HT再摄取抑制药(SSRI)等，具体应用实例包括但不限于异丙肼、苯乙肼、丙咪嗪、阿米替林、多虑平、氯丙咪嗪、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、氟伏沙明、西酞普兰等。
[0039] 本文中，术语“27-羟基胆固醇”(27-hydroxycholesterol,27OHC)是胆固醇经线粒体胆固醇27-羟化酶(CYP27A1)的代谢产物，其结构式如下：
[0040]
[0041] 27OHC是外周循环系统中含量最多的胆固醇代谢产物，最终转
化成胆汁酸排出体外，在维持体内胆固醇平衡方面发挥重要作用。
[0042] 术语“预测”是指估计或者确定患者将有利地或不利地响应于药物(治疗剂)或药物组或
治疗方案的可能性。
[0043] 术语“判断”是指估计或者确定患者已经或者正在有利地或不利地响应于药物(治疗剂)或药物组或治疗方案的可能性。
[0044] 在本发明的一个具体实施例中，所述用于诊断抑郁症的试剂、所述预测和/或判断抗抑郁药的治疗效果的试剂被制备成试剂盒，所述试剂盒可以为生化诊断试剂盒、免疫诊断试剂盒、或分子诊断试剂盒等，优选制备成所述免疫诊断试剂盒。
[0045] 所述诊断试剂盒指采用免疫学、
微生物学、分子生物学等原理或方法制备的、在体外用于对人类疾病的诊断、检测及流行病学调查等的试剂盒。
[0046] 所述诊断试剂盒可以为本领域公知的类型，包括但不限于Western印迹试剂盒、酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、放射免疫测定(RIA)试剂盒、放射免疫扩散试剂盒、ouchterlony免疫扩散试剂盒、火箭免疫电泳试剂盒、免疫组织化学染色试剂盒、免疫沉淀测定试剂盒、补体结合测定试剂盒、荧光激活细胞分选(FACS)试剂盒、适体芯片试剂盒、微阵列试剂盒、蛋白质芯片试剂盒等。
[0047] 所述试剂盒中，包括所述检测27OHC的试剂，所述试剂指能够特异性测定27OHC浓度的分子，包括但不限于可以特异性结合于27OHC的核酸分子、蛋白质、化合物等。
[0048] 在本发明的一个具体实施例中，可以选择能够特异性结合27OHC的蛋白质作为所述检测27OHC的试剂，在本发明的另一个具体实施例中，优选抗体作为所述检测27OHC的试剂，所述抗体可以是可特异性结合到标志物蛋白的抗体，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体及其
抗原结合
片段，只要其保留了抗原结合功能即可。
[0049] 在本发明中，所述检测27OHC的试剂上可以连接有能够被检测的标记分子。
[0050] 下面，参考具体实施例更详细地描述本发明，然而，实施例仅用于说明目的，对于本发明不具有限制作用。
[0051] 以下实施例中所用到各试剂和仪器来源如下表1所示，本文未记载的试剂或仪器或操作步骤均是本领域普通技术人员可常规确定的内容：
[0052] 表1实施例所用试剂和仪器
[0053]试剂/仪器 型号/规格 厂家
醋酸铵 500g含量≥98％ 国药集团化学试剂
甲酸 50ml Fluka
甲基叔丁基醚 1L含量≥99.9％ Merck
N’-二异丙基碳酰亚胺 D125407 25g含量≥99％ Merck
烟酰胺 72340 100g含量≥99％ Merck
4-二甲氨基吡啶 107700 25g含量≥99％ Merck
甲醇 34860 4L含量≥99.9％ Merck
高效液相色谱仪 安捷伦G1312B 安捷伦
质谱仪 AB Sciex Qtrap 6500 美国ABI公司
[0054] 实施例
[0055] 实施例1：外周血的采集以及测定外周血27OHC的浓度的方法
[0056] 1.根据已通过的伦理审查实验方案以及诊断标准，筛选出健康对照人群及抑郁症(未用药或停药6周以上)患者各91例，分别在抗抑郁药
艾司西酞普兰治疗前2周及治疗后12周，采用汉密尔顿抑郁量表(HAMD)、抑郁症状快速评定量表(QIDS)、杨氏躁狂量表(YMRS)及抑郁症筛查量表(PHQ9)评估患者的抑郁严重程度，同时抽取外周血5毫升于EDTA抗凝管内，3000转/分离心10分钟，分离上层血浆，并即刻分装，储藏与-80℃超低温
冰箱，备用。
[0057] 2.将血浆经过萃取后经高效液相色谱-质谱方法检测27OHC含量，具体方法如下：
[0058] (1)用5％的
牛血清白蛋白溶液配制27OHC的浓度为1-2000ng/ml的标准品溶液，用5％的牛血清白蛋白溶液作为空白样品。
[0059] (2)在1.5ml EP管中加入50μl标准品/空白样品/待测血浆，然后加入50μl内标(D5氘胆固醇+D7氘胆固醇50ng/ml)，之后加入200μl酸性缓冲液(50mM醋酸铵，1％甲酸)和1ml甲基叔丁基醚。
[0060] (3)经充分混合均匀后，把样品放在-80℃冰箱中，待其中的水相冷却结晶后，把0.5ml甲基叔丁基醚相(上清液)转移到1.5ml离心管中。
[0061] (4)把甲基叔丁基醚在35℃氮气吹干。
[0062] (5)在每个EP管中加入50μl的衍生化试剂(63mg N，N’-二异丙基碳酰亚胺，62mg烟酰胺和61mg 4-二甲氨基吡啶溶于5ml氯仿中)，于35℃加热混合2小时。
[0063] (6)用35℃氮气吹干二氯甲烷。
[0064] (7)100μl甲醇复溶后进样检测。
[0065] 之后的实施例中，均采用本实施例记载的方法采集外周血以及测定外周血27OHC的浓度。
[0066] 实施例2：外周血27OHC作为生物标记物用于抑郁症诊断
[0067] 1.本研究共纳入年龄和性别匹配的抑郁症患者和健康对照各91人，各组的基本人口资料及患者症状评估见表2.
[0068] 表2：受试者基本人口情况及患者临床症状评估
[0069]
[0070]
[0071] 注：HAMD：汉密尔顿抑郁量表；QIDS：抑郁症状快速评定量表；YMRS：杨氏躁狂量表；PHQ9：抑郁症筛查量表；NA：缺失值。
[0072] 经过血浆胆固醇检测，发现与健康对照组相比，抑郁症患者血浆27OHC与健康对照者相比无明显区别(图1，p＝0.714)，这提示患者外周胆固醇代谢没有改变，因此27OHC不能作为抑郁症诊断的生物标记物。
[0073] 实施例3：外周血27OHC作为生物标记物用于抗抑郁药的疗效预测
[0074] 将入组的抑郁症患者给予抗抑郁药艾司西酞普兰进行治疗，于治疗后2周、4周、8周和12周进行抑郁症状的量表评估(图2-1至图2-4)。患者经过12周抗抑郁治疗后各项评分均明显降低，症状改善。但有一部分患者症状改善并不明显，根据12周后患者治疗效果(汉密尔顿抑郁量表减分率达到50％)分为治疗有效(Responders)组和治疗无效(Non-responders)组。其中治疗有效患者为65人，治疗无效患者为26人。从图2-1至图2-4可以看到，治疗无效组虽然抗抑郁药有一定效果，但没有达到临床缓解的标准。
[0075] 在治疗前，抑郁症患者血浆27OHC浓度虽然基本没有差别，但是在治疗后，有效组和无效组的变化趋势明显不同，有效组患者血浆27OHC浓度随时间降低，而治疗无效组患者血浆27OHC浓度随时间略增加(图3)。经过12周治疗后，不同疗效患者组间27OHC水平的变化(治疗前-治疗后)出现明显差异(图4，p<0.001)，说明血浆27OHC可以作为抑郁症患者可以作为疗效预测的生物标记物。
[0076] 以上结果提示27OHC在不同疗效患者人群有明显差别，之后进一步观察27OHC水平与症状水平之间的关系。为此计算了12周治疗之后HAMD得分的减分率((治疗前-治疗后)/治疗前*100)，并分析其与血浆27OHC浓度在12周前后差值(治疗前-治疗后)的相关性(图5-1)：前后差值越大说明27OHC浓度下降越多，减分率越高证明疗效越好。结果显示，27OHC随治疗变化值与HAMD减分率存在明显的正相关，进一步提示27OHC与疗效的密切关系。结合受试者体重指数(BMI)及家族史指标，治疗前27OHC浓度作为疗效预测指标，接受者操作特性曲线(ROC)曲线下面积为0.633，预测灵敏度和特异度分别为76.9％和50.8％(图5-2)。
[0077] 通过实施例3可以看出，本发明通过对抗抑郁药使用患者用药前后外周血27OHC浓度变化的分析，发现抑郁症患者外周血27OHC还可以作为疗效预测的指标，在用药前预测抗抑郁药的疗效或者在用药后判断抗抑郁药物治疗的效果。
