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一种基于 睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法

阅读：1025发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法，样品制备收集睡眠认知行为治疗睡眠障碍人群原发性骨质疏松症患者的血浆样本，经处理后准备进行超高效液相色谱‑质谱检测分析；睡眠障碍根据匹兹堡睡眠质量指数量表确定；超高效液相色谱‑质谱检测分析：将血清样本经色谱柱分离，并采用质谱检测分析；数据分析提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据，通过正交偏最小二乘判别分析和配对样本T检验对数据进行分析，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些物质结合已有文献报道进行初步鉴定和验证。本发明睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症患者的早期预测和预后提供有利的技术支持。，下面是一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法，其特征在于：以下步骤：
S1：样品制备收集睡眠认知行为治疗睡眠障碍人群原发性骨质疏松症患者的血浆样本,经处理后准备进行超高效液相色谱-质谱检测分析，睡眠障碍根据匹兹堡睡眠质量指数量表Pittsburgh sleep quality index,PSQI确定；
S2：将所有被试开展睡眠认知行为治疗前后的100μl血浆与900μl丙-2-醇混合，涡旋超过10秒后超声处理10分钟，混合物-20℃冻存1小时，然后9500g离心10分钟，收集上层800μl并转移至上层，质量控制(QC)样品通过合并所有血清样品的等分试样代表分析中的血清样品，每5个样品中放置空白样品丙-2-醇/水，9:1v/v和QC样品；
S3：超高效液相色谱-质谱检测分析的仪器分析平台为UPLC-QTOF/MSACQUITY UPLC I-Class,Waters,Manchester,UK,进行电喷雾电离四倍飞行时间质量光谱仪Xevo G2-S Q-TOF,A Waters,Manchester,UK，ACQUITY UPLC CSH色谱柱1.7μm；50mm长×2.1mmi.d.用于LC分离和色谱柱保持为55℃，流速为0.4毫升/分钟样品注射是2μl，进样量为4微升，保持自动进样器为4℃，初始线性梯度：40％B，0-2分钟40％B至43％B，2-2.1分钟：43％B至50％B，
2.1-12分钟：50％B至54％B，12-12.1分钟：54％B至70％B，12.1-18分钟：70％B至99％B，18-
18.1分钟：99％B至40％B，18.1-20分钟：40％B；
S4：质谱条件正离子模式条件以氮气作为雾化、锥孔气体飞行检测模型，正负极毛细管电压为3kV模式，两种模式下的锥形电压均为25V，源设置为120℃，锥形气体流量为50升/h，去溶剂化温度设定为450℃，850升/小时的去溶剂化气体流量，亮氨酸脑啡肽Waters Co.，Manchester，UK被用作锁定质量参考离子，m/z 556.2771正模式和负模式下m/z 554.2615，锁定喷雾以5μl/分钟的速率校准数据，使用两次斜碰撞能量扫描的连续模式获取MSE数据，低能量模式，扫描范围50-2000Da，扫描时间0.2s，碰撞能量设置为6V，高能量模式，扫描范围50-2000Da，扫描时间0.2s，斜碰撞能量15-60伏；
S5：收集血浆样本,处理后经色谱柱分离,并采用质谱检测分析,在进行检测分析后提取并对齐仪器原始数据,获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据，采用正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA和配对样本T检验对数据进行分析，其中OPLS-DA按照OPLS的VIP值挖掘差异代谢物，得到睡眠认知行为治疗前后有差异的脂质分子，通过交叉比较，得到共有差异脂质分子，再对共有脂质分子与睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症患者的骨密度值T、Z和睡眠障碍量表分数做相关分析，通过分析相关性结果与临床症状的病理吻合性进行验证，得到代谢异常预测脂质分子。
2.根据权利要求1所述的一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法，其特征在于：所述超高效液相色谱-质谱检测分析：将血清样本经色谱柱分离,并采用质谱检测分析。
3.根据权利要求1所述的一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法，其特征在于：所述S3中色谱分离条件为:柱温为40℃流速为0.4毫升/分钟；流动相A组成，0.1％甲酸/10mM甲酸铵中乙腈/水；流动相B组成,B为0.1％甲酸/10mM甲酸铵在丙-2-醇/乙腈9:1v/v中的溶液；梯度洗脱。

说明书全文

一种基于 睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学

分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药研究学技术领域，具体为一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法。

背景技术

[0002] 睡眠障碍是目前中国社会最常见问题之一，主要表现为入睡困难、夜间觉醒次数增多、晨间早醒和醒后无法再入睡等。长期低质量睡眠与许多疾病的发生发展相关联，是骨质疏松症发生的重要致病因素，诱发其发生发展，骨质疏松极易出现骨折。骨折不仅降低人民群众的生活质量，而且增加卧床相关的死亡率。减少或者降低睡眠障碍，可在很大程度上改善低质量睡眠所致骨质疏松症，不仅减轻相关人群的痛苦，也降低了其发生骨折的风险。

[0003] 骨质疏松是一种以骨量降低，骨组织微结构破坏，导致骨脆性增加、骨强度下降，易发生骨折为特征的全身性代谢退化性骨病，其发生、发展是一个多因素作用、多基因参与、多阶段经历形成的极其复杂的生物学过程，目前具体的发病机制尚不明确。睡眠障碍人群发生骨质疏松症的脂代谢异常概率极高。

[0004] 睡眠认知行为治疗是目前治疗失眠的首选治疗方案，优于药物治疗失眠，而且不影响干扰体内代谢物质水平，为期6周，每周一次治疗，每次约一小时。

[0005] 代谢组学是一种高灵敏度，高通量分析方法，可用于研究病理生理状态下低分子量代谢物的特征变化。脂质组学是代谢组学的一个重要分支，旨在详细分析脂质物种及其在生物体系中的多重作用。超高效液相色谱-质谱(LC/MS)联用技术作为脂质组学分析中广泛采用的技术之一，具有高分离度、高速度和高灵敏度的特点。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法，具备的采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和配对样本T检验对数据分析结果进行交叉比对，就独立性的优点，解决了建模过程中所有样本都会被用来建立模型，所以该过程存在一定程度的非独立性，干扰了模型预测能力的判别和模型预测误差的估计。缺乏完全独立性的建模科导致过拟合的可能，这样的模型不能真实有效地反映代谢组数据的信息，从而对标记物的筛选出现偏差的问题。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法，包括以下步骤：

[0008] S1：样品制备收集睡眠认知行为治疗睡眠障碍人群原发性骨质疏松症患者的血浆样本，经处理后准备进行超高效液相色谱-质谱检测分析，睡眠障碍根据匹兹堡睡眠质量指数量表(Pittsburgh sleep quality index，PSQI)确定。

[0009] S2：将所有被试开展睡眠认知行为治疗前后的100μl血浆与900μl丙-2-醇混合，涡旋超过10秒后超声处理10分钟，混合物-20℃冻存1小时，然后9500g离心10分钟，收集上层(800μl)并转移至上层，质量控制(QC)样品通过合并所有血清样品的等分试样代表分析中的血清样品，每5个样品中放置空白样品(丙-2-醇/水，9∶1v/v)和QC样品。

[0010] S3：超高效液相色谱-质谱检测分析的仪器分析平台为UPLC-QTOF/MS(ACQUITY UPLC I-Class，Waters，Manchester，UK)，进行电喷雾电离四倍飞行时间质量光谱仪(Xevo G2-S Q-TOF，A Waters，Manchester，UK)，ACQUITY UPLC CSH色谱柱[1.7μm；50mm(长)×2.1mm(i.d.)]用于LC分离和色谱柱保持为55℃，流速为0.4毫升/分钟样品注射是2μl，进样量为4微升，保持自动进样器为4℃，初始线性梯度：40％B，0-2分钟40％B至43％B，2-2.1分钟：43％B至50％B，2.1-12分钟：50％B至54％B，12-12.1分钟：54％B至70％B，12.1-18分钟：
70％B至99％B，18-18.1分钟：99％B至40％B，18.1-20分钟：40％B。

[0011] S4：质谱条件正离子模式条件以氮气作为雾化、锥孔气体飞行检测模型，正负极毛细管电压为3kV模式，两种模式下的锥形电压均为25V，源设置为120℃，锥形气体流量为50升/h，去溶剂化温度设定为450℃，850升/小时的去溶剂化气体流量，亮氨酸脑啡肽(Waters Co.，Manchester，UK)被用作锁定质量参考离子，m/z 556.2771正模式和负模式下m/z 554.2615，锁定喷雾以5μl/分钟的速率校准数据，使用两次斜碰撞能量扫描的连续模式获取MSE数据，低能量模式，扫描范围50-2000Da，扫描时间0.2s，碰撞能量设置为6V，高能量模式，扫描范围50-2000Da，扫描时间0.2s，斜碰撞能量15-60伏。

[0012] S5：收集血浆样本，处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，在进行检测分析后提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和配对样本T检验对数据进行分析，其中OPLS-DA按照OPLS的VIP值挖掘差异代谢物，得到睡眠认知行为治疗前后有差异的脂质分子，通过交叉比较，得到共有差异脂质分子，再对共有脂质分子与睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症患者的骨密度值(T、Z)和睡眠障碍量表分数做相关分析，通过分析相关性结果与临床症状的病理吻合性进行验证，得到代谢异常预测脂质分子。

[0013] 优选的，所述超高效液相色谱-质谱检测分析：将血清样本经色谱柱分离，并采用质谱检测分析。

[0014] 优选的，所述S3中色谱分离条件为：柱温为40℃流速为0.4毫升/分钟；流动相A组成，0.1％甲酸/10mM甲酸铵中乙腈/水；流动相B组成，B为0.1％甲酸酸/10mM甲酸铵在丙-2-醇/乙腈(9∶1v/v)中的溶液；梯度洗脱。

[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

[0016] 本发明抽取交叉验证的优异特点，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和配对样本T检验对数据分析结果进行交叉比对，避免交叉验证方法非独立性的缺点，将其应用于睡眠认知行为治疗睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症脂代谢异常有较大改善作用的脂质代谢标记物的研究中，通过与患者骨密度值(T、Z)和睡眠障碍量表分数的相关分析确认并验证差异脂质代谢物，从而在全面、综合地考察睡眠认知行为治疗睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症改善作用的脂质代谢相关标记物的同时，实现标记物的合理筛选。本方法对睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症患者的早期预测和预后提供有利的技术支持。附图说明

[0017] 图1为本发明流程示意图。

具体实施方式

[0018] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0019] 请参阅图1，本发明提供一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法技术方案：一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法，包括以下步骤：

[0020] S1：样品制备收集睡眠认知行为治疗睡眠障碍人群原发性骨质疏松症患者的血浆样本，经处理后准备进行超高效液相色谱-质谱检测分析，睡眠障碍根据匹兹堡睡眠质量指数量表(Pittsburgh sleep quality index，PSQI)确定。

[0021] S2：将所有被试开展睡眠认知行为治疗前后的100μl血浆与900μl丙-2-醇混合，涡旋超过10秒后超声处理10分钟，混合物-20℃冻存1小时，然后9500g离心10分钟，收集上层(800μl)并转移至上层，质量控制(QC)样品通过合并所有血清样品的等分试样代表分析中的血清样品，每5个样品中放置空白样品(丙-2-醇/水，9∶1v/v)和QC样品。

[0022] S3：超高效液相色谱-质谱检测分析：将血清样本经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，超高效液相色谱一质谱检测分析的仪器分析平台为UPLC-QTOF/MS(ACQUITY UPLC I-Class，Waters，Manchester，UK)，进行电喷雾电离四倍飞行时间质量光谱仪(Xevo G2-S Q-TOF，A Waters，Manchester，UK)，ACQUITY UPLC CSH色谱柱[1.7μm；50mm(长)×2.1mm(i.d.)]用于LC分离和色谱柱保持为55℃，流速为0.4毫升/分钟样品注射是2μl，进样量为4微升，保持自动进样器为4℃，初始线性梯度：40％B，0-2分钟40％B至43％B，2-2.1分钟：43％B至50％B，2.1-12分钟：50％B至54％B，12-12.1分钟：54％B至70％B，12.1-18分钟：
70％B至99％B，18-18.1分钟：99％B至40％B，18.1-20分钟：40％B，色谱分离条件为：柱温为
40℃流速为0.4毫升/分钟；流动相A组成，0.1％甲酸/10mM甲酸铵中乙腈/水；流动相B组成，B为0.1％甲酸酸/10mM甲酸铵在丙-2-醇/乙腈(9∶1v/v)中的溶液；梯度洗脱。

[0023] S4：质谱条件正离子模式条件以氮气作为雾化、锥孔气体飞行检测模型，正负极毛细管电压为3kV模式，两种模式下的锥形电压均为25V，源设置为120℃，锥形气体流量为50升/h，去溶剂化温度设定为450℃，850升/小时的去溶剂化气体流量，亮氨酸脑啡肽(Waters Co.，Manchester，UK)被用作锁定质量参考离子，m/z 556.2771正模式和负模式下m/z 554.2615，锁定喷雾以5μl/分钟的速率校准数据，使用两次斜碰撞能量扫描的连续模式获取MSE数据，低能量模式，扫描范围50-2000Da，扫描时间0.2s，碰撞能量设置为6V，高能量模式，扫描范围50-2000Da，扫描时间0.2s，斜碰撞能量15-60伏。

[0024] S5：收集血浆样本，处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，在进行检测分析后提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和配对样本T检验对数据进行分析，其中OPLS-DA按照OPLS的VIP值挖掘差异代谢物，得到睡眠认知行为治疗前后有差异的脂质分子，通过交叉比较，得到共有差异脂质分子，再对共有脂质分子与睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症患者的骨密度值(T、Z)和睡眠障碍量表分数做相关分析，通过分析相关性结果与临床症状的病理吻合性进行验证，得到代谢异常预测脂质分子。

[0025] 工作原理：本方法基于睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法，包括收集原发性骨质疏松症患者认知行为治疗6周前后的匹兹堡国际睡眠质量量表与血浆样本，量表评分进行标准化，血浆处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析，再进行LC/MS检测分析后提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据；对数据进行分析得到代谢组轮廓，建立双重交叉验证筛选模型，筛选睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症患者使用认知行为疗法干预前后脂质差异特异性标记物；本发明可以综合地体现睡眠障碍人群出现原发性骨质疏松症情况时代谢产物的变异状况，可用于睡眠障碍人群是否出现骨质疏松症的早期预测和预后提供有利的技术支持。

[0026] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

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一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法

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