技术领域
[0001] 本
发明涉及
化妆品检测领域，尤其是一种用于检测祛斑类化妆品和香波中酚类化合物的纯度标准物质研制方法，酚类化合物主要指苯酚和对苯二酚。
背景技术
[0002] 化妆品中添加剂的准确检测对化妆品的安全性至关重要，由于苯酚和对苯二酚是化妆品中禁用物质，因此对于该种痕量添加剂的准确检测的难度大大增加。目前，化妆品中添加剂类的定量检测大多采用直接检测法，但是，在实际应用过程中，对于同一样品，不同检测机构提供的检测结果不尽相同，甚至差异较大。与标准化合物相比，化妆品中添加剂类标准物质不但具有准确计量的或严格定义的标准量值，还能保证特性量值在特定时间期限和贮存条件下保持在规定范围内的能
力，具有量值溯源性，对提高化妆品生产、
质量控制、检验的检测
水平以及添加剂类物质分析方法的评价和确认具有重要意义。
发明内容
[0003] 为了解决背景技术中存在的问题，本发明的提出了一种苯酚和对苯二酚标准物质的纯度值和不确定度的测定方法，能够准确测定苯酚和对苯二酚纯度值，并建立针对该纯度值的定值进行不确定度评价。
[0004] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0005] 步骤1：对原料进行筛查，使得纯度合格并进行下一步骤，合格后的产品作为待测样品进行下一步骤；
[0006] 步骤2：采用气相色谱-质谱联用法和傅里叶变换红外
光谱法联合对待测样品进行定性确证；
[0007] 步骤3：采用基于气相色谱(GC)法、高效液相色谱(HPLC)法和差示扫描量热(DSC)法三种不同原理的方法联合对待测样品进行纯度测定；
[0008] 步骤4：将待测样品进行分装后，再进行均匀性和
稳定性检验；
[0009] 所述的稳定性包括短期稳定性和长期稳定性。
[0010] 步骤5：根据步骤3计算得到纯度测定引起的不确定度，根据步骤4计算得到均匀性和稳定性引起的不确定度，将各个不确定度进行合成获得总不确定度。
[0011] 所述步骤1：原料筛查具体为：
[0012] 先将工业原料采用HPLC法(见步骤3-1.2)进行纯度初检，判断纯度值是否合格，纯度值不低于99％则认为合格进行下一步骤，不合格则进行重结晶处理，直至纯度合格。此时的产品作为待测样品进行下一步骤。
[0013] 所述纯度值合格是指纯度不低于99％。
[0014] 所述的原料为苯酚或者对苯二酚。本发明方法针对研制包括苯酚纯度标准物质和对苯二酚纯度标准物质。
[0015] 所述步骤2：定性确证具体为：
[0016] 将待测样品分别制成供试品溶液和固体压片后，再分别采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法和
傅立叶变换红外光谱(FT-IR)法采集得到质谱图和红外光谱图，质谱图和红外光谱图与标准谱图对照，根据匹配度定性确证原料的真实性，若原料真实则进行下一步骤。
[0017] 所述步骤2中将纯度初检合格后的待测样品制成供试品溶液和固体压片具体是：针对待测样品，一方面溶于纯甲醇制成供试品溶液，另一方面采用溴化
钾(KBr)固体压片法混合
研磨并用模具压制成固体薄片。
[0018] 所述步骤2中采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法采集得到质谱图具体是：
[0019] 将供试品溶液进样到色谱柱中，设置进样口
温度为250℃，传输线温度为280℃，载气流速为1mL/min，进样量为10μL，分流比为10:1，再采用两阶梯逐步升温方式，质谱部分均采用全扫描模式，扫描范围为12-500m/z，
溶剂延迟时间为3min，采集到质谱图。
[0020] 对于苯酚的供试品溶液，色谱柱升温操作为：采用初始温度60℃，保持1min后，以15℃/min的速率升温至270℃，保持10min。
[0021] 对于对苯二酚原料，色谱柱升温操作为：采用初始温度60℃，以10℃/min的速率升温至110℃，保持0.5min后，再以10℃/min的速率升温至180℃，保持3min。
[0022] 所述步骤2中采用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)法采集得到红外光谱图具体是：将固体压片后的样品上架采用DTGSKBr检测器和KBr分束器测试，
采样增益设置为1.0，红外光谱扫描范围为4000～400cm-1，样品扫描8次，背景扫描8次，取
分辨率为4.000cm-1，从而获得红外光谱图。
[0023] 所述步骤3：纯度测定具体为：
[0024] 3-1：针对待测样品，制成供试品溶液后，联合测定获得两组纯度值数据，两组纯度值数据均具有进行多次测定获得的数据；
[0025] 本发明处理过程中，GC法和HPLC法是基于质量平衡法(简写作“MB”)原理实现的，还需要对如溶剂残留、水分和灰分不响应的杂质再分别用顶空-GC法、卡尔费休库伦法和热重分析法测定。
[0026] 3-2：针对待测样品，采用差示扫描量热(DSC)法测定纯度值，获得一组纯度值数据，该组纯度值数据具有进行多次测定获得的数据；
[0027] 3-3：对于每个待测样品，重复步骤3-1和步骤3-2进行测量，将获得三组纯度值数据，进行
数据处理获得待测样品的最终纯度值。
[0028] 所述步骤3-1具体为：
[0029] 3-1.1：采用GC法采集色谱图，将色谱图用面积归一化法计算得到待测样品的初始纯度值IGC；
[0030] 3-1.2：用HPLC法采集色谱图，将色谱图用面积归一化法计算得到待测样品的初始纯度值IHPLC；
[0031] 3-1.3：分别采用静态顶空进样-GC-氢火焰
离子化(FID)检测器、卡尔费休库仑仪和热重分析仪对待测样品进行测定，分别获得残留溶剂的百分比含量Isolv、水分的百分比含量Imoi、灰分的百分比含量Iash(三种杂质的百分比含量)；
[0032] 3-1.4：根据步骤3-1.1和3-1.2获得的两个初始纯度值，分别经步骤3-1.3获得的杂质百分比含量计算获得GC法和HPLC法分别对应的两个修正纯度值I’GC和I’HPLC；
[0033] 3-1.5：重复步骤3-1.1～3-1.4进行多次测量获得两组纯度值数据。
[0034] 所述步骤3-1.1具体为：
[0035] 本发明优化后的GC法测试过程如下：将供试品溶液进样到弱极性色谱柱DB-1701(30m×0.32mm×0.25μm)中，设置进样口温度280℃，FID检测器温度280℃，载气氮气流速1mL/min，进样量1μL，分流比2.5：1；再采用三阶梯逐步升温方式进行操作，从而采集到色谱图，将色谱图用面积归一化法计算获得纯度值。
[0036] 对于苯酚，柱温条件设置初始时为65℃，以3℃/min的速率升温至200℃，再以10℃/min的速率升温至260℃，保持6min。苯酚的升温过程是
[0037] 对于对苯二酚，柱温条件设置初始时50℃，以8℃/min的速率升温至220℃，再以15℃/min的速率升温至270℃，保持6min。对苯二酚的升温过程是
[0038] 本发明比较了HP-5(弱极性，30m×0.25mm×0.25μm)，DB-1701(中等极性，30m×0.25mm×0.25μm)，DB-WAX(强极性，30m×0.25mm×0.25μm)3种不同极性色谱柱的对杂质和主成分的分离结果，结果表明，DB-1701色谱柱最有利于杂质的流出并检测，且杂质与主成分的理论塔板数更高、分离效果更佳，HP-2色谱柱的分离效果次之，DB-WAX色谱柱最差。
[0039] 所述步骤3-1.2具体为：
[0040] 本发明优化后的HPLC法测试过程如下：
[0041] 采用C18色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，设置进样量为10μL，柱流量为1mL/min，柱温为25℃，构建原料的流动相采集检测
波长为190nm～400nm的3D数据，波长分离度为1.2nm。以271.0nm(苯酚)和289.0nm(对苯二酚)为定值波长，从而采集到色谱图，将色谱图用面积归一化法计算获得纯度值。
[0042] 对于苯酚，流动相组成为30％甲醇+70％纯水。
[0043] 对于对苯二酚，流动相组成为70％甲醇+30％纯水。
[0044] 本发明在采用C18色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)
基础上，比较5种不同比例的甲醇(A)和纯水(B)为流动相(a.10％A+90B％；b.30％A+70％B；c.50％A+50％B；d.70％A+30％B；e.90％A+10％B)对杂质和主成分分离结果的影响，在杂质和主成分分子量相近的条件下，可保证各个组分极性大小的顺序出峰。通过实验分析确定本发明的苯酚和对苯二酚的流动相组成。
[0045] 由于进样量过低会导致苯酚中低含量的杂质低于仪器的
检测限而无法被检测出，若进样量(或柱流量或柱温)过高，则会导致苯酚中杂质与主成分分离不佳，且主成分出峰峰形不对称。因而选择本发明进样量为10μL的具体工艺条件。
[0046] 所述步骤3-1.3具体为：
[0047] (1)残留溶剂百分比含量测定：
[0048] 针对待测样品，根据原料生产工艺估计待测样品中可能产生的残留溶剂种类，依次运用静态顶空法进样、气相色谱法分离和FID检测器法检测测定残留溶剂的百分比含量。
[0049] 静态顶空进样法测定条件是：平衡温度80℃，定量环温度90℃，转移线温度110℃，平衡时间30min，加压时间2min；
[0050] 气相色谱法测定条件是：采用Agilent DB-624色谱柱，30m×0.32mm×0.50μm，载气流速1mL/min，分流比10:1，进样口温度200℃，起始柱温40℃，保持15min，以10℃/min程序升温至150℃，保持10min；
[0051] FID检测器检测条件是：温度250℃；将FID检测器检测获得的色谱图运用外标法计算残留溶剂的浓度值。
[0052] (2)水分百分比含量测定：
[0053] 针对待测样品，运用卡尔费休库仑仪测定获得水分的百分比含量，测定条件是：
[0054] 检测
环境温度为20℃，湿度为40％，极化
电极为DM143-5C，极化
电流5.0μA，指示单位为
电压(mV)，搅拌转速45％，控制终点为100.0mV；
电解电极的电流为自动终止，终止类型为漂移相对终止，漂移值为3.0μg/min，时间范围为0～3600s。
[0055] (3)灰分百分比含量测定：
[0056] 针对待测样品，运用热重分析仪测定获得灰分的浓度值，测定条件是：采用Al2O3
坩埚，在初温25℃以10℃/min的速率升温至650℃；记录
热分解过程中的质量变化，得到热重曲线，根据热重曲线分析输出灰分的浓度值。
[0057] 所述步骤3-1.4具体是：
[0058] I'GC＝(100％-Imoi-Isolv-Iash)×IGC
[0059] I'HPLC＝(100％-Imoi-Isolv-Iash)×IHPLC 公式(1)
[0060] 式中，I'GC和I'HPLC分别为气相色谱(GC)法和高效液相色谱(HPLC)法对应的修正纯度值，I'GC和I'HPLC是由上述公式从IGC和IHPLC修正得到，IGC和IHPLC分别为气相色谱(GC)法和高效液相色谱(HPLC)法对应获得的初始纯度值，Imoi、Isolv和Iash分别表示水分、溶剂残留和灰分的浓度值。
[0061] 所述步骤3-2具体为：差示扫描
量热法测纯度，采用空的40μL标准
铝坩埚为参比，称样量为3.24～6.80mg，再采用三阶梯逐步升温方式进行操作，然后采用纯度分析
软件Proteus Analysis获得纯度值IDSC，并进行多次测定获得两组纯度值数据。
[0062] 对于苯酚，初始温度为0℃，以5℃/min的速率升温至20℃，再以1℃/min的速率升温至60℃。苯酚的升温过程是
[0063] 对于对苯二酚，初始温度为0℃，以20℃/min的速率升温至155℃，再以10℃/min的速率升温至190℃。对苯二酚的升温过程是
[0064] 所述步骤3-3具体为：
[0065] 针对同一待测样品，将运用三种方法测得的三组纯度值数据采用以下方式依次处理：
[0066] 3-3.1：针对三组纯度值数据(即为多次测定获得的纯度值I'GC，I'HPLC和IDSC)，分别先运用峰态系数法和偏态系数法进行正态分布性检验，再运用Grabbs法和Dixon法进行离群值检验剔除可疑值；
[0067] 3-3.2：三组纯度值数据的每两组纯度值之间(即I'GC与I'HPLC之间，I'HPLC与IDSC之间，I'GC与IDSC之间)均运用t检验法进行平均值的等
精度检验，运用F检验法进行标准偏差的等精度检验；
[0068] 3-3.3：根据平均值和标准偏差的等精度结果，求取平均值作为原料的最终纯度值：
[0069] 若步骤3-3.1保留的纯度值数据同时满足平均值和标准偏差的等精度，则取三组纯度值数据的算术平均值；
[0070] 若步骤3-3.1保留的纯度值数据不同时满足平均值和标准偏差的不等精度，则取三组纯度值数据的加权平均值。
[0071] 所述步骤4中将原料进行分装具体是：在常温20℃±3℃的
洁净室中准确称取待测样品50mg左右，分装至棕色玻璃样品瓶中，得到分装样品，重复上述步骤，获得分装样品200瓶，编上号码，于冷藏和避光条件下保存，用于后续均匀性和稳定性检验。
[0072] 所述步骤4中在分装后具体为：
[0073] 4-1：均匀性检验
[0074] 分别从200瓶分装样品中按照头尾、中间编号随机
抽取10瓶样品，配制成供试品溶液，振荡，按照HPLC法(见步骤3-1.2)测定纯度值，每瓶样品平行测定3次；再采用单因素方差分析方法对测定结果进行统计分析，计算F统计值，查表获得F临界值，通过比较F统计值和F临界值，检验分装样品的均匀性；若F统计值小于F临界值，则样品均匀；若F统计值大于等于F临界值，则样品不均匀。
[0075] F统计值计算方式如下：
[0076]
[0077] 式中，Sinter和Sintra分别表示瓶间和瓶内方差，νinter和νintra分别表示瓶间和瓶内
自由度。
[0078] 4-2：稳定性检验
[0079] 4-2.1短期稳定性
[0080] 从分装样品中随机抽取数瓶，分别放在4℃、20℃和50℃环境中，分别至第1天，第2天，第5天和第8天各取出1瓶后，配制成供试品溶液，振荡，按照HPLC法(见步骤3-1.2)测定纯度值，每瓶样品平行测定3次，取平均值；再以放置在4℃环境中的分装样品测得的纯度值为标准，查表获得t临界值，计算t统计值ttest，通过比较t统计值和t临界值检验短期稳定性：若t统计值小于t临界值，则样品短期稳定；若t统计值大于等于t临界值，则样品短期不稳定。
[0081] t统计值ttest计算公式如下：
[0082]
[0083] 式中，x0和s0分别表示放置在4℃
冰箱中的分装样品测得的纯度平均值和纯度标准偏差，和s分别表示放置在各个不同温度环境下的分装样品测得的纯度值和标准偏差，n表示平行测定的次数(此时n＝3)。
[0084] 4-2.2长期稳定性
[0085] 将分装样品储存于20℃环境中，采用HPLC法(见步骤3-1.2)进行12个月的稳定性监测，按照先密后疏的原则选取时间
节点，每个时间节点选取1个样品，每个样品平行测定3次，取平均值；然后在潜在动力学机理未知的情况下，采用线性模型进行线性拟合，以x代表时间，以y代表某个时间节点的样品纯度值，拟合成一条直线，利用该直线斜率的显著性判断样品的稳定性。
[0086] 利用该直线斜率的显著性作为稳定性，来判断样品的稳定性具体是计算直线斜率的标准差，标准差与查表的t检验临界值相乘后和直线斜率的绝对值比较，如果直线斜率的绝对值小，则样品长期稳定；否则样品长期不稳定。
[0087] 所述步骤5是采用以下方式计算获得总不确定度：
[0088] 5-1：先采用以下计算方法获得GC法和HPLC法测定纯度值引起的不确定度：
[0089] 根据公式(1)，将基于GC法和HPLC法获得I'GC和I'HPLC的计算公式合并为：
[0090] I'GC-HPLC＝(100％-Imoi-Isolv-Iash)×IGC-HPLC＝f1(IGC-HPLC,Imoi,Isolv,Iash) 公式(4)[0091] 将获得I'GC和I'HPLC过程引起的不确定度合并为一个不确定度考虑u'GC-HPLC，根据公式(4)，推导其计算公式如下：
[0092]
[0093] 公式(5)中，uGC-HPLC表示获得IGC和IHPLC引起的合成不确定度，和 分别表示第一函数f1(见公式(4)对IGC-HPLC，Imoi，Isolv，Iash求偏导数，
umoi、usolv和uash分别表示水分、溶剂残留和灰分测定引起的不确定度，第一函数f1表示为f1(IGC-HPLC,Imoi,Isolv,Iash)＝(100％-Imoi-Isolv-Iash)×IGC-HPLC。
[0094] uGC-HPLC的计算方式为： uGC和uHPLC分别表示获得IGC和IHPLC引起的不确定度分量，由待测样品中主成分和杂质的响应因子差异、测量重复性以及仪器检测限引起的不确定度分量经合成获得，响应因子差异根据有效
碳数法计算校正响应因子计算获得，有效碳数等于组分(主成分或者杂质)的分子量与该组分分子中含有的碳
原子个数之比；umoi、usolv和uash分别以水分、溶剂残留和灰分测定的重复性计。
[0095] 5-2：再采用以下公式计算DSC法测定纯度值引起的不确定度uDSC：
[0096]
[0097] 其中，uDSC-A和uDSC-B表示DSC法测定中A类评定和B类评定的标准不确定度，uDSC-A是通过测量DSC法的重复性计算得到；
[0098] 对于uDSC-B，由于DSC法测定纯度的原理是基于范特霍夫方程，该方程如下：
[0099]
[0100] IDSC表示DSC法测定样品的纯度值，y表示杂质的摩尔分数，T0和Tm分别表示纯样品和实际样品的熔融温度，△Hf表示摩尔熔融
焓，R为气体常数，Q为样品吸收的热量，m为样品的质量，M为样品的摩尔质量。
[0101] 因此，uDSC-B的计算方法如下：
[0102]
[0103] 其中，um，uQ，uT分别为天平的称量误差、仪器的热量测量误差、仪器的温度误差这三个互相不相关的输入量的标准不确定度， 分别表示第二函数f2对m，Q，T0，Tm求偏导数，c1，c2，c3分别表示质量、热量和温度的计算值；
[0104] 第二函数f2表示为：
[0105]
[0106] 式中，T0和Tm分别表示纯样品和实际样品的熔融温度，R为气体常数，Q为样品吸收的热量，m为样品的质量，M为样品的摩尔质量。
[0107] 5-3：计算分不确定度
[0108] 根据均匀性检验得到的单因素方差分析结果采用以下公式计算得到均匀性引起的不确定度uH：
[0109]
[0110] 根据长期稳定性检验得到的拟合直线斜率的标准偏差乘以稳定性监测时间，采用以下公式计算得到稳定性引起的不确定度us：
[0111] uS＝s(b1)·t 公式(10)
[0112] 5-4：计算总不确定度
[0113] 采用以下公式将GC法、HPLC法和DSC法测定纯度引起的不确定度，以及均匀性和稳定性引起的不确定度进行综合计算得到总不确定度，公式如下：
[0114]
[0115] 其中，uH表示均匀性引起的不确定度，uS表示稳定性引起的不确定度，u'GC-HPLC表示GC法和HPLC法获得纯度修正值引起的合成不确定度，uDSC表示DSC法测定纯度值引起的不确定度。
[0116] 所述步骤1中的纯度初检和所述步骤4的均匀性和稳定性检验中的纯度值测定均与所述步骤3-1.2相同的过程。
[0117] 本发明通过原材料筛选、定性确证、纯度测定、均匀性和稳定性检验以及不确定度计算，获得了了苯酚和对苯二酚的标准物质，从而提高化妆品中酚类物质检测的准确度，同时保证检测结果的溯源性。
[0118] 本发明的有益效果是：
[0119] 本发明能够准确测定苯酚和对苯二酚纯度值，并建立针对该纯度值的定值获取不确定度的方式。
[0120] 本发明定性准确全面，三种纯度测定方法减少了因单一定值方法带来的系统误差，均匀性、稳定性和不确定度评估方法系统全面，保证了量值准确性、稳定性和可溯源性，获得了高纯度(99％以上)苯酚和对苯二酚纯度标准物质。
[0121] 本发明测定结果可获得苯酚和对苯二酚纯度标准物质，并通过纯度标准物质使得化妆品中相应添加剂的检测结果更加准确，可用于相应物质检测结果的量值溯源和量值传递、分析方法和检测能力的评价以及生产过程中的质量控制。
附图说明
[0123] 图2是
实施例1采集到的苯酚的质谱图；
[0124] 图3是实施例1采集到的苯酚的红外光谱图；
[0125] 图4是实施例1采集到的苯酚的气相色谱图；
[0126] 图5是实施例1采集到的苯酚的液相色谱图；
[0127] 图6是实施例1采集到的苯酚的差示扫描量热法曲线图；
[0128] 图7是实施例2采集到的对苯二酚的质谱图；
[0129] 图8是实施例2采集到的对苯二酚的红外光谱图；
[0130] 图9是实施例2采集到的对苯二酚的液相色谱图；
[0131] 图10是实施例2采集到的对苯二酚的气相色谱图；
[0132] 图11是实施例2采集到的对苯二酚的差示扫描量热法曲线图。
具体实施方式
[0133] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0134] 本发明的实施例如下：
[0135] 实施例1：苯酚
[0136] 步骤1——原料筛选
[0137] 采用百灵威科技有限公司生产的苯酚原料。运用HPLC法(见实施例1步骤3-1.2)测定纯度值，重结晶2次后得到纯度初检合格后的待测样品。
[0138] 步骤2——定性确证
[0139] 运用GC-MS法和FT-IR法定性确证苯酚。
[0140] 步骤2-1、采用GC-MS法定性确证苯酚
[0141] 针对苯酚待测样品，溶于甲醇后制成供试品溶液，进样测试。测试条件如下：设置进样口温度为250℃，传输线温度为280℃，载气流速为1mL/min，进样量为10μL，分流比为10:1；色谱柱升温操作为：采用初始温度60℃，保持1min后，以15℃/min的速率升温至270℃，保持10min。
[0142] 由附图1可得，分子离子峰94，经NIST标准谱图库检索得苯酚标准质谱图，二者匹配度为96％。
[0143] 步骤2-2、采用FT-IR法定性确证苯酚
[0144] 针对苯酚待测样品，采用KBr混合研磨后用模具压制成固体薄片，上架测试。测试条件如下：采用DTGS KBr检测器和KBr分束器测试，采样增益设置为1.0，红外光谱扫描范围为4000～400cm-1，样品扫描8次，背景扫描8次，取分辨率为4.000cm-1，从而获得红外光谱图(见附图2)。
[0145] 由附图2可得，ν＝3355.44cm-1(1)附近宽大的吸收峰是容易发生缔合的酚羟基O-H的伸缩振动峰，ν＝3090.03cm-1(2)，ν＝3046.04cm-1(3)，ν＝3020.22cm-1(4)均是苯环上不饱和C-H键的伸缩振动峰，ν＝1599.81cm-1(5)，ν＝1499.28cm-1(6)均是苯环的骨架振动，ν＝1231.12cm-1(7)是酚羟基中C-O的伸缩振动峰，ν＝752.99cm-1(8)和ν＝690.54cm-1(9)，是苯环上单取代的C-H键弯曲振动峰。经标准谱图库检索得苯酚标准红外光谱图，二者匹配度为94％。
[0146] 步骤3——纯度测定
[0147] 运用GC法、HPLC法和DSC法测定苯酚纯度。
[0148] 步骤3-1、针对苯酚的待测样品，溶于纯甲醇，制成供试品溶液，采用GC法和HPLC法联合测定纯度值；溶剂残留、水分和灰分不响应的杂质再分别用顶空-GC法、卡尔费休库伦法和热重分析法测定。
[0149] 步骤3-1.1、采用GC法采集色谱图，优化采集条件如下：
[0150] 比较了HP-5(弱极性，30m×0.25mm×0.25μm)，DB-1701(中等极性，30m×0.25mm×0.25μm)，DB-WAX(强极性，30m×0.25mm×0.25μm)3种不同极性色谱柱的对杂质和主成分的分离结果，结果表明，DB-1701色谱柱最有利于杂质的流出并检测，且杂质与主成分的理论塔板数更高、分离效果更佳，因此选择弱极性色谱柱DB-1701(30m×0.32mm×0.25μm)。
[0151] 设置进样口温度280℃，FID检测器温度280℃，载气氮气流速1mL/min，进样量1μL，分流比2.5：1；色谱柱升温过程是将采集到的色谱图(见附图3)用面积归一化法计算获得初始纯度值(用IGC表示)。附图3中，峰1为溶剂峰，峰2为苯酚，峰3为杂质，曲线b是曲线a的放大图。
[0152] 步骤3-1.2、采用HPLC法采集色谱图，优化采集条件如下：
[0153] 比较了5种不同比例的甲醇(A)和纯水(B)为流动相(a.10％A+90B％；b.30％A+70％B；c.50％A+50％B；d.70％A+30％B；e.90％A+10％B)对杂质和主成分分离度、理论塔板数、峰宽、对称性因素的影响，确定构建流动相组成为30％纯甲醇+70％纯水，采用C18色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，设置进样量为10μL，柱流量为1mL/min，柱温为25℃，采集检测波长为190nm～400nm的3D数据，以271.0nm苯酚为定值波长，将采集到的色谱图(见附图4)用面积归一化法计算获得初始纯度值(用IHPLC表示)。附图4中峰1和峰2为杂质，峰3为苯酚，曲线b是曲线a的放大图。
[0154] 步骤3-1.3、分别采用静态顶空进样-GC-氢火焰离子化(FID)检测器、卡尔费休库仑仪和热重分析仪对待测样品进行测定，分别获得残留溶剂、水分、灰分的三种杂质的百分比含量(分别用Isolv，Imoi和Iash表示)。具体测定条件如下：
[0155] (1)残留溶剂百分比含量测定：
[0156] 针对待测样品，根据原料生产工艺，估计待测样品中可能产生的残留溶剂种类为丙
酮，依次运用静态顶空法进样、气相色谱法分离和FID检测器法检测采集色谱图。
[0157] 静态顶空进样法测定条件是：平衡温度80℃，定量环温度90℃，转移线温度110℃，平衡时间30min，加压时间2min；
[0158] 气相色谱法测定条件是：采用Agilent DB-624色谱柱，30m×0.32mm×0.50μm，载气流速1mL/min，分流比10:1，进样口温度200℃，起始柱温40℃，保持15min，以10℃/min程序升温至150℃，保持10min；
[0159] FID检测器检测条件是：温度250℃；
[0160] 依照上述测定条件建立纯丙酮溶剂的标准曲线，运用外标法计算丙酮的百分比含量(用Isolv表示)。
[0161] (2)水分百分比含量测定：
[0162] 针对待测样品，运用卡尔费休库仑仪测定水分的百分比含量，测定条件是：
[0163] 检测环境温度为20℃，湿度为40％，极化电极为DM143-5C，极化电流5.0μA，指示单位为电压(mV)，搅拌转速45％，控制终点为100.0mV；电解电极的电流为自动终止，终止类型为漂移相对终止，漂移值为3.0μg/min，时间范围为0～3600s。获得的水分百分比含量用Imoi表示。
[0164] (3)灰分百分比含量测定：
[0165] 针对待测样品，运用热重分析仪测定获得灰分的浓度值，测定条件是：采用Al2O3坩埚，在初温25℃以10℃/min的速率升温至650℃；记录热分解过程中的质量变化，得到热重曲线，根据热重曲线分析输出灰分的百分比含量(用Iash表示)。
[0166] 3-1.4、根据步骤3-1.1和3-1.2获得的纯度值，分别经步骤3-1.3获得的杂质百分比含量，根据公式(1)计算获得修正纯度值(分别用I'GC和I'HPLC表示)。
[0167] 步骤3-2、针对苯酚的待测样品，采用DSC法测定苯酚纯度值。测定条件如下：
[0168] 采用空的40μL标准铝坩埚为参比，称样量为3.24～6.80mg，升温过程是采集DSC曲线(见附图5)，采用软件对曲线进行
纯度分析获得纯度值(用IDSC表示)。
[0169] 步骤3-3对于每个苯酚的待测样品，重复步骤3-1和步骤3-2进行10次测定，获得10次测定对应的三组纯度值，进行数据处理获得待测样品的最终纯度值。
[0170] 步骤3-3.1
[0171] 3-3.1：针对三组纯度值(I'GC，I'HPLC和IDSC)，分别先运用峰态系数法和偏态系数法进行正态分布性检验，再运用Grabbs法和Dixon法进行离群值检验，结果表明无可疑值，保留数据进行下一步骤；
[0172] 3-3.2：针对每两组纯度值(I'GC与I'HPLC，I'HPLC与IDSC，I'GC与IDSC)进行等精度检验，t检验结果显示三组数据的平均值是等精度的，F检验结果显示三组数据的标准偏差是等精度的；
[0173] 3-3.3：数据处理结果见表1。由于三组数据为等精度测定，则取三组纯度值的算术平均值为最终纯度值，即为：
[0174]
[0175] 表1三种方法测定苯酚纯度值结果
[0176]
[0177]
[0178] 步骤4——分装
[0179] 在常温20℃±3℃的洁净室中准确称取苯酚50mg左右，分装至棕色玻璃样品瓶中，获得分装样品，重复上述步骤，获得分装样品约200瓶，编上号码，于冷藏和避光条件下保存。用于均匀性和稳定性检验。
[0180] 步骤5——均匀性检验
[0181] 苯酚均匀性检验结果见表2。采用单因素方差分析方法对数据进行统计分析，根据公式(2)得到 即F统计值为2.24，查F检验临界值表可知：F0.05(9，20)＝2.39，即F临界值为2.39，因此F统计值
[0182] 表2苯酚均匀性检验结果
[0183]
[0184]
[0185] 步骤6——稳定性检验
[0186] 步骤6-1短期稳定性检验
[0187] 表3苯酚的短期稳定性检验结果
[0188]
[0189] 苯酚的短期稳定性检验结果见表3。以放置在4℃环境中的分装样品测得的纯度值为标准。由表3得，纯度标准值为x0＝99.60％，，其相对标准偏差为s0＝0.03％，平行测定次数n＝3，自由度ν＝n+n-2＝4。代入公式(3)计算得到t统计值(用ttest表示)。查t分布双侧分位数表可知，t(0.05,4)＝2.78。由表3得，在20℃条件下，ttestt(0.05,4)，表明分装样品在常温稳定性良好，而在高温条件下分装样品的纯度值发生显著衰减，因此分装样品需在常温下保存。
[0190] 步骤6-2长期稳定性检验
[0191] 表4苯酚的长期稳定性检验结果
[0192]
[0193] 苯酚的长期稳定性检验结果见表4。设时间对纯度值的方程为y＝b0+b1x，斜率的标准偏差为s(b1)，经回归分析得|b1|＝8.6×10-3，s(b1)＝3.78×10-3，经查t检验临界值表得t(0.95,4)＝2.78，则|b1|
[0194] 步骤7——不确定度评定
[0195] 步骤7-1纯度测定引起的不确定度评定
[0196] 三种方法进行纯度测定引起的不确定度结果如表所示(表5：GC法和HPLC法；表6：DSC法)。
[0197] 表5 GC法和HPLC法测定纯度引起的不确定度
[0198]
[0199] 表6 DSC法纯度测定引起的不确定度
[0200]
[0201] 纯度测定引入的不确定度(用uD表示)，由三种方法的不确定度合成，则得到：
[0202] 步骤7-2均匀性和稳定性引入的不确定度评定
[0203] 根据均匀性检验结果和公式(9)，得到均匀性引入的不确定度分量为：根据稳定性检验结果和公式(10)，有效期t＝12个月的
长期稳定性的不确定度为：uS＝s(b1)·t＝4.5×10-2％
[0204] 步骤8——结论
[0205] 根据步骤3得到，苯酚的纯度标准值为99.42％，根据步骤7和公式(11)标准不确定度为0.10％，扩展不确定度为0.20％，k＝2。在有效期一年时间内、常温下储存的均匀性和稳定性良好，可作为纯度标准物质用于化妆品中苯酚的准确测定、量值传递和量值溯源。
[0206] 本实施例的苯酚纯度标准物质经用户单位(深圳市通检测技术有限公司、深圳中检联检测有限公司和杭州市环境监测中心站)试用后，出具了用户试用报告，试用报告表示，该标准物质均匀性良好，量值准确可靠，使用方便，满足了化妆品中苯酚百分比含量准确测定的要求，具有很高的实用价值和推广价值。
[0207] 实施例2：对苯二酚
[0208] 步骤1原料筛选
[0209] 通过市售的采用百灵威科技有限公司生产的对苯二酚原料。运用HPLC法(见实施例2步骤3-1.2)测定纯度值，重结晶3次后得到纯度初检合格后的待测样品。
[0210] 步骤2——定性确证
[0211] 运用GC-MS法和FT-IR法定性确证对苯二酚。
[0212] 步骤2-1、采用GC-MS法定性确证对苯二酚
[0213] 针对对苯二酚待测样品，溶于甲醇后制成供试品溶液，进样测试。测试条件如下：设置进样口温度为250℃，传输线温度为280℃，载气流速为1mL/min，进样量为10μL，分流比为10:1；色谱柱升温操作为：色谱柱升温操作为：采用初始温度60℃，以10℃/min的速率升温至110℃，保持0.5min后，再以10℃/min的速率升温至180℃，保持3min，采用全扫描方式扫描，扫描范围为12-500m/z，溶剂延迟时间为3min。采集到的质谱图与标准质谱图对照，得到匹配度95％，表明待测样品是真实的(见附图6)。
[0214] 由附图6可得，分子离子峰119.9，经标准谱图库检索得对苯二酚标准质谱图，二者匹配度为95％。
[0215] 步骤2-2、采用FT-IR法定性确证对苯二酚
[0216] 针对对苯二酚待测样品，采用KBr混合研磨后用模具压制成固体薄片，上架测试。测试条件如下：
[0217] 采用DTGS KBr检测器和KBr分束器测试，采样增益设置为1.0，红外光谱扫描范围为4000～400cm-1，样品扫描8次，背景扫描8次，取分辨率为4.000cm-1，从而获得红外光谱图(见附图7)。
[0218] 由附图7可得，ν＝3261.34cm-1(1)处宽大的吸收峰是容易发生缔合的酚羟基O-H的伸缩振动峰。ν＝3030.11cm-1(2)是苯环上不饱和C-H键的伸缩振动峰。ν＝1517.92cm-1(3)，ν＝1475.25(4)均是苯环的骨架振动，ν＝1242.99cm-1(5)，ν＝1209.42cm-1(6)，ν＝1191.72cm-1(7)是酚羟基中C-O的伸缩振动峰，ν＝827.22cm-1(8)是苯环上1,4-二取代的C-H键弯曲振动峰。与标准谱图对照后，匹配度为94％。
[0219] 步骤3——纯度测定
[0220] 运用GC法、HPLC法和DSC法测定对苯二酚纯度。
[0221] 步骤3-1、针对对苯二酚的待测样品，溶于纯甲醇，制成供试品溶液，采用GC法和HPLC法联合测定纯度值；溶剂残留、水分和灰分不响应的杂质再分别用顶空-GC法、卡尔费休库伦法和热重分析法测定。
[0222] 步骤3-1.1、采用GC法采集色谱图，优化采集条件如下：
[0223] 比较了HP-5(弱极性，30m×0.25mm×0.25μm)，DB-1701(中等极性，30m×0.25mm×0.25μm)，DB-WAX(强极性，30m×0.25mm×0.25μm)3种不同极性色谱柱的对杂质和主成分的分离结果，结果表明，DB-1701色谱柱最有利于杂质的流出并检测，且杂质与主成分的理论塔板数更高、分离效果更佳，因此选择弱极性色谱柱DB-1701(30m×0.32mm×0.25μm)。
[0224] 设置进样口温度280℃，FID检测器温度280℃，载气氮气流速1mL/min，进样量1μL，分流比2.5：1；色谱柱升温过程是将采集到的色谱图(见附图8)用面积归一化法计算获得初始纯度值(用IGC表示)。
[0225] 附图8中，峰1是溶剂，峰2是对苯二酚，峰3是杂质。曲线b是曲线a的放大图。
[0226] 步骤3-1.2、采用HPLC法采集色谱图，优化采集条件如下：
[0227] 比较了5种不同比例的甲醇(A)和纯水(B)为流动相(a.10％A+90B％；b.30％A+70％B；c.50％A+50％B；d.70％A+30％B；e.90％A+10％B)对杂质和主成分分离度、理论塔板数、峰宽、对称性因素的影响，确定构建流动相组成为70％纯甲醇+30％纯水，采用C18色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，设置进样量为10μL，柱流量为1mL/min，柱温为25℃，采集检测波长为190nm～400nm的3D数据，以289.0nm苯酚为定值波长，将采集到的色谱图(见附图9)用面积归一化法计算获得初始纯度值(用IHPLC表示)。
[0228] 附图9中，峰1，峰3和峰4是杂质，峰2是对苯二酚。曲线b是曲线a的放大图。
[0229] 步骤3-1.3、分别采用静态顶空进样-GC-氢火焰离子化(FID)检测器、卡尔费休库仑仪和热重分析仪对待测样品进行测定，分别获得残留溶剂、水分、灰分的三种杂质的百分比含量(分别用Isolv，Imoi和Iash表示)。具体测定条件如下：
[0230] (1)残留溶剂百分比含量测定：
[0231] 针对待测样品，根据原料生产工艺，估计待测样品中可能产生的残留溶剂种类为丙酮，依次运用静态顶空法进样、气相色谱法分离和FID检测器法检测采集色谱图。
[0232] 静态顶空进样法测定条件是：平衡温度80℃，定量环温度90℃，转移线温度110℃，平衡时间30min，加压时间2min；
[0233] 气相色谱法测定条件是：采用Agilent DB-624色谱柱，30m×0.32mm×0.50μm，载气流速1mL/min，分流比10:1，进样口温度200℃，起始柱温40℃，保持15min，以10℃/min程序升温至150℃，保持10min；
[0234] FID检测器检测条件是：温度250℃；
[0235] 依照上述测定条件建立纯丙酮溶剂的标准曲线，运用外标法计算丙酮的百分比含量(用Isolv表示)。
[0236] (2)水分百分比含量测定：
[0237] 针对待测样品，运用卡尔费休库仑仪测定水分的百分比含量，测定条件是：
[0238] 检测环境温度为20℃，湿度为40％，极化电极为DM143-5C，极化电流5.0μA，指示单位为电压(mV)，搅拌转速45％，控制终点为100.0mV；电解电极的电流为自动终止，终止类型为漂移相对终止，漂移值为3.0μg/min，时间范围为0～3600s。获得的水分百分比含量用Imoi表示。
[0239] (3)灰分百分比含量测定：
[0240] 针对待测样品，运用热重分析仪测定获得灰分的浓度值，测定条件是：采用Al2O3坩埚，在初温25℃以10℃/min的速率升温至650℃；记录热分解过程中的质量变化，得到热重曲线，根据热重曲线分析输出灰分的百分比含量(用Iash表示)。
[0241] 3-1.4、根据步骤3-1.1和3-1.2获得的纯度值，分别经步骤3-1.3获得的杂质百分比含量，根据公式(1)计算获得修正纯度值(分别用I'GC和I'HPLC表示)。
[0242] 步骤3-2、针对对苯二酚的待测样品，采用DSC法测定对苯二酚纯度值。测定条件如下：
[0243] 采用空的40μL标准铝坩埚为参比，称样量为3.24～6.80mg，升温过程是采集DSC曲线(见附图10)，采用软件对曲线进行
纯度分析获得纯度值(用IDSC表示)。
[0244] 步骤3-3对于每个对苯二酚的待测样品，重复步骤3-1和步骤3-2进行10次测定，获得10次测定对应的三组纯度值，进行数据处理获得待测样品的最终纯度值。
[0245] 步骤3-3.1
[0246] 3-3.1：针对三组纯度值(I'GC，I'HPLC和IDSC)，分别先运用峰态系数法和偏态系数法进行正态分布性检验，再运用Grabbs法和Dixon法进行离群值检验，结果表明无可疑值，保留数据进行下一步骤；
[0247] 3-3.2：针对每两组纯度值(I'GC与I'HPLC，I'HPLC与IDSC，I'GC与IDSC)进行等精度检验，t检验结果显示三组数据的平均值是等精度的，F检验结果显示三组数据的标准偏差是等精度的；
[0248] 3-3.3：数据处理结果见表7。由于三组数据为等精度测定，则取三组纯度值的算术平均值为最终纯度值，即为：
[0249]
[0250] 表7三种方法测定对苯二酚纯度值结果
[0251]
[0252]
[0253] 步骤4——分装
[0254] 在常温20℃±3℃的洁净室中准确称取对苯二酚50mg左右，分装至棕色玻璃样品瓶中，获得分装样品，重复上述步骤，获得分装样品约200瓶，编上号码，于冷藏和避光条件下保存。用于均匀性和稳定性检验。
[0255] 步骤5——均匀性检验
[0256] 对苯二酚的均匀性检验结果见表8。采用单因素方差分析方法对数据进行统计分析，根据公式(2)得到 即F统计值为1.70，查F检验临界值表可知：F0.05(9，20)＝2.39，即F临界值为2.39，因此F统计值
[0257] 表8对苯二酚的均匀性检验结果
[0258]
[0259]
[0260] 步骤6——稳定性检验
[0261] 步骤6-2短期稳定性检验
[0262] 表9对苯二酚的短期稳定性检验结果
[0263]
[0264] 对苯二酚的短期稳定性检验结果见表9，以放置在4℃环境中的分装样品测得的纯度值为标准。由表3得，纯度标准值为x0＝99.74％，其相对标准偏差为s0＝0.01％，平行测定次数n＝3，自由度ν＝n+n-2＝4。代入公式(3)计算得到t统计值(用ttest表示)。查t分布双侧分位数表可知，t(0.05,4)＝2.78。由表9得，在20℃条件下，ttestt(0.05,4)，表明分装样品在常温稳定性良好，而在高温条件下分装样品的纯度值发生显著衰减，因此分装样品需在常温下保存。
[0265] 步骤6-2长期稳定性检验
[0266] 表10对苯二酚的长期稳定性考察结果
[0267]
[0268] 对苯二酚的长期稳定性考察结果见表10。设时间对纯度值的方程为y＝b0+b1x，斜率的标准偏差为s(b1)，经回归分析得|b1|＝2.3×10-3，s(b1)＝2.8×10-3，经查t检验临界值表得t(0.95,n-2)＝2.78，则|b1|
[0269] 步骤7——不确定度评定
[0270] 步骤7-1定值引入的不确定度评定
[0271] 步骤7-1纯度测定引起的不确定度评定
[0272] 步骤7-1.1GC法和HPLC法测定引起的不确定度
[0273] 三种方法进行纯度测定引起的不确定度结果如表所示(表11：GC法和HPLC法；表12：DSC法)。
[0274] 表11 GC法和HPLC法测定纯度引起的不确定度结果
[0275]
[0276] 表12 DSC法引起的不确定度
[0277]
[0278] 将纯度测定引起的不确定度(用uD表示)由三种纯度测定方法的不确定度合成，则得到：
[0279] 步骤7-2均匀性和稳定性引入的不确定度评定
[0280] 根据均匀性检验结果和公式(9)，得到均匀性引起的不确定度分量为：根据稳定性检验结果和公式(10)，有效期t＝12个月的
长期稳定性的不确定度为：uS＝s(b1)·t＝3.4×10-2％
[0281] 步骤8——结论
[0282] 根据步骤3得到，对苯二酚的标准纯度值为99.65％，根据步骤7和公式(11)得到标准不确定度为0.09％，扩展不确定度为0.18％，k＝2。在有效期一年时间内、常温下储存的均匀性和稳定性良好，可作为纯度标准物质用于化妆品中对苯二酚的准确测定、量值传递和量值溯源。
[0283] 本实施例的对苯二酚纯度标准物质经用户单位(深圳市通检测技术有限公司、深圳中检联检测有限公司和杭州市环境监测中心站)试用后，出具了用户试用报告，试用报告表示，该标准物质均匀性良好，量值准确可靠，使用方便，满足了化妆品中对苯二酚百分比含量准确测定的要求，具有很高的实用价值和推广价值。
[0284] 由上述实施例可见，本发明方法的定性准确，运用三种不同原理的方法联合测定纯度值，减少了因单一定值方法带来的系统误差，统计数据处理方法严谨，不确定度评估方法全面，保证了量值准确性、稳定性和可溯源性，获得了高纯度(99％以上)苯酚和对苯二酚纯度标准物质。
