靶向XTEN缀合物组合物及其制备方法
阅读：1004发布：2020-05-31
专利汇可以提供靶向XTEN缀合物组合物及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了药物缀合物组合物以及用于制备和使用该组合物的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明涉及靶向缀合物组合物，其包含与靶向部分连接的含半胱 氨 酸的结构域(CCD)、延伸的重组多肽(XTEN)和肽可切割部分，并具有与半胱氨酸残基交联的药理活性有效负载药物，从而导致组合物可被与靶组织相关的蛋白酶切割。本发明还提供了制备该靶向缀合物组合物的方法以及使用该靶向缀合物组合物的方法。，下面是靶向XTEN缀合物组合物及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种含有半胱氨酸的结构域(CCD)，所述结构域包含至少6个氨基酸残基，其中所述结构域的特征在于：
a.其具有至少一个半胱氨酸残基；
b.其具有至少一个非半胱氨酸残基，并且至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少
93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或
100％的非半胱氨酸残基选自3至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；
c.没有三个连续的氨基酸是相同的，除非所述氨基酸为半胱氨酸或丝氨酸；以及(d)谷氨酸残基不与半胱氨酸残基相邻。
2.根据权利要求1所述的CCD，其中所述CCD具有6至约144个氨基酸残基以及1至约10个半胱氨酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的CCD，其中至少一个半胱氨酸残基位于距所述CCD的N末端或C末端9个氨基酸残基之内。
4.根据前述权利要求中任一项所述的CCD，其中所述CCD序列与选自表6中所示序列的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或
99％的同一性或与之相同。
5.一种包含前述权利要求中任一项所述的CCD的融合蛋白，其中所述CCD与延伸的重组多肽(XTEN)融合，其中所述XTEN的特征在于：
a.其具有比所述CCD的分子量大至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍或至少30倍的分子量；
b.其具有100至约1200个氨基酸，其中至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少
93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或100％的氨基酸残基选自4至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；
c.其基本上是非重复的，以致于(1)XTEN序列不含三个连续的相同氨基酸，除非所述氨基酸为丝氨酸；(2)至少90％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，所述非重叠序列基序中的每一个包含12个氨基酸残基，其中任意两个连续的氨基酸残基在每个序列基序中出现不超过两次；或(3)所述XTEN序列具有小于3的平均子序列得分；
d.其具有如通过GOR算法所确定的大于90％的无规卷曲形成；
e.其具有如通过Chou-Fasman算法所确定的少于2％的α-螺旋和2％的β-折叠；以及f.当通过TEPITOPE算法分析时，其缺乏预测的T细胞表位，其中针对所述XTEN序列中表位的TEPITOPE算法预测是基于-9的阈值得分。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述序列基序选自表9中所示的序列。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的融合蛋白，其中所述XTEN与选自表10或表11中所示序列的序列具有至少90％的序列同一性或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少
94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％的序列同一性或与之相同。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含至少第一靶向部分(TM)，其中所述靶向部分能够特异性结合与靶组织相关的配体。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述TM与所述CCD的N末端或C末端连接。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白从N末端至C末端配置为：
a.(TM)-(CCD)-(XTEN)；或
b.(XTEN)-(CCD)-(TM)。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的融合蛋白，其中所述TM与所述CCD重组地融合。
12.根据权利要求9或权利要求10所述的融合蛋白，其中所述TM使用选自表12中所示序列的连接体序列与所述CCD缀合。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的融合蛋白，其中所述靶组织的配体与肿瘤、癌细胞或具有炎症状况的组织相关。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其进一步包含一个或多个药物或生物活性蛋白质，其中每个药物或生物活性蛋白质与所述CCD的半胱氨酸残基的巯基基团缀合。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述药物为选自表14和表15中的药物的细胞毒性药物。
16.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述药物为选自下组的细胞毒性药物：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述药物为单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
18.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述药物为单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。
19.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述药物为吗他汀(DM1)。
20.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述生物活性蛋白质选自TNFα、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素。
21.根据权利要求8-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少第一TM选自IgG抗体、Fab片段、F(ab)2片段、scFv、scFab、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中所述至少第一靶向部分为scFv。
23.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或
93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。
24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。
25.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述scFv包含重链CDR区段HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链CDR区段LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及来自选自表19中所示抗体的抗体的构架区(FR)，其中所述重链CDR和FR以FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且所述轻链CDR和FR以FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且进一步包含将所述轻链区段与所述重链区段融合的选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的融合蛋白，其包含第二scFv，其中所述第二scFv与所述第一scFv相同，并且所述第一和第二scFv通过选自SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的连接体串联地重组融合，其中所述scFv与所述CCD的N末端或C末端重组地融合。
27.根据权利要求22-25中任一项所述的融合蛋白，其包含第二scFv，其中所述第二scFv能够特异性结合与所述靶组织相关的第二配体，其中(i)所述第二配体不同于所述第一scFv结合的配体，(ii)所述第一和第二scFv通过选自SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的连接体串联地重组融合，并且(iii)所述scFv与所述CCD的N末端或C末端重组地融合。
28.根据权利要求27所述的融合蛋白，其中所述第二scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或
92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。
29.根据权利要求27所述的融合蛋白，其中所述第二scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。
30.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中所述第二scFv包含重链CDR区段HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链CDR区段LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及来自选自表20中所示抗体的抗体的相关构架区(FR)，其中所述重链CDR和FR区段以FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且所述轻链CDR和FR区段以FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且进一步包含将所述轻链区段与所述重链区段融合的选自表20中所示序列的连接体序列。
31.根据权利要求8-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少第一TM选自叶酸、促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂、天冬氨酰胺酰甘氨酰精氨酸(NGR)和精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD)。
32.根据权利要求8-20所述的融合蛋白，其中所述至少第一TM是非蛋白质的。
33.根据权利要求31所述的融合蛋白，其中所述至少第一TM为叶酸。
34.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中
a.所述靶组织具有炎症状况；
b.所述药物选自地塞米松、吲哚美辛、泼尼松龙、二丙酸倍他米松、丙酸氯倍他索、醋酸氟轻松、氟氢缩松、卤倍他索丙酸酯、双醋酸双氟拉松和去羟米松；并且
c.所述靶向部分为来源于能够特异性结合选自TNF、IL-1受体、IL-6受体、α4整联蛋白亚基、CD20和IL-21受体的配体的单克隆抗体的scFv。
35.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或
93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。
36.根据权利要求5-35中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含肽切割部分(PCM)，其中所述PCM能够被一种、两种或更多种哺乳动物蛋白酶所切割。
37.根据权利要求8-36中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含肽切割部分(PCM)，其中所述PCM能够被一种、两种或更多种哺乳动物蛋白酶所切割，并且其中所述融合蛋白从N末端至C末端被配置为：
a.(TM)-(CCD)-(PCM)-(XTEN)；
b.(XTEN)-(PCM)-(CCD)-(TM)；
c.(XTEN)-(PCM)-(TM)-(CCD)；或
d.(CCD)-(TM)-(PCM)-(XTEN)。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的融合蛋白，其进一步包含与所述第一XTEN相同的第二XTEN，其中所述第一和第二XTEN均使用三聚体交联体与所述PCM的N末端或C末端缀合。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的融合蛋白，其中所述PCM包含与选自表8中所示序列的序列具有至少90％的序列同一性或与之相同的肽序列。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物蛋白酶与所述靶组织共定位。
41.根据权利要求40所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物蛋白酶为所述靶组织分泌的细胞外蛋白酶，或为肿瘤细胞外基质的组分。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物蛋白酶选自表7中所示的蛋白酶。
43.根据权利要求36-41中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物蛋白酶选自跨膜肽酶、中性溶酶(CD10)、PSMA、BMP-1、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17(TACE)、ADAM19、ADAM28(MDC-L)、具有血小板反应蛋白基序的ADAM(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-1(胶原酶1)、MMP-2(明胶酶A)、MMP-3(溶基质蛋白酶1)、MMP-7(基质溶解素
1)、MMP-8(胶原酶2)、MMP-9(明胶酶B)、MMP-10(溶基质蛋白酶2)、MMP-11(溶基质蛋白酶3)、MMP-12(巨噬细胞弹性蛋白酶)、MMP-13(胶原酶3)、MMP-14(MT1-MMP)、MMP-15(MT2-MMP)、MMP-19、MMP-23(CA-MMP)、MMP-24(MT5-MMP)、MMP-26(基质溶解素2)、MMP-27(CMMP)、豆荚蛋白、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶X、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、分泌酶、尿激酶(uPA)、组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)、纤溶酶、凝血酶、前列腺特异性抗原(PSA、KLK3)、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、弹性蛋白酶、类胰蛋白酶、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)、DESC1、hepsin(HPN)、蛋白裂解酶、蛋白裂解酶-2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4(CAP2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、激肽释放酶相关肽酶(KLK家族)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14。
44.根据权利要求14-43中任一项所述的融合蛋白，其中在药物分子与所述融合蛋白的CCD的半胱氨酸残基之间进行缀合反应时，获得缀合物产物的异质群体，其中完全缀合的CCD-药物缀合物产物能够达到>6的峰距，其中：a)所述融合蛋白包含具有600个或更多个累积的氨基酸残基的多肽，包括具有3至9个半胱氨酸残基的CCD；b)所述异质缀合物产物具有与所述CCD连接的至少1、2和3个或更多个有效负载的混合物；并且c)在反相HPLC色谱条件下分析所述缀合产物。
45.根据权利要求44所述的融合蛋白，其中所述CCD为表6中具有3个半胱氨酸残基的序列，并且所述融合蛋白具有至少800个累积的氨基酸残基。
46.根据权利要求44所述的融合蛋白，其中所述CCD为表6中具有9个半胱氨酸残基的序列，并且所述融合蛋白具有至少800个累积的氨基酸残基。
47.根据权利要求40-46中任一项所述的融合蛋白，其中在所述PCM被所述靶组织蛋白酶切割时，所述XTEN从所述融合蛋白中释放，其中所述靶向部分和连接有药物或生物活性蛋白质的CCD仍然连接在一起作为释放的靶向组合物。
48.根据权利要求47所述的释放的靶向组合物，其中所述释放的靶向组合物的分子量具有比未切割的融合蛋白小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍的分子量。
49.根据权利要求47所述的释放的靶向组合物，其中所述释放的靶向组合物的流体动力学半径比未切割的融合蛋白小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的释放的靶向组合物，其中所述释放的靶向组合物对靶组织配体具有与未切割的融合蛋白相比大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍的结合亲和力。
51.根据权利要求47-49中任一项所述的释放的靶向组合物，其中所述释放的靶向组合物对所述配体具有小于约10-4M、或小于约10-5M、或小于约10-6M、或小于约10-7M、或小于约10-8M、或小于约10-9M、或小于约10-10M、或小于约10-11M、或小于约10-12M的结合亲和力常数(Kd)。
52.根据权利要求50或51所述的释放的靶向组合物，其中在体外ELISA测定中测量所述结合亲和力。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的释放的靶向组合物，其中在体外哺乳动物细胞的细胞毒性测定中，所述释放的靶向组合物对携带所述配体的靶细胞的细胞毒性比未切割的融合蛋白的细胞毒性大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍，其中通过计算IC50确定细胞毒性。
54.根据权利要求47-53中任一项所述的释放的靶向组合物，其中当在可比条件下在暴露于所述释放的靶向组合物或所述融合蛋白后24-72小时之间确定生长抑制时，在体外哺乳动物细胞的细胞毒性测定中，所述释放的靶向组合物对携带所述配体的靶细胞的生长的抑制比未切割的融合蛋白对生长的抑制大至少20％、或至少40％、或至少50％。
55.根据权利要求47所述的融合蛋白，其中在向具有携带所述配体的靶组织和能够切割所述PCM的共定位蛋白酶的受试者施用团剂量的治疗有效量的融合蛋白后，通过所述蛋白酶释放的所述释放的靶向组合物能够在所述靶组织中累积到比未切割的融合蛋白大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍的浓度。
56.根据权利要求55所述的融合蛋白，其中所述靶组织为肿瘤。
57.根据权利要求56所述的融合蛋白，其中在施用后7至21天，所述施用导致所述肿瘤的体积减小至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。
58.根据权利要求56所述的融合蛋白，其中在施用后7-21天，所述施用导致比不包含所述PCM且以可比剂量施用的融合蛋白多至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％的肿瘤体积减小。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的融合蛋白，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、兔、猴和人类。
60.一种选自表5中的缀合物的靶向缀合物组合物。
61.根据权利要求60所述的靶向缀合物组合物，其中所述组合物从N末端至C末端被配置为：
a.(TM)-(CCD)-(PCM)-(XTEN)；或
b.(XTEN)-(PCM)-(CCD)-(TM)；
其中药物分子与所述CCD的每个半胱氨酸残基连接。
62.一种靶向缀合物组合物，其包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式I的结构：
其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
63.一种靶向缀合物组合物，其包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式II的结构：
其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
64.一种靶向缀合物组合物，其包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式III的结构：
其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
65.一种靶向缀合物组合物，其包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式IV的结构：
其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
66.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式I的结构进行配置：
其中
a.所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或
97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
b.所述CCD选自表6中的CCD；
c.所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且
d.所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
67.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式II的结构进行配置：
其中
a.所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或
97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
b.所述CCD选自表6中的CCD；
c.所述PCM选自表8中所示的序列；
d.所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且
e.所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
68.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式III的结构进行配置：
其中
a.所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或
97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
b.所述CCD选自表6中的CCD；
c.所述PCM选自表8中所示的序列；
d.所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且
e.所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
69.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式IV的结构进行配置：
其中
a.所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或
97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
b.所述CCD选自表6中的CCD；
c.所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且
d.所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
70.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式V的结构进行配置：
其中
a.所述TM1为包含VL和VH序列的第一scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
b.所述TM2为与所述第一scFv不同的第二scFv，其中所述TM2包含VL和VH序列，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或
92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
c.所述CCD选自表6中的CCD；
d.所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且
e.所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
71.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式VI的结构进行配置：
其中
a.所述TM1为包含VL和VH序列的第一scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
b.所述TM2为与所述第一scFv不同的第二scFv，其中所述TM2包含VL和VH序列，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或
92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
c.所述CCD选自表6中的CCD；
d.所述PCM选自表8中的PCM；
e.所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且
f.所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
72.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式VIII的结构进行配置：
其中
a.所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或
97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
b.所述CCD选自表6中的CCD；
c.所述PCM选自表8中的PCM；
d.所述CL为选自表25中的交联体的交联体；
e.所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且
f.所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
73.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式X的结构进行配置：
a.所述TM1为包含VL和VH序列的第一scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
b.所述TM2为与所述第一scFv不同的第二scFv，其中所述TM2包含VL和VH序列，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或
92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；
c.所述CCD选自表6中的CCD；
d.所述PCM选自表8中的PCM；
e.所述XTEN为与表11中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同的半胱氨酸工程化的XTEN；
f.所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数；并且
g.y为与所述XTEN的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
74.一种药物组合物，其包含权利要求14-47中任一项所述的融合蛋白或权利要求60-
73中任一项所述的靶向缀合物组合物以及药学上可接受的载体。
75.根据权利要求74所述的药物组合物，其用于治疗受试者的疾病，其中所述疾病选自乳腺癌、ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝脏癌、肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、食管癌、纤维肉瘤、绒毛膜癌、卵巢癌、宫颈癌、喉癌、子宫内膜癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、卡波西肉瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、甲状腺癌、威尔姆斯肿瘤、泌尿道癌、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、成胶质细胞瘤、胰腺癌、白血病、急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(PCML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞疾病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、寻常痤疮、哮喘、自身免疫疾病、自身炎症性疾病、腹腔疾病、慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、超敏反应、炎性肠病、克罗恩病、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、肉样瘤病、移植排斥、血管炎、银屑病、纤维肌痛、肠易激综合征、红斑狼疮、骨关节炎、硬皮病和溃疡性结肠炎。
76.根据权利要求75所述的药物组合物，其用于在用于治疗所述受试者的药物方案中使用，所述方案包含所述药物组合物。
77.根据权利要求76所述的药物组合物，其中所述药物方案进一步包括确定在患有所述疾病的受试者中达到有益效果所需的药物组合物的量的步骤。
78.一种治疗受试者的疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用一个、或两个、或三个、或四个、或更多个治疗有效剂量的权利要求74所述的药物组合物的方案。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述疾病选自乳腺癌、ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝脏癌、肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、食管癌、纤维肉瘤、绒毛膜癌、卵巢癌、宫颈癌、喉癌、子宫内膜癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、卡波西肉瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、甲状腺癌、威尔姆斯肿瘤、泌尿道癌、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、成胶质细胞瘤和胰腺癌。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所施用的药物组合物包含靶向部分，其中所述靶向部分对所述疾病的肿瘤具有特异性结合亲和力。
81.根据权利要求79所述的方法，其中所施用的药物组合物包含靶向部分，其中所述靶向部分对选自表2、表3、表4、表18和表19中所示靶标的靶标具有特异性结合亲和力。
82.根据权利要求79所述的方法，其中所述施用导致与癌症相关的至少一个、两个或三个参数比未治疗的受试者大至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或
80％、或90％的改善，其中所述参数选自所述癌症的进展时间、复发时间、局部复发发现时间、区域转移发现时间、远处转移发现时间、症状发作时间、疼痛、体重、住院、止痛药需要增加时间、救治性化疗需要时间、救治性手术需要时间、救治性放疗需要时间、治疗失败时间和存活时间。
83.根据权利要求80或81所述的方法，其中所施用的剂量导致所述受试者的肿瘤大小的减小。
84.根据权利要求83所述的方法，其中肿瘤大小减小至少10％、或至少20％、或至少
30％、或至少40％、或至少50％或更多。
85.根据权利要求84所述的方法，其中在施用后至少约10天、至少约14天、至少约21天或施用后至少约30天内达到所述肿瘤大小的减小。
86.根据权利要求80或81所述的方法，其中所施用的剂量导致所述受试者的肿瘤停滞。
87.根据权利要求86所述的方法，其中在施用后至少约10天、至少约14天、至少约21天或施用后至少约30天内达到肿瘤停滞。
88.根据权利要求78-87中任一项所述的方法，其中所述方案包括每7天、或每10天、或每14天、或每21天、或每30天施用所述治疗有效剂量。
89.根据权利要求80或81所述的方法，其中在受试者中使用治疗有效剂量方案施用所述药物组合物，其中所述治疗有效剂量方案导致对携带选自表2、表3、表4、表18和表19中所示靶标的靶标的肿瘤细胞的生长抑制作用。
90.根据权利要求78所述的方法，其中当向受试者施用时，所述药物组合物的融合蛋白或靶向缀合物组合物显示出长于至少约72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约144h、或至少约10天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。
91.一种降低患有癌症肿瘤的受试者的治疗频率的方法，该方法包括使用针对权利要求74所述的药物组合物的治疗有效剂量方案向所述受试者施用所述药物组合物。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述施用导致所述受试者的肿瘤大小的减小，其中该肿瘤大小减小至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％或更多。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述导致癌症肿瘤大小减小的方案为每7天、或每10天、或每14天、或每21天、或每30天或每月施用治疗有效剂量的所述药物组合物。
94.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述导致癌症肿瘤大小减小的方案在受试者中具有比未与所述缀合物组合物连接的相应的有效负载药物的治疗有效剂量方案大3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍的给药间隔。
95.一种在体外处理癌细胞的方法，该方法包括向癌细胞的细胞培养物施用有效量的权利要求14-46中任一项所述的融合蛋白或权利要求60-73中任一项所述的靶向缀合物组合物，其中所述施用导致对所述癌细胞的细胞毒性作用。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述癌细胞具有靶标，所述缀合物组合物的TM对该靶标具有结合亲和力。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述靶标选自表2、表3、表4、表18和表19中所示的靶标。
98.根据权利要求95-97中任一项所述的方法，其中所述培养物包含能够切割所述缀合物组合物的PCM的蛋白酶。
99.根据权利要求95-98中任一项所述的方法，其中所述癌细胞选自表18中的细胞系。
100.根据权利要求95-99中任一项所述的方法，其中所述缀合物组合物的细胞毒性作用比使用不具有针对所述缀合物组合物的TM的配体的癌细胞所看到的细胞毒性作用更大。
101.一种分离的核酸，其包含选自以下的多核苷酸序列：(a)编码权利要求5-46中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸，或(b)(a)中的多核苷酸的互补体。
102.一种表达载体，其包含权利要求101所述的多核苷酸序列以及与所述多核苷酸序列可操作地连接的重组调节序列。
103.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求102所述的表达载体。
104.根据权利要求103所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核生物。
105.根据权利要求104所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。
靶向XTEN缀合物组合物及其制备方法
交叉引用
[0001] 本申请要求于2014年11月11日提交的美国临时申请号62/078,171、于2015年2月23日提交的美国临时申请号62/119,483；以及于2015年8月28日提交的美国临时申请号62/
211,378的权益；所有这些申请均通过引用并入本文。本申请涉及于2015年11月11日提交的美国临时申请号62/254,076，该申请通过引用并入本文。
211,378的权益；所有这些申请均通过引用并入本文。本申请涉及于2015年11月11日提交的美国临时申请号62/254,076，该申请通过引用并入本文。
背景技术
[0002] 许多经批准的癌症治疗法为杀死正常细胞以及肿瘤细胞的细胞毒性药物。这些细胞毒性药物的治疗益处在很大程度上取决于肿瘤细胞比正常细胞更敏感，从而允许使用不导致不可接受的副作用的剂量达到临床反应。然而，基本上所有这些非特异性药物都对正常组织造成一些损害，这往往限制了治疗。
[0003] 与抗体或其他结合细胞配体的分子连接的细胞毒性药物(通常以首字母缩写“ADC”(抗体-药物缀合物)命名)的使用意在通过将细胞毒性药物选择性递送给癌细胞来进一步提高治疗指数(或治疗窗)。虽然ADC提供了很大希望，但经批准的药物的数目仍然很少，它们的制备复杂且昂贵(鼠单克隆的人源化以及使这样的抗体人源化通常所需的大量突变)，并且许多的药代动力学是不充分的；例如，ADC中抗体片段诸如scFv的使用。另外，基于抗体的ADC的大小是关于这样的组合物穿透实体瘤或带有癌细胞的组织和器官的能力的限制。
[0004] 延长治疗剂(无论是治疗性蛋白、肽还是小分子)的半衰期，往往需要专门的制剂或对治疗剂自身的修饰。常规的修饰方法如聚乙二醇化、向治疗剂添加抗体片段或白蛋白分子，具有多个严重缺陷。虽然这些修饰形式可大规模制备，但这些常规方法通常受到商品成本高、生产过程复杂以及最终产品纯度低的困扰。往往，即使并非不可能，也很难纯化到靶标实体的均质性。这对于聚乙二醇化尤为明显，其中反应本身不能精确控制以生成携带相同数目或质量的聚乙二醇的聚乙二醇化药剂的同质群体。此外，这些聚乙二醇化药剂的代谢物可能具有严重的副作用。例如，已在动物模型中观察到聚乙二醇化蛋白引起肾小管空泡形成(Bendele,A.,Seely,J.,Richey,C.,Sennello,G.&Shopp,G.Short communication:renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol-conjugated proteins.Toxicol.Sci.1998.42,152–157)。肾清除的聚乙二醇化蛋白或它们的代谢物可在肾中积累，导致干扰正常肾小球过滤的PEG水合物的形成。另外，可诱导动物和人类产生针对PEG的抗体(Sroda,K.等人Repeated injections of PEG-PE liposomes generate anti-PEG antibodies.Cell.Mol.Biol.Lett.2005.10,37-47)。
[0005] 因此，对于可穿透和/或贴附于肿瘤或癌性组织并向癌细胞递送细胞毒性化合物，并且具有足够半衰期和增强的选择性使得总治疗指数提高的抗癌剂仍有相当大的需求。发明内容
[0006] 在一些方面，本发明公开了靶向缀合物组合物，其包含一个或多个延伸的重组多肽序列(XTEN)、一个或多个肽切割部分(PCM)、一个或多个靶向部分(TM)以及一个或多个有效负载药物分子，其中当该缀合物组合物暴露于蛋白酶时，PCM能够被切割。本发明还涉及在疾病治疗中使用所公开的缀合物组合物的治疗方法。
[0007] 本文公开的组合物和方法不仅作为治疗法有用，而且作为用于候选治疗剂的临床前和临床开发的研究工具也特别有用。在一些方面，本发明部分地通过生成具有有效负载肽、蛋白质和小分子以及靶向携带某些配体的组织的靶向部分，以及具有当接近靶组织或靶细胞时能够被蛋白酶所切割的肽基切割部分的靶向部分的靶向缀合物组合物，满足了这一需求。与未缀合的产物相比，靶向缀合物组合物在一个或多个方面较优越，包括增强的终末半衰期、靶向递送以及对健康组织降低的毒性。
[0008] 特别地考虑到，可切割的缀合物组合物实施方案可表现出本文所公开的性质的一种或多种或任意组合。进一步特别地考虑到，治疗方法可表现出本文所公开的性质的一种或多种或任意组合。
[0009] 在一个方面，本发明提供了一种含有半胱氨酸的结构域(CCD)。在一些实施方案中，所述CCD包含至少6个氨基酸残基，其中所述结构域的特征在于：(a)其具有至少一个半胱氨酸残基；(b)其具有至少一个非半胱氨酸残基，并且至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少
99％或100％的非半胱氨酸残基选自3至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；(c)没有三个连续的氨基酸是相同的，除非所述氨基酸为半胱氨酸或丝氨酸；以及(d)谷氨酸残基不与半胱氨酸残基相邻。在一些实施方案中，所述CCD具有6至约144个氨基酸残基以及1至约10个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述CCD包含至少两个半胱氨酸残基，并且任何两个相邻的半胱氨酸被不多于15个非半胱氨酸氨基酸残基隔开。在一些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基位于距所述CCD的N末端或C末端9个氨基酸残基之内。在一些实施方案中，所述CCD序列与选自表6中所示序列的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同。
99％或100％的非半胱氨酸残基选自3至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；(c)没有三个连续的氨基酸是相同的，除非所述氨基酸为半胱氨酸或丝氨酸；以及(d)谷氨酸残基不与半胱氨酸残基相邻。在一些实施方案中，所述CCD具有6至约144个氨基酸残基以及1至约10个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述CCD包含至少两个半胱氨酸残基，并且任何两个相邻的半胱氨酸被不多于15个非半胱氨酸氨基酸残基隔开。在一些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基位于距所述CCD的N末端或C末端9个氨基酸残基之内。在一些实施方案中，所述CCD序列与选自表6中所示序列的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同。
[0010] 在一个方面，本发明提供了一种包含本文公开的任意CCD的融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与延伸的重组多肽(XTEN)融合的CCD，其中所述XTEN的特征在于：(a)其具有比所述CCD的分子量大至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、或至少30倍的分子量；(b)其具有100至约1200个氨基酸，其中至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或100％的氨基酸残基选自4至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；(c)其基本上是非重复的，以致于(1)XTEN序列不含三个连续的相同氨基酸，除非所述氨基酸为丝氨酸；(2)至少90％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，所述非重叠序列基序中的每一个均包含12个氨基酸残基，其中任意两个连续的氨基酸残基在每个序列基序中出现不超过两次；或(3)所述XTEN序列具有小于3的平均子序列得分；(d)其具有如通过GOR算法所确定的大于90％的无规卷曲形成；(e)其具有如通过Chou-Fasman算法所确定的少于2％的α-螺旋和2％的β-折叠；以及(f)当通过TEPITOPE算法分析时，其缺乏预测的T细胞表位，其中针对所述XTEN序列中表位的TEPITOPE算法预测是基于-9的阈值得分。在一些实施方案中，所述序列基序选自表9中所示的序列。在一些实施方案中，所述XTEN与选自表10或表11中所示序列的序列具有至少90％的序列同一性或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少
97％、或至少98％、或至少99％的序列同一性或与之相同。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含至少第一靶向部分(TM)，其中所述靶向部分能够特异性结合与靶组织相关的配体。在一些实施方案中，所述TM与所述CCD的N末端或C末端连接。在一些实施方案中，所述融合蛋白从N末端至C末端配置为：(a)(TM)-(CCD)-(XTEN)；或(b)(XTEN)-(CCD)-(TM)。在一些实施方案中，所述TM与所述CCD重组地融合。在一些实施方案中，所述TM使用选自表12中所示序列的连接体序列与所述CCD缀合。在一些实施方案中，所述靶组织的配体与肿瘤、癌细胞或具有炎症状况的组织相关。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含一个或多个药物或生物活性蛋白质，其中每个药物或生物活性蛋白质与所述CCD的半胱氨酸残基的巯基基团缀合。在一些实施方案中，所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述药物为选自表14和表15中的药物的细胞毒性药物。在一些实施方案中，所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述药物为选自以下药物的细胞毒性药物：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。在一些实施方案中，所述药物为单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，所述药物为单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。在一些实施方案中，所述药物为吗他汀(DM1)。在一些实施方案中，所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述生物活性蛋白质选自TNFα、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素。在一些实施方案中，所述至少第一TM选自IgG抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、scFv、scFab、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，所述至少第一靶向部分为scFv。在一些实施方案中，所述scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或
94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。在一些实施方案中，所述scFv从N末端至C末端配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。在一些实施方案中，所述scFv包含重链CDR区段HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链CDR区段LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及来自选自表19中所示抗体的抗体的构架区(FR)，其中所述重链CDR和FR以FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且所述轻链CDR和FR以FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且进一步包含将所述轻链区段与所述重链区段融合的选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含第二scFv，其中所述第二scFv与所述第一scFv相同，并且所述第一和第二scFv通过选自SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的连接体串联地重组融合，其中所述scFv与所述CCD的N末端或C末端重组地融合。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含第二scFv，其中所述第二scFv能够特异性结合与所述靶组织相关的第二配体，其中(i)所述第二配体不同于所述第一scFv结合的配体，(ii)所述第一和第二scFv通过选自SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的连接体串联地重组融合，并且(iii)所述scFv与所述CCD的N末端或C末端重组地融合。在一些实施方案中，所述第二scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。在一些实施方案中，所述第二scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。在一些实施方案中，所述第二scFv包含重链CDR区段HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链CDR区段LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及来自选自表20中所示抗体的抗体的相关构架区(FR)，其中所述重链CDR和FR区段以FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且所述轻链CDR和FR区段以FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且进一步包含将所述轻链区段与所述重链区段融合的选自表20中所示序列的连接体序列。在一些实施方案中，所述至少第一TM选自叶酸、促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂、天冬氨酰胺酰甘氨酰精氨酸(NGR)和精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD)。在一些实施方案中，所述至少第一TM是非蛋白质的。在一些实施方案中，所述至少第一TM为叶酸。在一些实施方案中，(a)所述靶组织具有炎症状况；(b)所述药物选自地塞米松、吲哚美辛、泼尼松龙、二丙酸倍他米松、丙酸氯倍他索、醋酸氟轻松、氟氢缩松、卤倍他索丙酸酯、双醋酸双氟拉松和去羟米松；并且(c)所述靶向部分为来源于能够特异性结合选自TNF、IL-1受体、IL-6受体、α4整联蛋白亚基、CD20和IL-21受体的配体的单克隆抗体的scFv。在一些实施方案中，所述scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或
99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含肽切割部分(PCM)，其中所述PCM能够被一种、两种或更多种哺乳动物蛋白酶所切割。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含肽切割部分(PCM)，其中所述PCM能够被一种、两种或更多种哺乳动物蛋白酶所切割，并且其中所述融合蛋白从N末端至C末端被配置为：(a)(TM)-(CCD)-(PCM)-(XTEN)；(b)(XTEN)-(PCM)-(CCD)-(TM)；(c)(XTEN)-(PCM)-(TM)-(CCD)；或(d)(CCD)-(TM)-(PCM)-(XTEN)。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含与所述第一XTEN相同的第二XTEN，其中所述第一和第二XTEN均使用三聚体交联体与所述PCM的N末端或C末端缀合。在一些实施方案中，所述PCM包含与选自表8中所示序列的序列具有至少90％的序列同一性或与之相同的肽序列。在一些实施方案中，所述哺乳动物蛋白酶与所述靶组织共定位。在一些实施方案中，所述哺乳动物蛋白酶为所述靶组织分泌的细胞外蛋白酶，或为肿瘤细胞外基质的组分。在一些实施方案中，所述哺乳动物蛋白酶选自表7中所示的蛋白酶。在一些实施方案中，所述哺乳动物蛋白酶选自跨膜肽酶、中性溶酶(CD10)、PSMA、BMP-1、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17(TACE)、ADAM19、ADAM28(MDC-L)、具有血小板反应蛋白基序的ADAM(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-1(胶原酶
1)、MMP-2(明胶酶A)、MMP-3(溶基质蛋白酶1)、MMP-7(基质溶解素1)、MMP-8(胶原酶2)、MMP-
9(明胶酶B)、MMP-10(溶基质蛋白酶2)、MMP-11(溶基质蛋白酶3)、MMP-12(巨噬细胞弹性蛋白酶)、MMP-13(胶原酶3)、MMP-14(MT1-MMP)、MMP-15(MT2-MMP)、MMP-19、MMP-23(CA-MMP)、MMP-24(MT5-MMP)、MMP-26(基质溶解素2)、MMP-27(CMMP)、豆荚蛋白、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶X、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、分泌酶、尿激酶(uPA)、组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)、纤溶酶、凝血酶、前列腺特异性抗原(PSA、KLK3)、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、弹性蛋白酶、类胰蛋白酶、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)、DESC1、hepsin(HPN)、蛋白裂解酶、蛋白裂解酶-2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4(CAP2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、激肽释放酶相关肽酶(KLK家族)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14。在一些实施方案中，在所述药物分子与所述融合蛋白的CCD的半胱氨酸残基之间进行缀合反应时，获得缀合物产物的异质群体，其中完全缀合的CCD-药物缀合物产物能够达到>6的峰距，其中：a)所述融合蛋白包含具有600个或更多个累积的氨基酸残基的多肽，包括具有3至9个半胱氨酸残基的CCD；b)所述异质缀合物产物具有与所述CCD连接的至少1、2和3个或更多个有效负载的混合物；并且c)在反相HPLC色谱条件下分析所述缀合物产物。在一些实施方案中，所述CCD为表6中具有3个半胱氨酸残基的序列，并且所述融合蛋白具有至少800个累积的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述CCD为表6中具有9个半胱氨酸残基的序列，并且所述融合蛋白具有至少800个累积的氨基酸残基。在一些实施方案中，在所述PCM被所述靶组织蛋白酶切割时，所述XTEN从所述融合蛋白中释放，其中所述靶向部分和连接有药物或生物活性蛋白质的CCD仍然连接在一起作为释放的靶向组合物。在一些实施方案中，所述释放的靶向组合物的分子量具有比未切割的融合蛋白小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍的分子量。在一些实施方案中，所述释放的靶向组合物的流体动力学半径比未切割的融合蛋白小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍。在一些实施方案中，所述释放的靶向组合物对靶组织配体具有与未切割的融合蛋白相比大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍的结合亲和力。在一些实施方案中，所述释放的靶向组合物对所述配体具有小于约10-4M、或小于约10-5M、或小于约10-6M、或小于约10-7M、或小于约10-8M、或小于约10-9M、或小于约10-10M、或小于约10-11M、或小于约10-12M的结合亲和力常数(Kd)。在一些实施方案中，在体外ELISA测定中测量所述结合亲和力。在一些实施方案中，在体外哺乳动物细胞的细胞毒性测定中，所述释放的靶向组合物对携带所述配体的靶细胞的细胞毒性比未切割的融合蛋白的细胞毒性大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍，其中通过计算IC50确定细胞毒性。在一些实施方案中，当在可比条件下在暴露于所述释放的靶向组合物或所述融合蛋白后24-72小时之间确定生长抑制时，在体外哺乳动物细胞的细胞毒性测定中，所述释放的靶向组合物对携带所述配体的靶细胞的生长的抑制比未切割的融合蛋白对生长的抑制大至少20％、或至少
40％、或至少50％。在一些实施方案中，在向具有携带所述配体的靶组织和能够切割所述PCM的共定位蛋白酶的受试者施用团剂量的治疗有效量的融合蛋白后，通过所述蛋白酶释放的所述释放的靶向组合物能够在所述靶组织中累积到比未切割的融合蛋白大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍的浓度。在一些实施方案中，所述靶组织为肿瘤。在一些实施方案中，在施用后7至21天，所述施用导致所述肿瘤的体积减小至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。在一些实施方案中，在施用后7-21天，所述施用导致比不包含所述PCM且以可比剂量施用的融合蛋白多至少
10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％的肿瘤体积减小。在一些实施方案中，所述受试者选自小鼠、大鼠、兔、猴和人类。
97％、或至少98％、或至少99％的序列同一性或与之相同。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含至少第一靶向部分(TM)，其中所述靶向部分能够特异性结合与靶组织相关的配体。在一些实施方案中，所述TM与所述CCD的N末端或C末端连接。在一些实施方案中，所述融合蛋白从N末端至C末端配置为：(a)(TM)-(CCD)-(XTEN)；或(b)(XTEN)-(CCD)-(TM)。在一些实施方案中，所述TM与所述CCD重组地融合。在一些实施方案中，所述TM使用选自表12中所示序列的连接体序列与所述CCD缀合。在一些实施方案中，所述靶组织的配体与肿瘤、癌细胞或具有炎症状况的组织相关。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含一个或多个药物或生物活性蛋白质，其中每个药物或生物活性蛋白质与所述CCD的半胱氨酸残基的巯基基团缀合。在一些实施方案中，所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述药物为选自表14和表15中的药物的细胞毒性药物。在一些实施方案中，所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述药物为选自以下药物的细胞毒性药物：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。在一些实施方案中，所述药物为单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，所述药物为单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。在一些实施方案中，所述药物为吗他汀(DM1)。在一些实施方案中，所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述生物活性蛋白质选自TNFα、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素。在一些实施方案中，所述至少第一TM选自IgG抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、scFv、scFab、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，所述至少第一靶向部分为scFv。在一些实施方案中，所述scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或
94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。在一些实施方案中，所述scFv从N末端至C末端配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。在一些实施方案中，所述scFv包含重链CDR区段HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链CDR区段LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及来自选自表19中所示抗体的抗体的构架区(FR)，其中所述重链CDR和FR以FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且所述轻链CDR和FR以FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且进一步包含将所述轻链区段与所述重链区段融合的选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含第二scFv，其中所述第二scFv与所述第一scFv相同，并且所述第一和第二scFv通过选自SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的连接体串联地重组融合，其中所述scFv与所述CCD的N末端或C末端重组地融合。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含第二scFv，其中所述第二scFv能够特异性结合与所述靶组织相关的第二配体，其中(i)所述第二配体不同于所述第一scFv结合的配体，(ii)所述第一和第二scFv通过选自SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的连接体串联地重组融合，并且(iii)所述scFv与所述CCD的N末端或C末端重组地融合。在一些实施方案中，所述第二scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。在一些实施方案中，所述第二scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。在一些实施方案中，所述第二scFv包含重链CDR区段HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链CDR区段LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及来自选自表20中所示抗体的抗体的相关构架区(FR)，其中所述重链CDR和FR区段以FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且所述轻链CDR和FR区段以FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且进一步包含将所述轻链区段与所述重链区段融合的选自表20中所示序列的连接体序列。在一些实施方案中，所述至少第一TM选自叶酸、促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂、天冬氨酰胺酰甘氨酰精氨酸(NGR)和精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD)。在一些实施方案中，所述至少第一TM是非蛋白质的。在一些实施方案中，所述至少第一TM为叶酸。在一些实施方案中，(a)所述靶组织具有炎症状况；(b)所述药物选自地塞米松、吲哚美辛、泼尼松龙、二丙酸倍他米松、丙酸氯倍他索、醋酸氟轻松、氟氢缩松、卤倍他索丙酸酯、双醋酸双氟拉松和去羟米松；并且(c)所述靶向部分为来源于能够特异性结合选自TNF、IL-1受体、IL-6受体、α4整联蛋白亚基、CD20和IL-21受体的配体的单克隆抗体的scFv。在一些实施方案中，所述scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或
99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含肽切割部分(PCM)，其中所述PCM能够被一种、两种或更多种哺乳动物蛋白酶所切割。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含肽切割部分(PCM)，其中所述PCM能够被一种、两种或更多种哺乳动物蛋白酶所切割，并且其中所述融合蛋白从N末端至C末端被配置为：(a)(TM)-(CCD)-(PCM)-(XTEN)；(b)(XTEN)-(PCM)-(CCD)-(TM)；(c)(XTEN)-(PCM)-(TM)-(CCD)；或(d)(CCD)-(TM)-(PCM)-(XTEN)。在一些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含与所述第一XTEN相同的第二XTEN，其中所述第一和第二XTEN均使用三聚体交联体与所述PCM的N末端或C末端缀合。在一些实施方案中，所述PCM包含与选自表8中所示序列的序列具有至少90％的序列同一性或与之相同的肽序列。在一些实施方案中，所述哺乳动物蛋白酶与所述靶组织共定位。在一些实施方案中，所述哺乳动物蛋白酶为所述靶组织分泌的细胞外蛋白酶，或为肿瘤细胞外基质的组分。在一些实施方案中，所述哺乳动物蛋白酶选自表7中所示的蛋白酶。在一些实施方案中，所述哺乳动物蛋白酶选自跨膜肽酶、中性溶酶(CD10)、PSMA、BMP-1、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17(TACE)、ADAM19、ADAM28(MDC-L)、具有血小板反应蛋白基序的ADAM(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-1(胶原酶
1)、MMP-2(明胶酶A)、MMP-3(溶基质蛋白酶1)、MMP-7(基质溶解素1)、MMP-8(胶原酶2)、MMP-
9(明胶酶B)、MMP-10(溶基质蛋白酶2)、MMP-11(溶基质蛋白酶3)、MMP-12(巨噬细胞弹性蛋白酶)、MMP-13(胶原酶3)、MMP-14(MT1-MMP)、MMP-15(MT2-MMP)、MMP-19、MMP-23(CA-MMP)、MMP-24(MT5-MMP)、MMP-26(基质溶解素2)、MMP-27(CMMP)、豆荚蛋白、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶X、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、分泌酶、尿激酶(uPA)、组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)、纤溶酶、凝血酶、前列腺特异性抗原(PSA、KLK3)、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、弹性蛋白酶、类胰蛋白酶、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)、DESC1、hepsin(HPN)、蛋白裂解酶、蛋白裂解酶-2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4(CAP2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、激肽释放酶相关肽酶(KLK家族)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14。在一些实施方案中，在所述药物分子与所述融合蛋白的CCD的半胱氨酸残基之间进行缀合反应时，获得缀合物产物的异质群体，其中完全缀合的CCD-药物缀合物产物能够达到>6的峰距，其中：a)所述融合蛋白包含具有600个或更多个累积的氨基酸残基的多肽，包括具有3至9个半胱氨酸残基的CCD；b)所述异质缀合物产物具有与所述CCD连接的至少1、2和3个或更多个有效负载的混合物；并且c)在反相HPLC色谱条件下分析所述缀合物产物。在一些实施方案中，所述CCD为表6中具有3个半胱氨酸残基的序列，并且所述融合蛋白具有至少800个累积的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述CCD为表6中具有9个半胱氨酸残基的序列，并且所述融合蛋白具有至少800个累积的氨基酸残基。在一些实施方案中，在所述PCM被所述靶组织蛋白酶切割时，所述XTEN从所述融合蛋白中释放，其中所述靶向部分和连接有药物或生物活性蛋白质的CCD仍然连接在一起作为释放的靶向组合物。在一些实施方案中，所述释放的靶向组合物的分子量具有比未切割的融合蛋白小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍的分子量。在一些实施方案中，所述释放的靶向组合物的流体动力学半径比未切割的融合蛋白小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍。在一些实施方案中，所述释放的靶向组合物对靶组织配体具有与未切割的融合蛋白相比大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍的结合亲和力。在一些实施方案中，所述释放的靶向组合物对所述配体具有小于约10-4M、或小于约10-5M、或小于约10-6M、或小于约10-7M、或小于约10-8M、或小于约10-9M、或小于约10-10M、或小于约10-11M、或小于约10-12M的结合亲和力常数(Kd)。在一些实施方案中，在体外ELISA测定中测量所述结合亲和力。在一些实施方案中，在体外哺乳动物细胞的细胞毒性测定中，所述释放的靶向组合物对携带所述配体的靶细胞的细胞毒性比未切割的融合蛋白的细胞毒性大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍，其中通过计算IC50确定细胞毒性。在一些实施方案中，当在可比条件下在暴露于所述释放的靶向组合物或所述融合蛋白后24-72小时之间确定生长抑制时，在体外哺乳动物细胞的细胞毒性测定中，所述释放的靶向组合物对携带所述配体的靶细胞的生长的抑制比未切割的融合蛋白对生长的抑制大至少20％、或至少
40％、或至少50％。在一些实施方案中，在向具有携带所述配体的靶组织和能够切割所述PCM的共定位蛋白酶的受试者施用团剂量的治疗有效量的融合蛋白后，通过所述蛋白酶释放的所述释放的靶向组合物能够在所述靶组织中累积到比未切割的融合蛋白大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍的浓度。在一些实施方案中，所述靶组织为肿瘤。在一些实施方案中，在施用后7至21天，所述施用导致所述肿瘤的体积减小至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。在一些实施方案中，在施用后7-21天，所述施用导致比不包含所述PCM且以可比剂量施用的融合蛋白多至少
10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％的肿瘤体积减小。在一些实施方案中，所述受试者选自小鼠、大鼠、兔、猴和人类。
[0011] 在一个方面，本发明提供了一种靶向缀合物组合物。在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物选自表5中的缀合物。在一些实施方案中，所述组合物从N末端至C末端被配置为：(a)(TM)-(CCD)-(PCM)-(XTEN)；或(b)(XTEN)-(PCM)-(CCD)-(TM)；其中药物分子与所述CCD的每个半胱氨酸残基连接。
[0012] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式I的结构：其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0013] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式II的结构：其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0014] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式III的结构：其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0015] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式IV的结构：其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0016] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式I的结构进行配置：其中(a)所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(d)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(d)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0017] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式II的结构进行配置：其中(a)所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述PCM选自表8中所示的序列；(d)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(e)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述PCM选自表8中所示的序列；(d)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(e)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0018] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式III的结构进行配置：其中(a)所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述PCM选自表8中所示的序列；(d)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(e)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述PCM选自表8中所示的序列；(d)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(e)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0019] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式IV的结构进行配置：其中(a)所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(d)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(d)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0020] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式V的结构进行配置：其中(a)所述TM1为包含VL和VH序列的第一scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述TM2为与所述第一scFv不同的第二scFv，其中所述TM2包含VL和VH序列，其中每个VL和VH与来自选自表
19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(c)所述CCD选自表6中的CCD；(d)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或
94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(e)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀
10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(c)所述CCD选自表6中的CCD；(d)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或
94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(e)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀
10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0021] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式VI的结构进行配置：其中(a)所述TM1为包含VL和VH序列的第一scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述TM2为与所述第一scFv不同的第二scFv，其中所述TM2包含VL和VH序列，其中每个VL和VH与来自选自表
19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(c)所述CCD选自表6中的CCD；(d)所述PCM选自表8中的PCM；(e)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(f)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(c)所述CCD选自表6中的CCD；(d)所述PCM选自表8中的PCM；(e)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(f)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0022] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式VIII的结构进行配置：其中(a)所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述PCM选自表8中的PCM；(d)所述CL为选自表25中的交联体的交联体；(e)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(f)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述CCD选自表6中的CCD；(c)所述PCM选自表8中的PCM；(d)所述CL为选自表25中的交联体的交联体；(e)所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且(f)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0023] 在一些实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式X的结构进行配置：其中(a)所述TM1为包含VL和VH序列的第一scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(b)所述TM2为与所述第一scFv不同的第二scFv，其中所述TM2包含VL和VH序列，其中每个VL和VH与来自选自表
19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(c)所述CCD选自表6中的CCD；(d)所述PCM选自表8中的PCM；(e)所述XTEN为与表11中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同的半胱氨酸工程化的XTEN；(f)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数；
并且(g)y为与所述XTEN的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；(c)所述CCD选自表6中的CCD；(d)所述PCM选自表8中的PCM；(e)所述XTEN为与表11中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同的半胱氨酸工程化的XTEN；(f)所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数；
并且(g)y为与所述XTEN的半胱氨酸残基的数目相等的整数。
[0024] 在一个方面，本发明提供了一种药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含根据本文公开的各个实施方案中任一个，包括关于本发明的各个方面的任一个的融合蛋白。在一些实施方案中，所述药物组合物包含根据本文公开的各个实施方案中任一个，包括关于本发明的各个方面的任一个的靶向缀合物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗受试者的疾病，其中所述疾病选自乳腺癌、ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝脏癌、肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、食管癌、纤维肉瘤、绒毛膜癌、卵巢癌、宫颈癌、喉癌、子宫内膜癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、卡波西肉瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、甲状腺癌、威尔姆斯肿瘤、泌尿道癌、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、成胶质细胞瘤、胰腺癌、白血病、急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(PCML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞疾病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、寻常痤疮、哮喘、自身免疫疾病、自身炎症性疾病、腹腔疾病、慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、超敏反应、炎性肠病、克罗恩病、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、肉样瘤病、移植排斥、血管炎、银屑病、纤维肌痛、肠易激综合征、红斑狼疮、骨关节炎、硬皮病和溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，所述药物组合物用于在用于治疗所述受试者的药物方案中使用，所述方案包含所述药物组合物。在一些实施方案中，所述药物方案进一步包括确定在患有所述疾病的受试者中达到有益效果所需的药物组合物的量的步骤。
[0025] 在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用一个、或两个、或三个、或四个、或更多个治疗有效剂量的根据本文公开的各个实施方案中任一个，包括关于本发明的各个方面的任一个的药物组合物的方案。在一些实施方案中，所述疾病选自乳腺癌、ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝脏癌、肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、食管癌、纤维肉瘤、绒毛膜癌、卵巢癌、宫颈癌、喉癌、子宫内膜癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、卡波西肉瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、甲状腺癌、威尔姆斯肿瘤、泌尿道癌、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、成胶质细胞瘤和胰腺癌。在一些实施方案中，所施用的药物组合物包含靶向部分，其中所述靶向部分对所述疾病的肿瘤具有特异性结合亲和力。在一些实施方案中，所施用的药物组合物包含靶向部分，其中所述靶向部分对选自表2、表3、表4、表18和表19中所示靶标的靶标具有特异性结合亲和力。在一些实施方案中，所述施用导致与癌症相关的至少一个、两个或三个参数比未治疗的受试者大至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％的改善，其中所述参数选自所述癌症的进展时间、复发时间、局部复发发现时间、区域转移发现时间、远处转移发现时间、症状发作时间、疼痛、体重、住院、止痛药需要增加时间、救治性化疗需要时间、救治性手术需要时间、救治性放疗需要时间、治疗失败时间和存活时间。在一些实施方案中，所施用的剂量导致所述受试者的肿瘤大小的减小。在一些实施方案中，肿瘤大小减小至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％或更多。在一些实施方案中，在施用后至少约10天、至少约14天、至少约21天或施用后至少约30天内达到肿瘤大小的减小。在一些实施方案中，所施用的剂量导致所述受试者的肿瘤停滞。在一些实施方案中，在施用后至少约10天、至少约14天、至少约21天或施用后至少约30天内达到肿瘤停滞。在一些实施方案中，所述方案包括每7天、或每10天、或每14天、或每21天、或每30天施用所述治疗有效剂量。在一些实施方案中，使用在受试者中的治疗有效剂量方案施用所述药物组合物，其中所述治疗有效剂量方案导致对携带选自表2、表3、表4、表18和表
19中所示靶标的靶标的肿瘤细胞的生长抑制作用。在一些实施方案中，当向受试者施用时，所述药物组合物的融合蛋白或靶向缀合物组合物显示出长于至少约72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约144h、或至少约10天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。
19中所示靶标的靶标的肿瘤细胞的生长抑制作用。在一些实施方案中，当向受试者施用时，所述药物组合物的融合蛋白或靶向缀合物组合物显示出长于至少约72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约144h、或至少约10天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。
[0026] 在一个方面，本发明提供了一种降低患有癌症肿瘤的受试者的治疗频率的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用针对药物组合物的治疗有效剂量方案向所述受试者施用所述药物组合物。所述药物组合物可以是根据本文公开的各个实施方案中任一个，包括关于本发明的各个方面的任一个的任何药物组合物。在一些实施方案中，所述施用导致所述受试者的肿瘤大小的减小，其中肿瘤大小减小至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％或更多。在一些实施方案中，所述导致癌症肿瘤大小减小的方案为每
7天、或每10天、或每14天、或每21天、或每30天或每月施用治疗有效剂量的所述药物组合物。在一些实施方案中，所述导致癌症肿瘤大小减小的方案在受试者中具有比未与所述缀合物组合物连接的相应的有效负载药物的治疗有效剂量方案大3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍的给药间隔。
7天、或每10天、或每14天、或每21天、或每30天或每月施用治疗有效剂量的所述药物组合物。在一些实施方案中，所述导致癌症肿瘤大小减小的方案在受试者中具有比未与所述缀合物组合物连接的相应的有效负载药物的治疗有效剂量方案大3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍的给药间隔。
[0027] 在一个方面，本发明提供了一种在体外处理癌细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向癌细胞的细胞培养物施用有效量的根据本文公开的各个实施方案中任一个，包括关于本发明的各个方面的任一个的融合蛋白，其中所述施用导致对所述癌细胞的细胞毒性作用。在一些实施方案中，所述方法包括向癌细胞的细胞培养物施用有效量的根据本文公开的各个实施方案中任一个，包括关于本发明的各个方面的任一个的靶向缀合物组合物，其中所述施用导致对所述癌细胞的细胞毒性作用。在一些实施方案中，所述癌细胞具有靶标，所述缀合物组合物的TM对该靶标具有结合亲和力。在一些实施方案中，所述靶标选自表2、表3、表4、表18和表19中所示的靶标。在一些实施方案中，所述培养物包含能够切割所述缀合物组合物的PCM的蛋白酶。在一些实施方案中，所述癌细胞选自表18中的细胞系。在一些实施方案中，所述缀合物组合物的细胞毒性作用比使用不具有针对所述缀合物组合物的TM的配体的癌细胞所看到的细胞毒性作用更大。
[0028] 在一个方面，本发明提供了一种分离的核酸。在一些实施方案中，所述分离的核酸包含：(a)编码根据本文公开的各个实施方案中任一个，包括关于本发明的各个方面的任一个的融合蛋白的多核苷酸序列，和/或(b)根据(a)的多核苷酸的互补体。
[0029] 在一个方面，本发明提供了一种表达载体。在一些实施方案中，所述表达载体包含根据本文公开的各个方面和实施方案中任一个的多核苷酸，以及与所述多核苷酸序列可操作地连接的重组调节序列。
[0030] 在一个方面，本发明提供了一种宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含根据本文公开的各个方面和实施方案中任一个的表达载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞为原核生物。在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。援引并入
[0032] 可以通过参考以下对说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，进一步解释本发明的特征和优点。
[0033] 图1示出了适用于与有效负载缀合的XTEN的示意图。图1A示出了不同长度的未修饰的XTEN。图1B示出了具有含巯基侧链的内部半胱氨酸的半胱氨酸工程化的XTEN；下面是具有反应性N末端氨基基团的XTEN；再下面是具有含巯基反应性基团的N末端半胱氨酸的XTEN。图1C示出了具有多个内部半胱氨酸的半胱氨酸工程化的XTEN(左)和具有多个反应性氨基基团的赖氨酸工程化的XTEN(右)。图1D示出了具有工程化的巯基和氨基基团的XTEN的三种变化。
[0034] 图2示出了利用与伯氨基基团反应的NHS-酯及其水溶性类似物磺基-NHS-酯产生稳定的酰胺XTEN-有效负载产物的缀合反应。
[0035] 图3示出了各种缀合反应。图3A示出了利用巯基基团和N-马来酰亚胺的缀合反应。当反应混合物的pH在pH 6.5和7.5之间时，马来酰亚胺基团与巯基特异性反应，形成不可逆的稳定的硫醚连接。图3B示出了利用卤代乙酰基的缀合反应。最常用的卤代乙酰基试剂含有在生理pH下与巯基基团反应的碘乙酰基基团。碘乙酰基基团与巯基的反应通过巯基对碘的亲核取代进行，在XTEN-有效负载中产生稳定的硫醚连接。图3C示出了利用吡啶基二硫化物的缀合反应。吡啶基二硫化物在宽pH范围(最佳pH为4-5)内与巯基反应，以形成使XTEN与有效负载连接的二硫键。
[0036] 图4(在图4A和图4B中)示出了利用零长度交联体的缀合反应，其中该交联体用于使一个分子(如有效负载)的羧基官能团与另一个分子(如XTEN)的伯胺直接缀合。
[0038] 图6示出了使用基于硫代-烯的化学过程的缀合反应，其可通过称作硫代-烯反应的自由基反应或称作巯基迈克尔加成的阴离子反应进行。
[0039] 图7示出了利用基于酰肼和醛之间反应的化学过程产生XTEN-有效负载中所示腙连接的缀合反应。
[0040] 图8示出了利用酶连接的缀合反应。图8A：转谷氨酰胺酶是催化有效负载肽或蛋白质的谷氨酰胺的γ-甲酰胺基团与赖氨酸工程化的XTEN中赖氨酸的ε-氨基基团(或N末端氨基基团)之间形成异肽键，从而产生XTEN和有效负载之间的分子间或分子内交联的酶。图8B示出了酶促产生的XTEN-有效负载组合物，其利用来自金黄色葡萄球菌的分选酶A转肽酶催化蛋白质1的苏氨酸和甘氨酸残基之间的短5-氨基酸识别序列LPXTG的切割，随后将酰基片段转移到蛋白质1的N末端寡赖氨酸亲核体。通过使蛋白质2官能化以含有寡甘氨酸，两种蛋白质的酶促缀合是以位点特异性方式实现的，以产生所需的XTEN-有效负载组合物。
[0041] 图9示出了用作反应物以与靶向部分、有效负载或其他XTEN反应物连接的各种XTEN-交联体前体区段。图9A意在表明，1B表示右边前体的其余反应性基团。图9B示出了具有缀合至XTEN的多个(左)或单个(右)有效负载A分子的相似的反应性前体。
[0042] 图10示出了具有两个交联体反应性基团或并入的氨基酸的反应性基团的XTEN-交联体前体区段的示例性排列，其用作反应物以与有效负载或其他XTEN反应物连接。1B和2B表示将会与其他图中相似编号的反应性基团进行反应的反应性基团；1与1以及2与2等。
[0043] 图11意在示出各种反应物的实例和对于附图其他地方所示构型的命名。图11A示出了各种形式的反应性XTEN区段前体，其各自在N末端具有不同的反应性基团。图11B示出了具有2、3或4个反应性基团的各种交联体。在第一种情况下，二价交联体是与由“2”和“1”所表示的两种不同类型的反应性基团反应的杂官能连接体。其余三个表示相同反应性基团的二价、三价和四价交联体。图11C示出了两种XTEN区段前体的反应产物的命名。在顶部版本中，1A与1B反应产生在N末端连接的二聚体XTEN，其中交联体的残基由1AR-1BR表示，而底部版本也是在N末端连接的二聚体XTEN，其中交联体的残基由2AR-2BR表示。然而，也可使用相同的方法使靶向部分与XTEN或CCD缀合或者使有效负载药物与CCD缀合。
[0044] 图12示出了各种XTEN前体区段的产生。图12A示出了制备XTEN多肽的步骤，随后用2B-1A交联体使N末端与交联体反应，其中1A与N末端1B(例如，α氨基酸)反应以产生具有反应性基团2B的XTEN前体2。图12B示出了向XTEN的2B反应性基团连续加入具有2A反应性基团的两个交联体，产生XTEN前体4，该XTEN前体4然后与交联体在交联体的反应性1B与1A之间的N末端反应，产生具有反应性基团4B和3B的XTEN前体5。在这样的情况下，XTEN前体5然后可用作骨架反应物，以使两个靶向缀合融合蛋白与3B缀合以及靶向部分与4B缀合。
[0045] 图13示出了具有两种有效负载的双特异性缀合物的各种构型。图13A示出了具有两种有效负载的各一个分子的构型，而图13B示出了具有一种或两种有效负载的多个拷贝的各种构型。
[0046] 图14示出了包含靶向部分、XTEN和具有连接的有效负载的CCD的缀合物的实例。靶向部分可以是肽、拟肽或受体配体。图14A示出了与靶向部分缀合的CCD-XTEN的单一融合蛋白。该CCD具有与半胱氨酸残基缀合的3个有效负载。图14B示出了与两个CCD-XTEN融合蛋白(其可以包括PCM-TM-CCD-药物有效负载)的末端缀合的TM的缀合物，其中有效负载与CCD的半胱氨酸残基缀合。
[0047] 图15示出了组合的CCD-PCM-XTEN缀合物文库的创建实例。有效负载A、B、C与携带反应性基团1A的CCD-PCM-XTEN缀合，从而产生一组CCD-PCM-XTEN-前体区段。有效负载E、F和G与携带反应性基团1B的CCD-PCM-XTEN缀合，从而产生第二组CCD-PCM-XTEN-前体区段。这些区段经历组合缀合，然后从反应物纯化。这使得能够形成组合产物，该组合产物可以立即经历体外和体内测试。在这种情况下，反应性基团1A和1B是具有或不具有双特异性交联体的XTEN的α-氨基基团。在一个实例中，1A是叠氮化物，1B是炔烃，或者反之亦然，而有效负载经由XTEN中的巯基基团与XTEN附接。PCM结构域在所示的CCD-PCM-XTEN分子中是可选的。
[0048] 图16示出了组合的CCD-PCM-XTEN缀合物文库的创建实例，该缀合物文库优化了两种有效负载之间的比例。每种文库成员携带不同比例的有效负载A和有效负载E。PCM结构域在所示的CCD-PCM-XTEN分子中是可选的。在测试之后，将期望的候选物并入靶向缀合物组合物中。
[0049] 图17示出了组合的CCD-PCM-XTEN缀合物文库的创建实例，该缀合物文库产生了靶向部分和有效负载的组合。靶向部分与携带反应性基团1A的CCD-PCM-XTEN缀合。有效负载E、F和G与携带反应性基团1B的CCD-PCM-XTEN缀合。这些区段经历组合缀合，使得能够形成组合产物，其中每种文库成员包含靶向部分和有效负载。携带有效负载和缀合基团的所有CCD-PCM-XTEN区段可纯化为可以立即经历体外和体内测试的组合产物。PCM结构域在所示的CCD-PCM-XTEN分子中是可选的。在测试之后，将期望的候选物并入靶向缀合物组合物中。
[0050] 图18示出了与靶细胞相互作用的靶向缀合物组合物的示意性实例。图18A示出了一个实例，其中XTEN保持与CCD和靶向部分融合为融合蛋白，并与在许多癌细胞上过表达的靶受体结合。受体结合导致内化，随后是蛋白水解分解和有效负载A的细胞内释放，这对细胞是有毒的。图18B示出了一种构建体设计，其中XTEN通过PCM的切割而被释放，而包含靶向部分和具有连接的有效负载的CCD的所得片段与在许多癌细胞上过表达的靶受体结合。受体结合导致内化，随后是蛋白水解分解和有效负载A的细胞内释放，这对细胞是有毒的。
[0051] 图19示出了如实施例7所述的CCD-XTEN构建体的完整纯化过程。图19A示出了阳离子交换捕获步骤后的CCD-XTEN级分的SDS-PAGE分析。每个泳道的材料是：泳道1：分子量标记；泳道2：阳离子交换柱负载；泳道3-5：阳离子交换柱流过/洗涤级分1-3；泳道6：阳离子交换柱洗脱物；泳道7：阳离子交换条带。图19B示出了阴离子交换抛光步骤级分的SDS-PAGE分析。每个泳道的材料是：泳道1：分子量标记；泳道2：阴离子交换柱负载(胰蛋白酶消化后)；泳道3：阴离子交换柱流过物；泳道4-12：阴离子交换柱洗脱级分E1-E9。
[0052] 图20示出了如实施例8所述的CCD-PCM-XTEN构建体的完整纯化过程。图20A示出了阳离子交换捕获步骤后的CCD-PCM-XTEN级分的SDS-PAGE分析。每个泳道的材料是：泳道1：分子量标记；泳道2：阳离子交换柱负载；泳道3-5：阳离子交换柱流过/洗涤级分1-3；泳道6：
阳离子交换洗脱物；泳道7：阳离子交换柱条带。图20B示出了阴离子交换抛光步骤级分的SDS-PAGE分析。每个泳道的材料是：泳道1：分子量标记；泳道2：阴离子交换柱负载(胰蛋白酶消化后)；泳道3：阴离子交换柱流过物；泳道4-17：阴离子交换柱洗脱级分E1-E14；泳道
18：分子量标记；泳道19：阴离子交换柱负载(胰蛋白酶消化后)；泳道20-33：阴离子交换柱洗脱级分E15-E24；泳道34：阴离子交换柱条带。
阳离子交换洗脱物；泳道7：阳离子交换柱条带。图20B示出了阴离子交换抛光步骤级分的SDS-PAGE分析。每个泳道的材料是：泳道1：分子量标记；泳道2：阴离子交换柱负载(胰蛋白酶消化后)；泳道3：阴离子交换柱流过物；泳道4-17：阴离子交换柱洗脱级分E1-E14；泳道
18：分子量标记；泳道19：阴离子交换柱负载(胰蛋白酶消化后)；泳道20-33：阴离子交换柱洗脱级分E15-E24；泳道34：阴离子交换柱条带。
[0053] 图21示出了来自合成3x-MMAE-CCD-XTEN和3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN的实验的结果。图21A是如实施例11所述的表明纯度>95％的3x-MMAE-CCD-XTEN的分析性C4 RP-HPLC迹线。
图21B是如实施例12所述的表明纯度>95％的3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN的分析性C4 RP-HPLC迹线。
图21B是如实施例12所述的表明纯度>95％的3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN的分析性C4 RP-HPLC迹线。
[0054] 图22示出了来自如实施例15所述的合成3x-MMAE-CCD-XTEN的实验的结果。图22A是表明纯度>95％的MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN的分析性C4 RP-HPLC迹线。图22B是具有分子量标记物(泳道1)、MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN(泳道2)和MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN与Cys-XTEN反应的马来酰亚胺反应性评估(泳道3)的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶。
[0055] 图23示出了来自如实施例18所述的合成aHER2-靶向CCD-XTEN-药物缀合物的实验的结果。图23A是具有分子量标记物(泳道1)和来自HER2-XTEN和MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN反应的纯化的aHER2-靶向CCD-XTEN-药物缀合物(泳道2)的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶。图23B是表明aHER2-靶向CCD-XTEN-药物缀合物的纯度和完整质量的ESI-MS数据。图23C是表明aHER2-靶向CCD-XTEN-药物缀合物单体纯度的分析性SEC-HPLC数据。
[0056] 图24示出了来自如实施例19所述的合成具有PCM的aHER2-靶向CCD-XTEN-药物缀合物的实验的结果。图24A是具有分子量标记物(泳道1)和来自HER2-XTEN和MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN反应、具有PCM的纯化的aHER2-靶向CCD-XTEN-药物缀合物(泳道2)的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶。图24B是表明aHER2-靶向CCD-XTEN-药物缀合物的纯度和完整质量的ESI-MS数据。图24C是表明具有PCM的aHER2-靶向CCD-XTEN-药物缀合物单体纯度的分析性SEC-HPLC数据。
[0057] 图25示出了来自如实施例16所述的合成aHER2-靶向XTEN-3x-DM1缀合物的实验的结果。图25A是具有分子量标记物(泳道1)和纯化的aHER2-靶向XTEN-3xDM1缀合物(泳道2)的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶。图25B是表明aHER2-靶向XTEN-3xDM1的纯度和完整质量的ESI-MS数据。图25C是表明aHER2-靶向XTEN-3xDM1单体纯度的分析性SEC-HPLC数据。
[0058] 图26示出了来自XTEN_AE864的稳定性研究的样品的SDS-PAGE凝胶。如实施例29所述，将XTEN_AE864在大鼠血浆(图26A)、大鼠肾匀浆(图26B，左)和PBS缓冲液(图26B，右)中在37℃下温育至多7天。在0小时、4小时、24小时、7天取出样品，通过甲醇沉淀提取XTEN，并通过SDS-PAGE进行分析，随后用全染色剂(Stains-all)进行染色。箭头显示全长XTEN864的位置。
[0059] 图27示出了如实施例30所述进行的Ex4-XTEN_AE864的近紫外圆二色谱。
[0060] 图28是BlockScore算法(实施例32)的逻辑流程图的示意图。在该图中使用下面的图例：i、j——在贯穿整个序列的控制回路中使用的计数器；HitCount——此变量是追踪子序列在区组(block)内遇到相同的子序列多少次的计数器；SubSeqX——此变量代表正在检查冗余度的子序列；SubSeqY——此变量代表针对其检查SubSeqX的子序列；BlockLen——此变量代表用户确定的区组长度；SegLen——此变量代表区段的长度。对该程序进行硬编码以对长度为3、4、5、6、7、8、9和10的子序列生成评分；Block——此变量代表长度为BlockLen的字串。该字串由来自输入XTEN序列的字母组成，并且由i计数器的位置来确定；SubSeqList——这是保存所有生成的子序列评分的列表。
[0061] 图29示出了来自如实施例17所述的合成aHER2-靶向XTEN-3x-MMAE缀合物的实验的结果。图29A是具有分子量标记物(泳道1)和纯化的aHER2-靶向XTEN-3xMMAE缀合物(泳道2)的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶。图29B是表明aHER2-靶向XTEN-3xMMAE的纯度和完整质量的ESI-MS数据。
[0062] 图30示出了来自如实施例20所述的合成叶酸-靶向CCD-XTEN-药物缀合物的实验的结果。图30A是来自叶酸-AHHAC和MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN反应的纯化的叶酸-靶向CCD-XTEN-药物缀合物的分析性C4 RP-HPLC迹线。图30B是具有分子量标记物(泳道1)和纯化的叶酸-靶向CCD-XTEN-药物缀合物(泳道2)的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶。
[0063] 图31示出了来自如实施例21所述的合成具有PCM的叶酸-靶向CCD-XTEN-药物缀合物的实验的结果。图31A是来自叶酸-AHHAC和MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN反应、具有PCM的纯化的叶酸-靶向CCD-XTEN-药物缀合物的分析性C4 RP-HPLC迹线。图31B是具有分子量标记物(泳道1)和具有PCM的纯化的叶酸-靶向CCD-XTEN-药物缀合物(泳道2)的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶。
[0064] 图32示出了来自如实施例10所述的合成3x-MMAE-XTEN的实验的分析性C4 RP-HPLC结果。
[0065] 图33示出了来自如实施例11所述的合成3x-MMAE-CCD-XTEN和如实施例10所述的合成3x-MMAE-XTEN的实验的结果。图33A示出了用于药物有效负载与CCD-XTEN或半胱氨酸工程化的XTEN缀合的方案。图33B示出了用于药物与CCD-XTEN或半胱氨酸工程化的XTEN缀合的分析性C4 RP-HPLC迹线。
[0066] 图34示出了不同形式的靶向部分-CDC-PCM-XTEN-有效负载缀合物，其中PCM结构域是可选的。所附接的XTEN有助于在向受试者施用后延长组合物的全身半衰期。当组合物处于肿瘤微环境中时，肿瘤的过表达的蛋白酶切割PCM(如果存在)，释放末端XTEN，从而导致较小剩余区段更好地穿透，该剩余区段携带与具有连接的有效负载的CCD融合的靶向部分。图34A示出了与CCD附接的一个或多个有效负载A分子，该CCD将会在PCM处的蛋白水解切割后与靶向部分(TM1)保持在一起，从而从该组合物上释放XTEN。图34B示出了与CCD附接的一个或多个有效负载A分子，该CCD将会与靶向部分(TM1)和XTEN保持在一起，而没有XTEN从该组合物上的蛋白水解切割。图34C示出了通过多价交联体与PCM附接的不同数目的XTEN，该XTEN能够在PCM的切割之后被释放，从而导致携带靶向部分和具有连接的有效负载荷的CCD的较小N末端区段更好地穿透。图34D示出了在PCM切割后释放的XTEN的长度可因靶向缀合物组合物而异，目的在于调节有效负载和靶向部分的药代动力学、肿瘤穿透和屏蔽，后一种性质还在图35中示出。
[0067] 图35示出了靶向缀合物组合物构建体的不同形式，其中靶向部分(TM1)被蛋白酶可释放的XTEN和/或化合物构型的空间位阻所屏蔽。在这些示例性构型中，TM1仅在肿瘤微环境中的PCM切割后暴露，并变得可接近其配体。相反，由于正常组织缺乏在肿瘤微环境中所观察到的蛋白酶过表达，因此具有癌症靶标的高表达但缺乏蛋白酶表达或具有蛋白酶的低表达的正常组织将会幸免。图35A示出了与单个蛋白酶可切割的XTEN连接的构建体设计。图35B示出了与多个蛋白酶可切割的XTEN连接的构建体设计，以实现更好的屏蔽效应。
[0068] 图36示出了具有与CCD-XTEN缀合的叶酸靶向部分(图36A)或与CCD-PCM-XTEN缀合的叶酸靶向部分(图36B)的叶酸-靶向XTEN缀合物的化学结构和序列，其中MMAE分子(图36C)与CCD的Z修饰半胱氨酸残基缀合。
[0069] 图37示出了PCM-TM1-CCD-有效负载-PCM-XTEN2构建体的多个拷贝或PCM-TM1-CCD-有效负载构建体的多个拷贝向单个骨架XTEN上的缀合。图37A示出了含有三个反应性基团(IB)的XTEN1。图37B示出了在与靶向部分(TM1)融合的PCM序列上含有反应性基团(1A)的融合蛋白，该TM1与携带三个有效负载A拷贝和一个XTEN2的CCD区段融合；图37C示出了在与靶向部分(TM1)融合的PCM序列上含有反应性基团(1A)的融合蛋白，该TM1与携带三个有效负载A拷贝的CCD区段融合。图37D示出了图37A和37B最终缀合物的反应产物，其具有携带多个拷贝的蛋白酶可释放的TM1-CCD-3x-有效负载A-XTEN2缀合物的一个XTEN骨架序列，而图37E示出了图37A和37C最终缀合物的反应产物，其具有携带多个拷贝的蛋白酶可释放的TM1-CCD-3x-有效负载A缀合物的一个XTEN骨架序列。最终缀合物的TM1被屏蔽，但由于XTEN赋予的增强的渗透性和保留(EPR)效应，该构建体相比正常组织可能更多地渗入肿瘤组织。
[0070] 图38示出了靶向缀合物组合物的切割、结合和加工的示意性实例，该靶向缀合物组合物包含与CCD和连接的毒素有效负载融合、通过蛋白酶切割部分(PCM)与XTEN骨架缀合的靶向部分的融合蛋白，该蛋白酶切割部分(PCM)具有能够在靶细胞如肿瘤细胞的微环境中被蛋白酶切割的序列。当缀合物处于过表达能够切割PCM的蛋白酶的肿瘤微环境中时，所切割的具有TM1(与具有连接的细胞毒性有效负载A的CCD融合)的缀合物组分与在癌细胞上过表达的靶受体结合。受体结合导致所结合的融合蛋白缀合物的内化，随后是蛋白水解分解和有效负载A的细胞内释放，这对细胞是有毒的。
[0071] 图39示出了反应性PCM-TM1-CCD-有效负载-XTEN2(图39B)或反应性PCM-TM1-CCD-有效负载(图39C)分子的多个拷贝向单个骨架XTEN上的缀合。图39A示出了含有三个反应性基团(IB)的骨架XTEN以及用于使药物靠近肿瘤组织的靶向部分(TM2)。图39D示出了具有一个TM2靶向分子的最终缀合物构建体，该构建体在这种情况下携带三个拷贝的蛋白酶可释放的TM1-CCD-3x-有效负载A-XTEN2缀合物。图39E示出了具有一个TM2靶向分子的最终缀合物构建体，该构建体在这种情况下携带三个拷贝的蛋白酶可释放的TM1-CCD-3x-有效负载A缀合物。
[0072] 图40示出了图39的缀合物的切割、结合和加工的示意性实例，该缀合物包含通过蛋白酶切割部分(PCM)与骨架XTEN连接的靶向部分和毒素有效负载，该蛋白酶切割部分对靶细胞如肿瘤细胞发挥选择性作用。在这种情况下，XTEN骨架上的第二靶向结构域(TM2)用于使整个分子向肿瘤靠近，但不内化。这允许在肿瘤微环境中停留足够的时间以使肿瘤表达的蛋白酶作用于PCM，从而通过解除完整组合物的屏蔽效应而释放并“激活”TM1-CCD-有效负载A缀合物。
[0073] 图41示出了以选择性方式降低并随后恢复XTEN-缀合物中活性部分的效力的作用机理的示意图。在缺乏(或具有降低的)蛋白酶活性的血液和其他正常的健康组织中，图41A的XTEN-缀合物大部分保持完整，维持长血清半衰期和对具有活性部分的受体的正常组织的低亲和力。在蛋白酶水平升高的发炎组织中，蛋白酶将会切割PCM(图41B)，在发炎组织的附近释放有效负载，从而恢复效力和发挥其药理作用的能力。
[0074] 图42示出了携带多个拷贝的蛋白酶可释放的活性部分(图42B)或活性部分-XTEN2融合蛋白(图42C)的一个亲代XTEN骨架(图42A)的缀合。在这两种情况下，活性部分被阻断，直到如图41所述的发炎组织中过表达的蛋白酶将它们释放出来。
[0075] 图43示出了蛋白酶可激活的抗体片段的不同形式。图43A示出了定向为与可变轻链连接的可变重链(反之亦然)的scFv；图43B示出了与scFv的任一末端或两个末端融合的各种长度的蛋白酶可切割的XTEN。scFv的亲和力由于XTEN融合而受损，并在靶组织中的蛋白酶切割后恢复。图43C示出了蛋白酶可切割的XTEN向非必需CDR如可变轻链的CDR2和CDR3中的插入。所插入的XTEN区段不影响scFv的整体折叠，但对其他CDR提供了屏蔽效应，因此阻碍scFv-XTEN融合物与其靶标的结合，直到蛋白酶切割。图43D示出了蛋白酶可切割的XTEN与scFv的末端融合和CDR插入的各种排列。
[0076] 图44示出了用来确定MMP-9酶对肽基切割部分的作用的测定结果。将10μM具有PLGLAG切割位点的XTEN864-His与0.1ng/μL的MMP-9在20μL反应中进行温育。将反应在37℃下温育长达1小时，通过添加EDTA至20mM停止消化而以10分钟间隔收集等分试样。通过C18 RP-HPLC(图44A)进行样品分析以确定切割产物的百分比。在该测定中还包括两个阴性对照：一个用来确认在不存在MMP-9的情况下不发生消化，另一个用来确认在单独存在APMA(酶原活化中使用的化学物质)的情况下不发生消化(图44B)。
[0077] 图45示出了如实施例9所述的包含蛋白水解切割部分BSRS-1的XTEN的蛋白水解切割测定的结果。图45A是用MTSP-1、uPA、MMP-2、MMP-7消化的BSRS1-XTEN的SDS-PAGE测定的结果，其中与未切割的起始材料相比，消化产物以较小的表观分子量运行。图45B示出了消化前和消化后样品的RPC18 HPLC分析的结果，其中保留时间有明显位移。
[0078] 图46示出了缀合物组合物的构型，其中TM1与该组合物重组连接或与融合蛋白缀合。图46A示出了包含融合蛋白的缀合物组合物的构型，该融合蛋白包含XTEN、肽基切割部分(PCM)、CCD和位于N末端的TM1，其中TM1、CCD、PCM和XTEN都作为重组多肽进行连接，并且三个相同的有效负载A分子在CCD的半胱氨酸残基处与融合蛋白缀合。图46B示出了具有与图46A相同的组分，但组分的N末端至C末端方向相反的组合物。图46C示出了包含融合蛋白的缀合物组合物的构型，该融合蛋白包含XTEN、肽基切割部分(PCM)、CCD，并且TM1与CCD-PCM-XTEN融合蛋白的N末端缀合(箭头指示缀合位点)。
[0079] 图47示出了缀合物组合物的构型，其中TM1与该组合物重组连接或与融合蛋白缀合。图47A示出了包含与肽基切割部分(PCM)、靶向部分(TM1)和CCD的融合蛋白缀合的XTEN的缀合物组合物的构型。三个有效负载A分子在CCD的半胱氨酸残基处与融合蛋白缀合。图47B示出了包含XTEN的缀合物组合物的构型，该XTEN选自表10的序列并与肽基切割部分(PCM)缀合，其中该PCM序列选自表7的PCM序列并与同CCD缀合的靶向部分(TM1)连接。三个有效负载A分子与CCD的半胱氨酸残基缀合。箭头指示缀合位点。
[0080] 图48示出了靶向缀合物组合物的构型，其中TM1与该组合物重组连接或与融合蛋白缀合。图48A示出了包含与三聚体交联体连接的两个相同的XTEN分子的缀合物组合物的构型，融合蛋白包含i)肽基切割部分(PCM)；ii)重组连接在PCM和CCD之间的靶向部分(TM1)；和iii)具有在CCD的半胱氨酸残基处与融合蛋白缀合的三个有效负载A分子的CCD。箭头指示缀合位点。图48B示出了与图48相同的一般构型，但TM1与PCM重组连接并与CCD缀合。
[0081] 图49示出了靶向缀合物组合物的构型，其中TM1与该组合物重组连接或与融合蛋白缀合。图49A示出了包含XTEN骨架、三个相同的融合蛋白分子的缀合物组合物的构型，该融合蛋白包含i)肽基切割部分(PCM)；ii)与三个融合蛋白每一个中的PCM和CCD重组连接的靶向部分(TM1)；iii)CCD；和九个有效负载A分子，其中每个有效负载A三个分子在CCD的半胱氨酸残基处与三个融合蛋白中的每一个缀合。箭头指示缀合位点。图49B示出了与图49A相同的一般构型，但TM1与PCM重组连接并与携带有效负载A分子的CCD缀合。
[0082] 图50示出了靶向缀合物组合物的构型。图50A示出了缀合物组合物的构型，该缀合物组合物包含(a)第一融合蛋白，其包含与PCM和携带三个有效负载A分子的CCD重组连接的骨架XTEN和靶向部分(TM2)；(b)与XTEN的半胱氨酸残基缀合的三个相同的融合蛋白分子，其包含i)肽基切割部分(PCM)；ii)靶向部分(TM1)，其中TM1结合与TM2不同的靶标；iii)CCD；和(c)九个有效负载A分子，其中每个有效负载A三个分子在CCD的半胱氨酸残基处与三个融合蛋白中的每一个缀合。箭头指示缀合位点。图50B示出了与图50A相同的一般构型，但TM1与PCM重组连接并与携带有效负载A分子的CCD缀合。
[0083] 图51示出了包含免疫球蛋白分子和两个可切割的缀合物组合物分子的缀合物组合物的构型，该可切割的缀合物组合物包含融合蛋白，该融合蛋白包含i)XTEN；ii)肽基切割部分(PCM)；iii)CCD；和iv)三个相同的有效负载A分子，其中每个有效负载A三个分子在CCD的半胱氨酸残基处与每个融合蛋白缀合。箭头指示融合蛋白与免疫球蛋白的缀合位点。
[0084] 图52示出了与能够切割PCM(由剪刀指示)的蛋白酶进行反应的图46的缀合物组合物和所得到的反应产物。图52A(TM1的重组附接)和图52B(TM1的缀合附接)均示出了PCM处的切割位置和大体积XTEN从该组合物剩余部分上的释放，其中大大降低分子大小且不受XTEN的屏蔽效应影响的剩余部分能够与有效负载药物结合并将其递送至靶组织。
[0085] 图53示出了与能够切割PCM(由剪刀指示)的蛋白酶进行反应的图47的缀合物组合物和反应产物。图53A(TM1的重组附接)和图53B(TM1的缀合附接)均示出了PCM处的切割位置和大体积XTEN从该组合物剩余部分上的释放，其中大大降低分子大小且不受XTEN的屏蔽效应影响的剩余部分能够与有效负载药物结合并将其递送至靶组织。
[0086] 图54示出了与能够切割PCM(由剪刀指示)的蛋白酶进行反应的图48的缀合物组合物和所得到的反应产物。图54A(TM1的重组附接)和图54B(TM1的缀合附接)均示出了PCM处的切割位置和大体积XTEN从该组合物剩余部分上的释放，其中大大降低分子大小且不受XTEN的屏蔽效应影响的剩余部分能够与有效负载药物结合并将其递送至靶组织。
[0087] 图55示出了与能够切割PCM(由剪刀指示)的蛋白酶进行反应的图49的缀合物组合物和所得到的反应产物。图55A(TM1的重组附接)和图55B(TM1的缀合附接)均示出了PCM处的切割位置和两个XTEN分子(彼此连接)的大体积二聚体从该组合物剩余部分上的释放，其中大大降低分子大小且不受XTEN的屏蔽效应影响的剩余部分能够与有效负载药物结合并将其递送至靶组织。
[0088] 图56示出了与能够切割PCM(由剪刀指示)的蛋白酶进行反应的图50的缀合物组合物和所得到的反应产物。图56A(TM1的重组附接)和图56B(TM1的缀合附接)均示出了PCM处的切割位置和大体积XTEN从该组合物剩余部分上的释放，其中该剩余部分(三个TM1分子与具有3个有效负载分子的CCD连接，3个有效负载分子与各个CCD连接)能够与有效负载药物结合并将其递送至靶组织。
[0089] 图57示出了与能够切割PCM(由剪刀指示)的蛋白酶进行反应的图51的缀合物组合物和所得到的反应产物。
[0090] 图58示出了来自如实施例35所述在KB细胞中确定FA-XTEN432-3xMMAF和XTEN432-3xMMAF的体外活性的实验的结果。
[0091] 图59示出了来自如实施例61所述在KB细胞中确定FA-XTEN864-3xMMAF和XTEN864-3xMMAF的体外活性的实验的结果。
[0092] 图60示出了来自如实施例36所述在nu/nu小鼠中确定FA-XTEN432-3xMMAF和XTEN432-3xMMAF的PK的实验的结果。
[0093] 图61示出了来自如实施例36所述在nu/nu小鼠中确定FA-XTEN432-3xMMAF的MTD的实验的结果。
[0094] 图62示出了来自如实施例36所述在KB异种移植小鼠模型中确定FA-XTEN432-3xMMAF和XTEN432-3xMMAF的功效的实验的结果。
[0095] 图63示出了来自如实施例36所述在KB异种移植小鼠模型中确定FA-XTEN432-3xMMAF和XTEN432-3xMMAF的安全性的实验的结果。
[0096] 图64示出了来自如实施例36所述在KB异种移植小鼠模型中确定FA-XTEN864-3xMMAF和XTEN864-3xMMAF的功效的实验的结果。
[0097] 图65示出了来自如实施例36所述在KB异种移植小鼠模型中确定FA-XTEN864-3xMMAF和XTEN864-3xMMAF的安全性和耐受性的实验的结果。
[0098] 图66示出了缀合物可切割组合物的构型，该组合物包含XTEN；整合到TM1-XTEN-PCM-CCD融合蛋白序列中的三个不同的肽基切割部分(PCM1、PCM2、PCM3；由BSRS1共同表示)，其中每个PCM序列是不同的序列；CCD；和与XTEN融合的靶向部分(TM1)分子；以及三个有效负载A分子，其中有效负载A与CCD的半胱氨酸残基缀合。该图示意性地表明，该组合物能够被三种不同的蛋白酶切割，其中任何一种蛋白酶的切割产生不同的反应产物，但都导致大体积XTEN从该组合物上的释放。
[0099] 图67示出了如实施例37所述以26nmol/kg给药的四种不同构建体的所示处理组的血浆浓度。
[0100] 图68示出了如实施例37所述以460nmol/kg给药的与图67的每一种相同的四种构建体的处理组的血浆浓度。
[0101] 图69示出了如实施例37所述以26nmol/kg给药的两个所示处理组的组织浓度，其中图69A示出24h的结果，而图69B示出72h的结果。
[0102] 图70示出了如实施例37所述以460nmol/kg给药的两个所示处理组的组织浓度，其中图70A示出24h的结果，而图70B示出72h的结果。
[0103] 图71示出了如实施例37所述以26nmol/kg给药的两个所示处理组的组织浓度，其中图71A示出24h的结果，而图71B示出72h的结果。
[0104] 图72示出了如实施例37所述以460nmol/kg给药的两个所示处理组的组织浓度，其中图72A示出24h的结果，而图72B示出72h的结果。
[0105] 图73示出了如实施例37所述的所示两种靶向构建体在24h和72h间隔的肿瘤和血浆浓度。
[0106] 图74示出了如实施例38所述的三个所示处理组和对照组随时间推移的肿瘤体积数据。
[0107] 图75示出了如实施例38所述的三个所示处理组和对照组随时间推移的体重数据。
[0108] 图76示出了如实施例39所述各以2mg/kg给药的五个处理组的血浆浓度。
[0109] 图77示出了如实施例39所述各以2mg/kg给药的五个处理组的血浆浓度。
[0110] 图78示出了如实施例40所述的两种靶向构建体与其配体的结合。
[0111] 图79示出了来自如实施例41所述在存在和不存在叶酸的情况下确定FA-XTEN432-3xMMAF的体外选择性活性的实验的结果；其中图79A示出JEG-3的结果，图79B示出SW620的结果，图79C示出SK-BR-3的结果。
[0112] 图80示出了如实施例42所述的两个处理组随时间推移的肿瘤体积数据。
[0113] 图81示出了如实施例42所述的两个处理组随时间推移的体重数据。
[0114] 图82示出了如实施例42所述的三个处理组随时间推移的肿瘤体积数据。
[0115] 图83示出了来自如实施例44所述在存在和不存在曲妥珠单抗的情况下确定CXTEN432-3xMMAE和抗-HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720的体外活性的实验的结果；其中图83A示出SK-BR-3的结果，图83B示出BT474的结果，图83C示出HCC1954的结果，图83D示出NCI-N87的结果，而图83E示出SK-OV-3的结果。
[0116] 图84示出了来自如实施例44所述在存在和不存在曲妥珠单抗的情况下确定CXTEN432-3xDM1和抗-HER2scFv-3xDM1-CXTEN720的体外活性的实验的结果；其中图84A示出SK-BR-3的结果，图84B示出BT474的结果，图84C示出HCC1954的结果，图84D示出NCI-N87的结果，而图84E示出SK-OV-3的结果。
[0117] 图85示出了来自如实施例45所述在NCI-N87中确定抗-HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、蛋白酶处理及未处理的抗-HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753的体外活性的实验的结果。
[0118] 图86示出了如实施例48所述的XTEN的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)消化。每个泳道的材料是：泳道1：分子量标记；泳道2：未消化的XTEN_AE864；泳道3：XTEN_AE864与NE以1:1000摩尔比在37℃下温育2小时；泳道4：XTEN_AE864与NE以1:100摩尔比在37℃下温育2小时。
[0119] 图87示出了scFv和多联构型的示意图。图87A示出了scFv的两种构型，其在N末端至C末端方向上具有所示的框架或CDR可变区段的VL-连接体-VH或VL-连接体-VH组分。图87B示出了多联融合蛋白的两种构型，其在N末端至C末端方向上具有与CCD、PCM和XTEN序列融合的FRL4或FRH4区段。图87C示出了多联融合蛋白的两种构型，其在N末端至C末端方向上具有与PCM、CCD和FRL1或FRH1区段融合的XTEN序列。
具体实施方式
[0120] 在描述本发明实施方案之前，应当理解，这些实施方案仅作为例子提供，并且可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案来实施本发明。本领技术人员现在将可以在不背离本发明的情况下想到许多改变、变化和替代。
[0121] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但下面描述了合适的方法和材料。如有冲突，则以包括定义在内的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是示例说明性的而并非旨在限制。本领技术人员现在会在不背离本发明的情况下想到许多改变、变化和替代。定义
[0122] 除非另有规定，否则在本申请的上下文中，以下术语具有属于它们的含义。
[0123] 除了其中具体说明上限的情况之外，如整个说明书和权利要求书中所使用的术语“一个”、“一种”和“该”用于意指“至少一个”、“至少第一”、“一种或多种”或“多个”所提及的组分或步骤。因此，如本文所使用的“有效负载”意指“至少第一有效负载”，但包括多个有效负载。根据本公开内容，组合的可操作限制和参数，如任何单一试剂的量，对于本领域普通技术人员将是已知的。
[0124] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是线性或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其间可以插入非-氨基酸。这些术语还包括例如通过二硫键形成、糖基化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作(例如与标记组分缀合)而修饰的氨基酸聚合物。
[0126] “药理活性”剂包括期望递送至受试者的任何药物、化合物、物质组合物或混合物，例如，治疗剂、诊断剂或药物递送剂，其提供或预期提供可在体内或体外得到证明的一些(往往是有益的)药理作用。这样的药剂可包括肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、核苷、寡核苷酸和小分子合成化合物或其类似物。
[0127] 术语“天然L-氨基酸”表示以下氨基酸的L旋光异构体形式：甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
[0128] 应用于序列并在本文使用的术语“非天然存在的”指没有哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列的对应物、与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不互补、或与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，适当比对时，非天然存在的多肽或片段可以与天然序列共享不超过99％、98％、95％、
90％、80％、70％、60％、50％或甚至更低的氨基酸序列同一性。
90％、80％、70％、60％、50％或甚至更低的氨基酸序列同一性。
[0129] 术语“亲水性”和“疏水性”指物质具有的与水的亲和力程度。亲水性物质对水具有强亲和力，易于溶解于水、与水混合或被水润湿，而疏水性物质基本缺乏对水的亲和力，易于排斥水并不吸收水并且不易于溶解于水或与水混合或被水润湿。氨基酸可以根据其疏水性来表征。已经发展了许多量表。一个实例是由Levitt,M等,J Mol Biol(1976)104:59发展的量表，其在Hopp,TP等,Proc Natl Acad Sci USA(1981)78:3824中列出。“亲水性氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
[0130] “片段”，当用于生物活性蛋白质时，是保留至少一部分治疗活性和/或生物活性的生物活性蛋白质的截短形式。“变体”，当用于生物活性蛋白质时，是与天然生物活性蛋白质具有序列同源性的蛋白质，保留了生物活性蛋白质的至少一部分治疗活性和/或生物活性。例如，变体蛋白质与参考生物活性蛋白质相比可以共享至少70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“生物活性蛋白质变体”包括例如通过定点诱变、编码基因合成、插入而有意修饰或通过突变而意外修饰并保留活性的蛋白质。
95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“生物活性蛋白质变体”包括例如通过定点诱变、编码基因合成、插入而有意修饰或通过突变而意外修饰并保留活性的蛋白质。
[0131] 术语“序列变体”意指与其天然或原始序列相比已经通过一个或多个氨基酸插入、删除或置换而修饰的多肽。插入可能位于蛋白质的一个末端或两个末端，和/或可能定位于氨基酸序列的内部区域之内。一个非限制性的实例是XTEN序列在生物活性有效负载蛋白质序列内的插入。另一个非限制性实例是用不同的氨基酸置换XTEN中的氨基酸。在缺失变体中，本文所述的多肽中的一个或多个氨基酸残基被去除。因此，缺失变体包括有效负载多肽序列的所有片段。在置换变体中，多肽的一个或多个氨基酸残基被去除而替换成其他残基。在一个方面，置换在本质上是保守的。
[0132] 术语“部分”意指较大组合物的组分或意欲并入较大组合物中的组分，如药物分子的官能团或与较大多肽连接的靶向肽。
[0133] 如本文所用，“末端XTEN”是指当有效负载是肽或多肽时已融合至该有效负载或在该有效负载的N末端或C末端的XTEN序列。
[0134] 术语“肽基切割部分”或“PCM”是指可切割缀合物组合物中可被一种或多种蛋白酶识别并切割，从而实现从该XTEN缀合物中释放有效负载、XTEN或XTEN缀合物的一部分的切割序列。如本文所用，“哺乳动物蛋白酶”意指通常存在于哺乳动物的体液、细胞或组织中的蛋白酶。PCM序列可工程化为在体外分析中被存在于或接近于受试者的靶组织或哺乳动物细胞系的各种哺乳动物蛋白酶所切割。可以使用其他能够识别限定的切割位点的等效蛋白酶(内源性的或外源性的)。特别考虑到，PCM序列可以根据所使用的蛋白酶来调整和定制并且可以引入连接体氨基酸中以与相邻多肽连接。
[0135] 术语“以内”，当提及与第二多肽相连接的第一多肽时，包括分别将第一或第二多肽的N端连接至第二或第一多肽的C端的连接，还包括第一多肽向第二多肽的序列中的插入。例如，当XTEN在有效负载多肽“之内”连接时，该XTEN可与有效负载多肽的N端或C端相连接，或者可在有效负载多肽的任何两个氨基酸之间插入。
[0136] 用于本文提供的主题组合物的“活性”是指本领域对于该组合物的有效负载组分所公知的作用或效果，包括但不限于受体结合、拮抗剂活性、激动剂活性、细胞或生理反应或效果，无论是通过体外、离体或体内分析还是通过临床效果所测量的。
[0138] “宿主细胞”包括可以是或已经是主题载体如本文所述的那些主题载体的接受体的单个细胞或细胞培养物。在一些情况下，宿主细胞是原核生物，其可包括大肠杆菌(E.coli)。在其他情况下，宿主细胞是真核细胞，其可以是酵母、非人类哺乳动物细胞或人源细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于天然、意外或有意的突变，后代不一定与原始亲代细胞完全相同(形态方面或者总DNA互补体的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明的载体在体内转染的细胞。
[0139] 当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”指已经从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的掺杂组分是通常会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。对于本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以使之与其天然存在的对应物区别开来。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在对应物相区别，因为浓度或每体积的分子数目一般大于其天然存在的对应物。一般而言，通过重组方式制备并在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的”。
[0140] “分离的”核酸是从所述多肽编码核酸的天然来源中正常伴随的至少一种掺杂核酸分子中鉴定和分离出来的核酸分子。例如，分离的多肽编码核酸不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的多肽编码核酸分子与天然细胞中存在的特定多肽编码核酸分子有区别。然而，分离的多肽编码核酸分子包括正常表达所述多肽的细胞中含有的多肽编码核酸分子，此时，例如，核酸分子处于不同于天然细胞核酸分子的染色体内或者染色体外位置。
[0141] “嵌合”蛋白含有至少一个融合多肽，其包含至少一个与天然存在的位置不同的序列位置的区域。所述区域可以正常存在于不同的蛋白质中并且在融合多肽中聚集在一起；或者它们可以正常存在于相同的蛋白质中但在融合多肽中处于新的排列。嵌合蛋白可以通过例如化学合成或者通过产生并翻译其中肽区域以期望的关系编码的多核苷酸来产生。
[0142] “融合的”和“融合”在本文中可互换使用，并且是指通过重组方式使两个或更多个肽或多肽序列连接在一起。“融合蛋白”或“嵌合蛋白”包含与第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列，其在本质上不是天然连接的。
[0143] “可操作地连接的”表示被连接的DNA序列是连续的，并且在阅读相内或框内。“框内融合”指两个或更多个开放阅读框(ORF)以保持原始ORF正确阅读框的方式结合形成连续更长的ORF。例如，如果启动子或增强子影响多肽序列的转录，则该启动子或增强子与多肽的编码序列可操作地连接。因此，得到的重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或更多个区段的单个蛋白质(所述区段在自然中通常不会如此连接)。
[0144] “交联”、“缀合”、“连接(link)”、“连接(linking)”和“连结”在本文中可互换使用，并且是指通过化学反应共价连接两个不同的分子。如下文更全面描述的，交联可在一个或多个化学反应中发生。
[0145] 本文所使用的术语“缀合配偶体”是指可被连接或在缀合反应中连接的单独组分。
[0146] 术语“缀合物”意指由于缀合配偶体彼此共价连接而形成的异质分子，例如，与XTEN分子共价连接的生物活性有效负载或与反应性XTEN共价连接的交联体。
[0147] “交联体”和“连接体”以及“交联剂”可互换使用，并且在其最广泛的语境中是指用于共价连接两个或更多个实体的化学实体。在本文中定义实体时，例如，交联体连接两个、三个、四个或更多个XTEN，或使有效负载与XTEN连接。交联体包括但不限于小分子零长度、同双功能或异双功能和多功能交联体化合物的反应产物，两个点击化学反应物的反应产物。本领域技术人员将会理解，交联体可指在反应物交联后剩余的共价结合的反应产物。交联体还可包含尚未反应但能够与另一实体反应的一种或多种反应物。
[0148] 在多肽的语境中，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基端至羧基端方向的氨基酸顺序，序列中彼此邻接的残基在多肽一级结构中是连续的。“部分序列”是已知在一个或两个方向上包含额外残基的多肽的一部分的线性序列。
[0149] “异源的”意指衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。例如，从其天然编码序列中取出并可操作地连接至不同于天然序列的编码序列的富含甘氨酸序列是异源的富含甘氨酸序列。术语“异源的”当应用于多核苷酸、多肽时是指所述多核苷酸或多肽衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。
[0150] 术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸，包括单数的核酸以及复数的核酸，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以发挥已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、通过连锁分析确定的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸序列中可以插入非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。
[0151] 术语“多核苷酸的互补体”表示与参考序列相比具有互补碱基序列和反方向的多核苷酸分子，使得互补体可以与参考序列杂交，而具有完全保真性。
[0152] “重组的”当应用于多核苷酸时意指该多核苷酸是重组步骤的各种组合的产物，所述重组步骤可包括克隆、限制性消化和/或连接步骤以及导致重组蛋白在宿主细胞中表达的其他程序。
[0153] 术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用。它们指含有能够在被转录和翻译之后编码特定蛋白质的至少一个开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因组或cDNA，只要该多核苷酸含有至少一个开放阅读框，该开放阅读框可以涵盖整体编码区或其区段。“融合基因”是由至少两个连接在一起的异源多核苷酸构成的基因。
[0154] 如本文所使用的，“编码区”或“编码序列”是由可翻译成氨基酸的密码子组成的多核苷酸的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不被翻译成氨基酸，但它可被视为编码区的一部分，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等，不是编码区的一部分。编码区的边界通常由编码所得多肽的氨基末端的5'末端起始密码子和编码所得多肽的羧基末端的3'末端翻译终止密码子所确定。本发明的两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中，例如在单个载体上，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。随后，单个载体可以仅包含单个编码区，或者包含两个或更多个编码区，例如单个载体可分别编码如下所述的结合结构域A和结合结构域B。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码与编码本发明的结合结构域的核酸融合或未融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于特定的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能结构域。
[0155] 术语“下游”是指位于参考核苷酸序列3'的核苷酸序列。在某些实施方案中，下游核苷酸序列涉及跟随转录起始点的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。
[0156] 术语“上游”是指位于参考核苷酸序列5'的核苷酸序列。在某些实施方案中，上游核苷酸序列涉及位于编码区或转录起始点5'侧的序列。例如，大多数启动子位于转录起始位点的上游。
[0157] “同源性”或“同源的”或“序列同一性”指两个或更多个多核苷酸序列之间的或两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用例如BestFit等程序来确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用缺省设置，或者可以选择适当的评分矩阵例如blosum45或blosum80来优化同一性、相似性或同源性评分。优选地，同源的多核苷酸是在本文定义的严格条件下杂交的那些序列，并且与那些序列相比具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％、更优选97％、更优选98％和甚至更优选99％的序列同一性。同源的多肽优选具有至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95-99％相同的序列同一性。
[0158] 应用于多核酸的“连接”指在两个核酸片段或基因之间形成磷酸二酯键而使它们连接在一起的过程。为了使DNA片段或基因连接在一起，DNA末端必须彼此相容。在一些情况下，末端在核酸内切酶消化之后即是相容的。然而，可能必须首先将通常由核酸内切酶消化后产生的交错末端转化成平末端以使它们适合连接。
[0159] 术语“严格的条件”或“严格的杂交条件”包括提及多核苷酸将以比其他序列可检测地更大程度(例如，超过背景至少2倍)与其靶序列杂交的条件。一般而言，杂交的严格性部分地以进行洗涤步骤的温度和盐浓度来表示。通常，严格条件是如下条件：其中pH 7.0至8.3下的盐浓度小于约1.5M Na离子、通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且温度对于短的多核苷酸(例如，10至50个核苷酸)是至少约30℃并且对于长的多核苷酸(例如，大于50个核苷酸)是至少约60℃—例如，“严格的条件”可以包括在37℃下50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在0.1×SSC/1％SDS中于60℃下至65℃下三次洗涤，每次15分钟。
或者，可以使用约65℃、60℃、55℃或42℃的温度。SSC浓度可以从约0.1至2×SSC不等，其中SDS以约0.1％存在。这种洗涤温度通常被选择为比确定离子强度和pH下特定序列的热力学熔点低约5℃至20℃。Tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。计算Tm的方程和核酸杂交条件是熟知的并且可以参见Sambrook,J.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001。通常，使用阻断试剂来阻断非特异性杂交。这种阻断试剂包括例如约100-200μg/ml的经剪切和变性的鲑精DNA。在特定情况下，例如对于RNA:DNA杂交，还可以使用有机溶剂，例如浓度约35-50％v/v的甲酰胺。对这些洗涤条件的有用改变对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
或者，可以使用约65℃、60℃、55℃或42℃的温度。SSC浓度可以从约0.1至2×SSC不等，其中SDS以约0.1％存在。这种洗涤温度通常被选择为比确定离子强度和pH下特定序列的热力学熔点低约5℃至20℃。Tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。计算Tm的方程和核酸杂交条件是熟知的并且可以参见Sambrook,J.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001。通常，使用阻断试剂来阻断非特异性杂交。这种阻断试剂包括例如约100-200μg/ml的经剪切和变性的鲑精DNA。在特定情况下，例如对于RNA:DNA杂交，还可以使用有机溶剂，例如浓度约35-50％v/v的甲酰胺。对这些洗涤条件的有用改变对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
[0160] 术语“百分同一性”、“序列同一性百分比”和“％同一性”在应用于多核苷酸序列时是指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配百分比。这样的算法可以以标准化且可重复的方式在被比较的序列中插入空位以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。可以在整个确定的多核苷酸序列的长度上测量百分同一性，或者可以在较短长度上，例如在获自较大的确定的多核苷酸序列的片段长度上测量百分同一性，所述片段例如是至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且应当理解，本文在表格、附图或序列表中示出的序列所支持的任何片段长度可以用来描述可测量百分同一性的长度。序列同一性百分比如下计算：在比较窗口内比较两个最佳比对的序列，确定匹配位置的数目(此处在两个多肽序列中均出现相同残基)，将匹配位置的数目除以比较窗口内的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。当比较不同长度的序列时，最短的序列限定了比较窗口的长度。在计算序列同一性时，不考虑保守置换。
[0161] 有关本文鉴定的多肽序列的“百分同一性”被定义为：在比对序列并在必要时引入空位以实现最大百分序列同一性并且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分从而导致最佳比对后，询问序列中与第二个参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。旨在测定百分比氨基酸序列同一性的比对可以本领域技术中的各种方式实现，例如使用公开可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括对被比较的序列的全长实现最佳比对所需的任何算法。可以对整体确定的多肽序列长度测量百分同一性，或者可以对较短长度例如对获自较大的确定的多肽序列的片段长度测量百分同一性，所述片段例如是至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且应当理解，本文在表格、附图或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可以用来描述可测量百分同一性的长度。
[0162] 在多核苷酸序列的上下文中使用的“重复性”是指序列中的内部同源性程度，例如给定长度的相同核苷酸序列的频率。例如，重复性可以通过分析相同序列的频率来测定。
[0163] 通常，如果与非靶细胞或非靶组织相比，标志物(例如，被TM靶向的蛋白酶或配体)以更大的频率或更高的浓度出现在靶细胞或靶组织之中、之上或附近，那么可以认为该标志物与靶细胞或靶组织“相关联”或“共定位”。例如，如果标志物在靶组织周围的流体中存在的浓度比在更远离靶组织的流体中发现的浓度更高，那么可以认为该标志物与靶组织相关联。在一些实施方案中，与靶细胞相关联的标志物由靶细胞以比非靶细胞更高的水平表达。在一些实施方案中，与靶组织相关联的标志物由靶组织中的一个或多个细胞以比非靶组织中的细胞更高的水平表达。然而，标志物不需要为了与这样的细胞或组织相关联而由靶细胞或靶组织表达。例如，炎性标志物可与特定的发炎组织相关联，但由募集到该组织的免疫细胞表达。类似地，在受感染组织中以更高频率出现的微生物抗原被认为与这种受感染组织相关联，即便其来源于该微生物。在一些实施方案中，标志物与疾病或病况相关联，使得该标志物在患有该疾病或病况的个体中比在没有该疾病或病况的个体中更频繁地或以更高水平出现。
[0164] 本文所使用的术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物，例如RNA或多肽的过程。其包括但不限于将多核苷酸转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，以及将mRNA翻译成多肽。表达产生“基因产物”。如本文所使用的，基因产物可以是核酸，例如通过基因转录产生的信使RNA或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物进一步包括具有转录后修饰，例如多腺苷化或剪接的核酸，或具有翻译后修饰，例如甲基化、糖基化、脂质添加、与其他蛋白质亚单位相关联或蛋白水解切割的多肽。
[0165] “载体”或“表达载体”可互换使用并且是指优选在适当宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。该术语包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，以及功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供超过一种上述功能的载体。“表达载体”是被引入适当宿主细胞时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含可以用于产生期望的表达产物的表达载体的适合的宿主细胞。
[0166] “血清降解抗性”在应用于多肽时是指多肽在血液或其组分中抵抗降解的能力，该降解通常与血清或血浆中的蛋白酶有关。血清降解抗性可以通过使蛋白质与人(或视情况为小鼠、大鼠、猴)血清或血浆通常在约37℃混合通常一定天数(例如0.25、0.5、1、2、4、8、16天)来测量。可对这些时间点的样品进行Western印迹分析，并使用抗体检测蛋白质。抗体可以针对蛋白质中的标签。如果蛋白质在western印迹上显示单条带，其中蛋白质大小与注射的蛋白质大小相同，则没有发生降解。在该示例性方法中，通过Western印迹法或等效技术判断，50％的蛋白质被降解的时间点是蛋白质的血清降解半衰期或“血清半衰期”。
[0167] 术语“t1/2”、“半衰期”、“终末半衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本文中可互换使用，并且在本文中使用时意指的计算为ln(2)/Kel终末半衰期。Kel是通过log浓度对时间曲线的终末线性部分的线性回归而计算的终末消除速率常数。半衰期通常指活生物体中储存的施用物质的半数被正常生物过程代谢或消除所需的时间。当给定多肽的清除曲线被构建为时间的函数时，该曲线通常是双相的，具有快速的α相和更长的β相。人抗体在人类中典型的β相半衰期为21天。
[0168] “主动清除”意指除过滤以外的将蛋白质从循环中去除的机制，该机制包括由细胞、受体、代谢或蛋白质降解所介导的从循环中的去除。
[0169] “表观分子量因子”和“表观分子量”是相关术语，指特定氨基酸或多肽序列表现出的表观分子量的相对增加或降低的量度。表观分子量使用尺寸排阻色谱法(SEC)或类似方法通过与球状蛋白质标准品相比较来确定，并且以“表观kD”单位来度量。表观分子量因子是表观分子量和实际分子量之间的比例；后者通过基于氨基酸组成而加合组成中每种类型氨基酸的计算分子量来预测，或通过在SDS电泳凝胶中与分子量标准品比较而进行估算来预测。实施例中描述了对代表性蛋白质的表观分子量和表观分子量因子的确定。
[0170] 术语“流体动力学半径”或“Stokes半径”是分子在溶液中的有效半径(Rh，以nm为单位)，通过假设它是穿过溶液并受溶液粘性抵抗的主体来测量。在本发明的实施方案中，XTEN多肽的流体动力学半径测量与“表观分子量因子”相关联，表观分子量因子是更直观的量度。蛋白质的“流体动力学半径”影响其在水溶液中的扩散速率以及其在大分子凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径由其分子量以及其结构(包括形状和致密度)决定。测定流体动力学半径的方法是本领域熟知的，例如通过使用尺寸排阻色谱法(SEC)，如美国专利号6,406,632和7,294,513所述。大多数蛋白质具有球形结构，这是蛋白质在最小流体动力学半径下可以具有的最致密的三维结构。一些蛋白质具有随机和开放的非结构化或‘线性’构象，因此与类似分子量的典型球形蛋白质相比具有大得多的流体动力学半径。
[0171] “生理条件”指活宿主中的一组条件以及模拟活受试者的那些条件的体外条件，包括温度、盐浓度、pH。已经确立了用于体外分析的许多生理相关条件。一般而言，生理缓冲液包含生理浓度的盐并且被调节至中性pH，范围从约6.5至约7.8，优选约7.0至约7.5。许多生理缓冲液在Sambrook等(2001)中列出。生理相关温度为约25℃至约38℃，优选约35℃至约37℃。
[0172] “有效负载的单原子残基”意指在与主题XTEN或XTEN-连接体组合物反应后与XTEN化学连接的有效负载的原子；通常为硫、氧、氮或碳原子。例如，有效负载的原子残基可以是有效负载中的半胱氨酸巯基反应性基团的硫残基，肽或多肽或小分子有效负载的氨基反应性基团的氮分子，肽、蛋白质或小分子或合成的有机药物的碳或氧残基或反应性羧基或醛基基团。
[0173] “反应性基团”是可以与第二反应性基团缀合的化学结构。反应性基团的实例是氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应性基团可以被活化以促进与第二反应性基团的直接缀合或通过交联体的缀合。如本文所使用的，只要反应性基团具有参与化学反应的能力，其可以是XTEN、交联体、叠氮化物/炔烃点击化学反应物或有效负载的一部分。一旦反应，共轭键即连接有效负载或交联体或XTEN反应物的残基。
[0174] “控释剂”、“缓释剂”、“贮库制剂”和“持续释放剂”可互换使用，指与多肽在缺乏这些物质而施用时的释放持续时间相比能够延长本发明多肽释放持续时间的物质。本发明的不同实施方案可以具有不同的释放速率，导致不同的治疗量。
[0175] 本文所使用的术语“有效负载”是指具有可在体外分析中或当施用于受试者时得到证明的生物、药理或治疗活性或有益效果的任何蛋白质、肽序列、小分子、药物或物质组合物。有效负载还包括可用于成像或体内诊断目的的分子。有效负载的实例包括但不限于细胞因子、酶、激素、凝血因子和生长因子、化学治疗剂、抗病毒化合物、毒素、抗癌药物、细胞毒性药物、放射性化合物和造影剂，但在本发明的一些方面的语境中，具体排除仅用于结合受体或配体以将本发明的组合物定位到靶组织的靶向部分、抗体、抗体片段或有机小分子化合物。
[0176] 如本文所使用的术语“靶向部分”(缩写为“TM”)特别意在包括抗体、抗体片段、表1中列出的结合分子的类别，或对靶配体如细胞表面受体或抗原或糖蛋白、寡核苷酸、酶底物、抗原决定簇或可存在于靶组织或靶细胞表面之中或之上的结合位点具有特异性结合亲和力的肽、激素或有机分子。在一些实施方案中，TM是非蛋白质的。本文提供了非蛋白质TM的非限制性实例，如叶酸。
[0177] 术语“抗原”、“靶抗原”和“免疫原”在本文中可互换使用，是指抗体、抗体片段或基于抗体片段的分子与之结合或对之具有特异性的结构或结合决定簇。
[0178] 本文使用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。用于鉴定多肽拮抗剂的方法可以包括使天然多肽与候选拮抗剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。在本发明上下文中，拮抗剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物、抗体或降低生物活性蛋白质效应的任何其他分子。
[0179] “靶标”是指靶向部分的配体，如细胞表面受体、抗原、糖蛋白、寡核苷酸、酶底物、抗原决定簇或可存在于靶组织或靶细胞表面之中或之上的结合位点。
[0180] “靶组织”是指作为疾病病况，诸如但不限于癌症或炎症病况的原因或是疾病病况的一部分的组织。病变靶组织的来源包括身体器官、肿瘤、癌细胞、骨骼、皮肤、产生细胞因子或导致疾病病况的因子的细胞。
[0181] “确定成分培养基”是指包含细胞在培养物中存活和/或生长所必需的营养和激素需求，使得培养基的组分是已知的培养基。传统上，已通过添加生长和/或生存所必需的营养和生长因子来制备确定成分培养基。通常，确定成分培养基提供至少一种来自一个或多个以下类别的组分：a)所有必需氨基酸，通常是二十种氨基酸加半胱氨酸的基本组合；b)通常为碳水化合物如葡萄糖形式的能量来源；c)低浓度需要的维生素和/或其他有机化合物；d)游离脂肪酸；和e)微量元素，其中微量元素被定义为通常以极低浓度、通常在微摩尔范围内需要的无机化合物或天然存在的元素。确定成分培养基还可任选地补充有来自以下类别中的任何一种的一种或多种组分：a)一种或多种有丝分裂剂；b)盐和缓冲液，例如钙、镁和磷酸盐；c)核苷和碱基，诸如例如腺苷和胸苷、次黄嘌呤；和d)蛋白质和组织水解产物。
[0182] 术语“激动剂”以最广泛的含义使用并且包括模拟本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。适合的激动剂分子具体包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、小有机分子等。用于鉴定天然多肽的激动剂的方法可以包括使天然多肽与候选激动剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。
[0183] “抑制常数”或“Ki”可互换使用，意指酶-抑制剂复合物的解离常数，或该抑制剂对该酶的结合亲和力的倒数。
[0184] 本文使用的“治疗”或“处理”或“减轻”或“缓解”可互换使用，意指施用药物或生物剂以达到治疗益处、以治愈现有的病症或减小现有病症的严重性，或达到预防益处，预防或降低发作的可能性或出现病症的严重性。所谓治疗益处是指被治疗的潜在病症或与潜在病症相关的一种或多种生理症状的消除或缓解，使得在受试者中观察到改善，尽管受试者可能依然罹患所述潜在病症。
[0185] 本文使用的“治疗效果”或“治疗益处”指生理效应，包括但不限于人或其他动物中疾病的缓和、缓解或预防，或者指除此以外增强人或动物的生理或精神状态，这是由施用本发明多肽而非诱导生成针对生物活性蛋白质具有的抗原表位的抗体的能力引起的。对于预防益处，组合物可以被施用给处于发展特定疾病、病况或疾病症状(例如，确诊甲型血友病受试者中的出血)风险的受试者或者报告了疾病的一种或多种生理症状的受试者，尽管可能还未作出该疾病的诊断。
[0186] 本文使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”指单独或作为多肽组合物的一部分的药物或生物活性蛋白质的量，当以一次或重复剂量施用给受试者时，能够对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测的有益影响。这种影响不一定绝对是有益的。治疗有效量的确定在熟练技术人员的能力之内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
[0187] 本文使用的术语“治疗有效剂量方案”指连续施用多剂(即，至少2个或更多个)单独或作为多肽组合物的一部分的生物活性蛋白质的计划表，其中所述剂量以治疗有效量给予，以对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征产生持续有益的影响。I).通用技术
[0188] 除非另有说明，在本发明的实践中采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技术范围内。参见J.等，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001；“Current protocols in molecular biology”,F.M.Ausubel等编，1987；“Methods in Enzymology”系列，Academic Press,San Diego,CA.；“PCR 2:a practical approach”,M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编，Oxford University Press,1995；“Antibodies,a laboratory manual”Harlow,E.和Lane,D.编，Cold Spring Harbor Laboratory,1988；“Goodman&Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics”，第11版，McGraw-Hill,2005；和Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique”，第4版，John Wiley&Sons,Somerset,NJ,2000，这些内容均通过引用整体并入本文。
[0189] 宿主细胞可在各种培养基中进行培养。可商业购得的培养基如Ham's F10(Sigma)、基本必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Sigma)适用于培养真核细胞。此外，哺乳动物宿主细胞可在缺乏血清，但补充有激素、生长因子或特定细胞类型的存活和/或生长所必需的任何其他因子的确定成分培养基中生长。支持细胞存活的确定成分培养基维持活力、形态、代谢能力和潜在的细胞分化能力，而促进细胞生长的确定成分培养基提供细胞增殖或增生所需的所有化学物质。控制宿主细胞存活和体外生长的一般参数在本领域中是确立的。可在不同的细胞培养系统中被控制的物理化学参数是，例如pH、pO2、温度和摩尔渗透压浓度。通常在被开发用来提供最佳环境的标准培养基制剂中提供细胞的营养需求。营养物可分为几类：氨基酸及其衍生物、碳水化合物、糖、脂肪酸、复合脂质、核酸衍生物和维生素。除了维持细胞代谢的营养物之外，大多数细胞还需要来自下组中至少一种的一种或多种激素：类固醇、前列腺素、生长因子、垂体激素和肽激素，以在无血清培养基中增殖(Sato,G.H.等人,“Growth of Cells in Hormonally Defined Media”,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,1982)。除了激素之外，细胞可能需要转运蛋白，如转铁蛋白(血浆铁转运蛋白)、血浆铜蓝蛋白(铜转运蛋白)和高密度脂蛋白(脂质载体)，用于体外存活和生长。最佳激素或转运蛋白的组合将因各种细胞类型而异。这些激素或转运蛋白的大多数已外源添加，或者在极少数情况下，已经发现不需要特定因子的突变细胞系。本领域技术人员将会在无需过多实验的情况下知道维持细胞培养所需的其他因子。
[0190] 用于原核宿主细胞生长的生长培养基包括营养液体培养基(液体营养培养基)或LB培养基(Luria Bertani)。合适的培养基包括确定成分培养基和未确定成分培养基。通常，培养基含有细菌生长所需的碳源如葡萄糖、水和盐。培养基还可包含氨基酸源和氮源，例如牛肉或酵母提取物(未确定成分培养基中)或已知量的氨基酸(确定成分培养基中)。在一些实施方案中，生长培养基是LB液体培养基，例如LB Miller液体培养基或LB Lennox液体培养基。LB液体培养基包含蛋白胨(酪蛋白的酶消化产物)、酵母提取物和氯化钠。在一些实施方案中，使用包含抗生素的选择性培养基。在这种培养基中，只有拥有抗生素抗性的期望细胞才会生长。II).XTEN和靶向细胞毒性缀合物组合物
[0191] 本发明部分地涉及靶向缀合物组合物，其包含能够选择性结合靶组织如肿瘤或癌细胞或炎症组织，使得药物成分被靶细胞吸收，从而实现药理作用的药物有效负载，其中该组合物包含一种或多种XTEN，该XTEN赋予屏蔽和增强的药代动力学和药学性质。本发明考虑到该组合物的几种不同构型以便赋予主题组合物某些性质。在第一类构型中，缀合物组合物包含第一短多肽部分的融合蛋白，该融合蛋白包含散布有半胱氨酸残基的亲水性氨基酸(下文称为含半胱氨酸的结构域或CCD)，该第一短多肽部分与比包含XTEN多肽的所述第一部分更长的第二部分融合，第三部分包含能够特异性结合与靶组织相关联的配体的靶向部分(TM)，以及与CCD的半胱氨酸残基缀合的药理活性药物或生物制剂(包括能够杀死携带靶细胞配体的细胞的细胞毒性药物或抗炎药物)，其中靶向部分与靶细胞结合并内化、降解，从而释放药物或生物制剂以发挥其药理作用。在第二类构型中，除了前述组分之外，靶向缀合物组合物还具有重组插入CCD与XTEN之间的蛋白酶切割部分(PCM)，其中PCM能够被与靶组织相关联或接近于靶组织的哺乳动物蛋白酶切割。在这样的情况下，当组合物接近或结合靶组织或靶细胞时，XTEN通过蛋白酶的作用从组合物中释放，从而大大减小了构建体剩余部分的大小(剩余部分在下文称为“释放的靶向组合物”，其包含与CCD融合或连接的一个或多个靶向部分以及与CCD连接的药物或生物制剂)，以及由XTEN赋予的屏蔽效应，使得具有含附接药物的TM和CCD的释放的靶向组合物能够更好地溢出并穿透靶组织，从而被携带靶向部分的配体的细胞吸收，于是通过分子的内部加工，所释放的药物发挥其药理作用(参见例如，用于前述过程的示意性展示的图18、图38和图40)。因此，将第二类型设计为用作前药的形式，因为具有屏蔽XTEN释放的组合物和释放的靶向组合物变得比完整的组合物更具有活性、更具选择性、能够更好地溢出、能够更好地穿透靶组织，并且由于屏蔽效应和/或空间位阻的丧失而具有更高的结合亲和力。在这些组合物的优点中，由于XTEN的屏蔽和体积效应，完整的组合物不太可能与正常组织(与靶组织相比，其可能具有作为TM配体的低频受体)相互作用或结合，并且不太可能从健康器官和组织中的正常血管溢出，从而导致与常规化学治疗剂或生物制剂相比的较低的毒性和较少的副作用。一旦完整的组合物被发现与靶组织相关联地共定位的蛋白酶切割，则释放的靶向组合物就不再被屏蔽并且恢复其完全结合亲和力潜能，并且由于其小得多的尺寸，可以更容易地溢出并穿透靶组织。这样的组合物可用于治疗某些疾病，包括但不限于癌症和某些炎性疾病。本发明考虑到另外的构型，包括前述的变形，该变形包括具有两个或更多个靶向部分(其可以是相同的或者可以靶向不同配体)、两个或更多个XTEN(以进一步加强屏蔽效应和/或增加组合物的分子量)、与不同CCD连接的两种或更多种类型的药物分子或两个或更多个PCM的构建体。在一些实施方案中，CCD、XTEN和PCM(如果存在)作为融合蛋白产生，而TM可通过重组或通过化学缀合与构建体连接。在其他实施方案中，TM、CCD和PCM(如果存在)作为融合蛋白产生，而一种或多种XTEN可通过重组或通过化学缀合与构建体连接。在所有情况下，如下文更全面地描述的，药物或生物有效负载与CCD化学缀合。1.与细胞毒性有效负载、靶向部分和肽切割部分连接的缀合物
[0192] 在一个方面，本发明提供了靶向缀合物组合物，其包含与药理活性小分子或生物制剂(例如生物活性蛋白质)缀合的含半胱氨酸的结构域(CCD)、一个或多个XTEN、一个或多个靶向部分(TM)和一个或多个肽切割序列(PCM)，这些组分通过重组连接在一起或其中一些组分与该组合物缀合。本发明考虑到用于主题组合物的多种构型，包括但不限于本发明的各种示意图中所示的构型。将这些构型设计成赋予所得组合物某些性质，包括由附接的大XTEN组分来屏蔽TM和/或细胞毒性有效负载药物(其非限制性实例在图34、35、37和39中示出)，分子量和流体动力学半径增加从而赋予增强的药代动力学并减少向正常组织内的溢出，以及在PCM切割，从而释放大XTEN之后，分子大小和流体动力学半径随后减小，使得包含连接的TM和CCD-有效负载缀合物的释放组分(“释放的靶向组合物”)溢出并穿透进入靶组织中的能力增强(其非限制性实例在图52-57中示出)，并且靶向部分恢复其完全结合亲和力潜能(在释放的XTEN的屏蔽效应之后)，从而选择性地将附接的有效负载药物递送至靶细胞以发挥其药理作用。在另一方面，构型的设计还提供了这样的能力：提供制备TM和有效负载药物各种排列的结合组合物的成本有效方法(其非限制性实例在图15-17中示出)，以便提高效力、安全性和功效。
[0193] 在另一方面，本发明的目的是提供具有CCD和连接的药物有效负载、XTEN和与具有与靶组织的结合亲和力的TM，但缺少PCM的靶向缀合物组合物。考虑到，在穿透进入组织中不是限制因素的应用(例如，血液癌症或在具有渗漏血管的病变组织中)中或在不产生合适的蛋白酶的那些病症中，没有PCM的靶向缀合物组合物虽然具有结合靶组织配体，从而递送药物有效负载，产生期望的药理作用的能力，但仍具有由附接的XTEN所赋予的增强的药代动力学性质的益处。
[0194] 在又一方面，本发明的目的是提供具有所有上述组分但被配置成包含第二种不同药物有效负载，从而产生可提供多种药理作用的双功能组合物的靶向缀合物组合物，从而增强整体治疗效果。如下面更全面描述的，通常，这样的组合物将包含以分支或多聚体构型排列的两个或三个CCD和融合的PCM及XTEN。
[0195] 在另一方面，本发明的目的是提供被设计为具有TM、CCD和连接的有效负载及XTEN的多个拷贝的配置的靶向缀合物组合物，使得有效负载和/或TM被多个XTEN组分屏蔽，以便减少或消除与并非该组合物预期靶标的组织或细胞的非特异性相互作用，从而减少不期望的毒性或副作用。本领域技术人员将会理解，本发明的一些组合物通过以下机制的组合实现了这种非特异性相互作用的降低，这些机制包括通过使TM和/或有效负载定位于靠近大体积XTEN分子之间的附接点而形成的空间位阻；由于长柔性XTEN多肽的柔性、非结构化特征，通过栓系至组合物，该长柔性XTEN多肽能够围绕TM和有效负载组分摆动和移动，从而提供组合物和组织或细胞之间的一定程度的阻断；以及与单个TM和有效负载组分的大小相比，由于分子量大而导致完整组合物穿透细胞或组织的能力下降(由XTEN的实际分子量和由于非结构化XTEN的大流体动力学半径的已知性质所贡献)。然而，将这些组合物设计成使得当接近于携带或分泌能够切割PCM的蛋白酶的靶组织或靶细胞时，TM和连接的有效负载通过蛋白酶的作用从XTEN的大体积释放出来，去除空间位阻障碍，并且更自由地与靶细胞结合并被其内化，从而发挥所附接的有效负载药物或生物制剂的药理作用。主题组合物可用于多种病况的治疗，其中需要向细胞、组织或器官选择性递送治疗或毒性有效负载。在一个实施方案中，靶组织是癌症，其可以是白血病、淋巴瘤或肿瘤。在另一实施方案中，靶组织是炎症区域，其可定位在器官中或在受试者中广泛存在。考虑到包含抗炎药物或生物制剂的组合物可用于治疗选自下组的疾病：寻常痤疮、哮喘、自身免疫疾病、自身炎性疾病、乳糜泻、慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、超敏反应、炎性肠病、克罗恩病、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥、血管炎、银屑病、纤维肌痛、肠易激综合征、红斑狼疮、骨关节炎、硬皮病和溃疡性结肠炎。
[0196] 本发明考虑到用于主题组合物的多种靶向部分，其包括抗体、抗体片段诸如但不限于scFV，和抗体模拟物，包括但不限于表1列出的那些，以及能够结合与疾病或代谢或生理异常相关的配体或受体的肽和合成分子，诸如但不限于本文所述的叶酸、天冬氨酰胺酰甘氨酰精氨酸类似物(NGR)、精氨酰甘氨酰天冬氨酸类似物(RGD)和LHRH类似物。设计包含PCM的本发明的一些组合物时考虑靶组织蛋白酶的位置以及相同蛋白酶存在于不想被靶向的健康组织中，以及靶配体存在于健康组织中，但该配体在不健康靶组织中存在的程度更高，以便为该组合物提供最宽的治疗窗口(由最小有效剂量和最大耐受剂量之间的最大差异所确定的)。为了实现最宽的治疗窗口，特别考虑到，本发明的一些实施方案提供这些组合物，其中该组合物的TM将会放置在该组合物内的内部位置处(而不是末端位置处)，在该内部位置处TM可被围绕它的XTEN部分屏蔽(例如，在该内部位置处配体在健康组织和不健康靶组织中均有发现，但在后者中的浓度更高)。类似地，为了实现最宽的治疗窗口，特别考虑到，本发明的一些实施方案提供这些组合物，其中细胞毒性有效负载被XTEN屏蔽或者通过PCM与CCD连接，使得直到组合物与靶组织蛋白酶接触或被靶细胞内化，有效负载药物才从组合物释放，以便降低有效负载对健康组织的影响。
[0197] 相反，当健康组织中靶配体的存在程度较低时，本发明提供了构型实施方案，其中TM将会以更高的数目并入组合物中或不太可能被XTEN屏蔽的位置(如在组合物的N末端或C末端上)中，使得靶向缀合物组合物可有效到达并特异性累积在不健康靶组织中。
[0198] 在优选的实施方案中，将靶向缀合物组合物设计成使得在PCM被一种或多种组织相关的蛋白酶切割并从组合物的XTEN切去之后，TM和有效负载保持彼此连接，从而产生这样的效应：TM和连接的CCD-有效负载片段(“释放的靶向组合物”)的较小质量能够更有效地穿透进入靶组织中并与TM的细胞配体结合，然后在病变细胞中内化，以便发挥有效负载的药理作用(参见图18B、38和40)。在一些实施方案中，将靶向缀合物组合物设计成具有PCM，其中PCM是两种或更多种不同细胞外蛋白酶的底物，每种蛋白酶能够将组合物切割成包含与连接的CCD-有效负载部分连接的TM的片段，该片段与配体结合，并在靶组织中被内化，于是有效负载发挥其药理作用。在一些其他实施方案中，将靶向缀合物组合物设计成具有第一和第二PCM，其中每个PCM是不同细胞外蛋白酶的底物，该蛋白酶能够将组合物切割成包含TM的片段，或包含有效负载的片段，或包含与有效负载连接的TM的片段，该片段将会与配体结合，并在靶组织中被内化，于是有效负载发挥其药理作用。前述实施方案利用以下事实：某些病变靶组织能够表达多于一种蛋白酶，以及通过向组合物中选择性引入对不同蛋白酶敏感的不同PCM，使所得组合物更可能在相对于健康组织更接近于病变组织处被切割。在这样的实施方案中，将会理解，通过组合物的设计将会减轻对健康组织的影响，其中通过侧翼XTEN或通过将TM和/或有效负载组分设计成在到达靶组织和靶组织的相关联蛋白酶之前被其在构建体内的位置在空间上阻碍来屏蔽TM和/或有效负载。
[0199] 在某些实施方案中，本发明提供了靶向可切割缀合物组合物，其包含具有短第一部分的单一融合蛋白，该短第一部分包含TM、含半胱氨酸的结构域(CCD)和肽切割部分(PCM)，该肽切割部分(PCM)是与靶组织相关联的一种或多种蛋白酶的底物，其中该PCM与包含XTEN序列的较长第二部分重组连接，并将所述构建体分离成两个区域；在第一区域中，CCD和连接的药物有效负载与靶向部分的一个或多个分子(例如，重组或通过缀合)连接，第二区域包含XTEN。在图46-51中示意性地描绘了所得组合物的非限制性实例。可将构建体设计成从N末端至C末端的各种构型，包括(TM)-(CCD)-(PCM)-(XTEN)；(XTEN)-(PCM)-(CCD)-(TM)；(XTEN)-(PCM)-(TM)-(CCD)；和(CCD)-(TM)-(PCM)-(XTEN)。在前述的一个实施方案中，CCD序列展现出与表6所示的序列至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或97％、或99％的同一性或与表6所示的序列相同，PCM是选自表8所示序列的序列，XTEN展现出与表10所示的序列至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与表10所示的序列相同。在主题组合物的一些实施方案中，一个或多个TM分子是抗体片段。在一个实施方案中，一个或多个TM分子是衍生自表19所示的抗体或衍生自表19的VL和VH序列的scFV。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，TM的一个或多个分子是非蛋白质的或是小分子受体配体。在一些实施方案中，一个或多个非蛋白质TM是叶酸。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，一个或多个TM分子是LHRH(包括表
22的类似物)。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，一个或多个TM分子是RGD或RGD类似物或者NGD或NGD类似物。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，药物有效负载选自表14-17的有效负载。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，该组合物包含两种不同的有效负载，其中每种有效负载选自表14-17的有效负载。在另一个实施方案中，有效负载是生物活性蛋白质，如选自表16的有效负载的蛋白质。在其他实施方案中，靶向组合物的有效负载是细胞毒性药物，并且选自：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。在前述的一个实施方案中，细胞毒性有效负载为MMAF。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为美登素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为紫杉醇。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为假单胞菌外毒素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为MMAE。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为吗他汀(DM1)。在其他实施方案中，靶向缀合物组合物包含选自下组的两种不同的细胞毒性药物：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。
22的类似物)。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，一个或多个TM分子是RGD或RGD类似物或者NGD或NGD类似物。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，药物有效负载选自表14-17的有效负载。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，该组合物包含两种不同的有效负载，其中每种有效负载选自表14-17的有效负载。在另一个实施方案中，有效负载是生物活性蛋白质，如选自表16的有效负载的蛋白质。在其他实施方案中，靶向组合物的有效负载是细胞毒性药物，并且选自：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。在前述的一个实施方案中，细胞毒性有效负载为MMAF。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为美登素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为紫杉醇。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为假单胞菌外毒素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为MMAE。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为吗他汀(DM1)。在其他实施方案中，靶向缀合物组合物包含选自下组的两种不同的细胞毒性药物：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。
[0200] 在靶向缀合物组合物的一个实施方案中，该组合物的肽切割部分(PCM)选自表8所示的序列。特别考虑到给定组合物的PCM具有作为与组织相关联的一种或多种蛋白酶的底物的序列，其中所述组织上的抗原、标志物或受体也是该组合物的TM的配体。在这样的实施方案中，TM与配体的结合使靶向缀合物组合物向组织相关联的蛋白酶靠近，于是该组合物被切割，从而在所述组织附近或之内释放细胞毒性有效负载，产生药物成分的药理作用。在其中药物是细胞毒性药物的一个实施方案中，与细胞系不包含所述组织配体时靶向缀合物组合物的毒性相比，在采用包含所述组织配体的细胞系的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，与体外哺乳动物细胞毒性测定没有蛋白酶时靶向缀合物组合物的毒性相比，在采用包含组织配体的细胞系并且存在靶组织相关联的蛋白酶的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或
100倍的毒性。在另一个实施方案中，与PCM未切割时靶向缀合物组合物的毒性相比，在PCM被切割的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，所释放的靶向组合物(其包含TM和CCD，该CCD包含被切割并从组合物中释放的细胞毒性化合物)在体外哺乳动物细胞细胞毒性测定中以比未被切割的完整组合物大至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的浓度被内化到靶细胞中。在另一个实施方案中，完整的靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出的终末半衰期比未与该组合物连接的细胞毒性药物以可比的方式施用于受试者时长10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出至少约3天、或至少约7天、或至少约10天、或至少约14天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。
100倍的毒性。在另一个实施方案中，与PCM未切割时靶向缀合物组合物的毒性相比，在PCM被切割的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，所释放的靶向组合物(其包含TM和CCD，该CCD包含被切割并从组合物中释放的细胞毒性化合物)在体外哺乳动物细胞细胞毒性测定中以比未被切割的完整组合物大至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的浓度被内化到靶细胞中。在另一个实施方案中，完整的靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出的终末半衰期比未与该组合物连接的细胞毒性药物以可比的方式施用于受试者时长10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出至少约3天、或至少约7天、或至少约10天、或至少约14天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。
[0201] 在另一方面，本发明提供了与具有半胱氨酸残基(例如表11的序列)的XTEN骨架缀合的多种靶向缀合物组合物。在图37-40、图49和图50中示意性地描绘了所得组合物的各种构型的非限制性实例。在一个实施方案中，该组合物包含含有半胱氨酸残基、用作“骨架”的第一XTEN，其中一个或多个融合蛋白与骨架XTEN的半胱氨酸连接，该骨架XTEN依次包含与靶向部分融合或缀合的PCM和携带药物有效负载的CCD(参见图37)。在前述实施方案的另一种构型中，该融合蛋白进一步包含与每个融合蛋白的CCD的C末端附接的另一个PCM和XTEN，每个融合蛋白均与骨架XTEN附接。在另一个实施方案中，该组合物包含含有半胱氨酸残基的第一XTEN，其中靶向部分与XTEN的N或C末端重组融合或通过缀合而连接，该XTEN用作“骨架”，其中一个或多个融合蛋白与骨架XTEN的半胱氨酸连接，该骨架XTEN依次包含与靶向部分融合或缀合的PCM和携带药物有效负载的CCD(参见图39)。在前述实施方案的另一种构型中，该融合蛋白进一步包含与每个融合蛋白的CCD的C末端附接的另一个PCM和XTEN，每个融合蛋白均与骨架XTEN附接。在前述组合物中，第一XTEN展现出与选自表11的XTEN序列的序列至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与该序列相同。在前述靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，一个或多个侧融合蛋白的XTEN展现出与选自表10的XTEN序列的序列至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与该序列相同。在前述实施方案中，该组合物包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个融合蛋白，该融合蛋白包含TM、PCM和CCD以及缀合的药物分子，其中侧融合蛋白使用下文所述的交联体与XTEN半胱氨酸残基的巯基连接。在该组合物的一个实施方案中，一个或多个TM分子是抗体片段，如衍生自抗体或表19的VL和VH的scFv。在另一个实施方案中，TM的一个或多个TM分子是非蛋白质的或者是其他小分子受体配体。在一些实施方案中，一个或多个非蛋白质TM是叶酸。在另一个实施方案中，一个或多个TM分子是LHRH。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，与融合蛋白CCD的半胱氨酸残基缀合的一个或多个细胞毒性有效负载是相同的，并且选自表15的有效负载。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，与融合蛋白CCD的半胱氨酸残基缀合的一个或多个细胞毒性有效负载是相同的，并且选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。在前述的一个实施方案中，细胞毒性有效负载为多柔比星。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为MMAE。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为MMAF。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为美登素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为紫杉醇。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为假单胞菌外毒素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为吗他汀(DM1)。在其他实施方案中，靶向缀合物组合物包含与分开的融合蛋白的CCD半胱氨酸残基缀合的两种不同的细胞毒性药物，这些分开的融合蛋白随后与骨架XTEN缀合，其中每种细胞毒性药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。
[0202] 在靶向缀合物组合物的一个实施方案中，肽切割部分(PCM)选自表8所示的序列。在靶向缀合物组合物的另一个实施方案中，该组合物的PCM是与组织相关联的蛋白酶的底物，其中所述组织上的抗原、标志物或受体也是该组合物的TM的配体。在这样的实施方案中，TM与配体的结合使携带细胞毒性药物或生物制剂的靶向缀合物组合物向组织相关联的蛋白酶靠近，于是该组合物被切割，从而在所述组织附近释放包含细胞毒性有效负载的组分，使得较小的分子量能够在所述组织内被内化，产生本领域已知的细胞毒性组分的药理作用。在一个实施方案中，与细胞系不包含所述组织配体时靶向缀合物组合物的毒性相比，在采用包含所述组织配体的细胞系的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，与体外哺乳动物细胞毒性测定不包含靶组织相关联的蛋白酶时该组合物的毒性相比，在存在所述靶组织相关联的蛋白酶的情况下的该测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或
10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，与PCM未切割时该组合物的毒性相比，在PCM被切割的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，包含被切割并从组合物中释放的细胞毒性化合物的靶向缀合物组合物TM-CCD片段(释放的靶向组合物)在体外哺乳动物细胞细胞毒性测定中以比完整组合物大至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的浓度被内化到靶细胞中。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出的终末半衰期比未与靶向缀合物组合物连接的相应细胞毒性药物以可比的方式施用于受试者时长10倍、或20倍、或30倍、或
40倍、或50倍、或100倍。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出至少约3天、或至少约7天、或至少约10天、或至少约14天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。在另一个实施方案中，本发明提供了一种靶向缀合物组合物，当施用于受试者时，该组合物被与靶组织共定位的蛋白酶切割，从而释放包含细胞毒性化合物的TM-CCD片段(释放的靶向组合物)，并且所释放的靶向组合物被内化到携带配体的靶细胞中，达到为完整组合物的至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的浓度。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出的终末半衰期比未与靶向缀合物组合物连接的相应细胞毒性药物以可比的方式施用于受试者时长10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出至少约3天、或至少约7天、或至少约
10天、或至少约14天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。
10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，与PCM未切割时该组合物的毒性相比，在PCM被切割的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，包含被切割并从组合物中释放的细胞毒性化合物的靶向缀合物组合物TM-CCD片段(释放的靶向组合物)在体外哺乳动物细胞细胞毒性测定中以比完整组合物大至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的浓度被内化到靶细胞中。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出的终末半衰期比未与靶向缀合物组合物连接的相应细胞毒性药物以可比的方式施用于受试者时长10倍、或20倍、或30倍、或
40倍、或50倍、或100倍。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出至少约3天、或至少约7天、或至少约10天、或至少约14天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。在另一个实施方案中，本发明提供了一种靶向缀合物组合物，当施用于受试者时，该组合物被与靶组织共定位的蛋白酶切割，从而释放包含细胞毒性化合物的TM-CCD片段(释放的靶向组合物)，并且所释放的靶向组合物被内化到携带配体的靶细胞中，达到为完整组合物的至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的浓度。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出的终末半衰期比未与靶向缀合物组合物连接的相应细胞毒性药物以可比的方式施用于受试者时长10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在施用于受试者时展现出至少约3天、或至少约7天、或至少约
10天、或至少约14天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。
[0203] 在另一方面，本发明提供了包含第一和第二区域的靶向缀合物组合物，其中每个区域在其N末端与肽切割部分(PCM)连接，该PCM是与组织相关联的蛋白酶的底物，并且该PCM将该组合物分成两个区域：第一区域，其中CCD与未修饰的XTEN融合，该XTEN展现出与选自表10的XTEN序列至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与该序列相同；以及第二区域，其包含与第二未修饰的XTEN融合的CCD，其中该XTEN展现出与选自表10的XTEN序列至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与该序列相同，其中第二CCD进一步包含与第二CCD的半胱氨酸残基缀合的一个或多个细胞毒性有效负载，并且其中该组合物进一步包含与第一CCD的半胱氨酸残基缀合的一个或多个靶向部分(TM)。在图34和图35中示意性地描绘了所得组合物的非限制性实例。在本段前述组合物的一个实施方案中，与PCM缀合的TM是衍生自抗体的scFv或衍生自表19抗体的VL和VH的scFv。在前述的另一个实施方案中，与第二CCD缀合的TM是非蛋白质的或是小分子受体配体。在一些实施方案中，一个或多个非蛋白质TM是叶酸。在前述的又一个实施方案中，与第二CCD缀合的TM是本文所述的LHRH类似物。在前述组合物的一个实施方案中，肽切割部分(PCM)选自表8所示的序列。在前述组合物的另一个实施方案中，该组合物的PCM是与组织相关联的蛋白酶的底物，其中所述组织上的抗原、标志物或受体也是该组合物的TM的配体。在前述组合物的另一个实施方案中，与第一CCD缀合的一个或多个细胞毒性有效负载是相同的，并且选自表15的有效负载。在本段前述组合物的另一个实施方案中，与第一CCD缀合的一个或多个细胞毒性有效负载是相同的，并且选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-
12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效负载为MMAF。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为美登素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为紫杉醇。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为假单胞菌外毒素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为MMAE。在本段前述组合物的其他实施方案中，该组合物包含选自下组的两种不同的细胞毒性药物：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-
159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A，其中一种药物与第一CCD连接，而第二种药物与第二CCD连接，并且TM与构建体的末端融合。在这样的实施方案中，TM与配体的结合使该组合物向组织相关联的蛋白酶靠近，于是该组合物的PCM被切割，从而在所述组织附近释放包含细胞毒性有效负载的CCD或在所述组织内被内化，产生本领域已知的细胞毒性组分的药理作用。在该实施方案中，与细胞系不包含所述组织配体时组合物的毒性相比，在采用包含所述组织配体的细胞系的体外哺乳动物细胞毒性测定中，所切割的组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，与细胞系不包含所述组织配体和组织相关联的蛋白酶时组合物的毒性相比，在采用包含所述组织配体的细胞系和存在组织相关联的蛋白酶的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。此外，与PCM未切割时组合物的毒性相比，在PCM被切割的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。因为与组合物融合的XTEN的存在，所以该组合物在施用于受试者时展现出的终末半衰期比未与组合物连接的相应细胞毒性药物以可比的方式施用于受试者时长10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或
100倍。在实施方案中，该组合物在施用于受试者时展现出至少约3天、或至少约7天、或至少约10天、或至少约14天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。
12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效负载为MMAF。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为美登素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为紫杉醇。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为假单胞菌外毒素。在前述的另一个实施方案中，细胞毒性有效载荷为MMAE。在本段前述组合物的其他实施方案中，该组合物包含选自下组的两种不同的细胞毒性药物：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-
159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A，其中一种药物与第一CCD连接，而第二种药物与第二CCD连接，并且TM与构建体的末端融合。在这样的实施方案中，TM与配体的结合使该组合物向组织相关联的蛋白酶靠近，于是该组合物的PCM被切割，从而在所述组织附近释放包含细胞毒性有效负载的CCD或在所述组织内被内化，产生本领域已知的细胞毒性组分的药理作用。在该实施方案中，与细胞系不包含所述组织配体时组合物的毒性相比，在采用包含所述组织配体的细胞系的体外哺乳动物细胞毒性测定中，所切割的组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。在另一个实施方案中，与细胞系不包含所述组织配体和组织相关联的蛋白酶时组合物的毒性相比，在采用包含所述组织配体的细胞系和存在组织相关联的蛋白酶的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。此外，与PCM未切割时组合物的毒性相比，在PCM被切割的体外哺乳动物细胞毒性测定中，该组合物展现出至少约2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍的毒性。因为与组合物融合的XTEN的存在，所以该组合物在施用于受试者时展现出的终末半衰期比未与组合物连接的相应细胞毒性药物以可比的方式施用于受试者时长10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或
100倍。在实施方案中，该组合物在施用于受试者时展现出至少约3天、或至少约7天、或至少约10天、或至少约14天、或至少约21天、或至少约30天的终末半衰期。
[0204] 在另一方面，本发明提供了包含至少一个靶向部分的靶向缀合物组合物，该靶向部分针对选自表2、3、4、19和19所示靶标的靶标，与包含CCD、PCM和XTEN的融合蛋白融合，其中该组合物进一步包含与CCD的半胱氨酸残基缀合的一个或多个细胞毒性有效负载分子。在该组合物的一个实施方案中，TM分子是衍生自抗体或表19的VL和VH序列的scFv。在另一个实施方案中，TM是与CCD的N或C末端缀合的叶酸。在另一个实施方案中，TM是与CCD的N或C末端缀合的LHRH。在另一个实施方案中，细胞毒性有效负载是相同的，并且选自表14-17的有效负载。在前述组合物的另一个实施方案中，一个或多个细胞毒性有效负载是相同的，并且选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。
[0205] 在其他实施方案中，靶向缀合物组合物包含选自下组的两种不同的细胞毒性药物：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A，其中每种类型的细胞毒性药物与融合蛋白的不同CCD缀合，使得给定组合物的每个CCD仅包含相同的细胞毒性药物。
[0206] 如图34-37、41、42和46-51所示，主题靶向缀合物组合物可具有不同的化合价，其中一个、两个、三个或四个或更多个融合蛋白分子与一个或多个靶向部分连接。因此，靶向缀合物组合物可包含1、2、3或4个或更多个融合蛋白，该融合蛋白包含具有连接的有效负载和靶向部分的CCD。表1：靶向部分：抗体片段、支架和模拟物
表2：缀合物组合物可以针对的示例性靶标和靶向部分
表2：缀合物组合物可以针对的示例性靶标和靶向部分
[0207] 本发明的主题靶向缀合物组合物可以针对的靶向部分的其他靶标包括表3列出的肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，本发明提供了靶向缀合物组合物，其包含能够结合一种或多种表3的肿瘤相关抗原和表2、表4或表19的癌症靶配体的一种或多种靶向组分。表3：肿瘤相关抗原靶标
表4：靶向部分的靶配体
表4：靶向部分的靶配体
[0208] 在具体的实施方案中，本发明提供了包含一个、两个或更多个靶向部分和与不同的CCD缀合的一种、两种或更多种药物以及一个、两个或更多个XTEN的靶向缀合物组合物。表5中提供了特异性靶向缀合物组合物的非限制性实施方案，其中所述组合物具有以下特定组分：i)靶向部分；ii)CCD；iii)PCM序列；iv)表10的XTEN序列和v)药物(其中药物分子与相应CCD的每个半胱氨酸连接)。关于所列缀合物中的表5的XTEN序列，特别的意图在于，XTEN可以包含表10所述的XTEN的AE、AF和AG变异；例如，XTEN864包括AE864、AF864和AG864。
在一个实施方案中，表5的靶向缀合物组合物根据以下式II进行配置。在另一个实施方案中，表5的靶向缀合物组合物根据以下式III进行配置。本领域技术人员将会理解，特别考虑到所公开组分的其他组合，以及相应指定组分的不同数目或比例，以及有效负载所缀合的不同XTEN序列，以及本文所述的不同靶向部分可替代表中示例性实例中所指示的那些。例如，本发明考虑到，与给定CCD附接的药物分子的数目可以是1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9或更多，并且CCD将会具有将与药物部分缀合的相应数目的半胱氨酸残基。此外，本发明考虑到，与主题组合物附接的靶向部分的数目可以是1、或2、或3或更多，该靶向部分将会类似地与N末端氨基基团融合或与该组合物中相应数目的半胱氨酸或赖氨酸残基缀合。
表5：示例性靶向缀合物组合物
*提供靶向缀合物组合物组分的单独组分的描述
1提供靶向部分的名称，其中除叶酸之外的每个TM包含如表19列出的所示抗体的VH和VL序列，该序列由表20的连接体连接。
2提供表6的含半胱氨酸结构域的名称
3提供表8的PCM序列的名称
4提供表10的XTEN的长度(例如，XTEN713可以是AE713、AF713或AG713)
5提供与CCD缀合的药物分子的类型，其中药物分子的数目等于该组合物的相应CCD的半胱氨酸残基的数目
2.含半胱氨酸的结构域
在一个实施方案中，表5的靶向缀合物组合物根据以下式II进行配置。在另一个实施方案中，表5的靶向缀合物组合物根据以下式III进行配置。本领域技术人员将会理解，特别考虑到所公开组分的其他组合，以及相应指定组分的不同数目或比例，以及有效负载所缀合的不同XTEN序列，以及本文所述的不同靶向部分可替代表中示例性实例中所指示的那些。例如，本发明考虑到，与给定CCD附接的药物分子的数目可以是1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9或更多，并且CCD将会具有将与药物部分缀合的相应数目的半胱氨酸残基。此外，本发明考虑到，与主题组合物附接的靶向部分的数目可以是1、或2、或3或更多，该靶向部分将会类似地与N末端氨基基团融合或与该组合物中相应数目的半胱氨酸或赖氨酸残基缀合。
表5：示例性靶向缀合物组合物
*提供靶向缀合物组合物组分的单独组分的描述
1提供靶向部分的名称，其中除叶酸之外的每个TM包含如表19列出的所示抗体的VH和VL序列，该序列由表20的连接体连接。
2提供表6的含半胱氨酸结构域的名称
3提供表8的PCM序列的名称
4提供表10的XTEN的长度(例如，XTEN713可以是AE713、AF713或AG713)
5提供与CCD缀合的药物分子的类型，其中药物分子的数目等于该组合物的相应CCD的半胱氨酸残基的数目
2.含半胱氨酸的结构域
[0209] 在另一方面，本发明提供了用于主题组合物的包含一个或多个半胱氨酸残基的短长度多肽，其中本文所述的药物或生物有效负载利用使有效负载与半胱氨酸残基的巯基基团连接的交联体(下文更充分地描述)与该多肽缀合。在一些实施方案中，含半胱氨酸的结构域或“CCD”是相对短长度的多肽，并且通常包含至少6个氨基酸残基。在一些实施方案中，CCD具有6个至约144个氨基酸，和1个至约10个或更多个半胱氨酸残基。通常，CCD中半胱氨酸与非半胱氨酸残基的比例高于大多数天然存在的肽和蛋白质。本发明的目的是提供用于并入本发明的主题组合物中的CCD，该主题组合物包含靶向部分、XTEN和可选的蛋白酶切割部分，其中融合蛋白被特异性地配置用于将携带连接的有效负载药物或生物活性蛋白质的CCD定位到靶向部分附近，以更好地确保完整数目的并入的有效负载分子被递送至携带可与靶向部分结合的配体的细胞。虽然XTEN在血液中不是高度易于蛋白水解切割的(如下文实施例29和48以及图29和48所示)，但是它们对某些蛋白酶如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、MMP-2和MMP-9敏感，使得施用于受试者的包含XTEN的组合物最终被切割并随时间推移通过蛋白水解而降解。为了优化预期数目的连接的有效负载向靶组织的递送，设计了一些CCD多肽以提供具有至多10个半胱氨酸残基、散布有亲水性氨基酸的短序列。在一些实施方案中，本发明提供了用于并入主题组合物中的、包含至少一个非半胱氨酸残基的CCD，其中非半胱氨酸残基选自下组的3-6种氨基酸：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)。在一个实施方案中，CCD具有1个半胱氨酸残基和至多9个选自下组的3-6种氨基酸的非半胱氨酸残基：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)。在另一个实施方案中，主题组合物的CCD具有3个半胱氨酸残基和至多39个选自以下3-6种氨基酸的非半胱氨酸残基：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)，其中半胱氨酸残基可以是连续的，或者可以通过至多15个非半胱氨酸残基与另一半胱氨酸残基隔开。在另一个实施方案中，主题组合物的CCD具有9个半胱氨酸残基和至多135个选自下组的非半胱氨酸残基：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)，其中没有两个半胱氨酸残基是连续的，并且在CCD序列中，每个半胱氨酸残基可以通过至多15个非半胱氨酸残基与另一半胱氨酸残基隔开。在另一个实施方案中，主题组合物的CCD具有1个至9个半胱氨酸残基和6个至144个总残基(其中非半胱氨酸残基为选自下组的3-6种类型：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P))，其中半胱氨酸残基位于CCD的N末端或C末端的2个至9个残基内。在另一个实施方案中，主题组合物的CCD具有3个至9个半胱氨酸残基和14个至144个总残基(其中非半胱氨酸残基为选自下组的3-6种类型：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P))，并且任何2个半胱氨酸残基被不多于15个非半胱氨酸残基隔开。在另一个实施方案中，本发明提供了用于并入主题组合物中的CCD，该CCD具有与选自表6所示序列的序列具有至少90％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了用于并入主题组合物中的CCD，该CCD选自表6所示的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了包含与本文公开的靶向部分融合的CCD的融合蛋白，该CCD具有选自表6所示序列的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了包含融合于本文公开的靶向部分和XTEN之间的CCD的融合蛋白，该CCD具有选自表6所示序列的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了包含融合于本文公开的靶向部分和PCM之间的CCD的融合蛋白，该CCD具有选自表6所示序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含具有选自表5所示序列的序列的CCD，本文公开的靶向部分、PCM和XTEN的融合蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供了包含具有选自表6所示序列的序列的CCD，本文公开的PCM和XTEN，连同与CCD的N或C末端缀合的靶向部分的融合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含具有选自表5所示序列的序列的CCD，本文公开的靶向部分、PCM和XTEN的融合蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供了包含具有选自表6所示序列的序列的CCD，本文公开的PCM和XTEN，连同与CCD的N或C末端缀合的靶向部分的融合蛋白。
[0210] 本发明的另一个目的是提供用于并入主题组合物中的CCD，以增强在缀合反应之后回收组合物分子的能力，其中该组合物具有与并入CCD中的每个半胱氨酸残基缀合的预期全部数目的有效负载药物或生物分子。本发明利用了惊人的发现，即在HPLC分析中，CCD-XTEN融合蛋白的药物缀合物在具有不同数目药物分子的缀合物之间提供了显著改善的峰分离。比较具有均匀散布在序列中的并入的半胱氨酸残基的XTEN(例如，表11的半胱氨酸工程化的XTEN)与表10的XTEN(该XTEN与具有与半胱氨酸工程化的XTEN相同数目氨基酸的CCD融合)的融合蛋白，可在反应产物中看出差异。使相应的多肽经历缀合反应以使给定的有效负载与半胱氨酸连接，并且在HPLC分析后，就对应于完全缀合的反应产物的峰与对应于最接近完全缀合反应产物峰的次缀合反应产物的峰相比而言，XTEN和CCD的融合蛋白的反应产物具有比含半胱氨酸的XTEN缀合物的反应产物相应的峰分离显著更大的峰分离。换言之，与其中半胱氨酸残基更均匀地分布在不包含CCD的相应长度的XTEN长度中的组合物的反应产物相比，包含具有并入靶向缀合物组合物中的缀合有效负载药物或生物活性蛋白质的CCD的组合物能够在反相HPLC色谱分析上实现异源缀合反应产物的峰之间的更大分离。
[0211] 完全缀合物产物与下一个最接近的次缀合物产物的峰之间的分离可在数学上进行定义。如本文所使用的，“峰分离”定义如下：峰分离＝(tR2-tR1)/FWHM
其中
tR2：通过反相HPLC测定的完全缀合物产物峰的保留时间；
tR1：通过反相HPLC测定的最接近完全缀合的产物峰的次缀合峰的保留时间；以及
FWHM：完全缀合物产物峰的半峰全宽
其中反相HPLC色谱分析条件如下：
HPLC柱为C4-HPLC柱(Vydac，货号：214TP5415 Vydac C4)
洗脱方法：5-50％缓冲液B洗脱45分钟，1ml/min
缓冲液A：在H2O中的0.1％TFA
缓冲液B：在乙腈中的0.1％TFA
其中
tR2：通过反相HPLC测定的完全缀合物产物峰的保留时间；
tR1：通过反相HPLC测定的最接近完全缀合的产物峰的次缀合峰的保留时间；以及
FWHM：完全缀合物产物峰的半峰全宽
其中反相HPLC色谱分析条件如下：
HPLC柱为C4-HPLC柱(Vydac，货号：214TP5415 Vydac C4)
洗脱方法：5-50％缓冲液B洗脱45分钟，1ml/min
缓冲液A：在H2O中的0.1％TFA
缓冲液B：在乙腈中的0.1％TFA
[0212] 在一些实施方案中，本发明提供了靶向缀合物组合物，其中在药物分子与融合蛋白的CCD的半胱氨酸残基之间的缀合之后，得到异质的缀合物产物群体，其中完全缀合的CCD-药物缀合物产物能够实现>6的峰分离，其中：a)融合蛋白包含具有600个或更多个累积氨基酸残基的多肽，并包含具有3个至9个半胱氨酸残基的CCD；b)异质缀合物产物具有至少1个、2个和3个或更多个与CCD连接的有效负载的混合物；并且c)在反相HPLC色谱分析条件下分析缀合产物的异质群体。在前述的一个实施方案中，融合蛋白的CCD是具有3个半胱氨酸残基的表6的序列，并且融合蛋白具有至少800个累积的氨基酸残基。在前述的另一个实施方案中，融合蛋白的CCD是具有9个半胱氨酸残基的表6的序列，并且融合蛋白具有至少
800个累积的氨基酸残基。
表6：用于与药物有效负载缀合的含半胱氨酸结构域(CCD)
3.肽切割部分
800个累积的氨基酸残基。
表6：用于与药物有效负载缀合的含半胱氨酸结构域(CCD)
3.肽切割部分
[0213] 在一方面，本发明提供了包含一个或多个肽切割部分(PCM)的靶向缀合物组合物，该肽切割部分是与受试者中的靶组织相关联的蛋白酶的底物；靶组织的非限制性实例是癌症、肿瘤或参与炎症应答的组织或器官。本发明的目的是提供被特异性配置用于包含有效负载的靶向缀合物组合物的肽切割部分(PCM)，使得当包含PCM的组合物靠近与靶组织相关联的蛋白酶时，该组合物的有效负载(具有或没有XTEN序列的一些部分)或与TM连接的有效负载(具有或没有XTEN序列的一些部分)从该组合物中释放。靶向缀合物组合物的设计是使得包含TM和/或有效负载的所得释放组分具有增强的附接于或渗入靶组织的能力；无论是通过所得片段的降低的分子量，还是通过由被切掉的侧翼大体积XTEN所带来的减小的空间位阻。
[0214] 人类癌中的基质由细胞外基质和各种类型的非癌细胞如白细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞组成。肿瘤相关基质通过刺激新血管生成积极地支持肿瘤生长，并且支持并存的癌细胞的增殖和侵袭。基质成纤维细胞通常被称为癌相关成纤维细胞(CAF)，由于其能够动态地改变细胞外基质(ECM)的组成，从而促进肿瘤细胞侵袭和随后的转移定植，因此在肿瘤进展中具有特别重要的作用。特别是，本领域已知，蛋白酶是有助于包括肿瘤血管生成、侵袭、细胞外基质重塑和转移在内的恶性进展的重要组分，其中蛋白酶作为广泛的蛋白水解相互作用多向网络的一部分而起作用。
[0215] 由于恶性肿瘤的需求是其获得血管系统以便渗入周围正常组织中并向远处部位传播的能力，因此肿瘤主要依赖于来自多种酶类的细胞外内切蛋白酶例如金属蛋白酶(MMP)以及丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶的表达增加。然而，蛋白酶的作用不限于组织侵袭和血管生成。这些酶还在生长因子激活、细胞粘附、细胞存活和免疫监视中起主要作用。例如，由于MMP切割生长因子、细胞表面受体、细胞粘附分子或趋化因子的能力，因此能够在体内影响肿瘤细胞行为。总体而言，肿瘤相关联蛋白酶的作用在癌症的表型进化中表现出重要的力量。
[0216] 考虑到许多这样的蛋白水解酶在正常组织和肿瘤组织之间的差异表达，这种差异表达可用作半选择性激活或改变与肿瘤接近或共定位的化学治疗剂的手段。如本文所使用的，“共定位”意指蛋白酶在肿瘤附近或肿瘤内处于最高浓度，并且浓度随着与肿瘤距离的增加而降低。在这一方面，由于丝氨酸和金属蛋白酶在细胞外肿瘤环境中升高的活性及其选择性并特异性切割短肽序列的能力，因此它们是靶向的差异药物递送的候选物。具体而言，相对于非病变组织，肿瘤内增加的内切蛋白酶活性可用于激活包含特异性肽序列并具有随后释放的有效抗癌治疗剂的前药化合物，从而导致该肿瘤处的高水平活性剂和在正常健康组织中的低或阴性药物水平。由于这种前药癌症治疗剂的选择性递送，因此存在这些药剂所需活性的伴随降低，以及对包括肝、心脏和骨髓在内的正常组织的毒性降低，从而大大提高了这类化合物的治疗指数。
[0217] 在一些实施方案中，本发明包含含有PCM的靶向缀合物组合物，其中当该组合物被靶组织相关蛋白酶切割时，释放包含有效负载的片段，该包含有效负载的片段能够在所述组织内穿透，达到与不包含PCM的组合物相比至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍的浓度。在其他实施方案中，本发明包含含有PCM的靶向缀合物组合物，其中当该组合物被靶组织相关蛋白酶切割时，释放包含有效负载和TM的释放的靶向组合物片段，该释放的靶向组合物能够在所述组织内以与不包含PCM的相应组合物相比至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍的速率穿透。在前述的一个实施方案中，释放的靶向组合物片段在其释放后具有比未被蛋白酶切割的完整靶向缀合物组合物小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍的所得分子量。在前述的另一个实施方案中，释放的靶向组合物在其释放后具有比未被蛋白酶切割的完整靶向缀合物组合物小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍的所得流体动力学半径。特别考虑到在主题靶向缀合物组合物实施方案中，组织相关蛋白酶的切割产生包含有效负载的片段，因为该片段相对于完整组合物而言尺寸减小，所以能够更有效地穿透组织，如肿瘤，从而导致有效负载在所述组织或细胞内的药理作用。还特别考虑到将靶向缀合物组合物的PCM设计用于组合物中，该组合物旨在用已知由靶组织或靶细胞产生的特异性蛋白酶来靶向特定组织。在一个实施方案中，靶向缀合物组合物的PCM包含作为由靶组织分泌的细胞外蛋白酶(包括但不限于表7的蛋白酶)的底物的氨基酸序列。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物的PCM包含作为由靶组织分泌的细胞外蛋白酶的底物的氨基酸序列，包括但不限于表8所示的序列。在另一个实施方案中，PCM包含作为位于细胞内的细胞蛋白酶(包括但不限于表7的蛋白酶)的底物的氨基酸序列。在另一个实施方案中，PCM包含作为与癌组织相关联的蛋白酶的底物的氨基酸序列。在另一个实施方案中，PCM包含作为与癌性肿瘤相关联的蛋白酶的底物的氨基酸序列。在另一个实施方案中，PCM包含作为与癌症如白血病相关联的蛋白酶的底物的氨基酸序列。在另一个实施方案中，PCM包含作为与炎性组织相关联的蛋白酶的底物的氨基酸序列。
[0218] 在一个实施方案中，靶向缀合物组合物的PCM是选自表7所示蛋白酶的至少一种蛋白酶的底物。在一些实施方案中，PCM是选自金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的至少一种蛋白酶的底物。在另一个实施方案中，PCM是选自下组的一种或多种蛋白酶的底物：跨膜肽酶、中性溶酶(CD10)、PSMA、BMP-1、解联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17(TACE)、ADAM19、ADAM28(MDC-L)、具有血小板反应蛋白基序的ADAM(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-1(胶原酶1)、MMP-2(明胶酶A)、MMP-3(溶基质蛋白酶1)、MMP-7(基质溶解因子1)、MMP-8(胶原酶2)、MMP-9(明胶酶B)、MMP-10(溶基质蛋白酶2)、MMP-11(溶基质蛋白酶3)、MMP-12(巨噬细胞弹性蛋白酶)、MMP-13(胶原酶3)、MMP-14(MT1-MMP)、MMP-15(MT2-MMP)、MMP-19、MMP-23(CA-MMP)、MMP-24(MT5-MMP)、MMP-26(基质溶解因子2)、MMP-27(CMMP)、豆荚蛋白(Legumain)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶X、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、分泌酶、尿激酶(uPA)、组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)、纤溶酶、凝血酶、前列腺特异性抗原(PSA、KLK3)、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、弹性蛋白酶、类胰蛋白酶、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)、DESC1、Hepsin(HPN)、蛋白裂解酶、蛋白裂解酶-2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4(CAP2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、激肽释放酶相关肽酶(KLK家族)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14。在一些实施方案中，PCM是ADAM17的底物。在一些实施方案中，PCM是BMP-1的底物。在一些实施方案中，PCM是组织蛋白酶的底物。在一些实施方案中，PCM是半胱氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方案中，PCM是HtrA1的底物。在一些实施方案中，PCM是豆荚蛋白的底物。在一些实施方案中，PCM是MT-SP1的底物。在一些实施方案中，PCM是金属蛋白酶的底物。在一些实施方案中，PCM是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。在一些实施方案中，PCM是凝血酶的底物。在一些实施方案中，PCM是II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)的底物。在一些实施方案中，PCM是TMPRSS3的底物。
在一些实施方案中，PCM是TMPRSS4的底物。在一些实施方案中，PCM是uPA的底物。在一个实施方案中，PCM包含选自表8所示的序列的切割序列。在另一个实施方案中，切割缀合物组合物的PCM包含第一切割序列和与所述第一切割序列不同的第二切割序列，其中每种序列选自表8所示的序列，并且第一和第二切割序列通过选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的1个至6个氨基酸彼此连接。在另一个实施方案中，切割缀合物组合物的PCM包含第一切割序列、与所述第一切割序列不同的第二切割序列和第三切割序列，其中每种序列选自表8所示的序列，并且第一和第二以及第三切割序列通过选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的4个至6个氨基酸彼此连接。在其他实施方案中，本发明提供了包含一个、两个或三个PCM的靶向缀合物组合物。具体意图在于，可使靶向缀合物组合物的多个PCM联结以形成可被多种蛋白酶切割的通用序列。考虑到这样的组合物将会更容易被表达多种蛋白酶的病变靶组织切割，其结果是携带TM和/或有效负载药物的所得片段将会更容易穿透靶组织并发挥有效负载药物的药理作用。
表7：靶组织的蛋白酶
在一些实施方案中，PCM是TMPRSS4的底物。在一些实施方案中，PCM是uPA的底物。在一个实施方案中，PCM包含选自表8所示的序列的切割序列。在另一个实施方案中，切割缀合物组合物的PCM包含第一切割序列和与所述第一切割序列不同的第二切割序列，其中每种序列选自表8所示的序列，并且第一和第二切割序列通过选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的1个至6个氨基酸彼此连接。在另一个实施方案中，切割缀合物组合物的PCM包含第一切割序列、与所述第一切割序列不同的第二切割序列和第三切割序列，其中每种序列选自表8所示的序列，并且第一和第二以及第三切割序列通过选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的4个至6个氨基酸彼此连接。在其他实施方案中，本发明提供了包含一个、两个或三个PCM的靶向缀合物组合物。具体意图在于，可使靶向缀合物组合物的多个PCM联结以形成可被多种蛋白酶切割的通用序列。考虑到这样的组合物将会更容易被表达多种蛋白酶的病变靶组织切割，其结果是携带TM和/或有效负载药物的所得片段将会更容易穿透靶组织并发挥有效负载药物的药理作用。
表7：靶组织的蛋白酶
[0219] 在某些实施方案中，本发明提供了意在用于主题靶向缀合物组合物的PCM组合物，该组合物包含选自表8所示序列的至少第一切割序列。在一些实施方案中，将PCM组合物序列设计成具有某些明显性质，包括1)编码PCM组合物序列的核酸可容易地与编码XTEN或靶向部分的核酸序列连接或在该核酸序列内，从而产生可作为融合蛋白进行表达并回收的序列；和2)所得融合蛋白可用作本文所述靶组织蛋白酶的底物。在一个实施方案中，PCM展现出与选自表8所示序列的肽基切割序列的至少约90％同一性、或至少约93％同一性、或至少约94％同一性、或至少约95％同一性、或至少约96％同一性、或至少约97％同一性、或至少约98％同一性、或至少约99％同一性，或与选自表8所示序列的肽基切割序列相同。表8：肽基切割部分(PCM)的序列
↓表示切割位点
具体氨基酸缩写：
Cit：瓜氨酸；Cha：β-环己基丙氨酸；Hof：高苯丙氨酸；Nva：氨基辛二酸；Dpa：D-苯丙氨酸；NLE：正亮氨酸；SMC：S-甲基半胱氨酸
*斜杠之前、之间或之后的多个氨基酸的列出指示在该位置可以被置换的可替代氨基酸；“-”表示任何氨基酸可以置换中间列中所示的相应氨基酸
**x是除了脯氨酸之外的任何L-氨基酸
Hy是任何亲水性L-氨基酸
γ表示键为γ羧基连接
Ⅲ).靶向缀合物组合物的XTEN
↓表示切割位点
具体氨基酸缩写：
Cit：瓜氨酸；Cha：β-环己基丙氨酸；Hof：高苯丙氨酸；Nva：氨基辛二酸；Dpa：D-苯丙氨酸；NLE：正亮氨酸；SMC：S-甲基半胱氨酸
*斜杠之前、之间或之后的多个氨基酸的列出指示在该位置可以被置换的可替代氨基酸；“-”表示任何氨基酸可以置换中间列中所示的相应氨基酸
**x是除了脯氨酸之外的任何L-氨基酸
Hy是任何亲水性L-氨基酸
γ表示键为γ羧基连接
Ⅲ).靶向缀合物组合物的XTEN
[0220] 本发明部分地涉及为用于靶向缀合物组合物而工程化的延伸重组多肽(XTEN)序列。这样的组合物可用作产生融合蛋白的融合配偶体以及产生靶向缀合物组合物的试剂缀合配偶体。此外，本发明的目的是提供用于产生组合物的方法。
[0221] 作为示例性实例，能够与用于产生主题组合物的一个或多个融合配偶体(包括其他XTEN、PCM、靶向部分或将要与小分子有效负载缀合的CCD)连接或融合从而产生靶向缀合物组合物的XTEN被特别地工程化以赋予所得组合物某些性质，包括提高的溶解度、增强的药代动力学性质、增加的质量和流体动力学半径以减少溢出，以及屏蔽效应以减少与其他健康组织的不期望的相互作用以及由此产生的副作用或毒性。在一些情况下，将XTEN设计成并入明确数目的反应性氨基酸以与靶向部分连接或允许多价构建体的产生，其中XTEN用作与多个融合蛋白附接的骨架或用来允许经由交联体或叠氮化物/炔烃反应物与三价或四价连接体缀合。本发明还提供了制备用于产生主题组合物的这类工程化XTEN聚合物的方法。
[0222] 在另一方面，本发明提供了包含明确数目的交联体或叠氮化物/炔烃反应物、在单体和多聚体构型的产生中可用作反应物缀合配偶体的XTEN聚合物，以及制备这类反应物的方法。包含交联体或叠氮化物/炔烃反应物的XTEN在靶向部分、其他XTEN或其他融合蛋白的缀合中用作反应物，以产生特别设计的缀合物组合物，用于实现期望的物理、药物、靶向和药理性质，包括对靶组织的差异毒性。
[0223] 在另一方面，本发明提供了XTEN的组合物，其包括不同融合蛋白或靶向部分的组合，在单体或多聚体构型中具有明确数目，以提供具有增强的靶向、药物、药代动力学和药理性质(包括相比于健康组织对病变靶组织的差异毒性)的组合物。与这样的有效负载连接的这类组合物可在施用于受试者时具有预防、治疗或改善疾病的效用，并且由于有效负载的药理或生物作用而具有有益的应答。4.XTEN：延伸的重组多肽
[0224] 在一方面，本发明提供了可用作融合配偶体或缀合配偶体的XTEN多肽组合物，其通过重组融合或经由交联体反应物与一个或多个靶向部分、肽基切割部分、CCD或具有前述组分的融合蛋白连接，当与连接至CCD的药物或生物有效负载组合时，产生靶向缀合物组合物。
[0225] 在一些实施方案中，XTEN是在生理条件下没有或具有低程度的二级或三级结构的非天然存在的、基本上非重复的序列的多肽。XTEN通常具有约36个至约1000个或更多个氨基酸，这些氨基酸中大多数或全部是小的亲水性氨基酸。如本文所用的“XTEN”明确排除了完整抗体或抗体片段(例如单链抗体和Fc片段)。XTEN多肽具有作为融合和缀合配偶体的作用，因为它们起到多种作用，当与靶向部分、另一XTEN或其他融合蛋白接合、连接或融合时带来某些期望的性质。所得到的组合物与未连接至XTEN的相应的有效负载或靶向部分相比具有增强的性质，诸如增强的药代动力学、物理化学、药理学以及改善的毒理学和药学性质，从而使得它们可用于已知在本领域中已使用有效负载或靶向部分的某些病况的治疗。
[0226] XTEN的非结构化特征和物理化学性质部分是由典型地不成比例地限制于4-6种类型的亲水性氨基酸的总体氨基酸组合物、可量化的基本上非重复性设计的氨基酸连接以及XTEN多肽的所得长度和/或构型而导致的。在对于XTEN共同的而对于天然多肽不是共同的有利特征中，本文公开的XTEN的性质与绝对一级氨基酸序列是不相关的，如由表10和表11中的多种示例性序列所证明的，这些序列在不同长度范围内拥有相似的性质并赋予其所连接的有效负载或靶向部分增强的性质，其中许多性质在实施例中得到证明。实际上，特别考虑到本发明的组合物不限于表10和表11中具体列举的那些，而是实施方案包括与表10和表11的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，因为这些序列展现出下述XTEN的性质。已经确定，这样的XTEN具有相比于蛋白质更像非蛋白质亲水性聚合物(例如聚乙二醇或“PEG”)的性质。在一些实施方案中，本发明的XTEN展现出一种或多种以下有利性质：限定和均一的长度(对于给定序列)、构象柔性、二级结构减少或缺乏、高度的无规卷曲形成、高度的水溶性、高度的蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合、限定程度的电荷和增强的流体动力学(或Stokes)半径；与某些亲水性聚合物(例如聚乙二醇)相似、使得它们尤其可用作缀合配偶体的性质。
[0227] 将主题融合蛋白和缀合物的XTEN组分设计为在生理条件下表现得像变性的肽序列，尽管聚合物的长度延长。“变性的”描述了以肽骨架的大的构象自由度为特征的肽在溶液中的状态。大多数肽和蛋白质在高浓度变性剂的存在下或高温下采用变性构象。变性构象的肽具有，例如，特征性圆二色性(CD)谱，并以缺乏长程相互作用为特征，如通过NMR确定的。本文中“变性构象”和“非结构化构象”作为同义词使用。在一些实施方案中，本发明提供了在生理条件下类似于大部分缺乏二级结构的变性序列的XTEN序列。在其他情况下，XTEN序列在生理条件下基本上没有二级结构。在上下文中使用的“大部分缺乏”是指如通过本文所述的方法所测量或确定的，XTEN序列的少于50％的XTEN氨基酸残基对二级结构有贡献。在上下文中使用的“基本上缺乏”是指如通过本文所述的方法(包括算法或分光光度测定)所测量或确定的，XTEN序列的至少约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约
97％、或至少约99％的XTEN氨基酸残基对二级结构没有贡献。
97％、或至少约99％的XTEN氨基酸残基对二级结构没有贡献。
[0228] 本领域已知多种已建立的用于测定并确认主题XTEN的物理化学性质的方法和测定。这类性质包括但不限于二级或三级结构、溶解度、蛋白质聚集、稳定性、绝对和表观分子量、纯度和均一性、解链性质、污染和含水量。测量这类性质的方法包括分析离心、EPR、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻色谱法(SEC)、HPLC-反相、光散射、毛细管电泳、圆二色谱、差示扫描量热法、荧光、HPLC-离子交换、HPLC尺寸排阻、IR、NMR、拉曼光谱、折射测量法和UV/可见光谱法。特别是，可通过分光技术，例如通过“远紫外”光谱区(190-250nm)的圆二色谱法来测量二级结构。二级结构元素如α-螺旋和β-折叠各自产生CD谱的特征形状和幅度，以及这些结构元素的缺乏，并且在实施例中提供了XTEN的示例性CD测定，该测定支持XTEN缺乏二级结构的结论。如美国专利申请公开号20030228309A1中所述，还可以通过某些计算机程序或算法，如众所周知的Chou-Fasman算法(Chou,P.Y.等(1974)Biochemistry,13:222-45)和Garnier-Osguthorpe-Robson算法(“Gor算法”)(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996),GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence.Methods Enzymol 266:540-553)来预测多肽序列的二级结构。对于给定的序列，这些算法可预测是否存在一些二级结构或根本不存在二级结构，表示为形成例如α-螺旋或β-折叠的序列的残基的总数和/或百分比，或预计导致无规卷曲形成(其缺乏二级结构)的序列的残基的百分比。可使用例如fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝misc1的万维网网站的Chou-Fasman算法和npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_gor4.html的Gor算法(两者均在2015年10月30日访问)来对多肽序列进行分析。可以通过多种方法，包括通过使用以构象依赖的方式以链长度标测的特性粘数测量法(Tanford,C.,Kawahara,K.&Lapanje,S.(1966)J.Biol.Chem.241,1921–
1923)以及通过尺寸排阻色谱法(Squire,P.G.,Calculation of hydrodynamic
parameters of random coil polymers from size exclusion chromotography and comparison with parameters by conventional methods.Journal of Chromatography,
1981,5,433-442)来测定无规卷曲。在Arnau等,Prot Expr and Purif(2006)48,1-13中公开了另外的方法。
1923)以及通过尺寸排阻色谱法(Squire,P.G.,Calculation of hydrodynamic
parameters of random coil polymers from size exclusion chromotography and comparison with parameters by conventional methods.Journal of Chromatography,
1981,5,433-442)来测定无规卷曲。在Arnau等,Prot Expr and Purif(2006)48,1-13中公开了另外的方法。
[0229] 在一个实施方案中，主题缀合物中所用的XTEN序列具有如通过Chou-Fasman算法确定的0％到小于约5％的α-螺旋百分比。在另一个实施方案中，XTEN序列具有通过Chou-Fasman算法确定的0％到小于约5％的β-折叠百分比。在一个实施方案中，该缀合物的XTEN序列具有通过Chou-Fasman算法确定的0％到小于约5％的α-螺旋百分比和0％到小于约5％的β-折叠百分比。在一个实施方案中，该缀合物的XTEN序列具有小于约2％的α-螺旋百分比和小于约2％的β-折叠百分比。该组合物的XTEN序列具有如通过GOR算法确定的高度无规卷曲形成。在一些实施方案中，XTEN序列具有如通过GOR算法确定的至少约80％、更优选地至少约90％、更优选地至少约91％、更优选地至少约92％、更优选地至少约93％、更优选地至少约94％、更优选地至少约95％、更优选地至少约96％、更优选地至少约97％、更优选地至少约98％和最优选地至少约99％的无规卷曲形成。在一个实施方案中，该靶向缀合物组合物的XTEN序列具有如通过Chou-Fasman算法确定的0％到小于约5％的α-螺旋百分比和0％到小于约5％的β-折叠百分比和如通过GOR算法确定的至少约90％的无规卷曲形成。在另一个实施方案中，所公开的组合物的XTEN序列具有如通过Chou-Fasman算法确定的小于约2％的α-螺旋百分比和小于约2％的β-折叠百分比、如通过GOR算法确定的至少约90％的无规卷曲形成。在另一个实施方案中，如通过圆二色谱法所测量的，该组合物的XTEN序列基本上缺乏二级结构。
[0230] 将要与用于产生靶向缀合物组合物的组分连接的XTEN的选择标准通常涉及XTEN的物理化学性质和构象结构的属性，而这些属性继而用于赋予组合物增强的药物、药理和药代动力学性质。1.非重复序列
[0231] 特别考虑到，包含在主题缀合物组合物实施方案中的主题XTEN序列基本上是非重复性的。通常，重复性氨基酸序列具有聚集或形成更高级结构的倾向，如通过天然重复性序列如胶原蛋白和亮氨酸拉链所例证。这些重复性氨基酸还倾向于形成产生晶体或假晶体结构的接触。相反，非重复序列的低聚集倾向使得能够设计具有相对较低的带电氨基酸频率的长序列XTEN，如果序列为重复性的则这些带电氨基酸将可能聚集。通过评估一种或多种以下特征可观察到主题XTEN的非重复性。在一个实施方案中，基本上非重复的XTEN序列在序列中不具有为相同氨基酸类型(除非该氨基酸是丝氨酸)的三个连续的氨基酸，在这种情况下，不超过三个连续的氨基酸为丝氨酸残基。在另一个实施方案中，如下文更加充分描述的，本发明提供了基本上非重复的XTEN序列，其中该序列的80-90％由12个氨基酸残基的基序组成，其中该基序由4、5或6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，并且其中在任何一种基序中的任意两个连续氨基酸残基的序列在序列基序中重复不超过两次。在另一个实施方案中，本发明提供了基本上非重复的XTEN序列，其中该序列的至少约90％由12个氨基酸残基的基序组成，其中该基序由4、5或6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，并且其中在任何一种基序中的任意两个连续氨基酸残基的序列在序列基序中重复不超过两次。在另一个实施方案中，本发明提供了基本上非重复的XTEN序列，其中该序列的至少约90％由选自表9所示序列的12个氨基酸残基的基序组成。在另一个实施方案中，本发明提供了基本上非重复的XTEN序列，其中该序列的至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％或100％由选自表9所示AE序列的12个氨基酸残基的基序组成。在另一个实施方案中，本发明提供了基本上非重复的XTEN序列，其中该序列的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％或100％由选自表9所示AF序列的
12个氨基酸残基的基序组成。在另一个实施方案中，本发明提供了基本上非重复的XTEN序列，其中该序列的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少98％或100％由选自表9所示AG序列的12个氨基酸残基的基序组成。
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％或100％由选自表9所示AE序列的12个氨基酸残基的基序组成。在另一个实施方案中，本发明提供了基本上非重复的XTEN序列，其中该序列的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％或100％由选自表9所示AF序列的
12个氨基酸残基的基序组成。在另一个实施方案中，本发明提供了基本上非重复的XTEN序列，其中该序列的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少98％或100％由选自表9所示AG序列的12个氨基酸残基的基序组成。
[0232] 可以通过计算机程序或算法或通过本领域已知的其他方法来测定多肽或基因的重复性程度。根据本发明，本文公开了将在计算特定多肽如XTEN的重复性程度中使用的算法，并且提供了通过算法分析的序列的实例(参见下文的实施例)。在一个实施方案中，可根据方程式I给出的公式计算预定长度的多肽的重复性(下文称“子序列评分”)：其中：m＝(多肽的氨基酸长度)–(子序列的氨基酸长度)+1；且
Counti＝序列i中每个独特子序列出现的累计数
Counti＝序列i中每个独特子序列出现的累计数
[0233] 开发了称作“SegScore”的算法以应用上述方程式来定量多肽如XTEN的重复性，从而提供子序列评分，其中通过确定长度为“s”的独特子序列在设定长度中出现的次数(“计数”)，除以预定长度的序列中子序列的绝对数来分析预定氨基酸长度“n”的序列的重复性。任何给定的多肽的子序列评分将取决于独特子序列的绝对数和每个独特的子序列(意思是不同的氨基酸序列)在预定序列长度中出现的频率。
[0234] 在本发明的背景下，“子序列评分”是指每个独特的3-聚体读框在XTEN多肽的200个连续氨基酸中出现的总数除以200个氨基酸序列中独特3-聚体子序列的绝对数。此类由重复和非重复性多肽的200个连续氨基酸推导的子序列评分的实例在实施例32中提出。在一个实施方案中，本发明提供了包含一个XTEN的XTEN缀合物，其中XTEN具有小于12、更优选地小于10、更优选地小于9、更优选地小于8、更优选地小于7、更优选地小于6，并且最优选地小于5的子序列评分。在另一个实施方案中，本发明提供了包含至少两个XTEN的靶向缀合物组合物，其中每一个XTEN具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5或更小的子序列评分。在另一个实施方案中，本发明提供了包含至少三个连接的XTEN的XTEN组合物，其中每一个XTEN具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5或更小的子序列评分。在本文所述XTEN组合物的实施方案中，将具有序列评分为10或更小(即9、8、7等)的XTEN表征为基本上非重复的。
[0235] 在另一个实施方案中，可根据方程式II给出的公式计算任何长度的多肽的平均重复性(下文称“平均子序列评分”)：其中：n＝(多肽的氨基酸长度)–(区组的氨基酸长度)+1；
m＝(区组的氨基酸长度)–(子序列的氨基酸长度)+1；且
Counti＝区组i中每个独特子序列出现的累计数
m＝(区组的氨基酸长度)–(子序列的氨基酸长度)+1；且
Counti＝区组i中每个独特子序列出现的累计数
[0236] 开发了称作“BlockScore”的第二种算法以实施前述方程式来定量多肽如XTEN的平均重复性，以便可以比较不同长度的多肽的重复性。图28示出了BlockScore算法的逻辑流程图。对于BlockScore(或类似设计或目的的算法)，可将主题多肽序列视为比多肽长度更短的一系列相等长度的重叠区段(下文称为“区组”)。进而，可将每个区组视为比区组长度更短的一系列相等长度的重叠区段(下文称为“子序列”)。BlockScore算法通过首先将SegScore算法应用于多肽中单个重叠区组中的每一个以产生子序列评分阵列，然后确定多肽的所有区组的子序列评分平均值，从而确定评分(下文称为“平均子序列评分”)。例如，200个氨基酸残基长度的多肽具有总计165个重叠的36个氨基酸的“区组”和198个3-聚体氨基酸“子序列”，但是在每个区组内发现的独特3-聚体子序列(意指独特的三个氨基酸的特异性序列)的数目将会取决于区组内的重复性程度；具有含有高度重复性的区组的多肽将会通常具有较少的独特3-聚体子序列。由BlockScore产生的或通过前述方程式II应用于多肽而产生的平均子序列评分反映了重复性程度和分配给两个变量的值：1)氨基酸残基中区组的长度，和2)氨基酸残基中子序列的长度。本发明考虑到，可变“子序列”可以是3个至约
10个氨基酸残基的肽长度，并且可变“区组”可以是约20个至约800个氨基酸残基的肽长度。
在优选的方法中，并且如以下实施方案所应用(除非另有说明)，通过将前述方程式II或BlockScore算法应用于多肽序列来确定多肽的“平均子序列评分”，其中区组长度设定为36个氨基酸，子序列长度设定为3个氨基酸。
10个氨基酸残基的肽长度，并且可变“区组”可以是约20个至约800个氨基酸残基的肽长度。
在优选的方法中，并且如以下实施方案所应用(除非另有说明)，通过将前述方程式II或BlockScore算法应用于多肽序列来确定多肽的“平均子序列评分”，其中区组长度设定为36个氨基酸，子序列长度设定为3个氨基酸。
[0237] 在一些实施方案中，本发明提供了包含一个或多个XTEN的靶向缀合物组合物，其中每个XTEN具有3或更小和更优选小于2的平均子序列评分。在另一个实施方案中，本发明提供了包含两个XTEN的靶向缀合物组合物，其中至少一个XTEN具有3或更小和更优选小于2的平均子序列评分。在又一个实施方案中，本发明提供了包含至少三个XTEN的靶向缀合物组合物，其中每一个XTEN具有3或更小和更优选小于2的平均子序列评分。在本文所述靶向缀合物组合物的实施方案中，具有平均子序列评分为3或更小的组合物的XTEN组分是“基本上非重复性的”。
[0238] 已经确立，本发明的XTEN的非重复性特征以及在XTEN中占主导地位的氨基酸的特定类型(而不是绝对的一级序列)，赋予了XTEN和所得靶向缀合物组合物的一种或多种增强的物理化学和生物学性质。因此，虽然表10和表11的序列是示例性的，但它们并非意在限制，因为与表10和表11的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％序列同一性的序列展现出增强的XTEN的性质。这些增强的性质包括与具有重复序列、不与XTEN缀合的有效负载或蛋白质相比，得到的靶向缀合物的XTEN蛋白在宿主细胞中的高表达程度、编码XTEN的基因的更大的遗传稳定性，并赋予了更大的溶解度、较低的聚集倾向和增强的药代动力学。这些增强的性质允许更高效的生产、更均一的终产品、更低的商品成本，和/或促进含有极高蛋白质浓度(在一些情况下超过100mg/ml)的主题组合物的药物制剂的配制。此外，将这些缀合物的XTEN多肽序列设计为具有低内部重复度，以便当施用于哺乳动物时降低或基本上消除免疫原性。由主要限于仅三种氨基酸如甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的短的重复基序组成的多肽序列，当施用于哺乳动物时，尽管在这些序列中缺乏预测的T细胞表位，但仍可产生相对较高的抗体效价。这可能是由多肽的重复性质导致的，因为已经证明具有重复表位(包括蛋白质聚集体、交联的免疫原和重复性碳水化合物)的免疫原是高度免疫原性的，并且可以，例如，导致引起B细胞激活的B细胞受体的交联(Johansson,J.等.(2007)Vaccine,25:1676-82；Yankai,Z.等.(2006)Biochem Biophys Res Commun,345:1365-71；Hsu,C.T.等.(2000)Cancer Res,60:3701-5)；Bachmann MF等.Eur J Immunol.(1995)25(12):3445-3451)。
2.示例性序列基序和XTEN区段
2.示例性序列基序和XTEN区段
[0239] 本发明涵盖了包含多个较短序列或基序的单元的、用作融合和缀合配偶体的XTEN，其中所述基序的氨基酸序列基本上是非重复性的。甚至使用多聚化产生XTEN序列的序列基序小文库，利用“结构单元”方法，可满足非重复性质。而XTEN序列可由仅有4种不同类型的序列基序的多个单元组成，因为该基序自身通常由非重复性氨基酸序列组成，将整个XTEN序列设计为使得该序列基本上是非重复性的。
[0240] 特别的意图在于，用于本发明的主题组合物中的XTEN长度的范围不是限制性的，并且XTEN可以包含36个至1500个或更多个的任何数目的氨基酸残基并且被本发明的实施方案所包含。
[0241] 在一个实施方案中，XTEN包含这样的序列，在该序列中，至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或至少99％的氨基酸残基是选自下组的四至六种氨基酸：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)，并以基本上非重复的序列进行排列。在一个实施方案中，XTEN序列由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4、5或6种氨基酸组成。在其他实施方案中，至少约90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或
98％、或至少99％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有由4-6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成的12个氨基酸残基，并且其中全长XTEN中的任何一种氨基酸类型的含量不超过40％、或30％、或约
25％、或约17％、或约12％、或约8％。在其他实施方案中，至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成的12个氨基酸残基。
98％、或至少99％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有由4-6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成的12个氨基酸残基，并且其中全长XTEN中的任何一种氨基酸类型的含量不超过40％、或30％、或约
25％、或约17％、或约12％、或约8％。在其他实施方案中，至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中每种基序具有由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成的12个氨基酸残基。
[0242] 在一些实施方案中，本发明提供了包含一个、或两个、或三个、或四个各自至少约100至约1200个氨基酸残基或累积约200至约2000个氨基酸残基的基本上非重复的XTEN序列的靶向缀合物组合物，其中该序列的至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约
94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由选自表9的氨基酸序列的四个或更多个非重叠序列基序的多个单元组成。在本段上文所述的实施方案中，可选择并入XTEN中的基序或基序的一部分并使用本文所述的方法进行组装，以获得至少36、至少42、至少72、至少144、至少288、至少576、约864、至少1000、至少1500个氨基酸残基或任何中间长度的XTEN。可用于并入主题组合物的XTEN中的XTEN序列的非限制性实例在表10和表
11中示出。旨在使相对于表10和表11提到的特定序列具有各自表格中所示的序列，而广泛提到AE144序列，例如，意在涵盖任何具有144个氨基酸残基的AE序列，或广泛提到AG864序列，例如，意在涵盖任何具有864个氨基酸残基的AG序列等。
表9：12个氨基酸的XTEN序列基序和基序家族
基序家族* 基序序列
AE GSPAGSPTSTEE
AE GSEPATSGSETP
AE GTSESATPESGP
AE GTSTEPSEGSAP
AF GSTSESPSGTAP
AF GTSTPESGSASP
AF GTSPSGESSTAP
AF GSTSSTAESPGP
AG GTPGSGTASSSP
AG GSSTPSGATGSP
AG GSSPSASTGTGP
AG GASPGTSSTGSP
·表示当以不同排列一起使用时产生“家族序列”的独立基序序列
表10：XTEN多肽
94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％至约100％由选自表9的氨基酸序列的四个或更多个非重叠序列基序的多个单元组成。在本段上文所述的实施方案中，可选择并入XTEN中的基序或基序的一部分并使用本文所述的方法进行组装，以获得至少36、至少42、至少72、至少144、至少288、至少576、约864、至少1000、至少1500个氨基酸残基或任何中间长度的XTEN。可用于并入主题组合物的XTEN中的XTEN序列的非限制性实例在表10和表
11中示出。旨在使相对于表10和表11提到的特定序列具有各自表格中所示的序列，而广泛提到AE144序列，例如，意在涵盖任何具有144个氨基酸残基的AE序列，或广泛提到AG864序列，例如，意在涵盖任何具有864个氨基酸残基的AG序列等。
表9：12个氨基酸的XTEN序列基序和基序家族
基序家族* 基序序列
AE GSPAGSPTSTEE
AE GSEPATSGSETP
AE GTSESATPESGP
AE GTSTEPSEGSAP
AF GSTSESPSGTAP
AF GTSTPESGSASP
AF GTSPSGESSTAP
AF GSTSSTAESPGP
AG GTPGSGTASSSP
AG GSSTPSGATGSP
AG GSSPSASTGTGP
AG GASPGTSSTGSP
·表示当以不同排列一起使用时产生“家族序列”的独立基序序列
表10：XTEN多肽
[0243] 在其中XTEN中少于100％的氨基酸由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4、5或6种类型的氨基酸组成，或少于100％的序列由来自表9的序列基序或表10和表12的XTEN序列组成的一些实施方案中，XTEN的其他氨基酸残基选自任何其他14种天然L-氨基酸，但优选地选自亲水性氨基酸，使得XTEN序列含有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％的亲水性氨基酸。除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)之外的单个氨基酸或氨基酸短序列可并入XTEN中以实现所需的性质，如通过所编码的核苷酸允许限制性位点的并入，或通过包含半胱氨酸或赖氨酸氨基酸或引入切割序列促进与有效负载组分的连接。作为下文更充分描述的一个示例性实施方案，XTEN并入1个至约20个、或1个至约15个、或1个至约10个、或1至约5个、或9个、或3个、或2个半胱氨酸残基，或一个半胱氨酸残基，其中反应性半胱氨酸用于与如本文所述的交联体或靶向部分或其他XTEN连接。在这些实施方案中，赖氨酸和/或半胱氨酸残基的并入不另外影响如本文所述的XTEN的潜在性质。具有赖氨酸和/或半胱氨酸残基的前述XTEN的具体实施方案在表11中示出。不是甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的XTEN氨基酸散布于整个XTEN序列中，位于序列基序之内或之间，或者集中于XTEN序列的一个或多个短序列段中，如位于或接近于N末端或C末端。由于疏水性氨基酸向多肽赋予结构，因此本发明提供，用于缀合构建体的XTEN中的疏水性氨基酸的含量通常将会是并入XTEN中的总氨基酸的少于5％、或少于2％、或少于1％。在XTEN的构建中不受青睐的疏水性残基包括色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。此外，可以将XTEN序列设计为含有少于5％或少于4％或少于3％或少于2％或少于1％或不含以下的氨基酸：甲硫氨酸(为了避免氧化)、天冬酰胺和谷氨酰胺(为了避免脱酰胺作用)。在其他实施方案中，缀合构建体中使用的XTEN组分中的甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸含量通常少于5％、或少于2％，并且最优选地少于1％。在其他实施方案中，主题XTEN缀合物的XTEN将会具有这样的序列，该序列具有少于10％的带正电荷的氨基酸残基，或者少于约7％、或少于约5％、或少于约2％的带正电荷的氨基酸残基，甲硫氨酸和色氨酸残基的总数将会是总XTEN序列的少于2％，天冬酰胺和谷氨酰胺残基的总数将会是总XTEN序列的少于5％。
3.半胱氨酸和赖氨酸工程化的XTEN序列
3.半胱氨酸和赖氨酸工程化的XTEN序列
[0244] 在另一方面，本发明提供了用于并入主题组合物中、具有明确数目的并入的半胱氨酸或赖氨酸残基的XTEN，即分别为“半胱氨酸工程化的XTEN”和“赖氨酸工程化的XTEN”。本发明的目的是提供具有明确数目的半胱氨酸和/或赖氨酸残基的XTEN，以允许半胱氨酸的巯基基团或赖氨酸的ε氨基基团与有效负载、靶向部分或将要与工程化的XTEN缀合的交联体上的反应性基团之间的缀合。在前述的一个实施方案中，本发明的赖氨酸工程化的XTEN具有单个赖氨酸残基，优选地位于或接近于XTEN的C末端。在前述的另一个实施方案中，本发明的半胱氨酸工程化的XTEN具有1个至约20个半胱氨酸残基、或约1个至约10个半胱氨酸残基、或约1个至约5个半胱氨酸残基、或1个至约3个半胱氨酸残基、或9个半胱氨酸残基、或3个半胱氨酸残基、或2个半胱氨酸残基，或备选地仅一个半胱氨酸残基。使用前述含赖氨酸和/或半胱氨酸的XTEN实施方案，可以构建包含有效负载、靶向部分、一个或多个XTEN(其可以具有连接的交联体或有效负载或靶向部分)的缀合物，该缀合物用于产生可用于受试者中的疾病治疗的主题靶向缀合物组合物。在一个实施方案中，半胱氨酸工程化的XTEN将会用作骨架载体，使用PCM将会使单个靶向缀合融合蛋白与该骨架载体连接，使得当连接的单个靶向缀合融合蛋白靠近与能够切割PCM的蛋白酶共定位的靶组织时将会被释放。在另一个实施方案中，半胱氨酸工程化的XTEN用于制备携带2、3、4个或更多个与常见交联体连接的XTEN的构型，从而产生多价构建体，以便增加靶向缀合物组合物的总体分子量和大小。将会理解，在主题靶向缀合物组合物中，有效负载、靶向部分或与工程化的XTEN组分连接的另一个XTEN的最大分子数目由赖氨酸、半胱氨酸或具有并入XTEN中的活性侧基团(例如末端氨基或巯基)的其他氨基酸的数目确定。
[0245] 在一个实施方案中，本发明提供了半胱氨酸工程化的XTEN，其中编码XTEN(例如，表10的XTEN)的一种或多种氨基酸的核苷酸被替换成半胱氨酸氨基酸，以产生半胱氨酸工程化的XTEN基因。在另一个实施方案中，本发明提供了半胱氨酸工程化的XTEN，其中编码一个或多个半胱氨酸氨基酸的核苷酸插入XTEN编码基因中，以产生半胱氨酸工程化的XTEN基因。在其他情况下，编码约9个至约14个氨基酸的一种或多种基序、包含编码一个或多个半胱氨酸的密码子的寡核苷酸与编码XTEN基序或全长XTEN的其他寡核苷酸进行框内连接，以产生半胱氨酸工程化的XTEN基因。在前述的一个实施方案中，其中在XTEN基因的产生期间，一个或多个半胱氨酸插入XTEN序列中，可以使用本文所述的方法或通过标准分子生物学技术使编码半胱氨酸的核苷酸与编码用于XTEN的氨基酸的密码子连接，以产生在确定位置处具有半胱氨酸的半胱氨酸-XTEN基序，随后将基序组装成编码全长半胱氨酸工程化的XTEN的基因。在这样的情况下，其中例如，编码单个半胱氨酸的核苷酸加入编码选自表9的基序的DNA，所得基序将会具有13个氨基酸，而并入两个半胱氨酸将会产生具有14个氨基酸的基序等。在其他情况下，半胱氨酸基序可以通过编码半胱氨酸的核苷酸与编码用于XTEN、位于确定位置处的一种或多种氨基酸残基(例如G、S、T、E、P、A)的核苷酸连接而得以从头产生，并具有预定的长度和半胱氨酸氨基酸数目，并且该编码基序随后通过与其他XTEN编码基序序列退火而组装成如本文所述的编码全长XTEN的基因。在使用赖氨酸工程化的XTEN制备本发明的缀合物的情况下，将会用编码赖氨酸而非半胱氨酸的密码子执行上述方法。因此，通过前述方法，可以产生可包含约9-14个氨基酸残基并具有一个或多个反应性氨基酸，即半胱氨酸或赖氨酸的新XTEN基序。适用于含有单个半胱氨酸或赖氨酸的工程化XTEN的基序的非限制性实例为：GGSPAGSCTSP
GASASCAPSTG
TAEAAGCGTAEAA
GPEPTCPAPSG
GGSPAGSKTSP
GASASKAPSTG
然而，本发明考虑到用于并入XTEN中的不同长度的基序。
GASASCAPSTG
TAEAAGCGTAEAA
GPEPTCPAPSG
GGSPAGSKTSP
GASASKAPSTG
然而，本发明考虑到用于并入XTEN中的不同长度的基序。
[0246] 在一个实施方案中，本发明提供了具有单个C末端赖氨酸的XTEN序列，以用于与有效负载、靶向部分或另一个XTEN连接。在另一个实施方案中，本发明提供了具有1个至9个半胱氨酸残基的XTEN，其中该序列具有散布于XTEN长度中的多个半胱氨酸。在编码具有一个或多个半胱氨酸或赖氨酸残基的XTEN的基因由现有XTEN基序或区段构建的情况下，可以通过连接编码短XTEN或长XTEN的现有“结构单元”多核苷酸来设计和构建该基因；现有多核苷酸，例如，AE36、AE48、AE144、AE288、AE432、AE576、AE864、AM48、AM875、AE912、AG864，可与编码含半胱氨酸和/或含赖氨酸的基序的核苷酸进行框内融合，或者备选地，可以使用常规PCR方法或如本文所述的方法对编码半胱氨酸和/或赖氨酸的核苷酸PCR到编码XTEN序列的现有基因中。例如，当用编码一个或多个反应性半胱氨酸或赖氨酸残基的核苷酸修饰现有的全长XTEN基因时，可以产生编码半胱氨酸或赖氨酸的寡核苷酸，并且该寡核苷酸展现出与一个或多个XTEN短序列的部分同源性并可与其杂交，从而导致XTEN基因现有密码子的半胱氨酸或赖氨酸密码子的重组事件和置换。可将编码半胱氨酸或赖氨酸的寡核苷酸设计成在沿着已知XTEN序列的不同位点处与给定的序列区段杂交，以允许它们向XTEN编码基因中的插入。因此，本发明考虑到，可以通过选择XTEN序列内的限制性位点并设计适用于给定位置且编码半胱氨酸或赖氨酸的寡核苷酸，包括使用导致在相同XTEN序列中多次插入的设计的寡核苷酸，利用插入XTEN序列内不同位置处的半胱氨酸或赖氨酸来产生多个XTEN基因构建体。通过考虑XTEN已知序列的一种或多种这样的寡核苷酸的设计和选择以及本发明方法的合理使用，可对插入全长XTEN中的置换的反应性半胱氨酸或赖氨酸残基的潜在数目进行估计，然后通过对所得到的XTEN基因进行测序来确认该数目。
[0247] 在表11中提供了半胱氨酸和赖氨酸工程化的XTEN的非限制性实例。因此，在一个实施方案中，本发明提供了XTEN序列，其在最佳比对时具有与选自表11序列的序列或片段至少约80％的序列同一性、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的序列同一性或与选自表11序列的序列或片段相同。然而，应用半胱氨酸或赖氨酸工程化方法来产生包含半胱氨酸或赖氨酸残基的XTEN并不意味着被限制于前述实施方案的精确组成或组成特征的范围内。如本领域技术人员将会理解的，在不脱离所述发明的情况下，可以改变XTEN中并入的半胱氨酸或赖氨酸残基的精确位置和数目。
表11：半胱氨酸和赖氨酸工程化的XTEN
表11：半胱氨酸和赖氨酸工程化的XTEN
[0248] 在另一方面，本发明提供了若干确定长度的XTEN连接体，其含有被设计成在靶向部分的C末端处并入融合蛋白中的单个半胱氨酸残基，以允许交联体和所得TM-连接体与CCD的N末端、XTEN的N末端或表11中半胱氨酸工程化的XTEN的半胱氨酸残基缀合。用于靶向部分与CCD或与其他XTEN(因此，其作为连接体的作用)缀合的反应性巯基的引入允许替代方案以产生单一融合蛋白，该融合蛋白包含与主题靶向缀合物组合物的多肽组分即CCD、PCM和XTEN融合的靶向部分。在一些情况下，将XTEN连接体设计成具有H8标签，以允许在组合物的加工期间回收靶向部分-连接体融合蛋白。在表12中提供了XTEN连接体的非限制性实例，并在下文的实施例中列出了包含这类靶向部分-连接体的示例性靶向缀合构建体。表12：含半胱氨酸的连接体
[0249] 本发明的设计、选择和制备方法能够产生与亲电官能团反应的工程化XTEN。制备本文提供的主题缀合物的方法能够产生靶向缀合物组合物，其中有效负载或靶向部分分子以定量方式在指定位点处加入。如下文更充分地描述的，有效负载、靶向部分和其他XTEN可以位点特异性地且有效地连接至CCD、XTEN的N末端或C末端，具有巯基反应性试剂的半胱氨酸工程化XTEN，或具有胺反应性试剂的本发明的赖氨酸工程化XTEN，以及CCD或XTEN的N末端α氨基基团，然后使用例如实施例中更具体描述的非限制性方法进行纯化和表征。4.序列的长度
[0250] 在另一方面，本发明提供了用于并入组合物中的不同长度的XTEN，其中基于在组合物中要获得的性能或功能来选择XTEN序列的长度。例如，XTEN被用作组合物中的载体，本发明利用了以下发现：增加非重复性、非结构化多肽的长度增强了XTEN的非结构化性质，并相应地增强了包含XTEN载体的构建体的物理化学和药代动力学性质。通常，并入组合物中、作为单体或作为具有约400个残基的较长累计长度的多聚体的XTEN产生与较短的累计长度(例如短于约280个残基)相比更长的半衰期。如实施例中更充分描述的，即使是由重复次序的单一家族序列基序(例如，表9中的四个AE基序)构建的，XTEN的长度的成比例增加也产生这样的序列：与较短的XTEN长度相比，如通过GOR算法所确定的，具有更高比例的无规卷曲形成，或者如通过Chou-Fasman算法所确定的，具有减少的α-螺旋或β-折叠含量。此外，如实施例中所述，增加非结构化多肽融合配偶体的长度产生了与具有较短序列长度的非结构化多肽配偶体的多肽相比终末半衰期不成比例增加的构建体。在XTEN主要作为载体的一些实施方案中，本发明涵盖包含两个、三个、四个或多个XTEN的靶向缀合物组合物，其中XTEN蛋白的累计XTEN序列长度大于约100、200、400、500、600、800、900或1000至约3000个氨基酸残基，其中当施用至受试者时，该构建体与未连接至XTEN并以可比剂量施用的有效负载相比展现出增强的药代动力学性质。在前述的一个实施方案中，两个或更多个XTEN序列各自展现出与选自表10、表11中任何一个的序列的至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％或更大的同一性，并且其余载体序列(如果有的话)包含至少90％的亲水性氨基酸，并且少于约2％的总序列由疏水性或芳香性氨基酸或半胱氨酸组成。下文更加充分地描述了与未连接至组合物的有效负载相比靶向缀合物组合物的增强的药代动力学性质。
5.净电荷
5.净电荷
[0251] 在其他实施方案中，XTEN多肽具有通过并入氨基酸残基而赋予的非结构化特征，该氨基酸残基具有净电荷，并且在该XTEN序列中包含低百分比的或不包含疏水性氨基酸。总净电荷和净电荷密度通过改变XTEN序列中带电(正或负)氨基酸的含量来控制，其中净电荷通常表示为多肽中对带电状态作出贡献的氨基酸超出那些被具有相反电荷的残基所抵消的残基的百分比。在一些实施方案中，缀合物的XTEN的净电荷密度可能高于+0.1或低于-
0.1电荷/残基。本文的蛋白质或肽的“净电荷密度”是指净电荷除以蛋白质中氨基酸的总数。在其他实施方案中，XTEN的净电荷可以是约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约
6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约
17％、约18％、约19％或约20％或更多。基于该净电荷，一些XTEN具有1.0、1.5、2.0、2.5、
3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或者甚至6.5的等电点(pI)。在一个实施方案中，XTEN将具有1.5-4.5的等电点并且在生理条件下携带净负电荷。
0.1电荷/残基。本文的蛋白质或肽的“净电荷密度”是指净电荷除以蛋白质中氨基酸的总数。在其他实施方案中，XTEN的净电荷可以是约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约
6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约
17％、约18％、约19％或约20％或更多。基于该净电荷，一些XTEN具有1.0、1.5、2.0、2.5、
3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或者甚至6.5的等电点(pI)。在一个实施方案中，XTEN将具有1.5-4.5的等电点并且在生理条件下携带净负电荷。
[0252] 由于人或动物的大部分组织和表面具有净负电荷，在一些实施方案中将XTEN序列设计为具有使含有组合物的XTEN与多种表面如血管、健康组织或多种受体之间的非特异性相互作用最小化的净负电荷。不受特定理论的束缚，由于单独携带净负电荷并且分布于整个XTEN多肽序列的XTEN多肽氨基酸之间的静电排斥，XTEN可以采用开放构象。在一些实施方案中，将XTEN序列设计为具有由其他不带电荷的残基如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸或甘氨酸分开的至少90％至95％的带电残基，这导致电荷更均匀的分布、更好的表达或纯化行为。净负电荷在XTEN的延伸的序列长度上的这种统一分布还有助于多聚体非结构化构象，转而可导致流体动力学半径的有效增大。在优选的实施方案中，通过并入谷氨酸残基来赋予主题XTEN以负电荷。通常，在整个XTEN序列上谷氨酸残基被均匀地间隔开。在一些情况下，XTEN可含有约10-80、或约15-60、或约20-50个谷氨酸残基/20kDa XTEN，这可以导致XTEN具有将具有非常相似的pKa的带电残基，这可增加产物的电荷均匀性并锐化其等电点，增强得到的靶向缀合物组合物的物理化学性质，以便并因此简化纯化程序。例如，在需要具有负电荷的XTEN时，XTEN可仅选自AE家族序列，由于并入的谷氨酸，其具有大约17％的净电荷，或可包括不同比例的表9中含有谷氨酸的基序以提供期望程度的净电荷。在一个实施方案中，可对表10的XTEN序列进行修饰以包括谷氨酸残基，从而获得期望的净负电荷。因此，在一个实施方案中，本发明提供了XTEN，其中所述XTEN序列含有约1％、2％、4％、8％、10％、15％、17％、20％、25％或甚至约30％的谷氨酸。在一些情况下，XTEN可含有约10-80、或约
15-60、或约20-50个谷氨酸残基/20kDa XTEN，这可以导致XTEN具有将具有非常相似的pKa的带电残基，这可增加产物的电荷均匀性并锐化其等电点，增强得到的XTEN缀合物组合物的物理化学性质，以便并因此简化纯化程序。在一个实施方案中，本发明涉及除谷氨酸之外还将高达5％的天冬氨酸残基并入XTEN中以便得到净负电荷。
15-60、或约20-50个谷氨酸残基/20kDa XTEN，这可以导致XTEN具有将具有非常相似的pKa的带电残基，这可增加产物的电荷均匀性并锐化其等电点，增强得到的XTEN缀合物组合物的物理化学性质，以便并因此简化纯化程序。在一个实施方案中，本发明涉及除谷氨酸之外还将高达5％的天冬氨酸残基并入XTEN中以便得到净负电荷。
[0253] 不受特定理论的束缚，期望具有较高净负电荷的靶向缀合物组合物的XTEN与多种带负电的表面如血管、组织或多种受体具有较少的非特异性相互作用，这将进一步有助于降低主动清除率。相反，据认为具有低(或无)净电荷的靶向缀合物组合物的XTEN将与可增强血管或组织中相关缀合物活性的表面具有较高程度的相互作用。
[0254] 在期望无净电荷的其他实施方案中，XTEN可选自例如AGXTEN组分，如表9的不具有净电荷的AG基序。在另一个实施方案中，XTEN可包含不同比例的AE和AG基序，以便具有对于给定用途而言被认为是最佳的或维持给定物理化学性质的净电荷。
[0255] 本发明的组合物的XTEN通常没有或具有低含量的带正电氨基酸。在一些实施方案中，XTEN可具有少于约5％、或少于约2％、或少于约1％的带正电荷的氨基酸残基。然而，本发明涉及这样的构建体：其中将限定数目的带正电荷的氨基酸如赖氨酸并入XTEN中，以允许赖氨酸的ε胺与将缀合至XTEN骨架的有效负载或交联体上的反应性基团之间缀合。在前述的一个实施方案中，主题缀合物的XTEN具有约1至约10个赖氨酸残基，或约1至约5个赖氨酸残基，或约1至约3个赖氨酸残基，或备选地仅单个赖氨酸残基。使用前述含有赖氨酸的XTEN，可以构建包含在受试者病状的治疗中有用的靶向部分或有效负载的缀合物，其中与XTEN组分连接的有效负载剂的分子的最大数目取决于并入XTEN中的、具有反应侧基团(例如，末端胺)的赖氨酸的数目。6.低免疫原性
[0256] 在另一方面，本发明提供了具有低程度的免疫原性或基本上无免疫原性的XTEN组合物。几种因素可导致XTEN的低免疫原性，例如，非重复序列、非结构化构象、高度溶解度、低程度的或缺乏自聚集、序列中低程度的或缺乏蛋白水解位点和XTEN序列中低程度的或缺乏表位。
[0257] 构象表位是由蛋白质抗原的多种不连续的氨基酸序列构成的蛋白质表面的区域所形成的。蛋白质的精确折叠使这些序列成为可被宿主体液免疫系统识别为“外源物”的定义明确的、稳定的空间构型或表位，从而导致蛋白质的抗体的产生或细胞介导的免疫应答的激活。在后一种情况下，个体中对蛋白质的免疫应答深受T细胞表位识别的影响，T细胞表位识别是该个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性的功能。MHC II类肽复合物通过T细胞表面上的同源T细胞受体的结合以及某些其他共受体如CD4分子的交叉结合可诱导T细胞中的激活状态。激活导致细胞因子的释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞以产生抗体或作为完全的细胞免疫应答激活T杀伤细胞。
[0258] 肽结合给定的MHC II类分子以便在APC(抗原呈递细胞)表面上呈递的能力取决于许多因素；最重要的是其一级序列。在一个实施方案中，通过设计抵抗在抗原呈递细胞中的抗原加工的XTEN序列和/或选择不能良好结合MHC受体的序列而获得较低程度的免疫原性。本发明提供了基本上非重复性的XTEN多肽，其设计用于降低与MHC II受体的结合，以及避免针对T细胞受体或抗体结合的表位的形成，从而导致低程度的免疫原性。避免免疫原性可至少部分地有助于XTEN序列的构象柔性的结果；即，由于氨基酸残基的选择和次序而缺乏二级结构。例如，特别感兴趣的是在可导致构象表位的水溶液中或生理条件下采取紧密折叠构象的倾向较低的序列。使用常规治疗实践和剂量施用包含XTEN的多肽通常不会导致XTEN序列的中和抗体的形成，并且也降低了缀合物中有效负载的免疫原性。
[0259] 在一个实施方案中，在主题多肽中采用的XTEN序列可基本上没有被人类T细胞识别的表位。先前已公开了出于产生较低免疫原性的蛋白质的目的而对此类表位的消除；参见，例如WO 98/52976、WO 02/079232和WO 00/3317，将这些参考通过引用并入。已公开了对人类T细胞表位的分析(Stickler,M.等(2003)J Immunol Methods,281:95-108)。特别感兴趣的是能够寡聚体化而不产生T细胞表位或非人类序列的肽序列。这如下实现：测定这些序列的同向重复的T细胞表位的存在和6-聚体至15-聚体特别是9-聚体非人类序列的出现，然后改变对XTEN序列的设计以消除或破坏表位序列。在一些实施方案中，通过限制预测能结合MHC受体的XTEN的表位的数量，XTEN序列基本上是无免疫原性的。随着能够结合至MHC受体的表位的数量的降低，T细胞激活的能力以及T细胞辅助功能伴随降低，B细胞激活或上调降低以及抗体产生减少。低程度的预测的T细胞表位可通过表位预测算法，例如TEPITOPE(Sturniolo,T.等(1999)Nat Biotechnol,17:555-61)来确定。蛋白质中给定的肽框架的TEPITOPE评分为将该肽框架结合至多种最常见的人类MHC等位基因的Kd的log值(离解常数，亲和力，解离速率)，如在Sturniolo,T.等(1999)Nature Biotechnology 17:555)中所公开的。评分范围在至少20个logs个，从约10至约-10(相当于10e10Kd至10e-10Kd的结合约束)，并且通过避免在MHC上展示肽的过程中充当锚定残基的疏水性氨基酸如M、I、L、V、F而可以降低。在一些实施方案中，并入靶向缀合物组合物中的XTEN组分在约-5、或-6、或-7、或-8、或-9的TEPITOPE阈值评分时或在-10的TEPITOPE评分时不具有预测的T细胞表位。如本文所用的，评分“-9”是比评分-5更严格的TEPITOPE阈值。7.增加的流体动力学半径
[0260] 在另一方面，可用作融合配偶体的主题XTEN具有高流体动力学半径；与没有XTEN的有效负载相比，该性质赋予靶向缀合物组合物相应增加的表观分子量。如实施例44中所述的，XTEN与治疗性蛋白质序列的连接产生了组合物，与不连接至XTEN的治疗性蛋白质相比，该组合物可具有增加的流体动力学半径、增加的表观分子量和增加的表观分子量因子。例如，在需要延长半衰期的治疗性应用中，具有高流体动力学半径的一种或多种XTEN与靶向缀合物组合物融合或连接的组合物可有效地增大组合物的流体动力学半径以超过大约
3 - 5 n m 的 肾 小 球 孔 隙 大 小 ( 相 当 于 约 7 0 k D a 的 表 观 分 子 量 )(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly
(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277)，从而导致循环蛋白质的肾清除率降低，而终末半衰期相应延长以及其他增强的药代动力学性质。
蛋白质的流体动力学半径由其分子量以及其结构(包括形状或致密度)提供。不受特定理论的束缚，由于XTEN中并入的带电荷残基的个体电荷之间的静电排斥以及由于由缺乏赋予二级结构的潜能的序列中特定氨基酸所赋予的内在柔性，XTEN可采取开放构象。XTEN多肽的开放的、延伸的和非结构化的构象，与具有二级结构或三级结构的可比序列长度和/或分子量的多肽如典型的球状蛋白质相比，具有更大比例的流体动力学半径。测定流体动力学半径的方法是本领域熟知的，例如通过使用尺寸排阻色谱法(SEC)，如美国专利号6,406,632和7,294,513所述。实施例51表明，XTEN长度的增加导致与其附接的蛋白质(包括scFv)的流体动力学半径、表观分子量和/或表观分子量因子成比例增加，从而允许使靶向缀合物组合物适应表观分子量或流体动力学半径的期望截止值。因此，在某些实施方案中，靶向缀合物组合物可配置为具有XTEN，使得所得组合物可具有至少约5nm、或至少约8nm、或至少约
10nm、或约12nm、或约15nm、或约20nm、或约30nm或更大的流体动力学半径。如实施例44中详述的，例如，与具有288、576或864个氨基酸残基的XTEN(没有CCD和PCM的其他组分)直接连接的抗Her2的scFv导致测定的流体动力学半径为6.7、8.6和9.9；所有这些半径都大于已知的肾小管孔径。在前述的实施方案中，由靶向缀合物组合物中的XTEN所赋予的大的流体动力学半径可导致得到的缀合物的清除率的降低，终末半衰期的延长，和平均滞留时间的增加。如实施例中所描述的，当含XTEN的组合物的分子量由尺寸排阻色谱法分析获得时，XTEN的开放构象由于低程度的二级结构而导致并入了XTEN的缀合物的表观分子量的增加。如下文更充分描述的且如附图所示，在一个实施方案中，本发明利用这样的发现：不仅可以通过以线性方式或作为三聚体或四聚体的分支构型连接给定长度的单个XTEN，而且可以通过连接成比例更短长度的2、3、4个或更多个XTEN来实现表观分子量的增加。在一些实施方案中，包含有效负载和一个或多个XTEN的XTEN展现出至少约400kDa、或至少约500kDa、或至少约
700kDa、或至少约1000kDa、或至少约1400kDa、或至少约1600kDa、或至少约1800kDa、或至少约2000kDa的表观分子量。因此，靶向缀合物组合物展现出为该组合物的实际分子量的约
1.3倍、约2倍、或约3倍、或约4倍、或约8倍、或约10倍、或约12倍、或约15倍、或约20倍的表观分子量。在一个实施方案中，任何本文公开的实施方案的分离的靶向缀合物组合物在生理条件下展现出大于约1.3、或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7、或约8、或约10、或大于约15的表观分子量因子。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在生理条件下相对于该组合物的实际分子量具有约3至约20、或约5至约15、或约8至约12、或约9至约10的表观分子量因子。通常，主题靶向缀合物组合物的表观分子量的增加通过因素的组合增强了该组合物的药代动力学性质，这些因素包括降低的活性清除率、降低的肾清除率以及减少的通过毛细血管和静脉结的损失。
8.用于增加XTEN表达的组合物
3 - 5 n m 的 肾 小 球 孔 隙 大 小 ( 相 当 于 约 7 0 k D a 的 表 观 分 子 量 )(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly
(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277)，从而导致循环蛋白质的肾清除率降低，而终末半衰期相应延长以及其他增强的药代动力学性质。
蛋白质的流体动力学半径由其分子量以及其结构(包括形状或致密度)提供。不受特定理论的束缚，由于XTEN中并入的带电荷残基的个体电荷之间的静电排斥以及由于由缺乏赋予二级结构的潜能的序列中特定氨基酸所赋予的内在柔性，XTEN可采取开放构象。XTEN多肽的开放的、延伸的和非结构化的构象，与具有二级结构或三级结构的可比序列长度和/或分子量的多肽如典型的球状蛋白质相比，具有更大比例的流体动力学半径。测定流体动力学半径的方法是本领域熟知的，例如通过使用尺寸排阻色谱法(SEC)，如美国专利号6,406,632和7,294,513所述。实施例51表明，XTEN长度的增加导致与其附接的蛋白质(包括scFv)的流体动力学半径、表观分子量和/或表观分子量因子成比例增加，从而允许使靶向缀合物组合物适应表观分子量或流体动力学半径的期望截止值。因此，在某些实施方案中，靶向缀合物组合物可配置为具有XTEN，使得所得组合物可具有至少约5nm、或至少约8nm、或至少约
10nm、或约12nm、或约15nm、或约20nm、或约30nm或更大的流体动力学半径。如实施例44中详述的，例如，与具有288、576或864个氨基酸残基的XTEN(没有CCD和PCM的其他组分)直接连接的抗Her2的scFv导致测定的流体动力学半径为6.7、8.6和9.9；所有这些半径都大于已知的肾小管孔径。在前述的实施方案中，由靶向缀合物组合物中的XTEN所赋予的大的流体动力学半径可导致得到的缀合物的清除率的降低，终末半衰期的延长，和平均滞留时间的增加。如实施例中所描述的，当含XTEN的组合物的分子量由尺寸排阻色谱法分析获得时，XTEN的开放构象由于低程度的二级结构而导致并入了XTEN的缀合物的表观分子量的增加。如下文更充分描述的且如附图所示，在一个实施方案中，本发明利用这样的发现：不仅可以通过以线性方式或作为三聚体或四聚体的分支构型连接给定长度的单个XTEN，而且可以通过连接成比例更短长度的2、3、4个或更多个XTEN来实现表观分子量的增加。在一些实施方案中，包含有效负载和一个或多个XTEN的XTEN展现出至少约400kDa、或至少约500kDa、或至少约
700kDa、或至少约1000kDa、或至少约1400kDa、或至少约1600kDa、或至少约1800kDa、或至少约2000kDa的表观分子量。因此，靶向缀合物组合物展现出为该组合物的实际分子量的约
1.3倍、约2倍、或约3倍、或约4倍、或约8倍、或约10倍、或约12倍、或约15倍、或约20倍的表观分子量。在一个实施方案中，任何本文公开的实施方案的分离的靶向缀合物组合物在生理条件下展现出大于约1.3、或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7、或约8、或约10、或大于约15的表观分子量因子。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物在生理条件下相对于该组合物的实际分子量具有约3至约20、或约5至约15、或约8至约12、或约9至约10的表观分子量因子。通常，主题靶向缀合物组合物的表观分子量的增加通过因素的组合增强了该组合物的药代动力学性质，这些因素包括降低的活性清除率、降低的肾清除率以及减少的通过毛细血管和静脉结的损失。
8.用于增加XTEN表达的组合物
[0261] 在另一方面，本发明提供了包含编码主题构建体的融合蛋白的多核酸序列的构建体和制备构建体的方法，其中将额外的编码多核苷酸的辅助序列加入编码该融合蛋白的多核苷酸的5'端或加入编码主题组合物融合蛋白部分的序列的5'端，以增强并促进该融合蛋白在转化的宿主细胞如细菌中的表达。在表13和实施例中给出了这样的编码辅助序列的实例。在一个实施方案中，本发明提供了包含辅助序列的编码多肽的多核苷酸序列构建体，该辅助序列与选自表13的序列具有至少约90％的序列同一性，与本文所述靶向缀合物组合物的融合蛋白部分的N末端连接。本发明提供了编码构建体的表达载体，该构建体可用于以高表达水平产生基本上均质的多肽和XTEN制剂的方法中。在一些实施方案中，本发明提供了用于产生包含靶向缀合物组合物的融合蛋白部分的、基本上均质的多肽群体的方法，该方法包括在有效表达多肽，使得当发酵反应在600nm的波长下达到至少130的光密度时，大于约2g/L、或大于约3g/L、或大于约4g/L、或大于约5g/L、或大于约6g/L、或大于约7克/升(7g/L)的多肽作为宿主细胞的粗表达产物的组分得以产生的条件下，在发酵反应中培养包含载体的宿主细胞，该载体编码包含与融合蛋白序列融合的辅助序列的多肽(其中辅助序列与表13所示的序列具有至少90％的序列同一性)。在一个实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：在将多肽的亲和标签有效捕获到色谱基底上的条件下，使多肽吸附到第一色谱基底上；洗脱并回收多肽；在将多肽的第二亲和标签(如果存在)有效捕获到色谱基底上的条件下，使多肽吸附到第二色谱基底上；洗脱多肽；以及回收基本上均质的多肽制剂。在其他实施方案中，本发明提供了用于产生基本上均质的多肽群体的方法，该多肽包含本文所述主题组合物的融合蛋白以及第一和第二亲和标签以及辅助序列，该方法包括在当发酵反应在600nm的波长下达到至少130的光密度时，有效表达多肽产物的浓度大于约10毫克/克干重宿主细胞(mg/g)、或至少约15mg/g、或至少约20mg/g、或至少约25mg/g、或至少约30mg/g、或至少约40mg/g、或至少约50mg/g的条件下，在发酵反应中培养包含载体的宿主细胞，该载体编码包含XTEN以及第一和第二亲和标签的多肽。在前述的一个实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：在将多肽的第一亲和标签有效捕获到色谱基底上的条件下，使多肽吸附到第一色谱基底上；洗脱并回收多肽；在将多肽的第二亲和标签有效捕获到色谱基底上的条件下，使多肽吸附到第二色谱基底上；洗脱多肽；以及回收基本上均质的多肽制剂。
表13：在细菌中促进蛋白质表达、分泌和加工的辅助序列的实例
氨基酸序列*
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IV).有效负载
表13：在细菌中促进蛋白质表达、分泌和加工的辅助序列的实例
氨基酸序列*
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IV).有效负载
[0262] 本发明部分地涉及包含一种或多种有效负载分子的靶向缀合物组合物。考虑到，主题组合物可连接至广泛的多种有效负载分子，包括生物活性肽、蛋白质、药理活性小分子和成像小分子有效负载，以及这些类型有效负载的组合，从而产生具有1、2、3、4种或更多类型的有效负载的组合物。更具体地，活性有效负载可以落入多种结构类别中的一种，包括但不限于小分子药物、生物活性蛋白质(肽、多肽、蛋白质、重组蛋白、抗体和糖蛋白)、类固醇等。在一些实施方案中，本发明满足了在增加外源施用的治疗和诊断性有效负载的终末半衰期方面的长期需求，以及改善治疗指数并减少由这些有效负载对有需要的受试者的健康组织造成的副作用和损伤方面的长期需求。
[0263] 用于与本发明主题组合物连接的药理活性有效负载剂的功能类别的非限制性实例可以是以下任何一种或多种：抗炎剂、抗癌剂、细胞毒性药物、肿瘤剂、抗肿瘤剂、诊断剂、造影剂和放射性成像剂。在一些优选的实施方案中，有效负载是细胞毒性剂或抗癌剂，包括但不限于选自表14-17所示药物的一种或多种药物和/或生物制剂。在其他优选的实施方案中，有效负载是抗炎剂，包括但不限于选自表17所示药物的一种或多种药物。
[0264] 对于靶向缀合物组合物，特别考虑到，有效负载可以是拥有合适的反应性官能团(包括但不限于天然氨基、巯基、羧基、醛基、酮基、烯基、炔基、叠氮基、醇基、杂环)的药理活性剂，或备选地，可以使用本文所述的或本领域已知的可用于缀合此类反应性基团的任何缀合方法将有效负载修饰成含有适合与本发明的XTEN、XTEN-交联体或或XTEN-点击化学反应物缀合的前述反应性基团中的至少一种。具体的功能部分及其反应性描述于Organic Chemistry,第二版,Thomas Sorrell,University Science Books,Herndon,VA(2005)。此外，将会理解，含有反应性基团或被修饰成含有反应性基团的任何有效负载也将会在缀合之后含有与XTEN、XTEN-交联体或XTEN-点击化学反应物连接的残基。
[0265] 适用于同XTEN聚合物、XTEN-交联体或XTEN-点击化学反应物共价连接的示例性有效负载包括具有活性的生物活性蛋白质和药理活性小分子药物。适用于本发明组合物的示例性药物可在如美国官方药典、美国官方顺势疗法药典或官方国家处方集、医师案头参考(PDR)和由美国食品药品监督管理局(FDA)维护的橙皮书中所示的药物中找到。优选的药物是具有所需反应官能团的那些药物，或可被容易地衍生化以提供用于缀合的反应官能团并且当与XTEN缀合时将会保留未缀合有效负载的至少一部分药理活性的那些药物。1.作为有效负载的药物
[0266] 在本发明的一个方面，用于与本文所述的CCD缀合的靶向缀合物组合物的药物有效负载是本文所述的一种或多种药剂，或选自表14-17所示化合物的一种或多种药物或生物制剂，或药学上可接受的盐、酸或其衍生物或激动剂。在一个实施方案中，有效负载是选自表15所示药物的一种或多种细胞毒性剂。在一个实施方案中，用于并入靶向缀合物组合物种的有效负载是选自表17所示药物的一种或多种抗炎剂。在另一个实施方案中，有效负载是选自表16所示生物制剂的一种或多种生物药剂。在一些实施方案中，药物被衍生化以引入用于与本文所述的主题XTEN、XTEN-交联体或XTEN-点击化学反应物缀合的反应性基团。在另一个实施方案中，用于缀合的药物被衍生化以引入可切割的连接体，诸如但不限于缬氨酸-瓜氨酸-PAB，其中连接体在施用于受试者之后能够被循环蛋白酶或细胞内蛋白酶切割，从而从缀合物中释放药物有效负载。表14：用于与XTEN缀合的药物有效负载
表15：作为有效负载与XTEN缀合的细胞毒性药物
表16：作为有效负载与XTEN连接的生物活性蛋白质
表17：作为有效负载与XTEN缀合的抗炎性药物
2.作为有效负载的核酸
表15：作为有效负载与XTEN缀合的细胞毒性药物
表16：作为有效负载与XTEN连接的生物活性蛋白质
表17：作为有效负载与XTEN缀合的抗炎性药物
2.作为有效负载的核酸
[0267] 本发明还考虑在XTEN缀合物中使用核酸作为有效负载。在一个实施方案中，本发明提供了靶向缀合物组合物，其中有效负载选自适体、反义寡核苷酸、核酶核酸、RNA干扰核酸和反义基因核酸。用作治疗剂的此类核酸在本领域中是已知的(Edwin Jarald,Nucleic acid drugs:a novel approach.African Journal of Biotechnology Vol.3(12):662-666,2004；Joanna B.Opalinska.Nucleic-acid therapeutics:basic principles and recent applications.Nature Reviews Drug Discovery 1:503-514,2002)。
Ⅴ).靶向部分和制备此类组合物的方法
1.作为靶向部分的抗体片段
Ⅴ).靶向部分和制备此类组合物的方法
1.作为靶向部分的抗体片段
[0268] 本发明部分地涉及包含靶向部分(TM)的靶向缀合物组合物，该靶向部分包含抗体或衍生自与一种或多种延伸重组多肽(“XTEN”)重组融合或化学缀合的抗体的抗体片段。特别地，本发明提供了分离的靶向缀合物组合物，其包含可用于疾病、病症或病况治疗的TM，其中靶向部分可以针对参与、关联或调节疾病、病症或病况的抗原、配体或受体，而XTEN载体部分可被设计成通过如上文更充分描述的靶向缀合物组合物上的有效负载组分赋予期望的半衰期或增强的药物性质。在一个实施方案中，该组合物可进一步包含可以对相同或不同靶标具有结合亲和力的第二靶向部分或多个靶向部分，从而分别产生多价或多特异性靶向部分。本发明提供了靶向部分和XTEN的几种不同形式和构型。本文公开的实施方案的靶向缀合物组合物展现出如本文详述的性质和/或实施方案的一种或多种或任意组合。
[0269] 通常，当在体内使用或当用于体外分析时，主题靶向缀合物组合物的靶向部分对给定的靶组织或细胞展现出结合特异性。可将包含两个或更多个靶向部分的主题靶向缀合物组合物设计成通过选择性并入对相应结合位点具有结合亲和力的靶向部分来结合相同靶表位、相同靶标上的不同表位或不同靶标。
[0270] 主题靶向缀合物组合物的靶向部分可以针对的靶标包括细胞因子、细胞因子相关蛋白质、细胞因子受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞表面受体或抗原、激素或类似的循环蛋白质或肽、寡核苷酸、或酶底物、或小有机分子、半抗原或药物。靶标通常与疾病、病症或病况相关。如本文所使用的，“与疾病、病症或病况相关的靶标”意指靶标由病变细胞或不健康组织表达或过表达，该靶标导致疾病、病症或病况或是其介质或副产物，或者与健康组织或受试者相比，通常在患有疾病、病症或病况的受试者中以更高的浓度发现靶标，或者在受试者的疾病、病症或病况区域内或附近以比基线浓度更高的浓度发现靶标。虽然相比于正常组织，在病变组织中存在任何过量或定量，靶标也可以是与疾病、病症或病况相关的特征性表位、配体或化学实体(例如EGFR VIII变体)。前述的非限制性实例是靶标HER2，其由于HER2/neu基因的扩增或其蛋白质产物的过表达而与约30％的乳腺癌相关。HER2受体在乳腺癌中的过表达与增加的疾病复发和不良预后相关，并且人源化抗Her2/neu抗体用于治疗表达HER2受体的乳腺癌(参见例如美国专利号4,753,894)。
[0271] 在一个实施方案中，靶向缀合物组合物的一个或多个靶向部分可对一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)或者已知在肿瘤或癌细胞上表达或另外与肿瘤或癌症相关的配体具有结合亲和力。肿瘤相关抗原是本领域已知的，并且通常被视为癌症诊断和治疗的有效细胞靶标。特别地，研究人员试图鉴定TAA，与一种或多种正常非癌细胞相比，TAA在一种或多种特定类型的癌细胞表面上特异性表达，并且产生经由基于抗体的疗法特异性靶向癌细胞进行破坏的能力。在一个实施方案中，靶向缀合物组合物的一个或多个靶向部分对选自但不限于表2、表3、表4或表18靶标的靶标和配体具有结合亲和力。
[0272] 如下文更充分描述的，靶向部分可以衍生自或基于抗体、抗体片段、受体、免疫球蛋白样结合结构域、肽、适体的序列，或者可以是完全合成的。在一些实施方案中，靶向部分是非蛋白质的；其非限制性实例在本文提供。靶向部分可以包含一个或多个功能性抗原结合位点，后者使靶向部分具有“多特异性”。靶向部分的“抗原结合位点”是能够以亲本抗体或受体(抗原结合位点衍生于此)结合亲和力的至少一部分结合靶抗原的部分。抗原结合位点本身可由不止一个结合结构域组成，这些结合结构域在靶向部分中连接在一起。“结合结构域”意指能够与抗原或配体附接但可能需要其他结合结构域来实际结合和/或螯合该抗原或配体的多肽序列。来自抗体的CDR是结合结构域的实例。在整个说明书中将“抗体”用作靶向部分(TM)的典型实例，但并非意在限制。
[0273] 测量本发明靶向缀合物组合物的结合亲和力和/或其他生物活性的方法可以是本文公开的那些方法或本领域通常已知的方法。此外，可以测量靶向部分的物理化学性质以确定靶标结合程度、溶解度、结构和稳定性的保留。进行测定以便允许确定靶向部分对于靶标的结合特征，包括结合解离常数(Kd、Kon和Koff)、配体-受体复合物的解离半衰期，以及靶向部分改变与游离靶标相比的所结合靶标的生物活性的活性(IC50值)。如本文使用的术语“Kd”意在表示本领域已知的特定抗体-抗原相互作用的解离常数，并且将会用作靶向部分与其同源配体的结合亲和力的参数，以用于主题组合物。如本文所使用的术语“Kon”意在表示如本领域已知的抗体与抗原结合形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。如本文所使用的术语“Koff”意在表示如本领域已知的抗体从抗体/抗原复合物上解离的解离速率常数。术语“IC50”是指抑制配体激动剂最大生物应答的一半所需的浓度，并且通常通过竞争结合测定来确定。
[0274] 诸如流式细胞术或表面等离子体共振等技术可用于检测结合事件。测定可以包含可溶性抗原或受体分子，或者可以确定与细胞表达受体的结合。这样的测定可以包括基于细胞的测定，包括用于增殖、细胞死亡、细胞凋亡和细胞迁移的测定。可以使用结合或竞争性结合测定，如采用芯片结合受体或靶向部分的BiacoreTM测定，或如美国专利5,534,617中所述的ELISA测定，本文实施例中描述的测定、放射性受体测定或本领域已知的其他测定来测定主题组合物对靶配体的结合亲和力。然后可以使用标准方法，如由Zoelen等人,Trends Pharmacol Sciences(1998)19)12):487所述的斯卡查德(Scatchard)分析，或本领域已知的其他方法来确定结合亲和力常数。此外，可以使用竞争性ELISA结合测定将靶向部分的序列变体的文库与相应的天然或亲本抗体进行比较，以确定这些变体是否与亲本抗体或其一些部分具有相同的结合特异性和亲和力，使得这些抗体适用于包含在靶向部分中。这样的测定的结果可用于对靶向部分进行序列修饰，随后进行结合和物理化学表征测定的反复过程，以指导选择具有所需性质的特定构建体的过程。
[0275] 本发明提供了分离的靶向部分，其中一个或多个靶向部分对靶配体的结合亲和力可以为不与XTEN结合的亲本抗体或结合部分对靶受体或靶配体的亲和力的至少约1％、或至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％、或至少约99.9％或更多。在一个实施方案中，主题靶向缀合物组合物的一个或多个靶向部分与靶配体或配体之间的Kd小于约10-4M、或小于约10-5M、或小于约10-6M、或小于约10-7M、或小于约
10-8M、或小于约10-9M、或小于约10-10M、或小于约10-11M、或小于约10-12M。在前述实施方案中，靶向部分对靶标的结合亲和力将被表征为“特异性的”。本发明考虑到包含两个或更多个靶向部分的靶向缀合物组合物，其中各个靶向部分的结合亲和力可以独立地位于前述值的范围之间。本领域技术人员将会理解，与施用组合物的受试者的健康组织或健康细胞相比，靶向缀合物组合物的TM组分意在选择性或不成比例地将组合物和/或组合物的有效负载递送至靶组织或靶细胞，或者在体外分析的情况下递送至靶细胞附近。在本段前述实施方案的一些中，主题靶向缀合物组合物的一个或多个靶向部分与表2、表3、表4、表18或表19的靶标特异性结合。
表18：肿瘤细胞系
10-8M、或小于约10-9M、或小于约10-10M、或小于约10-11M、或小于约10-12M。在前述实施方案中，靶向部分对靶标的结合亲和力将被表征为“特异性的”。本发明考虑到包含两个或更多个靶向部分的靶向缀合物组合物，其中各个靶向部分的结合亲和力可以独立地位于前述值的范围之间。本领域技术人员将会理解，与施用组合物的受试者的健康组织或健康细胞相比，靶向缀合物组合物的TM组分意在选择性或不成比例地将组合物和/或组合物的有效负载递送至靶组织或靶细胞，或者在体外分析的情况下递送至靶细胞附近。在本段前述实施方案的一些中，主题靶向缀合物组合物的一个或多个靶向部分与表2、表3、表4、表18或表19的靶标特异性结合。
表18：肿瘤细胞系
[0276] 在一个实施方案中，本发明提供了包含能够与单个靶标结合的靶向部分的靶向缀合物组合物。在另一个实施方案中，本发明的靶向部分是多特异性的，并且靶向部分特异性结合至少两种不同的靶抗原或靶配体(“双功能”或“多特异性”)或与之相同靶标上的不同表位。可将多价靶向部分设计成双功能的，因为它们可以并入来自不同“亲本”抗体的异源结合结构域并结合两种不同的配体或抗原，以便更好地产生期望的药理反应；例如，导致细胞信号传导或细胞死亡或者调节一个或多个靶标生物学功能的靶细胞表面上的受体的二聚化。无论是通过引发细胞凋亡或坏死，还是通过所递送的细胞毒性有效负载的作用，导致细胞死亡的多特异性靶向部分均预期尤其在肿瘤疾病的治疗中具有效用。考虑适用于多价双功能靶向部分的靶标对的非限制性实例包括：IGF1和IGF2、IGF1/2和Erb2B、VEGFR和EGFR、CD20和CD3、CD138和CD20、CD38和CD20、CD38和CD138、CD40和CD20、CD138和CD40、CD38和CD40、IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-18、TNFα和IL-23、TNFα和IL-13、TNF和IL-18、TNF和IL-12、TNF和IL-1β、TNF和MIF、TNF和IL-17、TNF和IL-15、TNF和VEGF、VEGFR和EGFR、IL-13和IL-
9、IL-13和IL-4、IL-13和IL-5、IL-13和IL-25、IL-13和TARC、IL-13和MDC、IL-13和MIF、IL-
13和TGF-β、IL-13和LHR激动剂、IL-13和CL25、IL-13和SPRR2a、IL-13和SPRR2b、IL-13和ADAM8、TNFα和PGE4、IL-13和PED2、TNF和PEG2、CD19和CD20、CD-8和IL-6、PDL-1和CTLA-4、CTLA-4和BTNO2、CSPG和RGM A、IL-12和IL-18、IL-12和TWEAK、IL-13和ADAM8、IL-13和CL25、IL-13和IL-1β、IL-13和IL-25、IL-13和IL-4、IL-13和IL-5、IL-13和IL-9、IL-13和LHR激动剂、IL-13和MDC、IL-13和MIF、IL-13和PED2、IL-13和SPRR2a、IL-13和SPRR2b、IL-13和TARC、IL-13和TGF-β、IL-1α和IL-1β、MAG和RGM A、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、RGM A和RGM B、Te38和TNFα、TNFα和IL-12、TNFα和IL-12p40、TNFα和IL-13、TNFα和IL-15、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-1β、TNFα和IL-23、TNFα和MIF、TNFα和PEG2、TNFα和PGE4、TNFα和VEGF、TNFα和RANK配体、TNFα和Blys、TNFα和GP130、TNFα和CD-22以及TNFα和CTLA-4。
9、IL-13和IL-4、IL-13和IL-5、IL-13和IL-25、IL-13和TARC、IL-13和MDC、IL-13和MIF、IL-
13和TGF-β、IL-13和LHR激动剂、IL-13和CL25、IL-13和SPRR2a、IL-13和SPRR2b、IL-13和ADAM8、TNFα和PGE4、IL-13和PED2、TNF和PEG2、CD19和CD20、CD-8和IL-6、PDL-1和CTLA-4、CTLA-4和BTNO2、CSPG和RGM A、IL-12和IL-18、IL-12和TWEAK、IL-13和ADAM8、IL-13和CL25、IL-13和IL-1β、IL-13和IL-25、IL-13和IL-4、IL-13和IL-5、IL-13和IL-9、IL-13和LHR激动剂、IL-13和MDC、IL-13和MIF、IL-13和PED2、IL-13和SPRR2a、IL-13和SPRR2b、IL-13和TARC、IL-13和TGF-β、IL-1α和IL-1β、MAG和RGM A、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、RGM A和RGM B、Te38和TNFα、TNFα和IL-12、TNFα和IL-12p40、TNFα和IL-13、TNFα和IL-15、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-1β、TNFα和IL-23、TNFα和MIF、TNFα和PEG2、TNFα和PGE4、TNFα和VEGF、TNFα和RANK配体、TNFα和Blys、TNFα和GP130、TNFα和CD-22以及TNFα和CTLA-4。
[0277] 靶向缀合物组合物的靶向部分可衍生自本领域已知的各种单克隆抗体的一个或多个片段。这样的单克隆抗体的非限制性实例包括但不限于抗TNF抗体(美国专利号6,258,562)、抗IL-12和/或抗IL-12p40抗体(美国专利号6,914,128、抗IL-18抗体(US 2005/
0147610 A1)、抗RANKL(美国专利号7,411,050)、抗C5、抗CBL、抗CD147、抗gp120、抗VLA4、抗CD11a、抗CD18、抗VEGF、抗CD40L、抗Id、抗ICAM-1、抗CXCL13、抗CD2、抗EGFR、抗TGF-β2、抗E-选择蛋白、抗Fact VII、抗Her2/neu、抗Fgp、抗CD11/18、抗CD14、抗ICAM-3、抗CD80、抗CD4、抗CD3、抗CD23、抗β2整联蛋白、抗α4β7、抗CD52、抗HLA DR、抗CD22、抗CD20、抗MIF、抗CD64(FcR)、抗TCRαβ、抗CD2、抗Hep B、抗CA 125、抗EpCAM、抗gp120、抗CMV、抗gpIIbIIIa、抗IgE、抗CD25、抗CD33、抗HLA、抗VNR整联蛋白、抗IL-1α、抗IL-1β、抗IL-1受体、抗IL-2受体、抗IL-
4、抗IL4受体、抗IL5、抗IL-5受体、抗IL-6、抗IL-8、抗IL-9、抗IL-13、抗IL-13受体、抗IL-17和抗IL-23(参见Presta LG.2005Selection,design,and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol.116:731-6和Clark,M.,“Antibodies for
Therapeutic Applications,”，英国剑桥大学病理学系，2000年10月15日，在线发表于剑桥大学病理学系网站的M.Clark主页)。
0147610 A1)、抗RANKL(美国专利号7,411,050)、抗C5、抗CBL、抗CD147、抗gp120、抗VLA4、抗CD11a、抗CD18、抗VEGF、抗CD40L、抗Id、抗ICAM-1、抗CXCL13、抗CD2、抗EGFR、抗TGF-β2、抗E-选择蛋白、抗Fact VII、抗Her2/neu、抗Fgp、抗CD11/18、抗CD14、抗ICAM-3、抗CD80、抗CD4、抗CD3、抗CD23、抗β2整联蛋白、抗α4β7、抗CD52、抗HLA DR、抗CD22、抗CD20、抗MIF、抗CD64(FcR)、抗TCRαβ、抗CD2、抗Hep B、抗CA 125、抗EpCAM、抗gp120、抗CMV、抗gpIIbIIIa、抗IgE、抗CD25、抗CD33、抗HLA、抗VNR整联蛋白、抗IL-1α、抗IL-1β、抗IL-1受体、抗IL-2受体、抗IL-
4、抗IL4受体、抗IL5、抗IL-5受体、抗IL-6、抗IL-8、抗IL-9、抗IL-13、抗IL-13受体、抗IL-17和抗IL-23(参见Presta LG.2005Selection,design,and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol.116:731-6和Clark,M.,“Antibodies for
Therapeutic Applications,”，英国剑桥大学病理学系，2000年10月15日，在线发表于剑桥大学病理学系网站的M.Clark主页)。
[0278] 在一些实施方案中，靶向部分衍生自获批用于人类的治疗性单克隆抗体的一个或多个片段或者在临床试验或已建立的疾病、病症或病况的临床前模型中具有证明的疗效的抗体。在表19中列出了这样的单克隆抗体的非限制性实例。这样的治疗性抗体包括但不限于IDEC/Genentech/Roche的利妥昔单抗(参见例如美国专利号5,736,137)，其为用于治疗许多淋巴瘤、白血病和一些自身免疫疾病的嵌合抗CD20抗体；奥法木单抗，其为获批用于慢性淋巴细胞性白血病的抗CD20抗体，并且正在由GlaxoSmithKline开发用于滤泡性非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、类风湿性关节炎和复发缓解型多发性硬化；lucatumumab(HCD122)，其为由Novartis开发用于非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤的抗CD40抗体(参见例如美国专利号6,899,879)；AME-133，其为由Applied Molecular Evolution开发的抗体，与表达CD20的细胞结合用于治疗非霍奇金淋巴瘤；veltuzumab(hA20)，其为由Immunomedics公司开发的抗体，与表达CD20的细胞结合用于治疗免疫性血小板减少性紫癜；由Intracel开发的HumaLYM，用于治疗低级B细胞淋巴瘤；以及由Genentech开发的ocrelizumab，其为用于治疗类风湿性关节炎的抗CD20单克隆抗体(参见例如美国专利申请
20090155257)；曲妥珠单抗(参见例如美国专利号5,677,171)，其为由Genentech开发的获批用于治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；帕妥珠单抗，其为由Genentech开发的抗Her2二聚化抑制剂抗体，用于治疗前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌(参见例如美国专利号4,753,
894)；由Imclone和BMS开发的西妥昔单抗，其为用于治疗表皮生长因子受体(EGFR)的表达、KRAS野生型转移性结肠直肠癌和头颈癌的抗EGRF抗体(参见美国专利号4,943,533；PCT WO
96/40210)；帕尼单抗，其为一种对表皮生长因子受体(也称为EGF受体、EGFR、ErbB-1和Her1)特异的全人源单克隆抗体，目前由Amgen销售用于治疗转移性结肠直肠癌(参见美国专利号6,235,883)；zalutumumab，其为由Genmab开发的完全人IgG1单克隆抗体，靶向表皮生长因子受体(EGFR)用于治疗头颈部鳞状细胞癌(参见例如美国专利号7,247,301)；尼妥珠单抗，其为由Biocon、YM Biosciences、Cuba和Oncosciences(欧洲)开发的抗EGFR嵌合抗体，用于治疗头颈部鳞状细胞癌、鼻咽癌和神经胶质瘤(参见例如美国专利号5,891,996；美国专利号6,506,883)；阿仑单抗，其为由Bayer Schering Pharma销售的抗CD52人源化单克隆抗体，用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和T细胞淋巴瘤；
muromonab-CD3，其为由Ortho Biotech/Johnson&Johnson开发的抗CD3抗体，用作减少器官移植患者的急性排斥反应的免疫抑制剂生物制剂；替伊莫单抗(ibritumomab)，其为由IDEC/Schering AG开发的抗CD20单克隆抗体，用于治疗一些形式的B细胞非霍奇金淋巴瘤；
吉妥珠单抗，其为与附着有放射性同位素的细胞毒性螯合剂tiuxetan连接的抗CD33(p67蛋白)抗体，由Celltech/Wyeth开发用于治疗急性骨髓性白血病；阿法赛特(alefacept)，其为由Biogen开发的抗LFA-3Fc融合物，用于控制具有噬斑形成的中度至重度银屑病的炎症；阿昔单抗，其由抗血小板膜上IIb/IIIa受体的抗体的Fab片段制成，由Centocor/Lilly开发作为血小板聚集抑制剂，主要在冠状动脉手术期间和之后使用；巴利昔单抗，其为由Novartis开发的抗T细胞IL-2受体α链(CD25)的嵌合小鼠-人单克隆抗体，用于防止器官移植中的排斥反应；由Medimmune开发的帕利珠单抗；英夫利昔单抗(REMICADE)，其为由Centocor/Johnson and Johnson开发的抗TNFα抗体；阿达木单抗(HUMIRA)，其为由Abbott开发的抗TNFα抗体；HUMICADE，其为由Celltech开发的抗TNFα抗体；依那西普(ENBREL)，其为由Immunex/Amgen开发的抗TNFαFc融合物；ABX-CBL，其为由Abgenix开发的抗CD147抗体；ABX-IL8，其为由Abgenix开发的抗IL8抗体；ABX-MA1，其为由Abgenix开发的抗MUC18抗体；
Pemtumomab(R1549、90Y-muHMFG1)，其为由Antisoma开发的抗MUC1抗体；Therex(R1550)，其为由Antisoma开发的抗MUC1抗体；由Antisoma开发的AngioMab(AS1405)；由Antisoma开发的HuBC-1；由Antisoma开发的Thioplatin(AS1407)；ANTEGREN(那他珠单抗)，其为抗细胞粘附分子α4整联蛋白的人源化单克隆抗体，由Biogen开发的抗α-4-β-1(VLA4)和α-4-β-7抗体；VLA-1 mAb，其为由Biogen开发的抗VLA-1整联蛋白抗体；LTBR mAb，其为由Biogen开发的抗淋巴毒素β受体(LT BR)抗体；CAT-152，其为由Cambridge Antibody Technology开发的抗TGF-β2抗体；J695，其为由Cambridge Antibody Technology和Genzyme开发的抗TGFβ1抗体；CAT-213，其为由Cambridge Antibody Technology开发的抗嗜酸性粒细胞趋化因子1抗体；LYMPHOSTAT-B，其为由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences,Inc.开发的抗Blys抗体；TRAIL-R1mAb，其为由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences,Inc.开发的抗TRAIL-R1抗体；贝伐珠单抗(AVASTIN、rhuMAb-VEGF)，其为由Genentech开发的抗VEGF抗体；HERCEPTIN，其为由Genentech开发的抗HER受体家族抗体；
抗组织因子(ATF)，其为由Genentech开发的抗组织因子抗体；XOLAIR(奥马珠单抗)，其为由Genentech开发的抗IgE抗体；由Genentech和Millennium Pharmaceuticals开发的MLN-02抗体(以前称为LDP-02)；HUMAX 其为由Genmab开发的抗CD4抗体；tocilizumab，其为由Chugai开发的抗IL6R抗体；HUMAX-IL15，其为由Genmab和Amgen开发的抗IL15抗体；由Genmab和Medarex开发的HUMAX-炎症；HUMAX-癌症，其为由Genmab和Medarex以及Oxford GlycoSciences开发的抗乙酰肝素酶I抗体；由Genmab和Amgen开发的HUMAX-淋巴瘤；由Genmab开发的HUMAX-TAC；IDEC-131，其为由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD40L抗体；
IDEC-151(克立昔单抗)，其为由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD4抗体；IDEC-114，其为由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD80抗体；IDEC-152，其为由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD23抗体；由IDEC Pharmaceuticals开发的抗巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体；BEC2，其为由Imclone开发的抗独特型抗体；IMC-1C11，其为由Imclone开发的抗KDR抗体；DC101，其为由Imclone开发的抗flk-1抗体；由Imclone开发的抗VE钙粘蛋白抗体；CEA-CIDE(labetuzumab)，其为由Immunomedics开发的抗癌胚抗原(CEA)抗体；Yervoy(依匹木单抗)其为由Bristol-Myers Sequibb开发的抗CTLA4抗体，用于治疗黑色素瘤；
(依帕珠单抗)，其为由Immunomedics开发的抗CD22抗体；由Immunomedics开发的AFP-Cide；
由Immunomedics开发的MyelomaCide；由Immunomedics开发的LkoCide；由Immunomedics开发的ProstaCide；MDX-010，其为由Medarex开发的抗CTLA4抗体；MDX-060，其为由Medarex开发的抗CD30抗体；由Medarex开发的MDX-070；由Medarex开发的MDX-018；OSIDEM(IDM-1)，其为由Medarex和Immuno-Designed Molecules开发的抗Her2抗体； -CD4，其为
由Medarex和Genmab开发的抗CD4抗体；HUMA-IL15，其为由Medarex和Genmab开发的抗IL15抗体；CNTO 148，其为由Medarex和Centocor/J&J开发的抗TNFα抗体；CNTO1275，其为由Centocor/J&J开发的抗细胞因子抗体；MOR101和MOR102，其为由MorphoSys开发的抗细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体；MOR201，其为由MorphoSys开发的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体；tremelimumab，其为由Pfizer开发的抗CTLA-4抗体；visilizumab，其为由Protein Design Labs开发的抗CD3抗体；HUZAF，其为由Protein Design Labs开发的抗γ干扰素抗体；由Protein Design Labs开发的抗a5β1整联蛋白；由Protein Design Labs开发的抗IL-12；ING-1，其为由由Xoma开发的抗Ep-CAM抗体； (奥马珠单
抗)，其为Genomeech和Novartis开发的人源化抗IgE抗体；以及MLN01，其为由Xoma开发的抗β2整联蛋白抗体；本段中所有上述抗体参考文献通过引用明确地并入本文。可从可公开获取的数据库、专利或文献参考中获得上述抗体的序列。此外，在表19中列出了来自这些单克隆抗体序列的VH和VL序列的非限制性实例。在表19中列出了适用于使VL和VH序列重组连接作为scFv或其他此类抗体片段组合物的示例连接体，但本发明还考虑，使用本领域已知的连接体用于scFv的生成。
表19：单克隆抗体和序列
*下划线标出的序列(如果存在)为VL和VH内的CDR
表20：分子内连接体
(i)示例性靶向部分
20090155257)；曲妥珠单抗(参见例如美国专利号5,677,171)，其为由Genentech开发的获批用于治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；帕妥珠单抗，其为由Genentech开发的抗Her2二聚化抑制剂抗体，用于治疗前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌(参见例如美国专利号4,753,
894)；由Imclone和BMS开发的西妥昔单抗，其为用于治疗表皮生长因子受体(EGFR)的表达、KRAS野生型转移性结肠直肠癌和头颈癌的抗EGRF抗体(参见美国专利号4,943,533；PCT WO
96/40210)；帕尼单抗，其为一种对表皮生长因子受体(也称为EGF受体、EGFR、ErbB-1和Her1)特异的全人源单克隆抗体，目前由Amgen销售用于治疗转移性结肠直肠癌(参见美国专利号6,235,883)；zalutumumab，其为由Genmab开发的完全人IgG1单克隆抗体，靶向表皮生长因子受体(EGFR)用于治疗头颈部鳞状细胞癌(参见例如美国专利号7,247,301)；尼妥珠单抗，其为由Biocon、YM Biosciences、Cuba和Oncosciences(欧洲)开发的抗EGFR嵌合抗体，用于治疗头颈部鳞状细胞癌、鼻咽癌和神经胶质瘤(参见例如美国专利号5,891,996；美国专利号6,506,883)；阿仑单抗，其为由Bayer Schering Pharma销售的抗CD52人源化单克隆抗体，用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和T细胞淋巴瘤；
muromonab-CD3，其为由Ortho Biotech/Johnson&Johnson开发的抗CD3抗体，用作减少器官移植患者的急性排斥反应的免疫抑制剂生物制剂；替伊莫单抗(ibritumomab)，其为由IDEC/Schering AG开发的抗CD20单克隆抗体，用于治疗一些形式的B细胞非霍奇金淋巴瘤；
吉妥珠单抗，其为与附着有放射性同位素的细胞毒性螯合剂tiuxetan连接的抗CD33(p67蛋白)抗体，由Celltech/Wyeth开发用于治疗急性骨髓性白血病；阿法赛特(alefacept)，其为由Biogen开发的抗LFA-3Fc融合物，用于控制具有噬斑形成的中度至重度银屑病的炎症；阿昔单抗，其由抗血小板膜上IIb/IIIa受体的抗体的Fab片段制成，由Centocor/Lilly开发作为血小板聚集抑制剂，主要在冠状动脉手术期间和之后使用；巴利昔单抗，其为由Novartis开发的抗T细胞IL-2受体α链(CD25)的嵌合小鼠-人单克隆抗体，用于防止器官移植中的排斥反应；由Medimmune开发的帕利珠单抗；英夫利昔单抗(REMICADE)，其为由Centocor/Johnson and Johnson开发的抗TNFα抗体；阿达木单抗(HUMIRA)，其为由Abbott开发的抗TNFα抗体；HUMICADE，其为由Celltech开发的抗TNFα抗体；依那西普(ENBREL)，其为由Immunex/Amgen开发的抗TNFαFc融合物；ABX-CBL，其为由Abgenix开发的抗CD147抗体；ABX-IL8，其为由Abgenix开发的抗IL8抗体；ABX-MA1，其为由Abgenix开发的抗MUC18抗体；
Pemtumomab(R1549、90Y-muHMFG1)，其为由Antisoma开发的抗MUC1抗体；Therex(R1550)，其为由Antisoma开发的抗MUC1抗体；由Antisoma开发的AngioMab(AS1405)；由Antisoma开发的HuBC-1；由Antisoma开发的Thioplatin(AS1407)；ANTEGREN(那他珠单抗)，其为抗细胞粘附分子α4整联蛋白的人源化单克隆抗体，由Biogen开发的抗α-4-β-1(VLA4)和α-4-β-7抗体；VLA-1 mAb，其为由Biogen开发的抗VLA-1整联蛋白抗体；LTBR mAb，其为由Biogen开发的抗淋巴毒素β受体(LT BR)抗体；CAT-152，其为由Cambridge Antibody Technology开发的抗TGF-β2抗体；J695，其为由Cambridge Antibody Technology和Genzyme开发的抗TGFβ1抗体；CAT-213，其为由Cambridge Antibody Technology开发的抗嗜酸性粒细胞趋化因子1抗体；LYMPHOSTAT-B，其为由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences,Inc.开发的抗Blys抗体；TRAIL-R1mAb，其为由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences,Inc.开发的抗TRAIL-R1抗体；贝伐珠单抗(AVASTIN、rhuMAb-VEGF)，其为由Genentech开发的抗VEGF抗体；HERCEPTIN，其为由Genentech开发的抗HER受体家族抗体；
抗组织因子(ATF)，其为由Genentech开发的抗组织因子抗体；XOLAIR(奥马珠单抗)，其为由Genentech开发的抗IgE抗体；由Genentech和Millennium Pharmaceuticals开发的MLN-02抗体(以前称为LDP-02)；HUMAX 其为由Genmab开发的抗CD4抗体；tocilizumab，其为由Chugai开发的抗IL6R抗体；HUMAX-IL15，其为由Genmab和Amgen开发的抗IL15抗体；由Genmab和Medarex开发的HUMAX-炎症；HUMAX-癌症，其为由Genmab和Medarex以及Oxford GlycoSciences开发的抗乙酰肝素酶I抗体；由Genmab和Amgen开发的HUMAX-淋巴瘤；由Genmab开发的HUMAX-TAC；IDEC-131，其为由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD40L抗体；
IDEC-151(克立昔单抗)，其为由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD4抗体；IDEC-114，其为由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD80抗体；IDEC-152，其为由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD23抗体；由IDEC Pharmaceuticals开发的抗巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体；BEC2，其为由Imclone开发的抗独特型抗体；IMC-1C11，其为由Imclone开发的抗KDR抗体；DC101，其为由Imclone开发的抗flk-1抗体；由Imclone开发的抗VE钙粘蛋白抗体；CEA-CIDE(labetuzumab)，其为由Immunomedics开发的抗癌胚抗原(CEA)抗体；Yervoy(依匹木单抗)其为由Bristol-Myers Sequibb开发的抗CTLA4抗体，用于治疗黑色素瘤；
(依帕珠单抗)，其为由Immunomedics开发的抗CD22抗体；由Immunomedics开发的AFP-Cide；
由Immunomedics开发的MyelomaCide；由Immunomedics开发的LkoCide；由Immunomedics开发的ProstaCide；MDX-010，其为由Medarex开发的抗CTLA4抗体；MDX-060，其为由Medarex开发的抗CD30抗体；由Medarex开发的MDX-070；由Medarex开发的MDX-018；OSIDEM(IDM-1)，其为由Medarex和Immuno-Designed Molecules开发的抗Her2抗体； -CD4，其为
由Medarex和Genmab开发的抗CD4抗体；HUMA-IL15，其为由Medarex和Genmab开发的抗IL15抗体；CNTO 148，其为由Medarex和Centocor/J&J开发的抗TNFα抗体；CNTO1275，其为由Centocor/J&J开发的抗细胞因子抗体；MOR101和MOR102，其为由MorphoSys开发的抗细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体；MOR201，其为由MorphoSys开发的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体；tremelimumab，其为由Pfizer开发的抗CTLA-4抗体；visilizumab，其为由Protein Design Labs开发的抗CD3抗体；HUZAF，其为由Protein Design Labs开发的抗γ干扰素抗体；由Protein Design Labs开发的抗a5β1整联蛋白；由Protein Design Labs开发的抗IL-12；ING-1，其为由由Xoma开发的抗Ep-CAM抗体； (奥马珠单
抗)，其为Genomeech和Novartis开发的人源化抗IgE抗体；以及MLN01，其为由Xoma开发的抗β2整联蛋白抗体；本段中所有上述抗体参考文献通过引用明确地并入本文。可从可公开获取的数据库、专利或文献参考中获得上述抗体的序列。此外，在表19中列出了来自这些单克隆抗体序列的VH和VL序列的非限制性实例。在表19中列出了适用于使VL和VH序列重组连接作为scFv或其他此类抗体片段组合物的示例连接体，但本发明还考虑，使用本领域已知的连接体用于scFv的生成。
表19：单克隆抗体和序列
*下划线标出的序列(如果存在)为VL和VH内的CDR
表20：分子内连接体
(i)示例性靶向部分
[0279] 以下部分提供了示例性靶向部分及其在靶向缀合物组合物中的用途的非限制性列表和描述。
[0280] 抗Her2：
[0281] 在一个实施方案中，本发明提供了分离的抗Her2靶向部分。“抗Her2”意指与HER2/neu受体(又称erbB-2蛋白)细胞外结构域特异性结合的靶向部分，包括但不限于抗体、抗体片段、片段二聚体、陷阱和对HER2/erbB-2蛋白的细胞外结构域具有结合亲和力的其他多肽。在优选的实施方案中，抗Her2靶向部分是scFv。HER2编码基因被发现位于染色体17的q21区上，产生4.8kb的信使RNA(MRNA)，由HER2基因编码的蛋白质为185,000道尔顿。在正常受试者中，与HER2受体结合的配体促进与其他受体的二聚化，从而导致PI3K/Akt通路和MAPK通路的信号转导和激活。
[0282] 在约25％的乳腺癌中，每个肿瘤细胞核中的HER2基因相对于染色体17的拷贝数被扩增了2倍至大于20倍。HER2基因的扩增驱动蛋白质表达，并且所得到的肿瘤细胞表面受体数目的增加促进受体活化，从而导致信号传导、过度的细胞分裂和肿瘤形成(Hicks,DG等人,HER2+breast cancer:review of biologic relevance and optimal use of diagnostic tools.Am J Clin Pathol.(2008)129(2):263-73)。
[0283] 用作具有XTEN的融合配偶体的抗Her2靶向部分产生一种组合物，当该组合物通过与HER2/neu受体的细胞外区段的细胞外结构域结合并将生物活性有效负载递送至靶组织而施用于受试者时，具有治疗效用。此外，这样的结合可以干扰受体二聚化和由此产生的EGFR内在酪氨酸激酶功能的活化(Yarden等人,Biochemistry,(1988),27,3114-3118；Schlessinger,Biochemistry,(1988),27,3119-3123)，其结果是具有结合受体的细胞在细胞周期的G1期期间发生停滞，因此出现减少的肿瘤细胞增殖，以及血管生成的抑制。
[0284] 本发明的一个目的是提供新型抗Her2靶向部分，其包含与肿瘤细胞上表达的erbB-2蛋白特异性结合并且基本上不与正常人类细胞结合的一个或多个结合部分，该新型抗Her2靶向部分可用于治疗或预防表达erbB-2的癌症，或用于检测表达erbB-2的肿瘤细胞。已在Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)中报道了人源化HER2抗体的可变结构域CDR和FR残基。在一个实施方案中，抗Her2 TM组合物包含与缀合物组合物连接的单个抗Her2靶向部分。在另一个实施方案中，抗Her2组合物包含第一和第二抗Her2靶向部分，其可以是相同的或者可以结合erbB-2蛋白的不同表位。在一个实施方案中，缀合物组合物的抗Her2靶向部分组分包含曲妥珠单抗的一个或多个互补决定区(CDR)，该CDR能够结合与缀合物组合物连接的HER2/neu受体的细胞外区段的结构域IV。
[0285] 本发明的另一个实施方案涉及通过向患者施用治疗有效量的能够抑制HER2受体功能并将细胞毒性有效负载递送至肿瘤细胞从而影响细胞死亡的抗Her2靶向缀合物组合物来抑制肿瘤细胞生长的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗和/或预防erbB-2受体过表达肿瘤的方法，其包括施用治疗有效量的包含第一和第二抗Her2结合部分的抗Her2缀合物组合物，该第一和第二抗Her2结合部分可以是相同的或者可以是不同的并且结合能够抑制HER2受体功能的erbB-2蛋白的不同表位。优选地，TM的这类组合将会导致相关联的有效负载更有选择性地递送至靶肿瘤，并且与具有相同总浓度的独立TM的缀合物预期的细胞毒活性总和相比，展现出更好的细胞毒活性。此外，一种或多种所施用的缀合物组合物可与放射性核素缀合。
[0286] 抗cMet：
[0287] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗cMet靶向部分。“抗cMet”意指与Met或肝细胞生长因子(HGF)受体特异性结合的靶向部分。MET是原癌基因，其编码的肝细胞生长因子受体(HGFR)或cMet具有对于胚胎发育和创伤愈合所必需的酪氨酸激酶活性。在HGF结合和刺激下，MET诱导共同引起侵袭性生长的若干生物反应。癌症中异常的MET活化与不良预后相关，其中异常活跃的MET引发肿瘤生长、血管生成和新血管的形成，为肿瘤提供营养，并使癌症扩散到其他器官(转移)。MET在许多类型的人类恶性肿瘤，包括肾癌、肝癌、胃癌、乳腺癌和脑癌中被下调。抗cMET可以是与HGF受体特异性结合的靶向部分，作为HGF的拮抗剂。在优选的实施方案中，抗cMET靶向部分是scFv。抗cMET可用作融合配偶体以产生融合蛋白缀合物组合物，该组合物在施用于受试者用于治疗表达MET的肿瘤时具有预防或治疗效用。在一个实施方案中，缀合物组合物的抗cMET组分包含抗体MetMab或PRO143966的一个或多个互补决定区(CDR)。已在美国专利号5,686,292、US 6,468,529、US 7,476,724和美国专利申请公开号20070092520中描述了抗cMet及其序列的抗体。
[0288] 抗IL6R：
[0289] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗IL6R靶向部分。“抗IL6R”意指与IL-6受体特异性结合的靶向部分。在优选的实施方案中，抗IL6R靶向部分是scFv。抗IL6R可作为IL-6的拮抗剂。抗IL6R可用作融合配偶体以产生缀合物组合物，该组合物在施用于受试者用于治疗炎性病况如关节炎或克罗恩病时具有预防或治疗效用。Tocilizuma已显示出在中度至重度类风湿性关节炎中具有临床效用，并且已被FDA批准。在一个实施方案中，缀合物组合物的抗IL6R组分包含tocilizuma的一个或多个互补决定区(CDR)。已在美国专利号
5,670,373、5,795,965、5,817,790和7,479,543中描述了抗IL-6R的抗体。
5,670,373、5,795,965、5,817,790和7,479,543中描述了抗IL-6R的抗体。
[0290] 抗IL17：
[0291] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗IL17靶向部分。“抗IL17”意指与细胞因子IL-17特异性结合的靶向部分。在优选的实施方案中，抗IL17靶向部分是scFv。IL-17是约32kDa的二硫键连接的同型二聚体细胞因子，其仅由CD4+活化的记忆T细胞合成和分泌(综述于Fossiez等人,Int.Rev.Immunol.,16:541-551(1998)中)。白介素(IL-17)是例如在类风湿性关节炎患者的滑液中表达的促炎T细胞细胞因子。IL-17是多种细胞因子如TNF和IL-1的有效诱导物，并且IL-17已显示出与TNF和IL-1具有叠加效应或甚至协同效应。抗IL17可用作融合配偶体以产生缀合物组合物，该组合物在施用于受试者用于治疗炎性病况如关节炎或克罗恩病或多发性硬化时具有预防或治疗效用。LY2439821是一种抗体，当被加入口服DMARD时，显示出改善类风湿性关节炎的体征和症状的效用。在一个实施方案中，靶向部分的抗IL6R组分包含LY2439821的一个或多个互补决定区(CDR)。已在美国专利申请号20050147609和20080269467以及PCT申请公开WO 2007/070750中描述了抗IL17抗体。
[0292] IL17R：
[0293] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的IL17R靶向部分。“IL17R”意指与IL-17的细胞因子受体特异性结合的靶向部分。在优选的实施方案中，抗IL17R靶向部分是scFv。研究显示，T细胞与可溶形式的IL-17受体多肽接触抑制由PHA、伴刀豆球蛋白A和抗TCR单克隆抗体诱导的T细胞增殖和IL-2产生(Yao等人,J.Immunol.,155:5483-5486[1995])。由于白介素(IL-17)是作为多种细胞因子如TNF和IL-1的有效诱导剂的促炎T细胞细胞因子，IL17R可用作融合配偶体以产生结合并中和IL-17的缀合物组合物。IL17R在施用于受试者用于治疗炎性病况如类风湿性关节炎或克罗恩病时可以具有治疗效用。如美国专利号5,
869,286中所述，已经克隆了IL7R受体和同系物。
869,286中所述，已经克隆了IL7R受体和同系物。
[0294] 抗IL12：
[0295] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗IL12靶向部分。“抗IL12”意指与细胞因子IL-12，并且在一些情况下与IL-23特异性结合的靶向部分。在优选的实施方案中，抗IL12靶向部分是scFv。生物活性IL-12作为异二聚体存在，由35(p35)和40(p40)kD的2个共价连接的亚基组成，后者被称为IL-23。IL-12是作为炎症应答的重要部分的细胞因子，刺激来自T细胞和自然杀伤(NK)细胞的干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生，并减少IL-4介导的IFN-γ抑制。产生IL-12的T细胞具有与IL-12活性相关的共同受体CD30。IL-12还与自身免疫及银屑病有关，其中产生IL-12的T淋巴细胞和干细胞角质形成细胞之间的相互作用具有重要意义。优特克单抗(Ustekinumab)是一种抗IL12/23抗体，在治疗中重度斑块状银屑病中具有已证明的效用，并且已被FDA批准。抗IL12可用作具有XTEN的融合配偶体以产生融合蛋白组合物，该组合物在施用于患有诸如但不限于银屑病、类风湿性关节炎或克罗恩病的炎性病况的受试者时具有治疗效用。在一个实施方案中，缀合物组合物的抗IL12组分包含抗体优特克单抗的一个或多个互补决定区(CDR)。已在美国专利号7,
279,157中描述了抗IL-12的抗体及其用途。
279,157中描述了抗IL-12的抗体及其用途。
[0296] 抗IL23：
[0297] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗IL23靶向部分。“抗IL23”意指与细胞因子IL-23特异性结合的靶向部分。在优选的实施方案中，抗IL23靶向部分是scFv。IL-23是由IL-12的p40亚基组成的因子的名称，其是作为抗感染炎症应答的重要部分的促炎细胞因子。IL-23促进基质金属蛋白酶MMP9的上调，增加血管生成并降低CD8+ T细胞浸润。IL-23已被证明在银屑病、多发性硬化和炎性肠道中发挥作用。优特克单抗是一种抗IL23抗体，在银屑病中具有已证明的效用。抗IL232可用作具有XTEN的融合配偶体以产生融合蛋白组合物，该组合物在施用于患有诸如但不限于银屑病、类风湿性关节炎或克罗恩病的炎性病况的受试者时具有治疗效用。在一个实施方案中，缀合物组合物的抗IL23组分包含抗体优特克单抗的一个或多个互补决定区(CDR)。已在美国专利号7,491,391和7,247,711中描述了抗IL-23的抗体。
[0298] CTLA4：
[0299] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的CTLA4靶向部分。“CTLA4”意指与在抗原呈递细胞上的CD80和CD86特异性结合并且可以特异性结合B7的靶向部分。在优选的实施方案中，抗CTLA4靶向部分是scFv。CTLA4靶向部分可用作融合配偶体以产生缀合物组合物，该组合物在施用于患有诸如但不限于类风湿性关节炎、银屑病的炎性病况的受试者和器官移植的受试者时具有治疗效用。贝拉西普(Belatacept)是由与CTLA-4细胞外结构域连接的人IgG1免疫球蛋白的Fc片段组成的融合蛋白，并在提供延长的移植存活方面具有已显示的疗效。在一个实施方案中，缀合物组合物的CD80和/或CD86结合组分包含来自贝拉西普的一个或多个结合结构域。已在美国专利号5,434,131、5,773,253、5,851,795、5,885,579、7,094,874和7,439,230中描述了CTLA4组合物的克隆和用途。
[0300] 抗CD3：
[0301] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗CD3靶向部分。“抗CD3”意指与CD3T细胞受体特异性结合的靶向部分。在优选的实施方案中，抗CD3靶向部分是scFv。T细胞共受体是由四条独特的链——CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链组成的蛋白质复合物。这些链与被称为T细胞受体(TCR)的分子以及ζ链缔合，以在T淋巴细胞中产生激活信号。抗CD3单克隆抗体通过瞬时T细胞消耗和CD3/T细胞受体复合物的抗原调节来抑制免疫应答。例如，成年非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(T细胞介导的自身免疫性胰岛素依赖型糖尿病的自发模型)的抗CD3治疗可以抑制导致糖尿病的自身免疫过程。已在例如美国专利号4,515,893中描述了使用抗CD3抗体治疗疾病和病症。在一个实施方案中，缀合物组合物的CD3结合组分包含抗体Muromonab-CD3的一个或多个互补决定区(CDR)。
[0302] 抗CD40：
[0303] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗CD40靶向部分。“抗CD40”意指与细胞表面受体CD40特异性结合的靶向部分。在优选的实施方案中，抗CD40靶向部分是scFv。CD-40是一种细胞表面受体，当被CD40配体(CD40L)激活时，在免疫应答以及细胞生长和存活信号传导中发挥作用。CD40通常在B细胞恶性肿瘤如多发性骨髓瘤和淋巴瘤中过表达并活化。抗CD40可用作融合配偶体以产生缀合物组合物，该组合物在施用于患有多种癌症，尤其是B细胞恶性肿瘤的受试者时具有治疗效用。在一个实施方案中，缀合物组合物的抗CD40组分包含抗体lucatumumab的一个或多个互补决定区(CDR)。已在美国专利申请号7,445,
780以及美国专利申请号20070110754和20080254026中描述了抗CD40抗体。
780以及美国专利申请号20070110754和20080254026中描述了抗CD40抗体。
[0304] 抗TNFα：
[0305] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗TNFα靶向部分。“抗TNFα”意指与细胞因子TNFα特异性结合的靶向部分。在优选的实施方案中，抗TNFα靶向部分是scFv。TNFα或恶液质素(cachexin)是参与全身炎症的促炎细胞因子，并且是刺激急性期反应的细胞因子群体的一员。TNF的主要作用是调节免疫细胞。TNF主要由巨噬细胞产生，但也由淋巴细胞、肥大细胞、内皮细胞、心肌细胞、脂肪组织、成纤维细胞和神经元组织产生。大量的TNF响应于脂多糖和白介素-1(IL-1)而释放。TNF参与自身免疫疾病如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病和难治性哮喘，并在脓毒性休克和其他严重形式的急性炎症应答和SIRS中发挥作用。抗ILTNFα可用作融合配偶体以产生缀合物组合物，该组合物在包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病和难治性哮喘在内的多种炎性病症中具有治疗效用。抗TNFα抗体如英夫利昔单抗和依那西普在银屑病、克罗恩病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎中具有已证明的疗效。在一个实施方案中，缀合物组合物的抗TNFα组分包含英夫利昔单抗或依那西普的一个或多个互补决定区(CDR)或结合区域。已在美国专利号6,790,444中描述了抗TNF抗体，并在美国专利号5,605,690中描述了包含TNF受体的嵌合抗体。
[0306] 本发明提供了靶向部分组合物，其中前述参考的示例性靶向部分的结合区域是序列变体。例如，应当理解，可以在靶向部分中进行各种氨基酸缺失、插入和置换以产生在靶向部分的结合活性或药理学性质方面不背离本发明精神的变体。多肽序列中氨基酸的保守置换的实例示于表21中。然而，在其中与本文引用或公开的特定序列相比靶向部分的序列同一性小于100％的靶向部分实施方案中，本发明考虑其他19种天然L-氨基酸中的任何一种对给定靶向部分的给定氨基酸残基的置换，所述给定氨基酸残基可以在靶向部分序列内或靶向部分结合区域内的任何位置，包括相邻的氨基酸残基。如果任何一个置换导致不期望的结合活性变化，则可以采用可替代的氨基酸之一，并通过本文描述的方法(例如，实施例中的测定)或使用例如美国专利号5,364,934(其内容通过引用整体并入)中提出的关于保守和非保守突变的任何技术和指导或使用本领域公知的方法来评估构建体蛋白质。此外，变体可以包括例如这样的多肽，其中在所引用或所公开的靶向部分的氨基酸序列的N末端或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基，其保留所引用或所公开的靶向部分的一定的(如果不是全部的话)结合活性；例如，结合表2、表3、表4、表18或表19的靶标的能力。表21：示例性保守氨基酸置换
(ii)靶向部分的示例形式
(ii)靶向部分的示例形式
[0307] 以下部分提供了靶向部分的示例形式的非限制性列表和描述。
[0308] 本文所使用的“一种抗体”或“多种抗体”是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽组成的靶向部分，并且以最广泛的含义使用以涵盖完整的单克隆抗体、由至少两种完整抗体或其片段形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及抗体片段、scFv、双抗体和其他形式的合成TM，只要它们展现出期望的生物活性，例如对靶配体或抗原的结合亲和力。
[0309] 可以根据免疫球蛋白重链的恒定结构域的氨基酸序列，将免疫球蛋白分成不同的类别。存在五种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
[0310] 术语“单克隆”指示从基本上均质的抗体或片段群体获得的靶向部分抗体或抗体片段的特征，并且不被解释为需要通过特定方法产生抗体。例如，虽然根据本发明的方法产生的单克隆抗体可以通过最先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法进行制备，但它们也可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)来合成制备，并在哺乳动物或非哺乳动物宿主例如大肠杆菌中进行表达。用细菌细胞代替无线增殖化细胞大大简化了制备大量本发明结合融合蛋白分子的程序。此外，重组生产系统具有产生定制的抗体及其片段，甚至筛选特定属性文库的能力。例如，可能产生具有结合和效应子功能的新组合的嵌合分子、人源化抗体和新型抗原结合分子，包括双功能结合融合蛋白。此外，使用聚合酶链反应(PCR)扩增(Saiki,R.K.等人,Science 239,487-491(1988))向序列中引入变异并从细胞中分离产生抗体的序列，具有加速时间尺度的潜能，在此情况下特异性可得以分离。扩增的VH和VL基因可以直接克隆到载体中，以供在细菌或哺乳动物细胞中表达(Orlandi,R.等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86,3833-3837；Ward,E.S.等人,1989同上；Larrick,J.W.等人,1989,Biochem.Biophys.Res.Commun.160,1250-1255；Sastry,L.等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,5728-5732)。然后可在本文所述的结合测定或本领域已知的其他方法中筛选从细菌分泌的可溶性抗体片段，以选择具有足以满足应用的结合活性的那些构建体。
[0311] 本文的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定第一物种的抗体中的相应亲本序列相同或具有高度的同源性，而该链的剩余部分与衍生自第二物种的抗体中的序列相同或具有高度的同源性，其中所得抗体展现出期望的生物活性，例如，对靶抗原或靶配体的结合亲和力(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-4855(1984))。
[0312] 术语“人源化”意指嵌合的抗体(包括片段)的形式，因为它们包含衍生自非人源免疫球蛋白的最小序列，但另外包含来自人免疫球蛋白的序列。人源化是减少对非人源免疫球蛋白药物和含有非人源氨基酸序列的其他生物制剂的不良免疫反应的方法。在本领域中已经描述了使非人源抗体人源化的方法。优选地，人源化抗体含有来自非人类(例如，鼠科、大鼠或非人类灵长类动物)来源的一种或多种氨基酸残基，并且通常取自对靶配体具有期望的特异性和亲和力的VL或VH链的可变结构域。可以按照Winter及其同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，通过用非人源高变区序列置换人源抗体的相应序列(移植)来实质上进行人源化。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(参见例如美国专利号4,816,567)，其中人源可变结构域的全部或部分已被来自非人类物种的相应序列所置换。在实践中，人源化抗体通常是人源抗体，其中一些高变CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物(或其他非人类物种，例如非人类灵长类动物)抗体中的类似位点的残基所置换。在一个实施方案中，人源化抗体包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基，以便，例如增加结合亲和力或一些其他性质。通常，人源化抗体基本上包含所有的可变结构域(至少一个，通常两个)，其中所有或基本上所有的高变环(CDR)对应于或具有衍生自非人源免疫球蛋白的序列，而所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些区域。在svFv制备自人源化抗体的情况下，可变轻链和可变重链通常与连接体连接，该连接体可以是表20的连接体或来自表10的XTEN的片段。人源化抗体可任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，优选人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。
[0313] 主题组合物的靶向部分可衍生自人源化抗体。待用于组合物中的人源可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗体的免疫原性非常重要。例如，啮齿动物抗体的可变结构域的序列可与一组已知的人可变结构域序列进行比对，以便选择不太可能在受体中引起免疫应答而最可能接受移植的啮齿动物序列的人源可变结构域序列，以形成具有遗传的亲本啮齿动物抗体的物理化学性质的功能抗体。以相应的方式，与啮齿动物序列最接近的人源序列可用作人源化抗体的人源框架(FR)(Sims等人,J.Immunol,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人,J.Immnol.,151:2623(1993))。
[0314] 额外的性质在于，靶向部分可被人源化但仍保持对抗原的高亲和力和其他有利的生物学性质。为了实现这一目标，根据优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型进行亲本序列和各种概念性人源化产物分析的迭代过程，然后进行测试来制备人源化靶向部分。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。可获取用来说明并展示所选的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些展示能够分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以使用标准重组DNA技术从受体和供体中选择并组合FR残基，从而可以实现期望的特征，如增加的对靶抗原的亲和力。在一个实施方案中，产生靶向部分构建体，在该构建体中包含连接的重链可变结构域的序列与重链恒定结构域连接，并且包含连接的轻链可变结构域的序列与轻链恒定结构域连接(在该实施方案中称为融合蛋白)。优选地，恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。在前述的又一个实施方案中，可将靶向部分设计成包含部分或全部的免疫球蛋白铰链区，以便允许结合融合蛋白的二聚化，其然后可与CCD区域的N末端连接。在备选的实施方案中，可将结合融合蛋白设计成并入没有铰链而具有被截短但保留FcRn结合的CH2结构域的部分Fc，以便赋予构建体更长的终末半衰期。在又一个实施方案中，可将结合融合蛋白设计成并入没有铰链但具有CH2和CH3结构域的部分Fc，使该结合融合蛋白可经由CH3结构域二聚化。在本段上文所述的实施方案中，缀合物组合物的其余多肽组分可与靶向部分的N末端或C末端连接，以增强所得靶向缀合物组合物的一种或多种性质。
[0315] “抗体片段”包含完整抗体的一部分或者合成或嵌合的对应部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括以下分子，如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fabc片段、Fd片段、Fabc片段、结构域抗体(VHH)、单链抗体分子(scFv)、双抗体、单个抗体轻链、单个抗体重链、抗体链和其他分子之间的嵌合融合物等。
[0316] “Fab片段”是指与抗原结合的抗体区域。Fab片段由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域的二硫键连接的异二聚体组成。这些可变结构域在每个单体的氨基末端形成互补位——抗原结合位点。可在体外生成Fab片段。例如，木瓜蛋白酶可用于将免疫球蛋白单体切割成两个Fab片段和一个Fc片段。木瓜蛋白酶在铰链区下方进行切割，因此形成F(ab′)2片段和Fc片段。如下文更充分描述的，重链和轻链的可变区可以融合在一起形成单链可变片段(scFv)，该片段保留了亲本免疫球蛋白的原始特异性。
[0317] 来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列，被分为两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。
[0318] 术语“可变的”是指可变结构域的部分在各种抗体之间的序列广泛不同，并赋予每种特定抗体对其特定抗原的结合特异性。变异性集中在轻链和重链可变结构域中被称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中，即LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。特别地，来自抗体的CDR区可以并入主题组合物的靶向部分中，但也可以单独选自一种或多种抗体以产生结合结构域。可变结构域的更高度保守部分被称为框架区(FR)，当与CDR序列组合时，该框架区也可以并入靶向部分中。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，通常采用β-折叠构型，这四个FR区由形成环的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR区紧密地保持在一起，并且来自另一条链的CDR有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,NIH Publ.No.91-3242,Vol.I,pages 647-669(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原结合，但展现出或参与各种效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性。
[0319] 单链可变片段靶向部分
[0320] 在一方面，本发明提供了单链可变片段结合融合蛋白组合物。术语“单链可变片段”或“scFv”意指包含抗体的一个VH和一个VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中，并且通常通过结构域之间的多肽连接体而连接在一起，该连接体使scFv能够形成抗原结合所需的结构。制备scFv的方法是本领域已知的(参见例如，美国专利6,806,079；Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)PNAS 85:5879-5883；
Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编著,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994))。两个scFv可在单个多肽中串联组合形成scFv-scFv融合物，该融合物可以赋予增加的化合价或特异性。或者，两个scFv可以非共价连接形成双抗体。
Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编著,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994))。两个scFv可在单个多肽中串联组合形成scFv-scFv融合物，该融合物可以赋予增加的化合价或特异性。或者，两个scFv可以非共价连接形成双抗体。
[0321] 本发明的scFv结合融合蛋白组合物的结合结构域可以具有N末端至C末端构型：VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。在一个实施方案中，靶向部分随后将会与CCD、PCM和XTEN以及任选地与第二XTEN和PCM序列融合，该第二序列与所得融合蛋白的N末端或C末端连接，所得融合蛋白具有至少以下结构排列(N末端至C末端)：XTEN-PCM-CCD-VH-连接体-VL；VH-连接体-VL-CCD-PCM-XTEN；XTEN-PCM-CCD-VH-连接体-VL-PCM-XTEN；XTEN-PCM-CCD-VL-连接体-VH；VL-连接体-VH-CCD-PCM-XTEN；XTEN-PCM-CCD-VL-连接体-VH-CCD-PCM-XTEN。在另一个实施方案中，可以连接以上任何形式的两个相同或不同的scFv。在另一个实施方案中，scFv将会在XTEN的N末端或XTEN的一个或多个半胱氨酸或赖氨酸残基处与XTEN缀合。在融合蛋白的前述实施方案中，长载体XTEN可以包含这样的序列，该序列可以是选自表10的任一序列的片段，或者与选自表10的任一序列具有至少约80％的序列同一性，或81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的序列同一性。在scFv的前述实施方案中，本发明考虑并包含这样的组合物，其中来自所述抗体的VL和VH链(无论是以叙述方式描述的还是在包括表19在内的各个表格中列出的)并入由合适的连接体(如序列GSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSG，或表20中的序列)连接的scFv中，其中scFv可作为一种组分与CCD-PCM-XTEN融合蛋白或PCM重组融合，或者作为缀合物组合物的组分进行化学缀合。在一个实施方案中，本发明提供了用于缀合物组合物的scFv TM，其中TM衍生自表19的单克隆抗体，其中相应的VL和VH序列与这种单克隆抗体的VL和VH序列具有至少约80％的序列同一性，或81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在另一个实施方案中，本发明提供了用于靶向缀合物组合物的scFv TM，其中TM衍生自表19所列单克隆抗体的VH和VL序列，其中TM的VL和VH序列与这种单克隆抗体的VL和VH序列具有至少约80％的序列同一性，或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且VL和VH序列将会通过表20的连接体序列或本领域已知的用于scFv组合物的连接体进行连接，以产生scFv。
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的序列同一性。在scFv的前述实施方案中，本发明考虑并包含这样的组合物，其中来自所述抗体的VL和VH链(无论是以叙述方式描述的还是在包括表19在内的各个表格中列出的)并入由合适的连接体(如序列GSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSG，或表20中的序列)连接的scFv中，其中scFv可作为一种组分与CCD-PCM-XTEN融合蛋白或PCM重组融合，或者作为缀合物组合物的组分进行化学缀合。在一个实施方案中，本发明提供了用于缀合物组合物的scFv TM，其中TM衍生自表19的单克隆抗体，其中相应的VL和VH序列与这种单克隆抗体的VL和VH序列具有至少约80％的序列同一性，或81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在另一个实施方案中，本发明提供了用于靶向缀合物组合物的scFv TM，其中TM衍生自表19所列单克隆抗体的VH和VL序列，其中TM的VL和VH序列与这种单克隆抗体的VL和VH序列具有至少约80％的序列同一性，或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且VL和VH序列将会通过表20的连接体序列或本领域已知的用于scFv组合物的连接体进行连接，以产生scFv。
[0322] 本发明还包括使用少于常规抗体或scFv中发现的六个CDR构建的scFv靶向部分。在一个实施方案中，scFv包含位于LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1和HCDR2以及HCDR3的可能排列中的五个、四个或三个CDR区，其中散布有下文描述的合适连接体。在图43中示出了这样的scFv排列的代表性构型。在一个实施方案中，本发明提供了用于靶向缀合物组合物的scFv TM，其中TM衍生自表19的单克隆抗体，其中相应的LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1和HCDR2以及HCDR3序列与这种单克隆抗体的LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1和HCDR2以及HCDR3序列具有至少约80％的序列同一性，或81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在另一个实施方案中，本发明提供了用于靶向缀合物组合物的scFv TM，其中TM衍生自表19所列单克隆抗体的VH和VL序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1和HCDR2以及HCDR3序列，其中TM的LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1和HCDR2以及HCDR3序列与这种单克隆抗体的LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1和HCDR2以及HCDR3序列具有至少约80％的序列同一性，或81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％的序列同一性。
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在另一个实施方案中，本发明提供了用于靶向缀合物组合物的scFv TM，其中TM衍生自表19所列单克隆抗体的VH和VL序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1和HCDR2以及HCDR3序列，其中TM的LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1和HCDR2以及HCDR3序列与这种单克隆抗体的LCDR1、LCDR2和LCDR3、HCDR1和HCDR2以及HCDR3序列具有至少约80％的序列同一性，或81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％的序列同一性。
[0323] 用于连接靶向部分的组分的连接体优选在性质上是柔性的。在一个实施方案中，连接形成scFv靶向部分的抗原结合位点的VL和VH结合结构域的连接体可以具有约1个至约30个氨基酸残基的长度。在另一个实施方案中，连接体可以具有约30个至约200个氨基酸残基，或约40个至约144个氨基酸残基，或约50个至约96个氨基酸残基。在上文描述与靶向部分连接的任何实施方案中，连接体可以是衍生自表20的XTEN序列或连接体序列的序列。在另一个实施方案中，连接体可以是至少80％的残基由氨基酸甘氨酸、丝氨酸和/或谷氨酸组成的序列，诸如但不限于与序列GSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSG具有约80-100％序列同一性的序列，或其部分或多聚体。
[0324] 在一个实施方案中，本发明提供了包含两个或更多个scFv靶向部分的缀合物组合物。在一个实施方案中，这两个或更多个scFv靶向部分可以是相同的。在另一个实施方案中，这两个或更多个scFv靶向部分可以是不同的并且可与不同靶标(例如，表18-19的两种或更多种靶标)或相同靶标上的不同表位结合。在前述实施方案中，两个或更多个scFv靶向部分可以通过连接体序列进行连接，该连接体序列可以包括XTEN序列的片段或表20的连接体序列。2.作为靶向部分的蛋白质、激素和有机分子
[0325] 在另一方面，本发明提供了靶向缀合物组合物，其包含与用作靶向部分的非抗体分子共价连接的XTEN，该靶向部分可以是蛋白质、肽、激素、非蛋白质分子或对来自靶组织或靶细胞的配体具有特异性结合亲和力的有机分子。在一个实施方案中，非抗体靶向部分是在癌细胞上表达的细胞表面受体的配体。在另一个实施方案中，非抗体靶向部分是在炎症细胞上表达的细胞表面受体的配体。在另一个实施方案中，非抗体靶向部分是在癌细胞上表达的促黄体激素释放激素受体的配体。在另一个实施方案中，靶向部分是靶向癌细胞的一个或多个促黄体激素释放激素分子。在另一个实施方案中，非抗体靶向部分是在癌细胞上表达的叶酸受体的配体。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物的靶向部分是靶向癌细胞的一个或多个叶酸分子。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物的靶向部分是一个或多个CTLA4分子。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物的靶向部分是一个或多个天冬酰胺酰甘氨酰精氨酸(NGR)分子或其类似物。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物的靶向部分是一个或多个精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD)分子或其类似物。
[0326] “促黄体激素释放激素”或“LHRH”意指由GNRH1基因编码的人蛋白质(UniProt No.P01148)，以及具有天然肽的至少一部分生物活性的其物种和合成变异，其中LHRH在下丘脑视前区中由92个氨基酸的前激素原加工成具有序列pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的线性十肽终产物。LHRH在垂体/性腺轴的调节中，因而在再生中发挥关键作用。LHRH通过与垂体促性腺激素细胞上的高亲和力受体结合并随后释放FSH和LH来发挥其作用。LHRH被发现存在于下丘脑和垂体以外的器官中，并且由于高百分比的某些癌症组织具有LHRH结合位点，以及由于性类固醇已涉及乳腺癌和前列腺癌的发展，因此采用LHRH激动剂的激素疗法被批准或被考虑用于治疗性类固醇依赖性病况，如雌激素依赖性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌和雄激素依赖性前列腺癌。因为报道了半衰期少于4分钟(Redding TW等人The Half-life,Metabolism and Excretion of Tritiated Luteinizing Hormone-Releasing Hormone(LH-RH)in Man.J Clin Endocrinol.Metab.(1973)37:626-631)。因此，本发明考虑，使用LHRH作为用于治疗上述癌症的靶向缀合物组合物中的选择性靶向部分。
[0327] 在具体实施方案中，本发明提供了包含选自表22的一种或多种LHRH靶向组分和选自表14-17的一种或多种药物组分的靶向缀合物组合物。在前述实施方案中，LHRH可与第一XTEN连接，该第一XTEN利用本文所述的各种构型实施方案进而与缀合药物组分的一种或多种XTEN连接。或者，LHRH和药物组分可与单体XTEN缀合。表22：示例性LHRH
组合物
pGlu-HWSYGLRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-Lys]LRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-Trp]LRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-Leu]LRP-NHEt
pGlu-HWSY[D-Ser(tBu)]LRP-NHEt
pGlu-HWSY[D-2-Nal]LRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-His(Bzl)]LRP-NHEt
pGlu-HWSY[D-Ser(tBu)]LRP-Azagly-NH2
pGlu-HWSY[D-Trp]LRP-NHEt
pGlu-HWSHDWLPG-NH2
组合物
pGlu-HWSYGLRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-Lys]LRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-Trp]LRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-Leu]LRP-NHEt
pGlu-HWSY[D-Ser(tBu)]LRP-NHEt
pGlu-HWSY[D-2-Nal]LRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-His(Bzl)]LRP-NHEt
pGlu-HWSY[D-Ser(tBu)]LRP-Azagly-NH2
pGlu-HWSY[D-Trp]LRP-NHEt
pGlu-HWSHDWLPG-NH2
[0328] “叶酸(Folate)”和“叶酸(folic acid)”在本文中可互换使用，意指还被称为蝶酰基-L-谷氨酸、维生素B9、叶酸(folacin)和(2S)-2-[(4-{[(2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基]氨基}苯基)甲酰胺基]戊二酸的化学物质。叶酸是被称为叶酸受体的细胞受体的配体。叶酸受体α是由FOLR1基因编码的人源蛋白质(Campbell IG等人(1991)。叶酸结合蛋白是卵巢癌的标志物(Cancer Res 51(19):5329–5338)。许多癌细胞对叶酸具有高要求，并且过表达叶酸受体。由该基因编码的叶酸受体是叶酸受体(FOLR)家族的一员，并且该家族的成员对叶酸和若干还原性叶酸衍生物具有高亲和力，并介导5-甲基四氢叶酸向细胞内部的递送。叶酸受体可被包括卵巢癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、结肠直肠癌和脑癌在内的许多肿瘤过表达。因此，本发明考虑使用叶酸作为用于治疗上述癌症的靶向缀合物组合物中的选择性靶向部分。
[0329] “精氨酰甘氨酸天冬氨酸”或“RGD”在本文中可互换使用，意指由L-精氨酸、甘氨酸和L-天冬氨酸组成的三肽。RGD是细胞识别中常见的三肽序列，并且是整联蛋白的配体。含RGD的肽可充当整联蛋白-配体相互作用的抑制剂，并诱导细胞凋亡RGD肽可与已知控制血管生成、细胞增殖和细胞迁移的肿瘤标志物整联蛋白αVβ3相互作用(Mol.Pharmaceutics(2012)9:2961-2973)。整联蛋白αVβ3是一种玻连蛋白受体，已涉及到几种恶性肿瘤，包括黑色素瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌。此外，几乎所有具有骨转移的乳腺癌肿瘤都具有高表达的整联蛋白αVβ3。因此，本发明考虑使用RGD作为用于治疗癌症的靶向缀合物组合物中的选择性靶向部分。可用作靶向缀合物组合物中靶向部分的示例性RGD类似物包括RGDc、cRGC、环(RGDyK)、环(RGDfK)、环(RGDfC)、环(RGDf(N-Me)v)环(CGisoDGRG)。本发明还考虑，将前述RGD类似物并入短XTEN片段作为靶向部分的组合物。
[0330] “天冬酰胺酰甘氨酰精氨酸”或“NGD”在本文中可互换使用，意指天冬酰胺、甘氨酸和精氨酸的三肽。NGR是通过噬菌体展示所选择的三肽序列，通过识别肿瘤细胞的细胞膜上的氨肽酶N(APN或CD13)受体来特异性靶向肿瘤血管。结合APN后，NGR肽经由内体途径被内化到细胞中。虽然APN并非仅在肿瘤新生血管中表达，但NGR肽特异性靶向在肿瘤血管而非其他表达APN的组织中表达的APN(Cancer Res.(2002)62:867-874)。已经注意到包括乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌和胰腺癌在内的几种恶性肿瘤的APN表达增加(Cancer Sci.(2011)102:501-508)。此外，许多高APN肿瘤表达的病例与低生存率相关。因此，本发明考虑使用NGR作为用于治疗癌症的靶向缀合物组合物中的选择性靶向部分。可用作靶向缀合物组合物中靶向部分的示例性NGR类似物包括NGR、GNGRG、环(NGR)、环(kNGRE)和CNGRC(环状二硫化物)。本发明还考虑了将前述NGR类似物并入短XTEN片段作为靶向部分的组合物。Ⅵ).XTEN-交联体和制备这样的组合物的方法
[0331] 如本文所述的，本发明部分涉及作为有效负载与其缀合的缀合配偶体有用的XTEN-交联体缀合物组合物的高度纯化制备。本发明还涉及与一个或多个XTEN使用XTEN-交联体缀合配偶体连接的有效负载的高度纯化制备。本发明包含组合物和制备通过将本文所述的任何XTEN与有效负载连接而形成的靶向缀合物组合物的方法，以及反应组合物和制备通过将XTEN与交联体结合或本文所述的其他化学方法而形成的组合物的方法。术语“CCD-缀合物”、“CCD-交联体”、“XTEN-缀合物”和“XTEN-交联体”特别意在包含在反应物缀合配偶体缀合后剩余的连接反应产物，包括交联体的反应产物、点击化学反应物或本文所述的其他方法。
[0332] 在一些实施方案中，用于产生主题缀合物的CCD和XTEN包括选自表5、表10或表11中序列的任一个的一个或多个CCD或XTEN，该可CCD或XTEN与有效负载的组分直接连接或经由本文所公开的交联体连接。在一个实施方案中，用于产生靶向缀合物组合物的CCD包括与选自表5的CCD序列相比具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的CCD。在其他实施方案中，当与可比长度的序列进行最佳比对时，用于产生主题缀合物的一个或多个XTEN独立地包括与选自表10或表11的XTEN或其片段相比具有至少约80％的序列同一性、或者90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的XTEN序列。在一个实施方案中，主题缀合物为多聚体，其中它们包含第一和第二XTEN序列，其中XTEN为相同或不同的，并且当与可比长度的序列进行最佳比对时，其中每个均独立地包括与选自表10或表11的XTEN或其片段相比具有至少约90％的序列同一性、或者90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的XTEN序列。在另一个实施方案中，主题缀合物为多聚体，其中它们包含第一、第二或第三XTEN序列，其中XTEN为相同或不同的，并且当与可比长度的序列进行最佳比对时，其中每个均独立地包括与选自表10或表11的XTEN或其片段相比具有至少约90％的序列同一性、或者90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的XTEN序列。在又一个实施方案中，主题缀合物为多聚体，其中它们包含3个、4个、5个、6个或更多XTEN序列，其中XTEN为相同或不同的，并且其中每个均独立地包括与选自表10或表
11的XTEN或其片段相比具有至少约80％的序列同一性、或者81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的XTEN序列。在多聚体缀合物中，XTEN序列中残基的累积长度大于约100至约
3000个氨基酸残基，或约400至约1000个氨基酸残基，并且XTEN在序列或在长度上可以是相同的或可以是不同的。如本文所用的，当超过一个XTEN并入缀合物中时，累积长度意在包含氨基酸残基的全长。
11的XTEN或其片段相比具有至少约80％的序列同一性、或者81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的XTEN序列。在多聚体缀合物中，XTEN序列中残基的累积长度大于约100至约
3000个氨基酸残基，或约400至约1000个氨基酸残基，并且XTEN在序列或在长度上可以是相同的或可以是不同的。如本文所用的，当超过一个XTEN并入缀合物中时，累积长度意在包含氨基酸残基的全长。
[0333] 本发明包含组合物和制备与小分子有效负载药物共价连接产生缀合物的CCD和/或XTEN的方法，以及与有效负载的生物活性蛋白质(包含肽或多肽)连同其他组分(例如，靶向部分和PCM)共价连接产生靶向缀合物组合物的CCD或XTEN的组合物。在另一个方面，本发明提供了与一种或多种药物、一个或多个靶向部分以及一个或多个肽切割部分(PCM)的有效负载相连接产生本发明的靶向缀合物组合物的CCD或XTEN的组合物。特别地，本发明提供了在疾病或病况的治疗中有用的这样的靶向缀合物组合物，有效负载药物和/或蛋白质的给药对于受试者中疾病或病况的治疗、缓解或预防有用。一些实施方案的靶向缀合物组合物通常包含下列组分的一种或多种：1)XTEN；2)CCD；3)交联体；4)有效负载，5)靶向部分，以及任选地5)组分与之重组融合或化学缀合的PCM；直接或通过使用交联体，诸如本文所述的可商购获得的交联体，或通过使用点击化学反应物，或在一些情况下，可通过CCD或XTEN中的反应性基团与有效负载之间的缀合产生，而不使用如本文所述的连接体。然而，在前述组合物类型的一些情况下，假如组分在其他方面是化学反应性的，可不使用交联体产生组合物。
[0334] CCD或XTEN与有效负载和靶向部分的缀合与未与CCD或XTEN连接的有效负载相比，向产生的组合物赋予了多种优势。如下文更充分的描述，增强的性质的非限制性实例包括增加的总溶解性和代谢稳定性、循环中降低的蛋白水解敏感性、降低的免疫原性、当皮下或肌内施用时降低的吸收速率、降低的肾清除率、借助靶向部分增强的与靶组织的相互作用伴随降低的毒性、有效负载的靶向递送、借助XTEN的屏蔽作用降低的有效负载组分的活性指导通过PCM切割释放、以及增强的药代动力学性质。特别地，特别考虑到根据一些实施方案的主题组合物是经设计的，使得它们具有增强的治疗指数和降低的毒性或副作用，通过XTEN的屏蔽作用和位阻的结合以及有效负载的靶向递送(通过在组合物中包含靶向部分来实现)和在靶组织附近或内部的释放(通过在组合物中包含肽切割部分来实现)产生以肽切割部分作为底物的蛋白酶来实现。此外，考虑到组合物将通过它们的设计和与XTEN的连接与相应的未与XTEN连接的有效负载相比具有增强的药代动力学性质，例如，增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍的终末半衰期、增加的曲线下面积(AUC)(例如，25％、50％、100％、200％、300％或更多)、更低的分布体积、皮下或肌内注射后更慢的吸收(与必须通过相似途径施用的有效负载的可商购获得形式相比的优势)，诸如Cmax较低，这转而导致有效负载的副作用减少，共同地导致施用至受试者的缀合组合物提供治疗活性的时间段延长。在一些实施方案中，该缀合组合物包含允许活性有效负载缓释的切割序列(在上文更充分地描述)，使得当皮下或肌内施用时，甚至在进入血液循环系统之后，施用的靶向缀合物组合物作为贮剂(depot)。特别考虑到，靶向缀合物组合物可展现出本文所公开的改善性质的一种或多种或任意组合。由于这些增强的性质，与未与靶向缀合物组合物连接并以类似方式施用的有效负载相比，靶向缀合物组合物允许更低的给药频率、更特定的给药和/或降低的毒性。如本文所述，这样的靶向缀合物组合物组合物具有通过向有需要的受试者施用有效负载治疗本领域已知的将会影响、缓解或预防的某些病况的效用。1.用于缀合的交联体反应物
[0335] 在另一个方面，本发明涉及与交联体缀合的CCD或XTEN，产生可用于制备靶向缀合物组合物的CCD-交联体和XTEN-交联体。特别地，本文所述的CCD-交联体和XTEN-交联体缀合物配偶体对于与携带至少一种的巯基、氨基、氨基氧、羧基、醛、醇、叠氮化物、炔烃或本领域已知的可获得且合适的用于本文所述的组分之间反应的任何其他反应性基团的有效负载剂缀合有用。
[0336] 在另一个方面，本发明涉及与交联体缀合的有效负载，产生可用于制备靶向缀合物组合物的有效负载-交联体缀合物。特别地，本文所述的有效负载-交联体配偶体对于与携带至少一种的巯基、氨基、氨基氧、羧基、醛、醇、叠氮化物、炔烃或本领域已知的可获得且合适的用于本文所述的组分之间反应的任何其他反应性基团的CCD或XTEN缀合有用。
[0337] CCD和XTEN的示例性实施方案已在上文描述，包括基本上同质的XTEN的制备。本发明提供了进一步作为有效负载可与之缀合的平台的CCD和XTEN，使得它们作为“载体”，赋予组合物期望的药代动力学、化学和药物性质，其中其他性质在下文描述。在其他实施方案中，本发明提供了编码可与编码肽或多肽有效负载的基因相连接的CCD或XTEN的多肽，该有效负载可并入表达载体并且并入合适的宿主用于主题重组融合蛋白的表达和回收。
[0338] 在一些实施方案中，如本文上述的CCD或XTEN组分工程化以并入可与交联体反应的确定数目的反应性氨基酸残基，或可进一步包含可用于与有效负载缀合的反应性基团。在一个实施方案中，本发明提供了包含一个或多个半胱氨酸残基的CCD，其中每个含有反应性巯基基团的半胱氨酸与交联体缀合产生CCD-交联体缀合物，或与巯基反应性有效负载缀合产生CCD-有效负载缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了半胱氨酸工程化的XTEN，诸如表11的序列，其中每个含有反应性巯基基团的半胱氨酸与交联体缀合产生XTEN-交联体缀合物，或与巯基反应性有效负载缀合产生XTEN-有效负载缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了具有α氨基基团的XTEN或赖氨酸工程化的XTEN，其中每个含有带正电荷的亲水ε氨基基团的赖氨酸与交联体缀合产生XTEN-交联体缀合物，或与胺反应性有效负载缀合产生XTEN-有效负载缀合物。在半胱氨酸工程化的XTEN的实施方案中，每个包含可用于缀合的约1至约100个半胱氨酸氨基酸、或1至约50个半胱氨酸氨基酸、或1至约40个半胱氨酸氨基酸、或1至约20个半胱氨酸氨基酸、或1至约10个半胱氨酸氨基酸、或1至约5个半胱氨酸氨基酸、或9个半胱氨酸、或3个半胱氨酸、或单个半胱氨酸氨基酸。在赖氨酸工程化的XTEN的实施方案中，每个包含可用于缀合的约1至约100个赖氨酸氨基酸、或1至约50个赖氨酸氨基酸、或1至约40个赖氨酸工程化的氨基酸、或1至约20个赖氨酸工程化的氨基酸、或1至约
10个赖氨酸工程化的氨基酸、或1至约5个赖氨酸工程化的氨基酸、或单个赖氨酸。在另一个实施方案中，工程化的XTEN同时包含前述数目范围的半胱氨酸和赖氨酸残基。在另一个实施方案中，本发明提供了CCD，其中每个包含约1至约10个半胱氨酸氨基酸、或1至约10个半胱氨酸氨基酸、或1至约3个半胱氨酸氨基酸。在一个实施方案中，本发明提供了CCD，其中并入的每个含有反应性巯基基团的半胱氨酸与交联体缀合，产生CCD-交联体缀合物。
10个赖氨酸工程化的氨基酸、或1至约5个赖氨酸工程化的氨基酸、或单个赖氨酸。在另一个实施方案中，工程化的XTEN同时包含前述数目范围的半胱氨酸和赖氨酸残基。在另一个实施方案中，本发明提供了CCD，其中每个包含约1至约10个半胱氨酸氨基酸、或1至约10个半胱氨酸氨基酸、或1至约3个半胱氨酸氨基酸。在一个实施方案中，本发明提供了CCD，其中并入的每个含有反应性巯基基团的半胱氨酸与交联体缀合，产生CCD-交联体缀合物。
[0339] 一般而言，半胱氨酸巯基基团比胺或羟基基团对于亲电子缀合试剂更有反应性(特别地，更亲核)。此外，在给定蛋白质中通常找到较小数目的半胱氨酸残基；因此更不可能产生在相同蛋白质中的多个缀合。已经通过基因工程技术将半胱氨酸残基引入蛋白质以形成与配体的共价连接或形成新的分子内二硫键(Better等人(1994)J.Biol.Chem.13:9644-9650；Bernhard等人(1994)Bioconjugate Chem.5:126-132；Greenwood等人(1994)Therapeutic Immunology 1:247-255；Tu等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci USA 96:4862-
4867；Kanno等人(2000)J.of Biotechnology,76:207-214；Chmura等人(2001)
Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98(15):8480-8484；美国专利号6,248,564)。
4867；Kanno等人(2000)J.of Biotechnology,76:207-214；Chmura等人(2001)
Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98(15):8480-8484；美国专利号6,248,564)。
[0340] 在一个实施方案中，本发明提供了包含与交联体缀合的半胱氨酸工程化的XTEN或CCD的分离组合物，其中该交联体选自巯基反应性的同双功能或异双功能交联体。在另一个实施方案中，本发明提供了包含通过交联体缀合的赖氨酸工程化的XTEN的分离组合物，其中该交联体选自胺反应性的同双功能或异双功能交联体。交联通常是指通过共价键化学连接两个或更多个分子的过程。该过程还根据其与蛋白质和其他生物分子的使用称为缀合或生物缀合。例如，可修饰蛋白质以改变N末端和C末端以及蛋白质和肽上的氨基酸侧链，以便封闭或暴露结合位点、使功能失活或改变官能团以产生用于交联的新靶标。
[0341] 在一个方面，本发明提供了用于与XTEN聚合物位点特异性缀合的方法，使用它们衍生物的化学活性氨基酸残基(例如，N末端α-胺基团、赖氨酸的ε-胺基团、半胱氨酸的巯基基团、C末端羧基基团、谷氨酸和天冬氨酸的羧基基团)来完成。适用于与一级α-和ε-氨基基团反应的官能团为氰尿酸氯、二氯三嗪、trezylate、碳酸苯并三唑、p-硝基苯基碳酸酯、三氯苯基碳酸酯、醛、混合酸酐、羰基咪唑、亚氨基酯、四氟苯基(TFP)和五氟苯基(PFP)酯、N-羟基丁二酰亚胺酯、N-羟基磺基丁二酰亚胺酯(Harris,J.M.,Herati,R.S.Polym.Prepr.(Am.Chem.Soc.,Div.Polym.Chem),32(1),154-155(1991)；Herman,S.,等人Macromol.Chem.Phys.195,203-209(1994)；Roberts,M.J.等人Advanced Drug Delivery Reviews,54,459-476(2002))。N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-酯和它们的水溶性类似物磺基-NHS-酯)常用于蛋白质缀合(参见图2)。在与伯胺反应时，伴随在生理pH下相对有效的缀合，NHS-酯产生稳定的酰胺产物。缀合反应通常在50-200mM磷酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、HEPES或硼酸盐缓冲液(pH在7和9之间)中在4℃至室温下进行0.5至2小时。NHS-酯通常以相对于蛋白质两倍至50倍的摩尔过量使用。通常，试剂的浓度可从0.1-10mM变化，而最佳蛋白质浓度为50-100μM。
[0342] 在另一个方法中，考虑到XTEN多肽仅拥有单个N末端α-氨基基团，可使XTEN工程化为含有有意并入的赖氨酸残基的额外ε-氨基基团；其示例性序列提供于表11中。α-和ε-氨基基团具有不同的pKa值，对于N末端氨基酸的α-氨基基团为约7.6至8.0，并且对于赖氨酸的ε-氨基基团为约10-10.5。这样的pKa值的显著差异可用于选择性修饰氨基基团。所有伯胺的去质子化都在大于pH 8.0的pH下进行。在该环境中，不同胺的亲核性质决定了它们的反应性。当去质子化时，更亲核的赖氨酸的ε-氨基基团对于亲电体通常比α-氨基基团更有反应性。在另一方面，在较低pH(例如pH 6)下，更具酸性的α-氨基基团通常比ε-氨基基团更去质子化，并且反应性顺序颠倒。例如，FDA批准的药物Neulasta(pegfilgranstim)是通过20kDa PEG-醛的共价连接修饰的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。通过利用内部赖氨酸的α-氨基基团比ε-氨基基团更低的pKa达到蛋白质N末端氨基酸的特异性修饰(Molineaux,G.Curr.Pharm.Des.10,1235-1244(2004)，美国专利5,824,784)。
[0343] 包含半胱氨酸残基的CCD和XTEN多肽可使用本文所述的重组方法或通过本领域已知的标准方法来基因工程化(参见例如，实施例)。可使用高度特异性反应进行与巯基基团的缀合，导致通过交联体结合的单个缀合种类的形成。适用于与半胱氨酸巯基基团反应的官能团为N-马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。当反应混合物的pH为pH6.5和7.5之间时，马来酰亚胺基团与巯基基团特异性反应，形成不可逆的稳定硫醚连接(参见图3)。在中性pH下，马来酰亚胺与巯基的反应比与胺的反应快1000倍，但是当pH提高到大于8.5时，反应有利于伯胺。马来酰亚胺不与酪氨酸、组氨酸或蛋氨酸反应。对于反应溶液，必须从伴随马来酰亚胺使用的反应缓冲液排除巯基，因为它们将竞争缀合位点。可通过添加游离巯基在反应结束时猝灭反应中过量的马来酰亚胺，而EDTA可包含在缀合缓冲液中以使巯基的氧化最小化。
[0344] 在另一个实施方案中，本发明考虑到使用对于使CCD或XTEN或有效负载的巯基基团交联有用的卤代乙酰基试剂，以制备主题缀合物。最常用的卤代乙酰基试剂含有在生理pH下与巯基基团反应的碘代乙酰基基团。碘代乙酰基基团与巯基的反应通过碘与巯基的亲核取代产生稳定的硫醚连接来进行(参见图4)。在pH 8.3下，使用相对于巯基基团的数目轻微过量的碘代乙酰基基团确保巯基的选择性。如果使用大量过量的碘代乙酰基团，则碘代乙酰基团可与其他氨基酸反应。在pH 6.9-7.0下，咪唑可与碘代乙酰基基团反应，但是温育通常必须进行超过一周。组胺酰基侧链和氨基基团分别在大于pH 5和pH 7下以未质子化形式与碘代乙酰基基团反应。在另一个实施方案中，对于巯基基团有用的交联体为吡啶基二硫化物。吡啶基二硫化物与巯基基团在广泛的pH范围(最佳pH为4-5)反应，以形成将CCD或XTEN与有效负载连接的二硫键(参见图5)。作为二硫化物，使用这些试剂制备的缀合物是可切割的。在反应期间，在分子的-SH基团和2-吡啶基二硫酚基团之间发生二硫键交换。结果释放了吡啶-2-硫酮。这些试剂可用作交联体并向蛋白质中引入巯基基团。二硫键交换可在生理pH下进行，虽然反应速率较慢。
[0345] 可使用化学活性氨基酸残基或它们的衍生物(例如，N末端α-氨基基团、赖氨酸的ε-氨基基团、半胱氨酸的巯基基团、C末端氨基酸的羧基基团、天冬氨酸或谷氨酸的羧基基团)制备包含活性合成肽或多肽的靶向缀合物组合物。不考虑最初的氨基酸序列，每个肽都含有N末端α-氨基基团。如果必要的话，在活性肽/多肽的化学反应时，N末端α氨基基团可仍然被保护/封闭。合成肽/多肽可含有额外的赖氨酸的ε-氨基基团，其可以是天然的或对于缀合特定取代的。
[0346] 因为半胱氨酸在天然肽和蛋白质序列中比赖氨酸更不丰富，使用半胱氨酸作为用于缀合的位点降低了反应中与XTEN-交联体分子的多次缀合的可能性。这还降低了缀合时肽/蛋白质失活的可能性。此外，与半胱氨酸位点的缀合往往可以定义明确的形式进行，导致形成单一种类的多肽缀合物。在一些情况下，半胱氨酸可存在于将要缀合的肽的氨基酸序列中。在这样的情况下，可使用标准方法重组地或合成地将半胱氨酸残基添加到肽的N末端或C末端。或者，选择的氨基酸可对半胱氨酸进行化学或基因修饰。例如，对半胱氨酸的丝氨酸修饰被认为是保守突变。将巯基基团引入缺乏半胱氨酸的肽的另一个途径是使用巯基化试剂对赖氨酸ε-氨基的化学修饰，该试剂诸如2-亚氨基噻吩(Traut’s试剂)、SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯)、SATP(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代丙酸酯)、SAT-PEO4-Ac(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基(硫代四甘醇))、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、LC-SPDP(琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯)(在下文更充分地描述)。如上所述，一旦将独特的巯基基团引入肽中，其可通过含有巯基反应性的化合物选择性修饰，诸如N-马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。
[0347] 可通过多种连接化学法实现CCD或XTEN多肽与肽、蛋白质或小分子药物有效负载之间的缀合，包括根据本领域已知且可获得的方法可商购获得的零长度、同双功能或异双功能和多功能交联体化合物，诸如例如R.F .Taylor(1991)“Protein immobilization.Fundamentals and Applications”,Marcel Dekker Inc.,N.Y.；
G.T.Hermanson等人(1992)“Immobilized Affinity Ligand Techniques”,Academic Press,San Diego；G.T.Hermanson(2008)“Bioconjugate Techniques”,第二版Elsevier,Inc.,S.S.Wong(1991)“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”,CRC Press,Boca Raton中所述的化合物。用于在制备本发明的缀合物中使用的合适交联体可商购获得于诸如Sigma-Aldrich、Thermo Scientific(Pierce and Invitrogen Protein Research Products)、ProteoChem、G-Biosciences等公司。交联体的优选实施方案包括巯基反应性官能团或氨基反应性官能团。示例性的交联体的列表提供于表23中。
表23：示例性交联体
G.T.Hermanson等人(1992)“Immobilized Affinity Ligand Techniques”,Academic Press,San Diego；G.T.Hermanson(2008)“Bioconjugate Techniques”,第二版Elsevier,Inc.,S.S.Wong(1991)“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”,CRC Press,Boca Raton中所述的化合物。用于在制备本发明的缀合物中使用的合适交联体可商购获得于诸如Sigma-Aldrich、Thermo Scientific(Pierce and Invitrogen Protein Research Products)、ProteoChem、G-Biosciences等公司。交联体的优选实施方案包括巯基反应性官能团或氨基反应性官能团。示例性的交联体的列表提供于表23中。
表23：示例性交联体
[0348] 交联体的非限制性实例为BMB(1,4-双-马来酰亚胺基丁烷)、BMDB(1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷)、BMH(双-马来酰亚胺基己烷)、BMOE(双-马来酰亚胺基乙烷)、BMPH(N-(β-马来酰亚胺基丙酸)酰肼)、BMPS(N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)琥珀酰亚胺酯)、BM(PEG)2(1,8-双-马来酰亚胺基二甘醇)、BM(PEG)3(1,11-双-马来酰亚胺基三甘醇)、BS2G(双(磺基琥珀酰亚胺基)戊二酸酯)、BS3(磺基-DSS)(双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)、BS[PEG]5(双(NHS)PEG5)、BS(PEG)9(双(NHS)PEG9)、BSOCOES(双(2-[琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基]乙基)砜)、C6-SANH(C6-琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸丙酮腙)、C6-SFB(C6-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯)、DCC(N,N-二环己基碳二亚胺)、DPDPB(1,4-二-(3'-[2'吡啶基二硫]丙酰胺基)丁烷)、DSG(二琥珀酰亚胺基戊二酸酯)、DSP(二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，Lomant’s试剂)、DSS(二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、DST(二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)、DTME(二硫双-马来酰亚胺基乙烷)、DTSSP(磺基-DSP)(3,3'-二硫双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯))、EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))、EMCA(N-ε-马来酰亚胺基己酸)、EMCH(N-(ε-马来酰亚胺基己酸)酰肼)、EMCS(N-(ε-马来酰亚胺基己酰基氧基)琥珀酰亚胺酯)、GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯)、KMUA(N-κ-马来酰亚胺基十一酸)、KMUH(N-(κ-马来酰亚胺基十一酸)酰肼)、LC-SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯))、LC-SPDP(琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯)、MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼)、SBAP(琥珀酰亚胺基3-(溴代乙酰胺基)丙酸酯)、SFB(琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯)、SHTH(琥珀酰亚胺基4-酰肼对苯二酸酯)、SIA(N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸酯)、SM[PEG]2(NHS-PEG2-马来酰亚胺)、SM[PEG]4(NHS-PEG4-马来酰亚胺)、SM(PEG)6(NHS-PEG6-马来酰亚胺)、SM[PEG]8(NHS-PEG8-马来酰亚胺)、SM[PEG]12(NHS-PEG12-马来酰亚胺)、SM(PEG)24(NHS-PEG24-马来酰亚胺)、SMPB(琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基-苯基)丁酸酯)、SMPH(琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯)、SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯)、SPB(琥珀酰亚胺基-(4-补骨脂素-8-基氧基)丁酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、磺基-DST(磺基二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)、磺基-EGS(乙二醇双(磺基-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))、磺基-EMCS(N-(ε-马来酰亚胺基己酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-KMUS(N-(κ-马来酰亚胺基十一酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-LC-SMPT(磺基琥珀酰亚胺基6-(α-甲基-α-[2-吡啶基二硫]-甲苯酰胺基)己酸酯)、磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯)、磺基-MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SIAB(磺基琥珀酰亚胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)、磺基-SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、TMEA(三-(2-马来酰亚胺基乙基)胺)、TSAT(三-(琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯))。
[0349] 在一些实施方案中，使用交联试剂将CCD-缀合物或XTEN-缀合物引入非天然间隔臂。然而，在优选天然肽键的情况下，本发明提供了可使用经由羧酸酯基团的活化起作用的零长度交联体进行的反应。在其实施方案中，为了达到反应选择性，第一多肽必须仅含有游离的C末端羧基基团，而所有赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸侧链是受保护的，并且第二肽/蛋白质N末端α-胺必须是唯一可获得的未保护氨基基团(需要任何赖氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺均受保护)。在这样的情况下，优选使用表10的XTEN AG家族序列，该序列在XTEN-缀合物或XTEN-交联体中没有作为第一多肽的谷氨酸。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含AG XTEN序列的XTEN-交联体和XTEN-缀合物，其中该组合物使用零长度交联体与有效负载缀合。实施方案中利用的示例性零长度交联体包括但不限于DCC(N,N-二环己基碳二亚胺)和EDC(1-乙基-3-(3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，其中交联体用于将一个分子(诸如有效负载)的羧基官能团直接与另一个分子的伯胺缀合，诸如具有该官能团的有效负载(参见图6)。使用磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)作为用于缀合的催化剂，提高反应效率(Grabarek Z,Gergely J.Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters.(1990)Anal.Biochem.185(1),131-135)。
EDC与羧酸基团反应，并且激活羧酸基团以形成活性O-酰基异脲中间体，允许其在反应混合物中与氨基基团耦合。O-酰基异脲中间体在水溶液中是不稳定的，在两步缀合过程中不使用N-羟基琥珀酰亚胺增加稳定性则使该中间体无效。该中间体与伯胺反应以形成酰胺衍生物。交联反应通常在pH 4.5至5之间进行，并且对于许多应用仅需几分钟。然而，在4.5至7.5的pH下，反应的产率相似。EDC的水解是缀合期间的竞争反应，并且取决于温度、pH和缓冲组合物。4-吗啉乙磺酸(MES)是有效的碳二亚胺反应缓冲液。磷酸盐缓冲液降低了EDC的反应效率，但增加EDC的量可补偿降低的效率。Tris、甘氨酸和乙酸盐缓冲液不可用作缀合缓冲液。
EDC与羧酸基团反应，并且激活羧酸基团以形成活性O-酰基异脲中间体，允许其在反应混合物中与氨基基团耦合。O-酰基异脲中间体在水溶液中是不稳定的，在两步缀合过程中不使用N-羟基琥珀酰亚胺增加稳定性则使该中间体无效。该中间体与伯胺反应以形成酰胺衍生物。交联反应通常在pH 4.5至5之间进行，并且对于许多应用仅需几分钟。然而，在4.5至7.5的pH下，反应的产率相似。EDC的水解是缀合期间的竞争反应，并且取决于温度、pH和缓冲组合物。4-吗啉乙磺酸(MES)是有效的碳二亚胺反应缓冲液。磷酸盐缓冲液降低了EDC的反应效率，但增加EDC的量可补偿降低的效率。Tris、甘氨酸和乙酸盐缓冲液不可用作缀合缓冲液。
[0350] 本发明还提供了组合物，其中靶向缀合物组合物的三个组分，诸如式VIII、下面或图34中所描绘的，其中两个XTEN通过三价交联体与融合蛋白相连接，产生三聚缀合物。本发明还考虑到构型，其中式I-VII的融合蛋白的三个分子通过融合蛋白的半胱氨酸工程化的XTEN组分使用三聚体交联体连接。可基于具有表24中所述的多种反应侧基的合成多肽Ac-Cys-Ser-Pro-Cys-Ser-Pro-Cys-NH2或Ac-Lys-Ser-Pro-Lys-Ser-Pro-Lys-NH2使用标准缀合技术产生三聚体交联体。表24：三价交联体
[0351] 在其他实施方案中，可使用广泛的交联体组将CCD或XTEN与有效负载缀合，包括由间隔臂(线性或支链的)和两个或更多个能够将特定官能团(例如，伯胺、巯基等)连接在蛋白质或其他分子上的反应端组成的交联体。线性交联体可以是同双功能或异双功能的。同双功能交联体具有两个相同的反应性基团，该基团用于在一步反应过程中交联蛋白质。胺反应性同双功能交联体的非限制性实例为BS2G(双(磺基琥珀酰亚胺基)戊二酸酯)、BS3(磺基-DSS)(双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)、BS[PEG]5(双(NHS)PEG5)、BS(PEG)9(双(NHS)PEG9)、BSOCOES(双(2-[琥珀酰亚胺氧基羰基氧]乙基)砜)、DSG(二琥珀酰亚胺基戊二酸酯)、DSP(二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(Lomant试剂)、DSS(二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、DST(二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)DTSSP(磺基-DSP)(3,3'-二硫双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯))、EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))、磺基-EGS(乙二醇双(磺基-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))。
[0352] 此外，在组合物中和产生CCD-缀合物和/或XTEN-缀合物和/或CCD-交联体和/或XTEN-交联体组合物的方法中使用的同双功能交联体的实例为巯基反应剂，诸如BMB(1,4-双-马来酰亚胺基丁烷)、BMH(双-马来酰亚胺基己烷)、BMDB(1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷)、BMOE(双-马来酰亚胺基乙烷)、BM(PEG)2(1,8-双-马来酰亚胺基二甘醇)、BM(PEG)3(1,11-双-马来酰亚胺基三甘醇)、DPDPB(1,4-二-(3'-[2'吡啶基二硫]丙酰胺基)丁烷)、DTME(二硫双-马来酰亚胺基乙烷)。
[0353] 对于用于随后与有效负载缀合的CCD-交联体和XTEN-交联体缀合物的产生，优选异双功能交联体，因为该交联体可控制顺序反应。因为异双功能交联体拥有两个不同的反应性基团，所以它们在组合物中的使用允许了顺序的两步缀合。异双功能试剂使用更不稳定的基团与第一蛋白质反应。在一个实施方案中，异双功能交联体与CCD或XTEN中反应性基团的缀合分别产生CCD-交联体或XTEN-交联体缀合物。在完成反应并去除过量的未反应交联体后，可将经修饰的蛋白质(诸如XTEN-交联体)添加至有效负载，该有效负载与该交联体的第二反应性基团相互作用，产生CCD-缀合物或XTEN-缀合物。最常用的异双功能交联体在一端含有胺反应性基团，并在另一端含有巯基反应性基团。因此，这些交联体适用于与半胱氨酸-或赖氨酸工程化的XTEN一起使用，或与XTEN的N末端的α-氨基基团一起使用。异双功能交联体的非限制性实例为AMAS(N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)琥珀酰亚胺酯)、EMCS(N-(ε-马来酰亚胺基乙酰基氧基)琥珀酰亚胺酯)、GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯)、LC-SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯))、LC-SPDP(琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯)、MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SBAP(琥珀酰亚胺基3-(溴代乙酰胺基)丙酸酯)、SIA(N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸酯)、SM[PEG]2(NHS-PEG2-马来酰亚胺)、SM[PEG]4(NHS-PEG4-马来酰亚胺)、SM(PEG)6(NHS-PEG6-马来酰亚胺)、SM[PEG]8(NHS-PEG8-马来酰亚胺)、SM[PEG]12(NHS-PEG12-马来酰亚胺)、SM(PEG)24(NHS-PEG24-马来酰亚胺)、SMPB(琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基-苯基)丁酸酯)、SMPH(琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯)、SMPT(4-琥珀酰亚胺氧基羰基-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、磺基-EMCS(N-(ε-马来酰亚胺基乙酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-KMUS(N-(κ-马来酰亚胺基十一酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-LC-SMPT(磺基琥珀酰亚胺基6-(α-甲基-α-[2-吡啶基二硫]-甲苯氨基)己酸酯)、磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯)、磺基-MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SIAB(磺基琥珀酰亚胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)、磺基-SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)。允许含胺和巯基的分子共价缀合的异双功能交联体的实例为磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)。磺基-SMCC为SMCC的水溶性类似物，可在水性缓冲液中制备到高达10mM的浓度。该交联体的间隔臂中的环己烷环与不含该环的相似试剂相比降低了马来酰亚胺基团的水解率。该特征使已用SMCC或磺基-SMCC进行马来酰亚胺激活后的CCD或XTEN能够被冻干并储存以供后续与含巯基分子的缀合。因此，在一个实施方案中，本发明提供了具有XTEN的XTEN-交联体，当进行最佳比对时，与选自表11的序列或序列片段具有至少约80％的序列同一性，或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的序列同一性或与之相同，其中XTEN-交联体具有与XTEN的α-氨基基团或赖氨酸工程化的XTEN的ε胺相连接的一种或多种磺基-SMCC交联体。在另一个实施方案中，本发明提供了具有XTEN的XTEN-交联体，当进行最佳比对时，与选自表10的序列或序列片段具有至少约80％序列同一性，或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约
98％、或约99％的序列同一性或与之相同，其中该XTEN-交联体具有与XTEN的N末端的氨基基团相连接的一个磺基-SMCC。前述的异双功能交联体经由单个胺和单个半胱氨酸使两个分子缀合。针对与蛋白质中二硫桥的位点特异性缀合，开发了特殊类型的交联体(Balan S.等人Site-specific PEGylation of protein disulfide bonds using a three-carbon bridge.(2007)Bioconjugate Chem.18,61-76；Brocchini S.等人Disulfide bridge based PEGylation of proteins.(2008)Advanced Drug Delivery Reviews 60,3-12)。首先，将连接体合成为胺特异性4-[2,2-双[p-甲苯磺酰基)甲基]乙酰基)苯甲酸–NHS酯。该分子可与CCD或XTEN的氨基基团共价连接，分别产生双(砜)或XTEN-双(砜)。后一分子在pH
7.8的50mM磷酸钠缓冲液中的温育将会导致甲苯亚磺酸的消除，以生成XTEN-α,β-不饱和β’-单砜。得到的分子将以位点特异性方式与含有二硫桥的有效负载蛋白质反应。在第一步中，通过还原将二硫桥转化为两个巯基。在第二步中，CCD-单砜或XTEN-单砜使两个半胱氨酸双-烷基化，产生化学稳定的三碳桥。相同的α,β-不饱和β’-单砜不仅可用于与衍生自二硫桥的两个巯基基团缀合，还可用于与多组氨酸标签缀合(Cong Y.等人Site-specific PEGylation at histidine tags.(2012)Bioconjugate Chem.23,248-263)。
98％、或约99％的序列同一性或与之相同，其中该XTEN-交联体具有与XTEN的N末端的氨基基团相连接的一个磺基-SMCC。前述的异双功能交联体经由单个胺和单个半胱氨酸使两个分子缀合。针对与蛋白质中二硫桥的位点特异性缀合，开发了特殊类型的交联体(Balan S.等人Site-specific PEGylation of protein disulfide bonds using a three-carbon bridge.(2007)Bioconjugate Chem.18,61-76；Brocchini S.等人Disulfide bridge based PEGylation of proteins.(2008)Advanced Drug Delivery Reviews 60,3-12)。首先，将连接体合成为胺特异性4-[2,2-双[p-甲苯磺酰基)甲基]乙酰基)苯甲酸–NHS酯。该分子可与CCD或XTEN的氨基基团共价连接，分别产生双(砜)或XTEN-双(砜)。后一分子在pH
7.8的50mM磷酸钠缓冲液中的温育将会导致甲苯亚磺酸的消除，以生成XTEN-α,β-不饱和β’-单砜。得到的分子将以位点特异性方式与含有二硫桥的有效负载蛋白质反应。在第一步中，通过还原将二硫桥转化为两个巯基。在第二步中，CCD-单砜或XTEN-单砜使两个半胱氨酸双-烷基化，产生化学稳定的三碳桥。相同的α,β-不饱和β’-单砜不仅可用于与衍生自二硫桥的两个巯基基团缀合，还可用于与多组氨酸标签缀合(Cong Y.等人Site-specific PEGylation at histidine tags.(2012)Bioconjugate Chem.23,248-263)。
[0354] 在两步法中通常进行使用交联体组合物与磺基SMCC的缀合。在一个实施方案中，在例如磷酸盐缓冲盐水(PBS＝100mM硫酸钠，150mM氯化钠，pH 7.2)或pH 6.5-7.5下的类似不含胺和巯基缓冲液的缀合缓冲液中制备含胺蛋白质。将EDTA添加到1-5mM帮助与二价金属螯合，从而减少含巯基蛋白质中二硫化物的形成。含胺蛋白质的浓度决定了将要使用的交联体摩尔过量。通常，在<1mg/ml的蛋白质样品中利用40-80倍的摩尔过量，1-4mg/ml的蛋白质样品利用20倍的摩尔过量，并且5-10mg/ml的蛋白质样品中利用5倍至10倍的交联体摩尔过量。反应混合物(含胺蛋白质和交联体)在室温下温育30分钟或在4℃下温育2小时，然后使用与缀合缓冲液相平衡的脱盐柱去除过量的交联体。在制备CCD-交联体或XTEN-交联体的情况下，组合物将保持在该点。在CCD-交联体或XTEN-交联体与有效负载缀合的实施方案中，含巯基有效负载和交联体缀合物以对应于期望用于最终缀合物(考虑每CCD或XTEN分子预期的与一个或多个氨基基团缀合的交联体的数目)并与有效负载上存在的单个巯基基团相一致的摩尔比混合。反应混合物在室温下温育30分钟或在4℃下温育2小时。可通过SDS-PAGE然后通过蛋白质染色或通过适当的分析色谱技术如反相HPLC或阳离子/阴离子交换色谱法来估算缀合效率。
[0355] 在一个实施方案中，本发明提供了使用多价交联体产生的缀合物组合物，导致使用组合物Ac-(Lys*-Ser-Pro)n-Lys*-NH2(其中n＝1、2、3、4、5等，且Lys*为具有叠氮化物、马来酰亚胺、碘代乙酰基、溴代乙酰基等修饰的ε-氨基基团的赖氨酸)的合成肽的具有2、3、4、5、6个或更多XTEN的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了使用多价交联体产生的缀合物组合物，产生具有与1、2、3、4、5、6个或更多不同有效负载相连接的2、3、4、5、6个或更多XTEN的组合物。多价三功能交联体的非限制性实例为“Y-形”巯基反应性TMEA(三-(2-马来酰亚胺基乙基)胺)和胺反应性TSAT(三-(琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯)。可使用线性或支链的支架聚合物设计用于多价组合物的反应部分的任意组合。不受特定理论约束，具有通过三功能连接体连接的三个XTEN的缀合物组合物(有效负载转而经由并入的半胱氨酸残基与CCD连接)与单价XTEN组合物相比，可对构建体的每个“臂”利用成比例缩短的XTEN，其中相同的有效负载数目与每个CCD并入的半胱氨酸氨基残基相连接，并且得到的三聚靶向缀合物组合物将具有与单体XTEN-缀合物组合物可比的表观分子量和流体动力学半径，然而将具有较低的黏度，有助于组合物通过小口径针向受试者的施用，并且由于组合物与具有相等XTEN氨基酸数目的单价组合物相比减小的位阻和增加的柔性，将从有效负载提供相等或更好的效力。
[0356] 交联体可归类为“同双功能”或“异双功能”，其中同双功能交联体具有两个或更多个相同反应性基团，并在一步反应过程中使用以与含有相似官能团的分子随机连接或聚合，而异双功能交联体拥有不同的反应性基团，允许具有各自靶标官能团的分子的单步缀合或允许使不期望的聚合或自缀合最小化的顺序(两步)缀合。在优选的实施方案中，其中将CCD-交联体或XTEN-交联体制备并分离为用于随后反应的组合物，该CCD-交联体或XTEN-交联体与异双功能交联体连接，并且具有可用于随后反应的至少一个反应性基团。
[0357] 在一个实施方案中，本发明提供了利用具有二硫键的可切割交联体缀合的缀合物组合物。通常，切割受二硫键还原剂的影响，诸如β-巯基乙醇、DTT、TCEP，然而，特别考虑到这样的组合物将在具有内源性还原剂(诸如半胱氨酸和谷胱甘肽)的条件下以缓释的方式内源性切割。以下是这样的交联体的非限制性实例：DPDPB(1,4-二-(3'-[2'吡啶基二硫]丙酰胺基)丁烷)、DSP(二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(Lomant试剂)、DTME(二硫双-马来酰亚胺基乙烷)、DTSSP(磺基-DSP)(3,3'-二硫双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯))、LC-SPDP(琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯)、SMPT(4-琥珀酰亚胺氧基羰基-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、磺基-LC-SMPT(磺基琥珀酰亚胺基6-(α-甲基-α-[2-吡啶基二硫]-甲苯氨基)己酸酯)、磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯)。在另一个实施方案中，可在碱性条件下切割包含BSOCOES(双(2-[琥珀酰亚胺氧基羰基氧]乙基)砜)的XTEN-缀合物。在另一个实施方案中，可通过高碘酸酯氧化来切割包含DST(二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)和BMDB(1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷)的XTEN-缀合物。通过羟胺切割EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))和磺基-EGS(乙二醇双(磺基-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))，但将有望进行内源性切割，使得将从缀合物释放活性有效负载。
[0358] 通常，上述缀合试剂假设交联体是反应性的，具有其他稳定且惰性的基团，诸如胺、巯基和羧基。在其他实施方案中，本发明提供了基于用通常对生物聚合物稳定且不活泼但对彼此高度反应性的两个官能团单独修饰CCD、XTEN和有效负载的不同缀合途径。在点击化学的概念下已经将多种正交反应分组，这提供了具有良好稳定性性质并因此特别适合作为用于在单独反应中与有效负载随后缀合的试剂的XTEN-叠氮化物/炔烃反应物(Kolb H.C.,Finn M.G.,Sharpless K.B.Click chemistry:diverse chemical function from a few good reactions.(2001)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.40(11),2004-2021)。通常，将点击化学用作反应概念，该概念包含的反应涉及(1)炔烃-叠氮化物；(2)“烯”-硫醇，以及(3)醛-酰肼，并且本发明考虑到对所有这三种的使用。一个实例为炔烃对叠氮化物的Huisgen 1,3-两极环加成，以形成1,4-二取代-1,2,3-三唑，示于图7中。可通过N末端α氨基基团、赖氨酸的ε-氨基基团和半胱氨酸的巯基基团的化学修饰将叠氮化物和炔烃部分引入肽/蛋白质或药物有效负载或引入XTEN。表25提供了考虑在制备缀合物组合物中使用的点击化学反应物的非限制性实例，其中预期的缀合物的一个组分(CCD、XTEN或有效负载)与表的反应物1反应，且第二组分(CCD、XTEN或有效负载)与表的叠氮化物反应物2反应。例如，使用胺反应性炔烃对一个分子进行炔烃部分修饰，该炔烃诸如3-炔丙基氧丙酸、NHS酯、乙炔-PEG4-NHS酯、二苄基环辛炔(DBCO)-NHS酯、DBCO-PEG4-NHS酯、环辛炔(COT)-PEG2-NHS酯、COT-PEG3-NHS酯、COT-PEG4-NHS酯、COT-PEG2-五氟苯基(PFP)酯、COT-PEG3-PFP酯、COT-PEG4-PFP酯、BCOT-PEG2-NHS酯、BCOT-PEG3-NHS酯、BCOT-PEG4-NHS酯、BCOT-PEG2-PFP酯、BCOT-PEG3-PFP酯、BCOT-PEG4-PFP酯。或者，用巯基反应性炔烃修饰分子，该炔烃诸如乙炔-PEG4-马来酰亚胺、DBCO-马来酰亚胺或DBCO-PEG4-马来酰亚胺。用叠氮化物-PEG2-NHS酯、叠氮化物-PEG3-NHS酯、叠氮化物-PEG4-NHS酯、叠氮化物-PEG2-PFP酯、叠氮化物-PEG3-PFP酯、叠氮化物-PEG4-PFP酯或叠氮化物-PEG4-马来酰亚胺修饰第二分子。叠氮化物和炔烃部分可互换使用；它们对于生物分子和水环境是生物独特、稳定且惰性的。叠氮化物和炔烃反应物在混合时形成不可逆的共价键，而没有任何副反应(Moses J.E.和Moorhouse A.D.The growing applications of click chemistry.(2007)Chem.Soc.Rev.36,1249–1262；Breinbauer R.和 M.Azide-alkyne coupling:a powerful reaction for bioconjugate
chemistry.(2003)ChemBioChem 4(11),1147–1149；Rostovtsev V.V.,Green L.G.,Fokin V.V.,Sharpless K.B.A stepwise Huisgen cycloaddition process:copper(I)-
catalyzed regioselective"ligation"of azides and terminal alkynes.(2002)Angew Chem Int Ed Engl.41(14),2596-2599)。在一个实施方案中，本发明提供了包含与第二XTEN缀合的第一XTEN的缀合物，其中第一XTEN与来自表25的炔烃反应物1相连接，第二XTEN与来自表25的叠氮化物反应物2相连接，并且然后第一XTEN和第二XTEN在使炔烃反应物1和叠氮化物反应物2有效反应的条件下连接，产生XTEN-XTEN缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了包含与有效负载缀合的第一CCD的缀合物，其中第一CCD与来自表25的炔烃反应物1相连接，有效负载与来自表25的叠氮化物反应物2相连接，并且然后CCD和有效负载在使炔烃反应物1和叠氮化物反应物2有效反应的条件下连接，产生CCD-有效负载-缀合物。在又一个实施方案中，本发明提供了包含与有效负载缀合的第一CCD的缀合物，其中第一CCD与来自表25的叠氮化物反应物2相连接，有效负载与来自表25的炔烃反应物1相连接，并且然后CCD和有效负载在使炔烃反应物1和叠氮化物反应物2有效反应的条件下连接，产生CCD-有效负载缀合物。在前述实施方案中，影响反应的条件为本文所述的条件或本领域已知用于这样的反应物缀合的反应条件。本发明还考虑到前述缀合物的多种组合；例如，CCD-有效负载缀合物，其中通过点击化学反应物连接组分，并且其中一个CCD进一步包含使用点击化学与CCD缀合的有效负载的一个或多个分子，XTEN-CCD缀合物，其中组分通过点击化学反应物相连接，其中一个CCD进一步包含使用点击化学与CCD缀合的第一有效负载的一个或多个分子，且XTEN进一步包含使用点击化学与XTEN缀合的第二有效负载的一个或多个分子。这些组合的额外变化将对本领域普通技术人员显而易见。
表25：烯烃和叠氮化物点击化学反应物
*可以是NHS酯或磺基-NHS酯
chemistry.(2003)ChemBioChem 4(11),1147–1149；Rostovtsev V.V.,Green L.G.,Fokin V.V.,Sharpless K.B.A stepwise Huisgen cycloaddition process:copper(I)-
catalyzed regioselective"ligation"of azides and terminal alkynes.(2002)Angew Chem Int Ed Engl.41(14),2596-2599)。在一个实施方案中，本发明提供了包含与第二XTEN缀合的第一XTEN的缀合物，其中第一XTEN与来自表25的炔烃反应物1相连接，第二XTEN与来自表25的叠氮化物反应物2相连接，并且然后第一XTEN和第二XTEN在使炔烃反应物1和叠氮化物反应物2有效反应的条件下连接，产生XTEN-XTEN缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了包含与有效负载缀合的第一CCD的缀合物，其中第一CCD与来自表25的炔烃反应物1相连接，有效负载与来自表25的叠氮化物反应物2相连接，并且然后CCD和有效负载在使炔烃反应物1和叠氮化物反应物2有效反应的条件下连接，产生CCD-有效负载-缀合物。在又一个实施方案中，本发明提供了包含与有效负载缀合的第一CCD的缀合物，其中第一CCD与来自表25的叠氮化物反应物2相连接，有效负载与来自表25的炔烃反应物1相连接，并且然后CCD和有效负载在使炔烃反应物1和叠氮化物反应物2有效反应的条件下连接，产生CCD-有效负载缀合物。在前述实施方案中，影响反应的条件为本文所述的条件或本领域已知用于这样的反应物缀合的反应条件。本发明还考虑到前述缀合物的多种组合；例如，CCD-有效负载缀合物，其中通过点击化学反应物连接组分，并且其中一个CCD进一步包含使用点击化学与CCD缀合的有效负载的一个或多个分子，XTEN-CCD缀合物，其中组分通过点击化学反应物相连接，其中一个CCD进一步包含使用点击化学与CCD缀合的第一有效负载的一个或多个分子，且XTEN进一步包含使用点击化学与XTEN缀合的第二有效负载的一个或多个分子。这些组合的额外变化将对本领域普通技术人员显而易见。
表25：烯烃和叠氮化物点击化学反应物
*可以是NHS酯或磺基-NHS酯
[0359] 在一些实施方案中，使用通过自由基反应(称为硫醇-烯反应)或阴离子反应(称为硫醇Michael加成)进行的基于硫代-烯的点击化学使XTEN-缀合物和CCD-缀合物缀合(Hoyle C.E.和Bowman C.N.Thiol-ene click chemistry.(2010)Angew.Chem.Int.Ed.49,
1540-1573)。特别地，据认为硫醇Michael加成更适用于靶向缀合物组合物，其中有效负载为蛋白质(Pounder R.J.等人Metal free thiol-maleimide'Click'reaction as a mild functionalisation strategy for degradable polymers.(2008)Chem Commun(Camb).41,5158-5160)。因为至少一个分子需要含有自由巯基基团，所以如果有效负载不含半胱氨酸则可利用CCD。或者，可通过使用硫醇化试剂对XTEN、CCD或有效负载肽/蛋白质的N末端α-氨基基团或赖氨酸ε-氨基基团的化学修饰引入巯基基团，该试剂诸如2-亚氨基噻吩(Traut’s试剂)、SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯)、SATP(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代丙酸酯)、SAT-PEO4-Ac(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基(硫代四甘醇))、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、LC-SPDP(琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯)。这样的方法是本领域已知的(Carlsson J.等人(1978)Biochem.J.173,723-
737；Wang D.等人(1997)Bioconjug.Chem.8,878-884；Traut R.R.等人(1973)
Biochemistry 12(17),3266-3273；Duncan,R.J.S.等人(1983)Anal.Biochem.132.68-73；
美国专利号5,708,146)。硫醇-Michael加成反应的第二组分需要具有缺电子碳-碳双键的试剂，诸如在甲基丙烯酸酯、马来酰亚胺、α,β-不饱和酮、延胡索酸酯、丙烯腈、肉桂酸酯和巴豆酸酯中。N-马来酰亚胺通常用作巯基反应官能度，并可经由N末端α-氨基基团或Lysε-氨基基团修饰使用可商购获得的异双功能交联体(诸如AMAS(N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)琥珀酰亚胺酯))引入有效负载、CCD或XTEN分子中。得到的分别含有自由硫醇和马来酰亚胺部分的两个分子在温和条件下形成稳定的共价键，产生通过马来酰亚胺连接的缀合物。
1540-1573)。特别地，据认为硫醇Michael加成更适用于靶向缀合物组合物，其中有效负载为蛋白质(Pounder R.J.等人Metal free thiol-maleimide'Click'reaction as a mild functionalisation strategy for degradable polymers.(2008)Chem Commun(Camb).41,5158-5160)。因为至少一个分子需要含有自由巯基基团，所以如果有效负载不含半胱氨酸则可利用CCD。或者，可通过使用硫醇化试剂对XTEN、CCD或有效负载肽/蛋白质的N末端α-氨基基团或赖氨酸ε-氨基基团的化学修饰引入巯基基团，该试剂诸如2-亚氨基噻吩(Traut’s试剂)、SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯)、SATP(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代丙酸酯)、SAT-PEO4-Ac(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基(硫代四甘醇))、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、LC-SPDP(琥珀酰亚胺基6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯)。这样的方法是本领域已知的(Carlsson J.等人(1978)Biochem.J.173,723-
737；Wang D.等人(1997)Bioconjug.Chem.8,878-884；Traut R.R.等人(1973)
Biochemistry 12(17),3266-3273；Duncan,R.J.S.等人(1983)Anal.Biochem.132.68-73；
美国专利号5,708,146)。硫醇-Michael加成反应的第二组分需要具有缺电子碳-碳双键的试剂，诸如在甲基丙烯酸酯、马来酰亚胺、α,β-不饱和酮、延胡索酸酯、丙烯腈、肉桂酸酯和巴豆酸酯中。N-马来酰亚胺通常用作巯基反应官能度，并可经由N末端α-氨基基团或Lysε-氨基基团修饰使用可商购获得的异双功能交联体(诸如AMAS(N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)琥珀酰亚胺酯))引入有效负载、CCD或XTEN分子中。得到的分别含有自由硫醇和马来酰亚胺部分的两个分子在温和条件下形成稳定的共价键，产生通过马来酰亚胺连接的缀合物。
[0360] 在其他实施方案中，利用基于酰肼和醛之间反应的点击化学产生XTEN-缀合物、XTEN-XTEN缀合物和CCD-缀合物，诸如Ganguly等人所述，且如图7中所示(Ganguly T.等人The hydrazide/hydrazone click reaction as a biomolecule labeling strategy for M(CO)3(M＝Re,99mTc)radiopharmaceuticals.(2011)Chem.Commun.47,12846-12848)。例如，CCD可修饰为具有肼或酰肼，该CCD与具有醛基团的有效负载混合以产生期望的CCD-有效负载缀合物。在一个实施方案中，本发明提供了CCD，同时将至少一个肼或酰肼引入α-N末端氨基基团或修饰一个或多个赖氨酸ε-氨基基团以提供适合作为用于与靶标有效负载缀合的CCD，因为该CCD被认为是稳定的。得到的形成自芳香肼和芳香醛的双-芳基腙对于92℃和2.0-10.0的广泛pH值范围均稳定(Solulink,Inc.，Protein-Protein Conjugation Kit，Technical Manual，货号#S-9010-1)。反应中的离去基团为水，且不需要任何还原剂(例如，氰基硼氢化钠)来稳定该键。用肼/酰肼或醛部分修饰的分子在水环境中具有良好的稳定性并且保持活性而无特殊处理需求。CCD分子的氨基基团通过NHS-酯/酰肼修饰，诸如SANH(琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸丙酮腙)、C6-SANH(C6-琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸丙酮腙)、SHTH(琥珀酰亚胺基4-酰肼对苯二酸酯)。在典型反应中，在修饰缓冲液中将蛋白质制备为1-5mg/ml溶液，并以5倍至20倍摩尔过量添加改性剂，并在室温下使反应进行2小时。单独地，用NHS-酯/醛SFB(琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯)或C6-SFB(C6-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯)在相似条件下修饰有效负载分子。然后将两种修饰的分子均脱盐到缀合缓冲液(100mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 6.0)中。使用1摩尔等效量的限制蛋白和1.5-2摩尔等效量的可大量使用的蛋白质将得到的组分混合在一起。添加pH 6.0的100mM磷酸盐、150mM NaCl中的100mM苯胺的催化剂缓冲液以将苯胺的最终浓度调节到10mM，并在室温下使反应进行2小时。
[0361] 在另一个实施方案中，可通过醛和伯胺基团之间的反应然后用硼氢化钠或氰基硼氢化钠对形成的Schiff碱进行还原来产生CCD-有效负载或XTEN-有效负载缀合物。作为方法中的第一步，在不含胺的缀合缓冲液(诸如0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH 7.2)中使用典型的胺-NHS化学通过NHS-酯/醛SFB(琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯)、C6-SFB(C6-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯)或SFPA(丁二酰亚胺基4-甲酰基苯氧基乙酸酯)修饰CCD或XTEN分子，诸如具有一级α-氨基基团的XTEN或具有ε-氨基基团的含Lys XTEN。产生的修饰醛分子可保持在该点作为XTEN-或CCD-交联体组合物或可用作试剂来产生靶向缀合物组合物。为了制备靶向缀合物组合物，将修饰的醛-CCD(还可包含PCM和XTEN作为融合蛋白)与具有反应性氨基基团的有效负载和温和还原剂(诸如20-100mM氰基硼氢化钠)混合。将反应混合物在室温下温育6小时或在4℃下温育过夜。然后用pH 7.4的50-500mM Tris·HCl和20-100mM氰基硼氢化钠封闭未反应的醛基团，允许缀合的纯化缀合物的分离。
[0362] 在其他实施方案中，本发明提供了包含肽或蛋白质有效负载的缀合物，其中基于有效负载的肽/蛋白质C末端酰基叠氮化物的反应性经由化学连接对有效负载进行缀合。例如，当使用具有羟甲基苯甲酸树脂(HMBA)固相肽合成(SPPS)产生肽或蛋白质时，可通过多种亲核试剂从树脂切割最终肽以提供具有多样的C末端官能度的肽。在一个实施方案中，该方法包括肽基/蛋白质树脂的肼解以产生肽或蛋白质酰肼。然后，在稀释的盐酸中产生的具有亚硝酸钠或亚硝酸叔丁酯的酰基酰肼的亚硝化导致酰基叠氮化物的形成。得到的羰基叠氮化物(或酰基叠氮化物)为活泼的羧酸酯基团(酯)，可与XTEN或CCD的伯胺反应以形成稳定的酰胺键，产生缀合物。在替代的实施方案中，伯胺可以是XTEN或CCD N末端的α-胺或XTEN序列中工程化的赖氨酸残基的一个或多个ε-胺。在缀合反应中，叠氮化物官能团为离去基团。通过亲核体在缺电子羰基基团处的攻击发生与胺基团的缀合反应(Meienhofer,J.(1979)The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.Vol.1,Academic Press:N.Y.；ten Kortenaar P.B.W.等人Semisynthesis of horse heart cytochrome c analogues from two or three fragments.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,8279-8283)。
[0363] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过酶连接制备的靶向缀合物组合物。转谷氨酰胺酶是催化有效负载肽或蛋白质的谷氨酰胺的γ-羧酰胺基团和赖氨酸工程化的XTEN中赖氨酸的ε-氨基基团之间异肽键形成的酶，从而在XTEN和有效负载之间产生分子间或分子内交联(参见图9)，产生组合物(Lorand L,Conrad S.M.Transglutaminases.(1984)Mol.Cell Biochem.58(1-2),9-35)。已成功用于连接的酶的非限制性实例为XIIIa因子(Schense J.C.,Hubbell J.A.Cross-linking exogenous bifunctional peptides into fibrin gels with factor XIIIa.(1999)Bioconjug.Chem.10(1):75-81)和组织型转谷氨酰胺酶(Collier J.H.,Messersmith P.B.Enzymatic modification of self-assembled peptide structures with tissue transglutaminase.(2003)Bioconjug.Chem.14(4),748-755；Davis N.E.,Karfeld-Sulzer L.S.,Ding S.,Barron A.E.Synthesis and characterization of a new class of cationic protein polymers for multivalent display and biomaterial applications.(2009)Biomacromolecules 10(5),1125-
1134)。已知谷氨酰胺底物序列GQQQL对组织型转谷氨酰胺酶具有高特异性(Hu B.H.,Messersmith P.B.Rational design of transglutaminase substrate peptides for rapid enzymatic formation of hydrogels.(2003)J.Am.Chem.Soc.125(47),14298-
14299)。组织型转谷氨酰胺酶序列特异性对于酰基接纳体(赖氨酸)比对于酰基供体(谷氨酰胺)更不严格(Greenberg C.S.,Birckbichler P.J.,Rice R.H.Transglutaminases:
multifunctional cross-linking enzymes that stabilize tissues.(1991)FASEB J.1991,5,3071–3077)。
1134)。已知谷氨酰胺底物序列GQQQL对组织型转谷氨酰胺酶具有高特异性(Hu B.H.,Messersmith P.B.Rational design of transglutaminase substrate peptides for rapid enzymatic formation of hydrogels.(2003)J.Am.Chem.Soc.125(47),14298-
14299)。组织型转谷氨酰胺酶序列特异性对于酰基接纳体(赖氨酸)比对于酰基供体(谷氨酰胺)更不严格(Greenberg C.S.,Birckbichler P.J.,Rice R.H.Transglutaminases:
multifunctional cross-linking enzymes that stabilize tissues.(1991)FASEB J.1991,5,3071–3077)。
[0364] 在酶促产生的靶向缀合物组合物的替代实施方案中，将来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的分选酶A转肽酶用于催化蛋白质1的苏氨酸和甘氨酸残基之间的短5-氨基酸识别序列LPXTG的切割，并随后将酰基片段转化为蛋白质1的N末端寡甘氨酸亲核体(参见图8)。通过使蛋白质2官能化为含有寡甘氨酸，有可能以位点特异性方式使两个蛋白质酶促缀合以产生期望的靶向缀合物组合物。可使用标准分子生物学克隆方案容易地制备携带分选酶识别位点的多肽。很方便将谷氨酸引入识别位点的X位置，因为该残基在分选酶A的天然底物中很常见(Boekhorst J.,de Been M.W.,Kleerebezem M.,Siezen R.J.Genome-wide detection and analysis of cell wall-bound proteins with LPxTG-like sorting motifs.(2005)J.Bacteriol.187,4928-4934)。可通过将分选酶切割位点放置在底物的C末端(Popp M.W.,Antos J.M.,Grotenbreg G.M.,Spooner E.,Ploegh H.L.Sortagging:A versatile method for protein labeling.(2007)
Nat.Chem.Biol.311,707-708)和柔性环(Popp M.W.,Artavanis-Tsakonas K.,Ploegh H.L.Substrate filtering by the active-site crossover loop in UCHL3 revealed by sortagging and gain-of-function mutations.(2009)J.Biol.Chem.284(6),3593-
3602)处来达到高水平的酰基转移作用。对于在C末端标记的蛋白质来说，最小LPETG标签中的甘氨酸不放置在C末端很重要；该甘氨酸必须在与至少一个另外的C末端氨基酸的肽连接中。此外，通过向切割位点的C末端添加额外的甘氨酸以产生LPETGG来达到更好的连接(Pritz S.,Wolf Y.,Kraetke O.,Klose J.,Bienert M.,Beyermann M.Synthesis of biologically active peptide nucleic acid-peptide conjugates bysortase-
mediated ligation.(2007)J.Org.Chem.72,3909-3912；Tanaka T.,Yamamoto T.,Tsukiji S.,Nagamune T.Site-specific protein modification on living cells catalyzed by sortase.(2008)Chembiochem 95,802-807)。与分选酶介导的转肽作用相容的亲核体具有具有单一的结构需求，即具有自由氨基末端的甘氨酸残基的延伸。可使用在任何位置含有一至五个甘氨酸的亲核体实现成功的转肽作用；然而，在优选的实施方案中，当存在两个或三个甘氨酸时获得最大反应率。
Nat.Chem.Biol.311,707-708)和柔性环(Popp M.W.,Artavanis-Tsakonas K.,Ploegh H.L.Substrate filtering by the active-site crossover loop in UCHL3 revealed by sortagging and gain-of-function mutations.(2009)J.Biol.Chem.284(6),3593-
3602)处来达到高水平的酰基转移作用。对于在C末端标记的蛋白质来说，最小LPETG标签中的甘氨酸不放置在C末端很重要；该甘氨酸必须在与至少一个另外的C末端氨基酸的肽连接中。此外，通过向切割位点的C末端添加额外的甘氨酸以产生LPETGG来达到更好的连接(Pritz S.,Wolf Y.,Kraetke O.,Klose J.,Bienert M.,Beyermann M.Synthesis of biologically active peptide nucleic acid-peptide conjugates bysortase-
mediated ligation.(2007)J.Org.Chem.72,3909-3912；Tanaka T.,Yamamoto T.,Tsukiji S.,Nagamune T.Site-specific protein modification on living cells catalyzed by sortase.(2008)Chembiochem 95,802-807)。与分选酶介导的转肽作用相容的亲核体具有具有单一的结构需求，即具有自由氨基末端的甘氨酸残基的延伸。可使用在任何位置含有一至五个甘氨酸的亲核体实现成功的转肽作用；然而，在优选的实施方案中，当存在两个或三个甘氨酸时获得最大反应率。
[0365] 虽然缀合化学的多个实施方案已经根据蛋白质-蛋白质缀合进行了描述，但是在本发明的实践中特别意在靶向缀合物组合物的有效负载部分可以是适用于存在于靶标小分子药物中的官能团(如胺、巯基、羧基)的这些缀合方法中的小分子药物。本领域普通技术人员将理解，与官能度通常局限于氨基、巯基和羧基基团的蛋白质和肽相比，人们可使用更宽泛的化学技术。药物有效负载可通过官能团与XTEN缀合，该官能团包括但不限于，伯氨基基团、氨氧基、酰肼、羟基、硫醇、硫醇盐、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)、琥珀酰亚胺基羧甲醇盐(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、p-硝基苯基碳酸酯(NPC)。药物分子有效负载的其他合适的反应官能团包括缩醛、醛(例如，乙醛、丙醛和丁醛)、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、酰基卤、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和tresylate。
[0366] 在具有药物作为有效负载的XTEN-缀合物的一些实施方案中，药物分子通过具有用于与药物和XTEN或CCD结合的两个反应位点的交联体与赖氨酸-或半胱氨酸工程化的XTEN(诸如表11的序列)或表6中的CCD相连接。优选的交联体基团为在循环中对水解相对稳定的基团，当从缀合物切割时可生物降解且无毒。此外，交联体的使用可对在药物和CCD或XTEN之间具有更大柔性的缀合物提供可能性，或在药物和CCD或XTEN之间提供足够的空间，使得CCD或XTEN不影响药效团及其结合位点之间的结合。在一个实施方案中，交联体具有的反应性基团具有对CCD或XTEN上存在的亲核基团具有反应性的亲电子基团。优选的亲核体包括硫醇、硫醇盐和伯胺。赖氨酸-或半胱氨酸工程化的XTEN或包含半胱氨酸的CCD的亲核基团的杂原子对于交联体上的亲电子基团具有反应性，并对交联体单元形成共价键，产生交联体缀合物。对于交联体有用的亲电子基团包括但不限于，马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团，并对XTEN提供用于连接的方便位点。在另一个实施方案中，交联体具有反应位点，该位点具有对存在于药物上的亲电子基团具有反应性的亲核基团，使得可在XTEN-交联体或CCD-交联体与有效负载药物之间发生缀合，产生缀合物。药物上有用的亲电子基团包括但不限于，羟基、硫醇、醛、烯烃、烷烃、叠氮化物和酮羰基基团。交联体的亲核基团的杂原子可与药物上的亲电子基团反应并形成共价键。交联体上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩胺基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼。药物上的亲电子基团为交联体的连接提供了方便的位点。
[0367] 在特定的实施方案中，药物与主题赖氨酸工程化的XTEN的赖氨酸ε氨基基团的缀合使用反应性药物-N-羟基琥珀酰亚胺反应物或酯，诸如药物-琥珀酰亚胺丙酸酯或药物-琥珀酰亚胺丁酸酯或其他药物-琥珀酰亚胺缀合物。或者，主题赖氨酸工程化XTEN的赖氨酸残基可用于通过与2-亚氨基噻吩的反应引入游离巯基。或者，主题赖氨酸工程化的XTEN的靶标底物赖氨酸可与具有可用于与活性药物剂缀合的自由酰肼或醛基团的异双功能试剂相连接。反应酯可在生理pH下缀合，但反应性较少的衍生物通常需要更高的pH值。如果使用不稳定的蛋白质有效负载，还可使用低温。在低温条件下，可将更长的反应时间用于缀合反应。
[0368] 在另一个特定实施方案中，本发明提供了具有与主题赖氨酸工程化的XTEN的赖氨酸残基缀合的氨基基团的XTEN-缀合物，其中通过N末端氨基酸的α-氨基基团的pKa值(约7.6至8.0)与赖氨酸的ε-氨基基团的pKa(约10)之间的差异促进缀合。末端氨基基团的缀合往往使用反应性药物-醛(诸如药物-丙醛或药物-丁醛)，该药物-醛对胺更有选择性，并因此更不可能与例如组氨酸的咪唑基团反应。此外，氨基残基与琥珀酸或其他羧酸酐反应，或与N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、N,N′-羰基二咪唑(CDI)或p-硝基苯基氯甲酸酯反应以分别产生活化的琥珀酰亚胺基碳酸酯、咪唑氨基甲酸酯或p-硝基苯基碳酸酯。伴随这些试剂的衍生化作用具有使赖氨酸基残基的电荷变得相反的作用。药物-醛与主题XTEN的末端氨基基团的缀合通常在合适的缓冲液中在允许人们利用赖氨酸的ε-氨基基团与蛋白质N末端残基的α-氨基基团之间的pKa值差异的pH下发生。在实施方案的方法中，用于缀合的反应使用约pH7至约pH8的范围内的pH。用于赖氨酸ε氨基基团缀合的有用方法已描述于美国专利号4,904,584和美国专利号6,048,720中。
[0369] 将会用于产生靶向缀合物组合物的活化方法和/或缀合化学取决于多肽的反应性基团以及药物部分的官能团(例如，氨基、羟基、羧基、醛、巯基、烯烃、烷烃、叠氮化物等)、药物-交联体反应物的官能团、或XTEN-交联体或CCD-交联体反应物的官能团。药物缀合可针对与工程化的XTEN多肽或CCD上所有可获得的连接基团的缀合，诸如并入的半胱氨酸残基或赖氨酸残基上特异性的工程化连接基团。为了控制反应物使得缀合针对适当的反应位点，本发明考虑到在缀合反应期间使用保护性基团。“保护基团”为在某些反应条件下防止或封闭分子中的特定化学反应官能团的反应。保护基团将取决于被保护的化学反应性基团的类型以及将会使用的反应条件以及分子中额外反应性基团的存在而变化。可被保护的官能团的非限制性实例包括羧酸基团、羟基基团、氨基基团、巯基基团和羰基基团。用于羧酸和氢氧根的代表性保护基团包括酯(诸如p-甲氧苄基酯)、酰胺和酰肼；对于氨基基团为氨基甲酸酯(诸如叔丁基羰基)和酰胺；对于羟基基团为醚和酯；对于巯基基团为硫醚和硫酯；对于羰基为缩醛和缩酮；诸如此类。这样的保护基团是本领域技术人员公知的，并描述于例如T.W.Greene和G.M.Wuts,Protecting Groups in Organic Synthesis,Third Edition,Wiley,New York,1999,and references cited therei中。可在一步中或以逐步的方式(例如，如WO 99/55377中所述)实现缀合，诸如通过添加反应中间体交联体、使用本文所公开的交联体或本领域已知对于将要与药物分子上的反应性官能团相连接的多肽的半胱氨酸或赖氨酸残基的缀合有用的交联体。
[0370] 在本发明的一些实施方案中，用于将交联体与半胱氨酸工程化的XTEN或CCD缀合的方法可提供用还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT))预处理以还原任何半胱氨酸二硫残基以形成高度亲核的半胱氨酸巯基基团(-CH2SH)的XTEN或CCD。随后通过任何方便的方法去除还原剂，诸如通过脱盐作用。因此，还原的XTEN或CCD与具有亲电子官能团如马来酰亚胺或α-卤代羰基的药物-交联体化合物或交联体试剂根据例如Klussman等人(2004)Bioconjugate Chemistry 15(4),765-773的缀合方法反应。交联体或药物与半胱氨酸残基的缀合通常在合适的缓冲液中在pH 6-9下在4℃至25℃的温度范围下进行约16小时的时期。或者，可对半胱氨酸残基衍生化。合适的衍生化试剂和方法是本领域公知的。例如，半胱氨酰最常与α-卤代乙酸酯(及其相应胺)反应，诸如碘乙酸或碘乙酰胺，以给出羧甲基或羧氨基甲基衍生物。还通过与溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(4-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、
3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、p-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的反应对半胱氨酰残基衍生化。
3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、p-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的反应对半胱氨酰残基衍生化。
[0371] 在一些情况下，在旨在使尽可能多的可获得的连接基团与药物或药物连接体分子反应的条件下进行缀合。这凭借药物相对于多肽合适的摩尔过量来实现。活化药物或药物-连接体分子与多肽的典型摩尔比为高达约1000-1，诸如高达约200-1或高达约100-1。然而在一些情况下，该比率可有所降低，诸如高达约50-1、10-1或5-1。还可使用等摩尔比。
[0372] 在优选的实施方案中，与未与靶向缀合物组合物连接的相应有效负载相比，本发明的靶向缀合物组合物保留了至少一部分药理活性。在一个实施方案中，靶向缀合物组合物保留了未与靶向缀合物组合物连接的有效负载的药理活性的至少约1％、或至少约5％、或至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％。
[0373] 在一个实施方案中，靶向缀合物组合物可设计为通过连接体的非特异性或酶促水解(包括二硫键还原、pH依赖性释放)或通过外源性或内源性蛋白酶(包括表6的蛋白酶)在体内释放有效负载。细胞可通过受体介导的胞吞、吸附胞吞或流体相胞吞摄取大分子(Jain R.K.Transport of molecules across tumor vasculature.(1987)Cancer Metastasis Rev.6(4),559-593；Jain R.K.Transport of molecules,particles,and cells in solid tumors.(1999)Ann.Rev.Biomed.Eng.1,241-263；Mukherjee S.,Ghosh R.N.,Maxfield F.R.Endocytosis.(1997)Physiol.Rev.77(3),759-803)。一旦细胞摄取靶向缀合物组合物，可通过核内体(pH 5.0–6.5)和溶酶体(pH 4.5–5.0)中的低pH值以及通过溶酶体酶(例如，酯酶和蛋白酶)释放有效负载。酸敏感性交联体的实例为可与携带硫醇的载体耦合的6-马来酰亚胺基己酰基腙。腙连接体在pH值<5下迅速被切割，允许缀合物内在化后在核内体和溶酶体的酸性pH下释放有效负载(Trail P.A.等人Effect of linker variation on the stability,potency,and efficacy of carcinoma-reactive BR64-doxorubicin immunoconjugates.(1997)Cancer Res.57(1),100-105；Kratz F.等人Acute and repeat-dose toxicity studies of the(6-maleimidocaproyl)hydrazone derivative of doxorubicin(DOXO-EMCH),an albumin-binding prodrug of the anticancer agent doxorubicin.(2007)Hum.Exp.Toxicol.26(1),19-35)。临床批准的mAb–药物缀合物吉妥珠单抗奥唑米星(MylotargTM)为含有抗CD33的人源化mAb P67.6，与细胞毒性抗生剂加利车霉素化学连接的药物-抗体缀合物。抗体和药物之间的连接体包含两个不稳定键：腙和位阻性二硫化物。已经表明，酸敏感性腙键为实际的切割位点(Jaracz S.,Chen J.,Kuznetsova L.V.,Ojima I.Recent advances in tumor-targeting anticancer drug conjugates.(2005)Bioorg.Med.Chem.13(17),5043-5054)。
[0374] 对于通过二硫键与有效负载连接的那些靶向缀合物组合物，可通过还原不稳定连接体中的二硫键释放有效负载。例如，huN901–DM1为由mmunoGen,Inc.开发的用于治疗小细胞肺癌的肿瘤激活的免疫治疗前药。前药由与微管抑制剂美登素DM1缀合的人源化抗CD56mAb(huN901)组成。平均3.5-3.9个DM1分子经由受阻的二硫键与每个抗体结合。虽然二硫化物连接在血液中是稳定的，但是在进入通过huM901靶向的细胞后迅速被切割，从而释放活性DM1(Smith S.V.Technology evaluation:huN901-DM1,ImmunoGen.(2005)Curr.Opin.Mol.Ther.7(4),394-401)。DM1已经与Millennium Pharmaceuticals MLN-591(一种抗前列腺特异性膜抗原mAb)耦合。DM1经由受阻的二硫键与抗体连接，在允许内在化的细胞内药物释放同时提供了血清稳定性(Henry M.D.等人A prostate-specific
membrane antigen-targeted monoclonal antibody-chemotherapeutic conjugate designed for the treatment of prostate cancer.(2004)Cancer Res.64(21),7995-
8001)。
membrane antigen-targeted monoclonal antibody-chemotherapeutic conjugate designed for the treatment of prostate cancer.(2004)Cancer Res.64(21),7995-
8001)。
[0375] 可使用短可切割肽作为有效负载与CCD或工程化XTEN之间的连接体通过产生组合物来实现有效负载从靶向缀合物组合物的释放。临床评估的缀合物的实例为多柔比星–HPMA(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)缀合物，其中多柔比星经由被溶酶体蛋白酶如组织蛋白酶B切割的四肽间隔区GlyPheLeuGly通过其氨基糖与HPMA共聚物相连接(Vasey P.A.等人Phase I clinical and pharmacokinetic study of PK1[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer doxorubicin]:first member of a new class of
chemotherapeutic agents-drug-polymer conjugates.(1999)Clin.Cancer Res.5(1),
83-94)。达到临床开发期的具有肽连接体的载体-药物缀合物的其他实例为大分子铂络合物。两种基于HPMA的药物候选物由HPMA共聚物骨架组成，络合的氨基丙二酸铂络合物通过组织蛋白酶B切割的肽间隔区GlyPheLeuGly或三肽间隔区GlyGlyGly与该骨架结合
(Rademaker-Lakhai J.M.等人A Phase I and pharmacological study of the platinum polymer AP5280given as an intravenous infusion once every 3 weeks in patients with solid tumors.(2004)Clin.Cancer Res.10(10),3386-3395；Sood P.等人Synthesis and characterization of AP5346,a novel polymer-linked diaminocyclohexyl
platinum chemotherapeutic agent.(2006)Bioconjugate Chem.17(5),1270-1279)。
chemotherapeutic agents-drug-polymer conjugates.(1999)Clin.Cancer Res.5(1),
83-94)。达到临床开发期的具有肽连接体的载体-药物缀合物的其他实例为大分子铂络合物。两种基于HPMA的药物候选物由HPMA共聚物骨架组成，络合的氨基丙二酸铂络合物通过组织蛋白酶B切割的肽间隔区GlyPheLeuGly或三肽间隔区GlyGlyGly与该骨架结合
(Rademaker-Lakhai J.M.等人A Phase I and pharmacological study of the platinum polymer AP5280given as an intravenous infusion once every 3 weeks in patients with solid tumors.(2004)Clin.Cancer Res.10(10),3386-3395；Sood P.等人Synthesis and characterization of AP5346,a novel polymer-linked diaminocyclohexyl
platinum chemotherapeutic agent.(2006)Bioconjugate Chem.17(5),1270-1279)。
[0376] 开发了高度选择性的方法以经由前列腺-特异性抗原(PSA)蛋白酶靶向前列腺癌，该酶在前列腺组织和前列腺癌中几乎专门地表达。合成了紫杉醇、EMC-ArgSerSerTyrTyrSerLeu-PABC-紫杉醇(EMC：ε-马来酰亚胺基乙酰基；PABC：p-氨基苄氧基羰基)的新型白蛋白结合前药。该前药是水溶性的，并与内源性和外源性白蛋白结合。前药的白蛋白结合形式被PSA切割，释放紫杉醇-二肽Ser-Leu-PABC-紫杉醇。由于PABC自消除连接体的并入，因此该二肽迅速降解以释放紫杉醇作为最终切割产物(Elsadek B.等人Development of a novel prodrug of paclitaxel that is cleaved by prostate-specific antigen:an in vitro and in vivo evaluation study.(2010)Eur.J.Cancer
46(18),3434-3444)。
46(18),3434-3444)。
[0377] 间隔区(Self-immolative spacer)由于它们在前药递送系统中的效用已经获得了显著的兴趣。多个报道描述了线性自我消除系统或树状聚体结构，可由单一切割事件起始，通过多米诺样链断裂释放它们的所有单元(Haba K.等人Single-triggered trimeric prodrugs.(2005)Angew.Chem.,Int.Ed.44,716-720；Shabat D.Self-immolative dendrimers as novel drug delivery platforms.(2006)J.Polym.Sci.,Part A:
Polym.Chem.44,1569-1578.Warnecke A.,Kratz F.2,4-Bis(hydroxymethyl)aniline as a building block for oligomers with self-eliminating and multiple release properties.(2008)J.Org.Chem.73,1546-1552；Sagi A.等人Self-immolative polymers.(2008)J.Am.Chem.Soc.130,5434-5435)。在一个研究中，设计并合成了具有四个抗癌剂喜树碱分子和两个PEG5000分子的自我牺牲树状前药。通过盘尼西林-G-酰胺酶在生理条件下有效激活前药，并将游离喜树碱释放到反应介质中以造成细胞生长抑制(Gopin A.等人Enzymatic activation of second-generation dendritic prodrugs:conjugation of self-immolative dendrimers with poly(ethylene glycol)via click chemistr y.(2006)Bioconjugate Chem.17,1432-1440)。被肿瘤细胞中过表达的蛋白酶切割的特定酶底物的并入可生成高效的癌细胞特异性树状前药活化系统。被蛋白酶切割的序列的非限制性实例列于表6中。
Polym.Chem.44,1569-1578.Warnecke A.,Kratz F.2,4-Bis(hydroxymethyl)aniline as a building block for oligomers with self-eliminating and multiple release properties.(2008)J.Org.Chem.73,1546-1552；Sagi A.等人Self-immolative polymers.(2008)J.Am.Chem.Soc.130,5434-5435)。在一个研究中，设计并合成了具有四个抗癌剂喜树碱分子和两个PEG5000分子的自我牺牲树状前药。通过盘尼西林-G-酰胺酶在生理条件下有效激活前药，并将游离喜树碱释放到反应介质中以造成细胞生长抑制(Gopin A.等人Enzymatic activation of second-generation dendritic prodrugs:conjugation of self-immolative dendrimers with poly(ethylene glycol)via click chemistr y.(2006)Bioconjugate Chem.17,1432-1440)。被肿瘤细胞中过表达的蛋白酶切割的特定酶底物的并入可生成高效的癌细胞特异性树状前药活化系统。被蛋白酶切割的序列的非限制性实例列于表6中。
[0378] 在一些实施方案中，本发明提供了靶向缀合物组合物构型，包括二聚、三聚、四聚和更高次序的缀合物，其中有效负载使用如本文上述的不稳定连接体与XTEN连接。在前述的一个实施方案中，组合物进一步包含靶标组分以将组合物递送到靶细胞上的配体或受体。在另一个实施方案中，本发明提供了缀合物，其中一个、两个、三个或四个独立的缀合物组合物用不稳定的连接体与抗体或抗体片段缀合，提供了用于在临床适应症的靶向治疗中使用的可溶性组合物，诸如但不限于，肿瘤和其他癌症的多种治疗，其中抗体提供靶向组合物，然后当在靶细胞中内在化时，不稳定的连接体允许有效负载与组合物分离并影响预期的活性(例如，肿瘤细胞中的细胞毒性)。
[0379] 非结构化特征和均一组合物和XTEN的电荷产生了在缀合反应后可开发用于纯化靶向缀合物组合物的性质。特定效用为通过离子交换对靶向缀合物组合物的捕获，允许去除未反应的有效负载和有效负载衍生物。特定效用为通过疏水作用色谱法(HIC)捕获缀合物。由于它们的亲水性，因此大多数XTEN多肽展现出与HIC树脂的低结合，由于有效负载和柱材料之间的疏水相互作用有利于捕获靶向缀合物组合物以及该缀合物组合物与未能在缀合过程期间与有效负载缀合的未缀合物组合物的分离。与大多数化学或天然聚合物相比，XTEN和靶向缀合物组合物的高纯度提供了显著的益处，特别是聚乙二醇化的有效负载。大多数化学和天然聚合物均通过随机或半随机聚合作用产生，导致了许多类似物的生成。
可通过多种方法对这样的聚合物进行分馏以提高产物中靶标实体的部分。然而，甚至在浓缩之后，大多数天然聚合物和它们的有效负载缀合物的制备含有少于10％的靶标实体。具有G-CSF的PEG缀合物的实例已描述于[Bagal,D.,等人(2008)Anal Chem,80:2408-18]。该出版物显示，即使是批准用于治疗使用的PEG缀合物也含有超过100种类似物，该类似物伴随至少10％靶标实体的浓度发生。
可通过多种方法对这样的聚合物进行分馏以提高产物中靶标实体的部分。然而，甚至在浓缩之后，大多数天然聚合物和它们的有效负载缀合物的制备含有少于10％的靶标实体。具有G-CSF的PEG缀合物的实例已描述于[Bagal,D.,等人(2008)Anal Chem,80:2408-18]。该出版物显示，即使是批准用于治疗使用的PEG缀合物也含有超过100种类似物，该类似物伴随至少10％靶标实体的浓度发生。
[0380] 随机聚合物如PEG的复杂度是对于在缀合和纯化期间监测和质量控制的重要阻碍。相反，通过本文所述的方法纯化的XTEN具有高水平的纯度和均匀度。此外，如本文所述产生的缀合常规地含有大于约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％预期的靶标并处于预期的构型，导致容易解释质谱和色谱图。
5.靶向缀合物组合物构型
5.靶向缀合物组合物构型
[0381] 本发明的目的是提供靶向缀合物组合物的不同构型或具有多种数目的给定类型组分的构型，以赋予所得组合物定制的特性。
[0382] 在一个方面，本发明提供了单体靶向缀合物组合物，其具有靶向部分、CCD、XTEN、与CCD中每个半胱氨酸部分缀合的有效负载(例如，药物或生物活性蛋白质)和任选的PCM的单个拷贝。
[0383] 在一个实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式I的结构进行配置：其中：i)TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；ii)CCD选自表6中的CCD；iii)XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且iv)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且iv)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
[0384] 在另一个实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式II的结构进行配置：其中：i)TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；ii)CCD选自表6中的CCD；iii)PCM选自表8中所示的序列；iv)XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或
91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且v)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且v)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
[0385] 在另一个实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式III的结构进行配置：其中：i)TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；ii)CCD选自表6中的CCD；iii)PCM选自表8中所示的序列；iv)XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或
91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且v)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且v)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
[0386] 在另一个实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式IV的结构进行配置：其中：i)TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；ii)CCD选自表8中的CCD；iii)XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且iv)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且iv)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
[0387] 在另一个实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式V的结构进行配置：其中：i)TM1和TM2为各自包含VL和VH序列的不同的scFv，其中每个VL和VH均来源于表
19中的第一和第二抗体，或其中每个均与来自选自表19中所示的VL和VH序列的第一和第二抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或
98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间，并且TM1和TM2通过选自序列SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的亲水性氨基酸的短连接体重组地融合在一起；ii)CCD选自表6中的CCD；iii)XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或
98％、或99％的同一性或与之相同；并且iv)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
19中的第一和第二抗体，或其中每个均与来自选自表19中所示的VL和VH序列的第一和第二抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或
98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间，并且TM1和TM2通过选自序列SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的亲水性氨基酸的短连接体重组地融合在一起；ii)CCD选自表6中的CCD；iii)XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或
98％、或99％的同一性或与之相同；并且iv)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
[0388] 在另一个实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式VI的结构进行配置：其中：i)TM1和TM2为各自包含VL和VH序列的不同的scFv，其中每个VL和VH均来源于表
19中的第一和第二抗体，或其中每个均与来自选自表19中所示的VL和VH序列的第一和第二抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或
98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间，并且TM1和TM2通过选自序列SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的亲水性氨基酸的短连接体重组地融合在一起；ii)CCD选自表6中的CCD；iii)PCM选自表8中所示的序列；iv)XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或
94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且iv)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
19中的第一和第二抗体，或其中每个均与来自选自表19中所示的VL和VH序列的第一和第二抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或
98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间，并且TM1和TM2通过选自序列SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的亲水性氨基酸的短连接体重组地融合在一起；ii)CCD选自表6中的CCD；iii)PCM选自表8中所示的序列；iv)XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或
94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且iv)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
[0389] 在另一个实施方案中，所述靶向缀合物组合物根据式VII的结构进行配置：其中：i)TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；ii)CCD选自表6中的CCD；iii)PCM选自表8中所示的序列；iv)XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或
91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且v)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
6.组合物的多聚体构型
91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且v)药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。
6.组合物的多聚体构型
[0390] 在一个方面，本发明提供了靶向缀合物组合物，其中不同数目的XTEN配偶体通过连接体以数字定义的构型连接，例如，二聚体、三聚体、四聚体或多聚体。如本文所用的，“前体”意在包括在产生中间体或最终组合物的缀合反应中用作反应物的组分，并且包括但不限于任何长度的XTEN区段(包括表10和表11中的XTEN)、XTEN-交联体、XTEN-有效负载-交联体区段、CCD-交联体、CCD-有效负载、CCD-XTEN-交联体、具有反应性基团的有效负载、连接体和本文所述的其他这样的组分。
[0391] 在一些实施方案中，本发明提供了缀合物，其中两个XTEN前体区段通过二价交联体连接，产生二价构型，诸如图15-17中所示。在二价XTEN-缀合物的一个实施方案中，每个XTEN-缀合物可以是单体融合蛋白，其进一步包含靶向部分、CCD、PCM和生物活性肽或多肽，其中每个融合蛋白前体区段通过N末端的α氨基基团与二价连接体连接，产生二价缀合物。在二价XTEN-缀合物的另一个实施方案中，每个XTEN前体区段均为单体融合蛋白，其包含靶向部分、CCD、PCM和生物活性肽或多肽，其中每个融合蛋白与二价连接体在C末端处连接，产生二价缀合物。在二价XTEN-缀合物的另一个实施方案中，每个缀合物包含与CCD、CCD-XTEN融合物或与XTEN缀合的一个或多个有效负载(可以是肽、多肽或药物)，其中每个前体通过在N末端的二价连接体与包含一个或多个第二不同有效负载分子的其他前体连接，产生二价缀合物。在本段的前述实施方案中，可使用不同方法产生将要连接的前体，诸如将连接体与第一前体XTEN缀合，然后实现第二反应以将前体与第二XTEN或CCD-XTEN前体的末端的反应性基团连接。或者，XTEN或CCD-XTEN末端之一或二者均可修饰为前体，该前体可随后通过点击化学或通过本文所述或所示的其他方法进行连接，留下很少或不留下残留的原子以桥接产生的缀合物的交叉。在另一个实施方案中，两个CCD-XTEN或XTEN前体序列通过二硫桥使用引入到前体XTEN反应物末端处或末端附近的半胱氨酸或巯基基团进行连接，产生二价XTEN-缀合物。使用这样的方法可构建多种构型。这样的二价缀合物的示例性构型如下。
[0392] 在一个实施方案中，本发明提供了具有式VIII的结构的靶向缀合物组合物：其中每次出现时，TM独立地为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；
CCD选自表6中的CCD；PCM选自表8中所示的序列；iv)XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；CL为选自表24中的三聚体交联体，各个XTEN是相同的，其中XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或
99％的同一性或与之相同；并且药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。在前述实施方案中，XTEN可使用三聚体交联体与融合蛋白相连接，该三聚体交联体包括但不限于表24中的交联体。
CCD选自表6中的CCD；PCM选自表8中所示的序列；iv)XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；CL为选自表24中的三聚体交联体，各个XTEN是相同的，其中XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或
99％的同一性或与之相同；并且药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。在前述实施方案中，XTEN可使用三聚体交联体与融合蛋白相连接，该三聚体交联体包括但不限于表24中的交联体。
[0393] 本发明进一步提供了具有四聚体构型的XTEN-连接体与XTEN-连接体有效负载缀合物。在一个实施方案中，本发明提供了缀合物，其中三个XTEN序列通过四价连接体连接，产生四聚体构型。在一个实施方案中，本发明提供了具有式IX的结构的靶向缀合物组合物：其中每次出现时，TM独立地为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；
CCD选自表6中的CCD；PCM选自表8中所示的序列；iv)XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；CL为四价交联体；各个XTEN是相同的，其中XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。四价连接体的非限制性实例包括四价巯基、四价-N-马来酰亚胺连接体，诸如美国专利号7,524,821中所述的。
CCD选自表6中的CCD；PCM选自表8中所示的序列；iv)XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；CL为四价交联体；各个XTEN是相同的，其中XTEN与表10中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等。四价连接体的非限制性实例包括四价巯基、四价-N-马来酰亚胺连接体，诸如美国专利号7,524,821中所述的。
[0394] 在另一个实施方案中，本发明提供了具有式X的结构的靶向缀合物组合物：其中每次出现时，TM1独立地为包含VL和VH序列的第一scFv，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或
91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；TM2为与第一scFv不同的第二scFv，其中TM2包含VL和VH序列，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；CCD选自表6中的CCD；PCM选自表8中的PCM；XTEN为与表11中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同的半胱氨酸工程化的XTEN；药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等；并且y为与XTEN的半胱氨酸残基的数目相等的3与10之间(包括3和10)的整数。
91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；TM2为与第一scFv不同的第二scFv，其中TM2包含VL和VH序列，其中每个VL和VH均来源于表19中的抗体，或与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中的序列的连接体序列，其中连接体重组地融合在VL与VH之间；CCD选自表6中的CCD；PCM选自表8中的PCM；XTEN为与表11中所示的序列具有至少
90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同的半胱氨酸工程化的XTEN；药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n与CCD的半胱氨酸残基的数目相等；并且y为与XTEN的半胱氨酸残基的数目相等的3与10之间(包括3和10)的整数。
[0395] 特别地考虑到，式I-X的实施方案的TM的每个scFv具有可从N末端至C末端配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH的VL和VH，并且式V和式VI的实施方案的TM1和TM2可各自独立地配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。7.具有四个或更多个XTEN的多价构型
[0396] 使用表11中的XTEN，考虑含有与半胱氨酸工程化的骨架相连接的三个或更多个XTEN-缀合物分子的组合物，其中PCM、TM和CCD(具有连接的有效负载药物)的融合蛋白与XTEN的半胱氨酸残基缀合，产生“梳状”多价构型。在一个实施方案中，通过采用适用于与半胱氨酸工程化的XTEN反应的连接体使前述融合蛋白的PCM的N末端与半胱氨酸工程化的XTEN反应来产生多价构型缀合物组合物，从而产生最终产物。在实施方案中，通过并入XTEN的反应性半胱氨酸基团的数目来控制最终产物的化合价。此外，考虑可设计最终产物以将第二靶向部分定位在XTEN的N末端或C末端上，这改善了与靶细胞上该靶向部分的配体的相互作用。这样的梳状构型的典型示意性实例示于图37和图39中。8.单体XTEN骨架上的双特异性有效负载构型
[0397] 在另一个方面，本发明提供了XTEN缀合物，其含有与单个半胱氨酸工程化的XTEN骨架连接的两个不同的有效负载分子，从而产生二价缀合物。在一个实施方案中，通过采用适用于与半胱氨酸工程化的XTEN反应的交联体使工程化的XTEN如表11中特别提供的XTEN与具有第一附接有效负载药物的一个或多个分子的第一靶向缀合物组合物反应，然后采用适用于与赖氨酸工程化的XTEN反应的交联体与具有不同的第二附接有效负载药物的一个或多个分子的第二靶向缀合物组合物进行第二反应，来产生二价构型缀合物，从而产生最终产物。通过设计工程化的XTEN来控制相连接的靶向缀合物组合物的数目和位置，并确定反应性巯基或氨基基团的放置。在一个实施方案中，二价缀合物包含与工程化的XTEN的相应半胱氨酸和赖氨酸残基连接的具有第一有效负载的一个或分子的第一靶向缀合物组合物的单个分子和具有第二有效负载的一个或多个分子的第二靶向缀合物组合物的单个分子。在另一个实施方案中，二价偶联物包含第一靶向缀合物组合物的一个、或两个、或三个、或更多个分子，该第一靶向缀合物组合物具有与半胱氨酸-赖氨酸工程化的XTEN的半胱氨酸残基相连接的第一有效负载的一个或多个分子；以及第二靶向缀合物组合物的单个分子，该第二靶向缀合物组合物具有与半胱氨酸-赖氨酸工程化的XTEN的单个赖氨酸相连接的第二有效负载的一个或多个分子。在另一个实施方案中，二价缀合物包含通过连接体与半胱氨酸-赖氨酸工程化的XTEN相连接的第一有效负载的一个、或两个、或三个、或四个、或五个分子，以及第二有效负载的一个、或两个、或三个、或四个、或五个分子。
[0398] 在另一个实施方案中，通过使半胱氨酸工程化和赖氨酸工程化的XTEN(如表11的XTEN)与适用于与半胱氨酸工程化的XTEN反应的第一连接体反应，然后与适用于与赖氨酸工程化的XTEN反应的连接体进行第二反应，然后使XTEN-交联体骨架与具有能够与第一连接体反应的巯基反应性基团的第一有效负载反应，然后使第二有效负载与能够与第二交联体反应的氨基基团反应来产生二价构型缀合物，从而产生最终产物。9.XTEN-有效负载构型的文库
[0399] 在另一个方面，本发明提供了XTEN-有效负载缀合物前体的文库、制备该文库的方法以及以组合途径结合文库前体的方法，如图15-16中所示，以实现有效负载的最佳组合以及最佳比例。在一个实施方案中，本发明提供了单独XTEN的文库，每个XTEN与给定有效负载(包括本文所述的有效负载)的1个、或2个、或3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个或更多个分子相连接，以产生XTEN-有效负载前体的文库。在该方法中，一系列将要连接的XTEN-有效负载前体进一步与连接体偶联，并随后与能够在实现偶联的条件下与连接体反应的其他XTEN-有效负载前体混合并反应，从而产生以本文所述的构型与XTEN连接的有效负载的多种排列和比例的文库。然后在适合评估给定临床适应证(例如，癌症、代谢紊乱、糖尿病)的参数的体外或体内测定中筛选这样的文库，以确定哪些组合物提供最佳反应或作用。在一个示例性实施方案中，前体的一个类别包括多种靶向部分，诸如对表2、表3、表4、表18或表19中的肿瘤相关抗原或配体具有结合亲和力的抗体片段或scFv(例如，属于或来源于表19中的抗体)，并且前体的第二类别为一种或多种有效负载，诸如选自表14-
17中的细胞毒性药物或有效负载。将要连接的前体的每个类别进一步与连接体偶联，并且如图17中所示，随后与能够在实现偶联的条件下与连接体反应的其他XTEN-有效负载前体混合并反应，产生多种彼此比例不同的靶向部分和药物排列的文库。设计XTEN-缀合物以在两种不同有效负载的情况下允许一种有效负载与另一种的固定比例为例如1:1、或1:1.5、或1:2、或1:3、或2:3、或1:4、或1:5或1:9。相似的比例范围将适用于包含3、4、5种或更多种有效负载的文库缀合物。在前述的一个实施方案中，并且如图37所示，缀合物进一步包含在XTEN骨架与XTEN-有效负载组分之间的一个或多个肽切割部分(PCM)，其中PCM为与靶组织相关的蛋白酶的底物，即靶向部分的配体，其中靶向部分与配体的结合使缀合物接近蛋白酶，导致XTEN-有效负载组分的释放，以及与缺乏所述PCM和靶向部分的组合物相比对靶组织增强的杀伤或增强的生物作用。在这样的情况下，释放的有效负载可直接在组织表面上作用，或可内在化并进一步降解，导致有效负载(诸如本文所述的细胞毒性药物)的释放。
Ⅶ).剂型和药物组合物
17中的细胞毒性药物或有效负载。将要连接的前体的每个类别进一步与连接体偶联，并且如图17中所示，随后与能够在实现偶联的条件下与连接体反应的其他XTEN-有效负载前体混合并反应，产生多种彼此比例不同的靶向部分和药物排列的文库。设计XTEN-缀合物以在两种不同有效负载的情况下允许一种有效负载与另一种的固定比例为例如1:1、或1:1.5、或1:2、或1:3、或2:3、或1:4、或1:5或1:9。相似的比例范围将适用于包含3、4、5种或更多种有效负载的文库缀合物。在前述的一个实施方案中，并且如图37所示，缀合物进一步包含在XTEN骨架与XTEN-有效负载组分之间的一个或多个肽切割部分(PCM)，其中PCM为与靶组织相关的蛋白酶的底物，即靶向部分的配体，其中靶向部分与配体的结合使缀合物接近蛋白酶，导致XTEN-有效负载组分的释放，以及与缺乏所述PCM和靶向部分的组合物相比对靶组织增强的杀伤或增强的生物作用。在这样的情况下，释放的有效负载可直接在组织表面上作用，或可内在化并进一步降解，导致有效负载(诸如本文所述的细胞毒性药物)的释放。
Ⅶ).剂型和药物组合物
[0400] 本发明提供了包含本发明的靶向缀合物组合物的药物组合物。在一个实施方案中，该药物组合物包含选自本文所述的多个实施方案的靶向缀合物组合物，以及至少一种药学上可接受的载体。
[0401] 在另一个方面，本发明提供了包含本文所述的靶向缀合物组合物的团剂量或剂型。在一个实施方案中，靶向缀合物组合物的团剂量或剂量包含对于人类患者治疗有效的根据体重调节的团剂量。
[0402] 在其他实施方案中，该团剂量或剂量(i)用于治疗有需要的受试者的癌症；和/或(ii)配制用于皮下施用。在一个实施方案中，团剂量或剂型为包含本文所公开的任何实施方案的靶向缀合物组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0403] 在另一个实施方案中，本发明提供试剂盒，其包含包装材料和至少第一容器，该容器包含前述实施方案的药物组合物，和标示出该药物组合物及储存和处理条件的标签，以及任选地关于制备和/或向受试者施用该药物组合物的说明书页。
[0404] 本发明提供了制备药物组合物的方法，该方法包括将实施方案的受试者靶向缀合物组合物与至少一种药学上可接受的载体组合成药学上可接受的制剂的步骤。可根据已知方法配制本发明的靶向缀合物组合物以制备药学上有用的组合物，由此将靶向缀合物组合物与药学上可接受的载体媒介物(诸如水溶液或缓冲液、药学上可接受的悬浮液和乳液)混合组合。非水溶剂的实例包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著.(1980))混合来制备治疗制剂，以便以冻干制剂或水溶液形式储存。药物组合物可通过任何合适的手段或途径进行施用，包括皮下、通过输液泵皮下、肌内和静脉内。应当理解，优选的途径将随接受者的疾病和年龄以及所治疗的病况的严重程度而变化。渗透泵可以在片剂、丸剂、胶囊或可植入装置中用作缓释剂。注射器泵也可用作缓释剂。此类装置描述于美国专利4,976,696；4,933,185；5,017,378；6,309,370；6,254,573；4,435,173；4,398,908；6,572,585；5,298,022；5,176,502；5,492,534；5,318,540；和
4,988,337，这些专利的内容以引用的方式并入本文。本领域技术人员考虑本发明的公开内容和这些其他专利的公开内容，能够生产用于本发明组合物的延长释放的注射器泵。
4,988,337，这些专利的内容以引用的方式并入本文。本领域技术人员考虑本发明的公开内容和这些其他专利的公开内容，能够生产用于本发明组合物的延长释放的注射器泵。
[0405] 在另一个实施方案中，本发明提供了本文所述的任何实施方案的靶向缀合物组合物，其用于制备对于治疗病况有用的药物，该病况包括但不限于癌症或炎症状况。Ⅷ).治疗方法
[0406] 本发明提供了治疗受试者的疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的针对有需要的受试者的任何前述实施方案的靶向缀合物组合物。在一个实施方案中，该方法的靶向缀合物组合物包含单一类型的选自表14-17的有效负载。在另一个实施方案中，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的选自表5中所示的构建体的靶向缀合物组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的选自实施例中所示的构建体的靶向缀合物组合物。
[0407] 在其他实施方案中，所述方法包括向患有癌症的人类患者施用至少两个治疗有效的根据体重调节的团剂量的本文公开的任何实施方案的靶向缀合物组合物。在前述的一个实施方案中，所述方法包括向患有癌症的人类患者施用至少两个治疗有效的根据体重调节的团剂量的选自表5中所示构建体的靶向缀合物组合物，其中所述团剂量的所述施用间隔至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约28天或至少约一个月。
[0408] 在另一个实施方案中，所述方法包括向患有癌症的人类患者施用至少两个治疗有效的根据体重调节的团剂量的选自表5中所示构建体的靶向缀合物组合物，其中所述治疗有效的根据体重调节的团剂量选自至少约0.05mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.2mg/kg、至少约0.4mg/kg、至少约0.8mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.2mg/kg、至少约1.4mg/kg、至少约1.6mg/kg、至少约1.8mg/kg、至少约2.0mg/kg、至少约2.2mg/kg、至少约2.4mg/kg、至少约2.6mg/kg、至少约2.7mg/kg、至少约2.8mg/kg、至少3.0mg/kg、至少4.0mg/kg、至少约5.0mg/kg、至少约6.0mg/kg、至少约7.0mg/kg、至少约10mg/kg或至少约15mg/kg。
[0409] 在治疗方法中，靶向缀合物组合物的有效负载为当施用于患有特定疾病或病况的受试者时具有有益效果的本领域已知的有效负载。在一个实施方案中，组合物的有效负载经由对靶组织细胞的细胞毒性作用介导它们的治疗作用。在本段的前述实施方案中，所述方法在治疗或缓解或预防选自以下的疾病中有用：癌症、癌症支持性医护或炎症、自身免疫疾病、感染性疾病、代谢病、肌肉骨骼疾病、肾脏病症、眼科疾病、疼痛和与炎症相关的呼吸疾病。更具体地，所述癌症选自乳腺癌、ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝脏癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、结肠直肠癌、食管癌、纤维肉瘤、绒毛膜癌、卵巢癌、宫颈癌、喉癌、子宫内膜癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、腺癌、卡波西肉瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、甲状腺癌、威尔姆斯肿瘤、泌尿道癌、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、成胶质细胞瘤和胰腺癌、白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(PCML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞疾病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
[0410] 在治疗方法的一些实施方案中，靶向缀合物组合物可皮下、肌内或静脉内施用。在一个实施方案中，使用治疗有效量施用组合物。在一个实施方案中，与未与靶向缀合物组合物连接并使用可比剂量施用于受试者的有效负载相比，两个或更多个连续剂量的治疗有效量的施用导致在组合物的治疗窗内花费的时间增加。在治疗窗内花费时间的增加可以比未修饰的有效负载长至少三倍，或者可替代地，比相应的有效负载或未与XTEN连接的有效负载长至少四倍、或五倍、或六倍、或七倍、或八倍、或九倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。
[0411] 在治疗方法的一个实施方案中，在维持治疗效果所需的剂量方案下，将比未与靶向缀合物组合物连接的相应有效负载小至少约两倍、或小至少约三倍、或小至少约四倍、或小至少约五倍、或小至少约六倍、或小至少约八倍、或小至少约10倍的靶向缀合物组合物或包含靶向缀合物组合物的药物组合物施用于有需要的受试者。在该方法的一些实施方案中，该治疗效果为本领域已知的与将要治疗或预防的受试者的潜在病况相关的测量的参数、临床症状或终点，诸如但不限于，癌症标志物的存在或浓度、肿瘤大小、肿瘤停滞、肿瘤数目、肿瘤坏死、体重、细胞因子水平、血液参数、疼痛、癌症进展时间、复发时间、局部复发发现时间、区域转移发现时间、远处转移发现时间、症状发作时间、住院、止痛药需要增加时间、救治性化疗需要时间、救治性手术需要时间、救治性放疗需要时间、治疗失败时间和存活时间。在前述实施方案中，维持治疗效果所需的时间为至少约21天、或至少约30天、或至少约一个月、至少约45天、至少约60天、至少约90天、或至少约120天。
[0412] 在治疗方法的另一个实施方案中，在维持与未与靶向缀合物组合物连接的有效负载维持治疗效果所需的相应mole/kg量可比的曲线下面积所需的剂量方案下，将比未与靶向缀合物组合物连接的相应有效负载小至少约两倍、或小至少约三倍、或小至少约四倍、或小至少约五倍、或小至少约六倍、或小至少约八倍、或小至少约10倍的靶向缀合物组合物或包含靶向缀合物组合物的药物组合物施用于有需要的受试者。在另一个实施方案中，靶向缀合物组合物或包含缀合物的药物组合物需要较不频繁的施用以用于受试者的常规治疗，其中靶向缀合物组合物或药物组合物的剂量约每四天、约每七天、约每10天、约每14天、约每21天或约每月向受试者施用一次，并且靶向缀合物组合物达到与未与靶向缀合物组合物连接并施用于受试者的相应有效负载可比的曲线下面积。在其他实施方案中，在维持有效血液浓度所需的剂量方案下，将比未与靶向缀合物组合物连接的有效负载的相应量少约5％、或约10％、或约20％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％的mole/kg的累积更少量的靶向缀合物组合物施用于受试者，但缀合物达到与未与靶向缀合物组合物连接的相应有效负载相比至少可比的曲线下面积。累积减小量为在至少约一周、或至少约14天、或至少约21天、或至少约30天、或至少约一个月的时间段的测量结果。
[0413] 在一个实施方案中，本发明提供了在体外治疗癌细胞的方法，该方法包括向癌细胞的培养物施用包含有效量的靶向缀合物组合物的组合物，该组合物包含针对表2或表3、表4、表18或表19中的靶标的靶向部分，以及选自表14-17中的化合物的一个或多个有效负载。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含有效量的靶向缀合物组合物的药物组合物，该组合物包含针对表2、或表3、或表4、表18或表19中的靶标的靶向部分，以及选自表14-17中的化合物的一个或多个有效负载。在该方法的另一个实施方案中，该癌症选自乳腺癌、ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝脏癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、结肠直肠癌、食管癌、纤维肉瘤、绒毛膜癌、卵巢癌、宫颈癌、喉癌、子宫内膜癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、腺癌、卡波西肉瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、甲状腺癌、威尔姆斯肿瘤、泌尿道癌、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、成胶质细胞瘤、胰腺癌、白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(PCML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞疾病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在该方法的另一个实施方案中，施用导致与癌症相关的至少一个、两个或三个参数的改善比未治疗的受试者大至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％，其中该参数选自通过实体瘤治疗疗效评价标准(RECIST)定义的反应率、癌症进展时间(复发)、局部复发发现、区域转移发现、远处转移发现、症状发作、住院、止痛药需要增加、救治性化疗需要、救治性手术需要、救治性放疗需要、治疗失败时间和增加的存活时间。
[0414] 在另一个方面，本发明提供了用于治疗患有疾病的受试者的方案，所述方案包括包含本文所述的任何实施方案的靶向缀合物组合物的组合物。在方案的一个实施方案中，该方案进一步包括确定在患者中达到治疗效果所需要的包含靶向缀合物组合物的药物组合物的量的步骤。
[0415] 本发明提供了包括针对患病受试者的治疗方案的靶向缀合物组合物，包括将包含本文所述的任何实施方案的缀合物的药物组合物以有效量施用两个或更多个连续剂量，其中该施用导致与疾病相关的至少一个参数的改善。
[0416] 在一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用一个、或两个、或三个、或四个或更多个治疗有效剂量的包含靶向缀合物组合物的实施方案的药物组合物的方案。在方法的一个实施方案中，该疾病选自乳腺癌、ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝脏癌、肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、食管癌、纤维肉瘤、绒毛膜癌、卵巢癌、宫颈癌、喉癌、子宫内膜癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、卡波西肉瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、甲状腺癌、威尔姆斯肿瘤、泌尿道癌、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、成胶质细胞瘤和胰腺癌。在方法的另一个实施方案中，施用的药物组合物包含靶向部分，其中该靶向部分对疾病的肿瘤具有特异性结合亲和力。在方法的另一个实施方案中，施用的药物组合物包含靶向部分，其中该靶向部分对选自表3中的肿瘤相关抗原的肿瘤相关抗原具有特异性结合亲和力。在方法的另一个实施方案中，施用的剂量导致受试者的肿瘤大小减小至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％或更多。在前述实施方案中，在施用后至少约7天、或至少约10天、或至少约14天、或至少约21天或至少约30天内达到肿瘤大小的减小。在方法的另一个实施方案中，施用的剂量导致受试者的肿瘤停滞，其中在施用后至少约7天、或至少约10天、或至少约14天、或至少约21天或至少约30天内达到停滞。在本段的前述实施方案中，该方案包括每7天、或每10天、或每14天、或每21天、或每月施用治疗有效剂量。
[0417] 在另一个方面，本发明提供了用于在制备用于治疗受试者的疾病的药物中使用的靶向缀合物组合物。在一个实施方案中，本发明提供了本文所公开的任何实施方案的用于在制备用于治疗受试者的癌症的药物中使用的靶向缀合物组合物。在前述实施方案中，该癌症选自乳腺癌、ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝脏癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、结肠直肠癌、食管癌、纤维肉瘤、绒毛膜癌、卵巢癌、宫颈癌、喉癌、子宫内膜癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、腺癌、卡波西肉瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、甲状腺癌、威尔姆斯肿瘤、泌尿道癌、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、成胶质细胞瘤、胰腺癌、白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(PCML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞疾病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。Ⅸ).药物试剂盒
[0418] 在另一个方面，本发明提供了试剂盒以便于偶联组合物的使用。在一些实施方案中，试剂盒包含本文提供的药物组合物、容器和容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如，由多种材料如玻璃或塑料形成的瓶、小瓶、注射器等。该容器容纳作为对于治疗受试者有效的制剂的药物组合物，并可具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。包装插页可列出对于药物批准的适应证、针对药物用于经批准的适应证的重构和/或施用的说明、合适的剂量和安全性信息、以及标识药物批号和有效期的信息。在前述的另一个实施方案中，试剂盒可包含可携带用于药物组合物的合适稀释剂的第二容器，该容器的使用将为使用者提供待递送给受试者的适当浓度。在另一个实施方案中，试剂盒包含：在至少第一容器中：第一容器：在治疗患有疾病的受试者中足够施用的一定量的偶联组合物药物；一定量的药学上可接受的载体；可携带针对主题组合物的合适稀释剂的第二容器，该容器将向使用者提供待递送给受试者的适当浓度的药物组合物；以及标识药物以及储存和操作条件的标签、和/或对于药物批准的适应证的插页、以及针对药物用于治疗经批准的适应证的重构和/或施用的说明、合适的剂量和安全性信息、以及标识药物批号和有效期的信息。Ⅹ).本发明的核酸序列
[0419] 本发明提供了编码靶向缀合物组合物的多肽组分的分离的多核酸以及与编码靶向缀合物组合物的多肽组分的多核酸分子互补的序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码本文所述的任何实施方案的靶向缀合物组合物的多核酸，或该多核酸的互补体。
[0420] 在其他实施方案中，本发明提供了编码本文所述的任何实施方案的融合为单一多肽的靶向部分、CCD、PCM和XTEN的融合蛋白的多核酸，或该多核酸的互补体。在一个实施方案中，多核酸编码选自表5中的构建体的蛋白质组分，或该多核酸的互补体。
[0421] 在一个实施方案中，本发明包括产生编码靶向缀合物组合物的多肽的多核酸或与该多核酸互补的序列(包括其同源变体)的方法。一般而言，方法包括产生编码靶向缀合物组合物的多肽的多核苷酸序列并表达得到的基因产物，以及组装编码该组分的核苷酸，框内连接这些组分，将编码基因引入适合于宿主细胞的表达载体，用该表达载体转化适合的宿主细胞，并在引起或允许产生的融合蛋白在转化的宿主细胞中表达的条件下培养该宿主细胞，从而产生融合蛋白多肽，其可通过本文所述的方法或通过本领域已知的标准蛋白质纯化方法回收。在前述的一个实施方案中，宿主细胞为原核生物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。分子生物学中标准的重组技术可用来制备本发明的多核苷酸和表达载体。
[0422] 根据本发明，使用编码靶向缀合物组合物的多肽的核酸序列(或其互补体)来产生指导在适当的宿主细胞中表达的重组DNA分子。多种克隆策略适合进行本发明，其中许多用来产生包含本发明的组合物的编码基因或其互补体的构建体。在一个实施方案中，该克隆策略用于产生编码靶向缀合物组合物的多肽的基因，其包含编码用于转化宿主细胞(用于表达靶向缀合物组合物的多肽)的多肽的核苷酸。在另一个实施方案中，该克隆策略用于产生编码蛋白质有效负载的基因，其包含编码用于转化宿主细胞(用于表达用于与靶向缀合物组合物的多肽缀合的有效负载组合物)的有效负载的核苷酸。
[0423] 在一种方法中，首先制备含有对应于靶向缀合物组合物的多肽的DNA序列。用于制备这样的构建体的示例性方法描述于实施例中。然后使用构建体来产生适用于转化宿主细胞的表达载体，该宿主细胞诸如用于XTEN的表达和回收的原核宿主细胞(例如，大肠杆菌)。用于表达载体的产生、宿主细胞的转化以及主题组合物的多肽的表达和回收的示例性方法描述于实施例中。
[0424] 可以一步或多步制备编码靶向缀合物组合物的多肽的基因，其为通过完全合成或者通过与酶促过程组合的合成，如限制酶介导的克隆、PCR和重叠延伸，包括在实施例中更全面描述的方法。例如，可以使用本文公开的方法来将编码独立组分基因的多核苷酸短序列连接成期望序列。使用标准的基因合成技术，从寡核苷酸组装编码靶向缀合物组合物的多肽的基因。可以使用优化密码子使用和氨基酸组成的算法进行基因设计。如本文所述，然后将所得基因与编码有效负载肽或靶向缀合物组合物的多肽的基因进行组装，并用所得基因转化宿主细胞并产生和回收靶向缀合物组合物的多肽，以用于评价其性质。
[0425] 然后可以将得到的编码靶向缀合物组合物的多肽的多核苷酸单独克隆到表达载体中。将核酸序列通过多种程序插入载体。一般而言，使用本领域已知的技术将DNA插入适当的限制内切核酸酶位点。载体组分一般包括但不限于信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列中的一个或多个。含有这些组分中的一个或多个的适宜载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。此类技术是本领域熟知的并且详细描述于科学文献和专利文献中。各种载体是可公开获得的。例如，载体可以是质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式，它们可以方便地经历重组DNA过程，并且载体的选择将往往依赖于将其引入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者，该载体可以是当引入宿主细胞时整合至宿主细胞基因组中并与其已整合至其中的染色体一起复制的载体。
[0426] 本发明提供了含有复制和控制序列的质粒表达载体的使用，所述复制和控制序列与宿主细胞相容并被宿主细胞识别，并且与编码多肽的基因可操作地连接以用于多肽的控制表达。载体通常带有复制位点以及编码能够在转化的细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。对于多种细菌、酵母和病毒，此类载体序列是熟知的。可以使用的有用的表达载体包括例如染色体、非染色体和合成DNA序列的区段。“表达载体”指DNA构建体，其包含与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，所述控制序列能够影响编码多肽的DNA在合适的宿主中的表达。要求是这些载体在选择的宿主细胞中可复制并且可存活。可以根据需要使用低拷贝数或高拷贝数的载体。
[0427] 合适的载体包括但不限于SV40和pcDNA的衍生物以及已知的细菌质粒例如col EI、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(描述于Smith等,Gene 57:31-40(1988))、pMB9及其衍生物、质粒例如RP4、噬菌体DNA例如噬菌体I的许多衍生物例如NM98 9，以及其他噬菌体DNA例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母噬菌体例如2μm质粒或2μm质粒的衍生物，以及着丝粒和整合型酵母穿梭载体；用于真核细胞的载体，例如用于昆虫和哺乳动物细胞的载体；由质粒和噬菌体DNA组合产生的载体，例如经修饰具有噬菌体DNA或表达控制序列的质粒；等等。还可在本发明中使用的酵母表达系统包括但不限于非融合pYES2载体(Invitrogen)，融合pYESHisA,B,C(Invitrogen)、pRS载体等。载体的控制序列包括实现转录的启动子、控制这种转录的任选的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。启动子可以是任何DNA序列，其在所选的宿主细胞中展示出转录活性，并且可来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。适合用于原核宿主表达载体的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等,Nature,275:615(1978)；Goeddel等,Nature,
281:544(1979)]，碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel,Nucleic Acid Res.,8:
4057(1980)；EP 36,776]，和杂合启动子，例如tac启动子[deBoer等,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]，它们都与编码CFXTEN多肽的DNA可操作地连接。用于细菌系统的启动子还可以含有与编码CFXTEN多肽的DNA可操作地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
Ⅺ).本发明的多联体序列
281:544(1979)]，碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel,Nucleic Acid Res.,8:
4057(1980)；EP 36,776]，和杂合启动子，例如tac启动子[deBoer等,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]，它们都与编码CFXTEN多肽的DNA可操作地连接。用于细菌系统的启动子还可以含有与编码CFXTEN多肽的DNA可操作地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
Ⅺ).本发明的多联体序列
[0428] 在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含在制备或组装靶向缀合物组合物中有用的靶向缀合物组合物的多肽组分的多联体的融合蛋白。如图87B和C所示，表26和表27中的序列的多联体序列为在N末端至C末端构型中具有至少四种不同构型的融合蛋白；1)FRH4序列、CCD、PCM和228个氨基酸的短XTEN序列；2)FRL4序列、CCD、PCM和228个氨基酸的短XTEN序列；3)229个氨基酸的短XTEN序列、PCM、CCD和FRL1；以及4)229个氨基酸的短XTEN序列、PCM、CCD和FRH1。本发明的目的是提供在靶向缀合物组合物的组合物中的融合蛋白多联体，其中多联体序列插入到本文公开的实施方案的scFv(小于相应的FR序列WGQGTLVTVS、或TFGQGTKVEIK、或EVQLVESGGG、或DIQMTQSPSS)与表10或表11中的XTEN之间的融合蛋白中。然后，产生的融合蛋白将与本文所述的一种或多种有效负载药物或生物制剂(包括但不限于表14-17中的那些)缀合，产生靶向缀合物组合物。
[0429] 在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含显示出与选自表26中所示序列的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含显示出与选自表27中所示序列的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约
95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的序列。
95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的序列。
[0430] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含融合蛋白的组合物，其在N末端至C末端方向具有以下组分：1)第一区域，其包含来源于表19中含有FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CRL3、FRL4、来自表20的连接体、FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3和CRH3序列的抗体的scFv；2)第二区域，其包含显示出与来自表26的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约
98％、或至少约99％的同一性或与之相同的序列；以及3)第三区域，其包含显示出与选自表
10或表11中所示序列的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的XTEN。
98％、或至少约99％的同一性或与之相同的序列；以及3)第三区域，其包含显示出与选自表
10或表11中所示序列的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的XTEN。
[0431] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含融合蛋白的组合物，其在N末端至C末端方向具有以下组分：1)第一区域，其包含来源于表19中含有FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CRH3、FRH4、来自表20的连接体、FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3和CRL3序列的抗体的scFv；2)第二区域，其包含显示出与来自表26的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约
98％、或至少约99％的同一性或与之相同的序列；以及3)第三区域，其包含显示出与选自表
10或表11中所示序列的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的XTEN。
98％、或至少约99％的同一性或与之相同的序列；以及3)第三区域，其包含显示出与选自表
10或表11中所示序列的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的XTEN。
[0432] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含融合蛋白的组合物，其在N末端至C末端方向具有以下组分：1)第一区域，其包含显示出与选自表10或表11中所示序列的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的XTEN；2)第二区域，其包含显示出与来自表27的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的序列；以及3)第三区域，其包含来源于表19中含有CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CRL3、FRL4、来自表20的连接体、FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CRH3和FRH4序列的抗体的scFv。
[0433] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含融合蛋白的组合物，其在N末端至C末端方向具有以下组分：1)第一区域，其包含显示出与选自表10或表11中所示序列的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的XTEN；2)第二区域，其包含显示出与来自表27的序列至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的同一性或与之相同的序列；以及3)第三区域，其包含来源于表19中含有CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CRH3、FRH4、来自表20的连接体、FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CRL3和FRH4序列的抗体的scFv。
[0434] 在其他实施方案中，本发明提供了包含该部分的段落的融合蛋白的靶向缀合物组合物，该靶向缀合物组合物具有与半胱氨酸残基连接的药物或生物制剂，其中该药物或生物制剂选自表14-17中的药物或生物制剂。在前述的一个实施方案中，所述药物或生物制剂选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂 (PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素。表26：用于靶向缀合物组合物的融合蛋白组分的多联体
*序列为FR4-CCD-PCM-XTEN的融合物的N末端至C末端的序列
表27：用于靶向缀合物组合物的融合蛋白组分的多联体
*序列为XTEN-PCM-CCD-FR1*的融合物的N末端至C末端的序列
*序列为FR4-CCD-PCM-XTEN的融合物的N末端至C末端的序列
表27：用于靶向缀合物组合物的融合蛋白组分的多联体
*序列为XTEN-PCM-CCD-FR1*的融合物的N末端至C末端的序列
[0435] 以下为本发明的组合物、方法和治疗方案的实施例。应当理解，考虑到以上提供的一般描述，可实施多个其他的实施方案。
实施例
实施例
[0436] 实施例1：XTEN_AE864的构建
[0437] 由XTEN_AE36的连续二聚化成AE72、144、288、576和864来构建XTEN_AE864。从37个不同的XTEN_AE36区段构建XTEN_AE72区段的集合。将携带所有37个不同的36-氨基酸区段的大肠杆菌的培养物混合并分离质粒。用BsaI/NcoI消化该质粒库以产生小片段作为插入序列。用BbsI/NcoI消化相同的质粒库以产生大片段作为载体。将插入序列和载体片段连接，导致长度倍增，并且将连接混合物转化到BL21Gold(DE3)细胞以获得XTEN_AE72的菌落。
[0438] 将XTEN_AE72区段的该文库称为LCW0406。对来自LCW0406的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到XTEN_AE144的文库LCW0410。对来自LCW0410的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到XTEN_AE288的文库LCW0414。从文库随机选取两个独立克隆LCW0414.001和LCW0414.002并进行测序以证实同一性。对来自LCW0414的所有克隆进行组合并使用如上述相同的方法再次二聚化，得到XTEN_AE576的文库LCW0418。我们针对高水平的GFP荧光从文库LCW0418筛选了96个独立克隆。对通过PCR具有正确大小的插入序列和强荧光的8个独立克隆进行测序，并且基于测序和表达数据选择2个独立克隆(LCW0418.018和LCW0418.052)将来使用。
[0439] 使用如上所述相同的二聚化过程，通过组合XTEN_AE576的LCW0418.018和XTEN_AE288的LCW0414.002构建XTEN_AE864的特定克隆pCW0432。
[0440] 实施例2：XTEN_AG864的构建
[0441] 使用几轮连续的二聚化，我们从实施例4所列XTEN_AD36区段开始组装XTEN_AG864序列的集合。所使用的方法和材料修改自上述实施例1的材料。组装了这些序列并评估了来自XTEN_AG864的几个独立克隆并发现在生理条件下显示良好的表达和优良的溶解度。XTEN_AG864的全长克隆具有优良的溶解度，并且显示在食蟹猴中超过60h的半衰期。
[0442] 实施例3：CXTEN的构建(1x氨基、3x巯基-XTEN864)
[0443] 在具有T7启动子&SASRSABsaIrev-AACG、CI1-AE864BsaIfor-AACG&AE432-CI2BbsIrev2和CI2-AE432BsaIfor2&AE_003SbfIrev引物对的质粒pYS0072上进行PCR反应以获得CI1、CI2和AE-SbfI的PCR产物。凝胶纯化正确大小的条带并用相应的合适限制酶消化作为插入序列。
[0444] 用NdeI/SbfI消化质粒pYS0072并凝胶纯化大片段作为载体。将该载体与上述插入序列连接并转化入DH5α感受态细胞以通过对编码HD2-R-XTEN_AE864(C12,C432,C854)-R-H8蛋白质的pCW1305的正确克隆的测序确认进行筛选。DNA序列和蛋白质序列提供于下表28中。表28：针对CXTEN(1x氨基、3-巯基-XTEN864)的DNA和氨基酸序列
[0445] 实施例4：CCD-XTEN的构建
[0446] 使用AE_003BsaIBbsIfor-TGGT&AE712-MycAgeIrev引物对在pCW1470上运行PCR以获得BsaIBbsI-AE712的PCR产物。凝胶纯化正确大小的条带并用BsaI/AgeI消化作为插入序列。将插入序列与BsaI/AgeI消化的pNL0322载体连接并转化入DH5α感受态细胞以筛选pCW1471的正确克隆作为下一克隆步骤的载体。
[0447] 使用AE42_3CBsaIfor&AE42BsaIrev-TGGT引物对在pCW1466上运行PCR以获得AGGT-AE42-TGGT的PCR产物。凝胶纯化正确大小的条带并用BsaI消化作为插入序列。用BsaI/BbsI消化上述pCW1471并凝胶纯化大片段作为载体。将载体与插入序列连接并转化入DH5α感受态细胞以通过对编码HD2-R-XTEN_AE42(C8,C24,C40)-XTEN_AE712-R-Myc-H8蛋白质的pCW1472(AC1255)的正确克隆的测序确认进行筛选。DNA序列和蛋白质序列提供于下表
29中。
表29：针对1x氨基、3x巯基-XTEN42-XTEN712的DNA和氨基酸序列
29中。
表29：针对1x氨基、3x巯基-XTEN42-XTEN712的DNA和氨基酸序列
[0448] 实施例5：CCD-PCM-XTEN的构建
[0449] 使用4Afor&AE712HindIIIrev引物对在含有PCM-XTEN_AE712-H8的质粒pCW1464上运行PCR反应以获得没有组氨酸的AE712的PCR产物。凝胶纯化正确大小的条带并用SbfI/HindIII消化作为插入序列。用BsaI/HindIII消化pCW1464并凝胶纯化大片段作为载体。将载体与先前BsaI/SbfI消化的来自pCW1330的XTEN片段和XTEN_AE712的SbfI/HindIII消化的PCR插入序列相连接。转化入DH5α感受态细胞以获得pCW1469的菌落并通过测序确认筛选正确克隆作为下一克隆步骤的载体。
[0450] 使用TEV-AE42_3CNheIfor&AE42_3CBsaIrev引物对在pCW1466上运行PCR以获得TEV-AE42_3C的PCR产物。凝胶纯化正确大小的条带并用NheI/BsaI消化作为插入序列。用NdeI/BsaI消化上述质粒pCW1469并凝胶纯化大片段作为载体。将载体与HD2-H8NheIfor&rev的退火的寡核苷酸和TEV-AE42_3C的NheI/BsaI消化的PCR插入序列相连接。转化入DH5α感受态细胞以通过对编码HD2-His8-TEV-XTEN_AE42(C8,C24,C40)-PCM-XTEN_AE712蛋白质的pCW1470(AC1254)的正确克隆的测序确认进行筛选。DNA序列和蛋白质序列提供于下表30中。表30：针对1x氨基、3x巯基-XTEN42-PCM-XTEN712的DNA和氨基酸序列
[0451] 实施例6：用于缀合的XTEN的发酵
[0452] 通过将携带含有对于缀合蛋白质序列适当的XTEN的质粒的大肠杆菌甘油储备物接种到含有50μg/mL卡那霉素的125mL LB肉汤培养基中来制备起子培养物。然后将培养物在37℃下摇动过夜。使用起子培养物接种在具有B.Braun Biostat B控制器的5L玻璃夹套容器中的含有——12.5g硫酸铵、15g无水磷酸氢二钾、2.5g二水柠檬酸钠；8.5g一水磷酸二氢钠；50g NZ BL4大豆蛋白胨(Kerry Bioscience#5X00043)；25g酵母提取物(Teknova#Y9020)；1.8L水；0.5mL聚丙二醇；2.5mL微量元素溶液(Amunix recipe 144-1)；17.5mL 1M硫酸镁；以及2mL卡那霉素(50mg/mL)——的2L发酵分批培养基。发酵控制设置为：pH＝6.9+/-0.1；dO2＝10％；在125-1180rpm范围的仅搅拌器模式中的溶解氧级联；每分钟5升90％氧气的气流；初始温度37℃；13％氢氧化铵的碱控制；以及无酸控制。在培养6小时后，以30g/hr的速度开始50％的葡萄糖进料。在培养20小时后，加入25mL的1M硫酸镁和3mL的1M IPTG。在45小时的总发酵运行时间后，通过离心收获培养物，得到针对所有构建体的湿重
0.45-1.1千克的细胞沉淀。将这些沉淀冷冻储存在-80℃下直至进一步使用。在发酵中的多个时间点获取培养样品，将细胞裂解，然后用加热和快速冷却使细胞碎片絮凝，通过离心制备澄清的可溶性裂解物，并根据制造商说明书使用来自Invitrogen的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶采用Coomassie染色通过常规非还原SDS-PAGE进行分析。结果显示，XTEN融合蛋白的积累为发酵运行时间的函数，并且XTEN融合蛋白构建体在发酵规模下表达，具有>1g/L的效价，约160kDa的表观MW(注意，实际分子量为100kDa。观察到的SDS-PAGE的迁移与针对其他含有XTEN的融合蛋白观察到的迁移是可比的)。
0.45-1.1千克的细胞沉淀。将这些沉淀冷冻储存在-80℃下直至进一步使用。在发酵中的多个时间点获取培养样品，将细胞裂解，然后用加热和快速冷却使细胞碎片絮凝，通过离心制备澄清的可溶性裂解物，并根据制造商说明书使用来自Invitrogen的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶采用Coomassie染色通过常规非还原SDS-PAGE进行分析。结果显示，XTEN融合蛋白的积累为发酵运行时间的函数，并且XTEN融合蛋白构建体在发酵规模下表达，具有>1g/L的效价，约160kDa的表观MW(注意，实际分子量为100kDa。观察到的SDS-PAGE的迁移与针对其他含有XTEN的融合蛋白观察到的迁移是可比的)。
[0453] 实施例7：来自高密度细菌发酵的CCD-XTEN的纯化
[0454] 1.表达
[0455] 在大肠杆菌BL21_DE3中在T7RNA聚合酶的控制下表达构建体AC1255(MKNPEQAEEQAEEQREET-SASRGS-CCD1-XTEN_AE713-SASRSA-Myc-His8)。在LB瓶中培养AC1255直至OD600为约2.5，并将AC1255转移到含有具有2.1g/L葡萄糖的丰富培养基的发酵罐中。在分批进料耗尽后，以预编程的葡萄糖限制曲线添加70％w/v的葡萄糖。用IPTG在40-
50OD600下诱导培养，然后培养18-24小时直至收获。通过离心使细胞沉淀，并在-80℃下冷冻。
50OD600下诱导培养，然后培养18-24小时直至收获。通过离心使细胞沉淀，并在-80℃下冷冻。
[0456] 2.裂解和澄清
[0457] 将细胞沉淀(2600g)重新悬浮于pH 4.0的7400ml 50mM柠檬酸盐中。将重新悬浮的细胞加热到8℃持续15分钟，然后在冰上快速冷却30分钟。用12M HCl将裂解物的pH调节到3.0，并在4℃下在搅拌下将裂解物在pH 3.0下储存过夜。然后通过在4℃下在7000rpm下离心40min将裂解物澄清两次，并对上清液进行0.2μm过滤。
[0458] 3.阳离子交换捕获步骤
[0459] 将澄清的裂解物加载至装有Capto SP ImpRes(GE Healthcare)的1L柱上，该柱先前用NaOH清洁并用Mcilvaine缓冲液，pH 3.0、100mM NaCl平衡。用3个柱体积的Mcilvaine缓冲液，pH 3.0洗柱，并用5个柱体积的洗脱缓冲液(34％20mM柠檬酸，pH 2.5、66％40mM磷酸氢二钠，pH 9.0)洗脱，然后用1个柱体积的20M磷酸盐、500mM NaCl，pH 7.0解吸。通过4-12％Bis-Tris SDS-PAGE和Coomassie染色分析级分(图19A)。基于凝胶，将含有期望产物的洗脱级分用于进一步处理。
[0460] 4.阳离子交换柱洗脱集合体的胰蛋白酶消化
[0461] 在阳离子交换色谱后，使用胰蛋白酶消化切掉N标签和C标签。然后使用40％w/w氢氧化钠/12M HCl将集中的级分的pH调节到8.0，然后在温和混合下与牛胰蛋白酶(Sigma)在室温下温育过夜(酶/蛋白质质量比为1:5000)。在反应后，通过添加2mM EDTA和10mM DTT使胰蛋白酶灭活，并将反应混合物加热到80℃持续15分钟，然后在冰上冷却直至温度降低到10℃。
[0462] 5.阴离子交换抛光步骤
[0463] 使用阴离子交换色谱作为抛光步骤以从最终产物分离切割的标签和截短的产物。对胰蛋白酶消化后的样品进行0.2μm过滤，然后加载至装有Capto Q ImpRes(GE
Healthcare)的1.57L柱上，该柱先前用NaOH清洁并用20mM MES，pH 6.35平衡。在加载后，用
4个柱体积的20mM MES pH 6.35洗柱，然后用4个柱体积的20mM MES，pH 6.35、50mM NaCl洗柱。应用三个梯度洗脱步骤：20mM MES，pH 6.35、50-145mM NaCl超过5个柱体积，随后20mM MES，pH 6.35、145-205mM NaCl超过5个柱体积，最后20mM MES，pH 6.35、205-350mM NaCl超过5个柱体积。之后，用0.5个柱体积的20mM MES，pH 6.35、500mM NaCl使柱解吸。通过SDS-PAGE然后通过全染料(Stains-all)的染色分析级分(图19B)。基于凝胶，集中洗脱液E1至E7用于制剂。
Healthcare)的1.57L柱上，该柱先前用NaOH清洁并用20mM MES，pH 6.35平衡。在加载后，用
4个柱体积的20mM MES pH 6.35洗柱，然后用4个柱体积的20mM MES，pH 6.35、50mM NaCl洗柱。应用三个梯度洗脱步骤：20mM MES，pH 6.35、50-145mM NaCl超过5个柱体积，随后20mM MES，pH 6.35、145-205mM NaCl超过5个柱体积，最后20mM MES，pH 6.35、205-350mM NaCl超过5个柱体积。之后，用0.5个柱体积的20mM MES，pH 6.35、500mM NaCl使柱解吸。通过SDS-PAGE然后通过全染料(Stains-all)的染色分析级分(图19B)。基于凝胶，集中洗脱液E1至E7用于制剂。
[0464] 7.浓缩和缓冲液更换(配制)
[0465] 作为最终步骤，使用Biomax-5Pellicon XL超滤盒(Millipore)将集中的蛋白质的缓冲液更换为配制缓冲液(20mM MES，pH 5.5)，并浓缩至>15mg/mL的最终浓度。
[0466] 实施例8：来自高密度细菌发酵的CCD-PCM-XTEN的纯化
[0467] 1.表达
[0468] 在大肠杆菌BL21_DE3中在T7RNA聚合酶的控制下表达构建体AC1254(MKNPEQAEEQAEEQREET-His8-SASRSA-TEV-CCD1-LSGRSDNHSPLGLAGS-AE713)。在LB瓶中培养AC1255直至OD600为约2.5，并将AC1255转移到含有具有2.1g/L葡萄糖的丰富培养基的发酵罐中。在分批进料耗尽后，以预编程的葡萄糖限制曲线添加70％w/v的葡萄糖。用IPTG在40-
50OD600下诱导培养，然后培养18-24小时直至收获。通过离心使细胞沉淀，并在-80℃下冷冻。
50OD600下诱导培养，然后培养18-24小时直至收获。通过离心使细胞沉淀，并在-80℃下冷冻。
[0469] 2.裂解和澄清
[0470] 将细胞沉淀(4204g)重新悬浮于pH 4.0的8400ml 50mM柠檬酸盐中。将重新悬浮的细胞加热到8℃持续15分钟，然后在冰上快速冷却30分钟。用12M HCl将裂解物的pH调节到3.0，并在4℃下在搅拌下将裂解物在pH 3.0下储存过夜。然后通过在4℃下在7000rpm下离心40min将裂解物澄清两次，并对上清液进行0.2μm过滤。
[0471] 3.阳离子交换捕获步骤
[0472] 将澄清的裂解物加载至装有Capto SP ImpRes(GE Healthcare)的1L柱上，该柱先前用NaOH清洁并用Mcilvaine缓冲液，pH 3.0、100mM NaCl平衡。用3个柱体积的Mcilvaine缓冲液，pH 3.0洗柱，并用5个柱体积的洗脱缓冲液(34％20mM柠檬酸，pH 2.5、66％40mM磷酸氢二钠，pH 9.0)洗脱，然后用1个柱体积的20M磷酸盐、500mM NaCl，pH 7.0解吸。通过4-12％Bis-Tris SDS-PAGE和Coomassie染色分析级分(图20A)。基于凝胶，将含有期望产物的洗脱级分用于进一步处理。
[0473] 4.阳离子交换柱洗脱集合体的TEV蛋白酶消化
[0474] 在阳离子交换色谱后，使用TEV蛋白酶消化切掉N标签。然后使用40％w/w氢氧化钠将洗脱集合体的pH调节到pH8.0，并将DTT和EDTA加入样品中，以达到各自1mM的最终浓度。然后在温和混合下将样品与TEV蛋白酶在室温下温育过夜(酶/蛋白质质量比为1:20)。在反应后，通过添加2mM EDTA和10mM DTT使TEV蛋白酶灭活，并将反应混合物加热到80℃持续15分钟，然后在冰上冷却直至温度降低到10℃。
[0475] 5.阴离子交换抛光步骤
[0476] 使用阴离子交换色谱作为抛光步骤以从最终产物分离切割的标签和截短的产物。对TEV消化后的样品进行0.2μm过滤，然后加载至装有Capto Q ImpRes(GE Healthcare)的
3L柱上，该柱先前用NaOH清洁并用20mM MES，pH 6.35平衡。在加载后，用3个柱体积的20mM MES pH 6.35洗柱，并用3个柱体积的20mM MES，pH 6.35、40mM NaCl洗柱。然后应用三个梯度洗脱步骤：20mM MES，pH 6.35、40-90mM NaCl超过3个柱体积，随后20mM MES，pH 6.35、
90-200mM NaCl超过5个柱体积，最后20mM MES，pH 6.35、200-350mM NaCl超过8个柱体积。
然后用1个柱体积的20mM MES，pH 6.35、500mM NaCl使柱解吸。通过SDS-PAGE然后通过全染料的染色分析级分(图20B)。基于凝胶，集中洗脱液17至22用于制剂。
3L柱上，该柱先前用NaOH清洁并用20mM MES，pH 6.35平衡。在加载后，用3个柱体积的20mM MES pH 6.35洗柱，并用3个柱体积的20mM MES，pH 6.35、40mM NaCl洗柱。然后应用三个梯度洗脱步骤：20mM MES，pH 6.35、40-90mM NaCl超过3个柱体积，随后20mM MES，pH 6.35、
90-200mM NaCl超过5个柱体积，最后20mM MES，pH 6.35、200-350mM NaCl超过8个柱体积。
然后用1个柱体积的20mM MES，pH 6.35、500mM NaCl使柱解吸。通过SDS-PAGE然后通过全染料的染色分析级分(图20B)。基于凝胶，集中洗脱液17至22用于制剂。
[0477] 7.浓缩和缓冲液更换(配制)
[0478] 作为最终步骤，使用Biomax-5Pellicon XL超滤盒(Millipore)将集中的蛋白质的缓冲液更换为配制缓冲液(20mM MES，pH 5.5)，并浓缩至>15mg/mL的最终浓度。
[0479] 实施例9：CCD-PCM-XTEN构建体AC1254的酶激活、储存和消化
[0480] 本实施例显示前述CCD-PCM-XTEN构建体之一AC1254(PCM序列为表8中的BSRS1且先前描述于实施例8中)，可被多种肿瘤相关蛋白酶(包括MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-14、MTSP1和uPA)在试管中切割。
[0481] 1.酶激活
[0482] 从R&D系统获得使用的所有酶。提供重组人u-纤溶酶原激活剂(uPA)和重组人蛋白裂解酶作为激活酶并储存在-80℃下直至使用。提供重组小鼠MMP-2、重组人MMP-7和重组小鼠MMP-9作为酶原且需要通过4-氨基乙酸苯汞(APMA)激活。首先将APMA溶解于0.1M NaOH中达到10mM的最终浓度，然后使用0.1N HCl将pH重新调节到中性。在50mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2，pH 7.5中将APMA储备物进一步稀释到2.5mM。为了激活MMP酶原(pro-MMP)，将
1mM APMA和100ug/mL MMP酶原在37℃下温育1小时(MMP-2、MMP-7)或3小时(MMP-9)。然后可将添加至50％甘油的最终浓度的活化酶在-20℃下储存数周。
1mM APMA和100ug/mL MMP酶原在37℃下温育1小时(MMP-2、MMP-7)或3小时(MMP-9)。然后可将添加至50％甘油的最终浓度的活化酶在-20℃下储存数周。
[0483] 2.酶消化
[0484] 测试一组酶以确定每种酶对AC1254(CCD1-BSRS1-AE713)的切割效率。以下列酶与底物的摩尔比将10μM底物与每种酶一起温育：MMP-2(1:680)、MMP-7(1:200)、MMP-9(1:6711)、蛋白裂解酶(1:12.5)和uPA(1:12.5)。在37℃下将反应温育2小时，然后通过在MMP反应的情况下将EDTA添加到20mM并且在uPA和蛋白裂解酶反应的情况下在85℃下加热15分钟来停止消化。
[0485] 3.切割效率分析
[0486] 通过将5μg未消化和经消化的材料加载至SDS-PAGE并用Coomassie Blue染色(图45A)，以及将8μg未消化和经消化的产物运行C4 RP-HPLC(图45B)来进行样品的分析以确定切割产物的百分比。通过RP-HPLC，通过分析以10分钟间隔收集到的消化反应的样品，可观察到一小时过程中MMP-9消化的典型时程。(图44A)还可包括两种阴性对照：一种证实在不存在MMP时不发生消化，一种证实在只存在APMA时不发生消化(图44B)。对于SDS-PAGE凝胶，使用ImageJ来分析条带强度并确定切割百分比。在通过多种蛋白酶切割PCM区段时，底物CCD1-PCM-XTEN将产生两个片段，小片段大多含有CCD1，而另一个片段含有XTEN，后者在SDS-PAGE上将以较低的表观分子量迁移。结果证实，此处测试的所有蛋白酶均如所预期的切割构建体，且催化效率的程度不同。
[0487] 实施例10：IA-MMAE与CXTEN864缀合以产生3x-MMAE-CXTEN864
[0488] 用3摩尔当量的TCEP在80℃下在pH 8.0下将205mg的CXTEN(XTEN_AE864(Am1,C12,C432,C854)，下表31中的序列)还原20min。将经还原的3x-Cys-XTEN与5摩尔当量的IA-MMAE(溶解在无水DMF中)在25℃下反应过夜。通过C4 RP-HPLC评估缀合效率。完全缀合的药物负载产物峰(在此情况下为3x-MMAE峰)与距离完全缀合峰最近的次缀合(underconjugated)峰(在此情况下为2x-MMAE峰)之间间距的量化通过使用下列公式计算峰距(即用这些峰之间保留时间的差值除以半峰全宽)来确定：峰距＝(tR2-tR1)/FWHM
其中
tR2：完全缀合物产物峰的保留时间
tR1：最接近完全缀合物产物峰的次缀合峰的保留时间
FWHM：半峰全宽
其中
tR2：完全缀合物产物峰的保留时间
tR1：最接近完全缀合物产物峰的次缀合峰的保留时间
FWHM：半峰全宽
[0489] 用于比较不同构建体的分离的分析方法：将含有10μg XTEN的反应混合物注入C4 RP-HPLC(Vydac，货号#214TP5415，4.6mm x 150mm，5um粒径))并使用在缓冲液A(在水中0.1％TFA)中的5-50％缓冲液B(在乙腈中0.1％TFA)的方法在45分钟内以1mL/min进行分析。
[0490] 通过使用此方法，确定当制备3xMMAE缀合物时CXTEN的峰距为4.5(图33B)。
[0491] 对于纯化，用TFA将混合物酸化到pH<3，并添加DMF直到13％(v/v)的最终体积。将混合物分成两个等份，且每份均通过制备型C4 RP-HPLC(C4，Vydac，250mm x 22mm)进行纯化。通过C4 RP-HPLC分析色谱级分。将含有期望产物的级分集中，用1M HEPES pH 8.0中和，并进行真空浓缩。使用超滤(Sartorius，Vivacell 100，10kDa MWCO)将3x-MMAE-XTEN产物配制在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中。通过C4 RP-HPLC证明最终产物的高纯度(>95％，图32)。确定反应产率为53.0％。表31：实施例10中组分的氨基酸序列
[0492] 实施例11：IA-MMAE与CCD-XTEN缀合以产生3x-MMAE-CCD-XTEN
[0493] 向在12.3mL 20mM MES pH 5.5中的236mg的CCD-XTEN(XTEN_AE759(Am1,C8,C24,C40)，下表33中的序列)添加3.08mL 1M HEPES pH 8.0。用3摩尔当量的TCEP在80℃下将该CCD-XTEN还原20min。然后将还原的CCD-XTEN用1.4mL的1M HEPES pH 8.0稀释并与6摩尔当量的IA-MMAE(溶于6.13mL无水DMF)在25℃下反应24h。用30摩尔当量的谷胱甘肽在25℃下将反应猝灭30min。
[0494] 使用与实施例10中所述的相同的分析方法，通过C4 RP-HPLC(Vydac，货号#214TP5415，4.6mm x 150mm，5um粒径)评估缀合。观察到与3x药物负载的CXTEN(峰距＝4.5，参见实施例10)相比，3x药物负载的CCD-XTEN的增加的峰距(峰距＝11.8)(图33B)。
[0495] 用TFA将混合物酸化到pH<3，并添加DMF直到13％(v/v)的最终体积。通过制备型C4 RP-HPLC(C4，Vydac，250mm x 22mm)纯化期望的3x-MMAE-XTEN产物。通过C4 RP-HPLC分析色谱级分。将含有期望产物的级分集中，用1M HEPES pH 8.0中和，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare)上纯化，其中使用10个柱体积的150mM至350mM NaCl的梯度进行洗脱。通过C4 RP-HPLC分析色谱级分。将选择的具有3x-MMAE-CCD-XTEN的级分集中，并使用超滤配制在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中。通过C4 RP-HPLC证明最终产物的高纯度(>95％，图
21A)。确定反应产率为57.9％，优于IA-MMAE与CXTEN缀合(参见上述实施例10)达到的产率。
21A)。确定反应产率为57.9％，优于IA-MMAE与CXTEN缀合(参见上述实施例10)达到的产率。
[0496] 结论：与使用CXTEN的构建体相比，CCD并入构建体的融合蛋白中导致回收期望的完全缀合产物的能力增强(如通过峰距所确定的)，并且总产物产率更高。
[0497] 实施例12：IA-MMAE与CCD-PCM-XTEN缀合以产生3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN
[0498] 用3摩尔当量的TCEP在80℃下在pH 8.0下将CCD-PCM-XTEN(XTEN_AE42(Am1,C8,C24,C40)-PCM-XTEN_AE713还原20min。随后将经还原的CCD-PCM-XTEN与6摩尔当量的IA-MMAE在25℃下在pH 8.0下反应2天。用30摩尔当量的谷胱甘肽在25℃下将反应猝灭30min，并通过C4 RP-HPLC评估缀合。用TFA将混合物酸化到pH<3，并添加DMF直到13％(v/v)的最终体积。通过制备型C4 RP-HPLC(C4，Vydac，250mm x 22mm)纯化期望的3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN产物。通过C4 RP-HPLC分析色谱级分。将含有期望产物的级分集中，用1M HEPES pH 8.0中和，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare)上纯化，其中使用10个柱体积的150mM至
350mM NaCl的梯度进行洗脱。通过C4 RP-HPLC分析色谱级分。将选择的具有3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN的级分集中，并使用超滤配制在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中。通过C4 RP-HPLC和完整质量(观察到ESI-MS为+12Da)证明最终产物的高纯度(>95％，图21B)。
350mM NaCl的梯度进行洗脱。通过C4 RP-HPLC分析色谱级分。将选择的具有3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN的级分集中，并使用超滤配制在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中。通过C4 RP-HPLC和完整质量(观察到ESI-MS为+12Da)证明最终产物的高纯度(>95％，图21B)。
[0499] 实施例13：通过缀合制备碘乙酰胺-3x-DM1-CXTEN
[0500] 用0.075mL的1M HEPES pH 8.0调节在20mM MES pH 5.5中的1.5mL的XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422)(28.5mg,725nmol)半胱氨酸工程化的XTEN区段的pH。向该3x-Cys-XTEN中添加0.067mL的IA-DM1(在无水DMF中54mM)，并添加额外的DMF以完全溶解IA-DM1。在室温下将反应温育2.5h并通过RP-HPLC进行监测。通过制备型HPLC(C4，Vydac，250mm x 10mm)纯化3x-DM1-CXTEN产物。通过C4 RP-HPLC分析色谱级分。将含有3x-DM1-CXTEN的级分集中，用1M HEPES pH 8.0中和，并进行真空浓缩。使用超滤(Amicon Ultra-15，3kDa MWCO)将3x-DM1-CXTEN产物配制在20mM HEPES pH 7.0、135mM NaCl中。通过使0.45mL的3x-DM1-CXTEN(4.1mg，99nmol)和0.023mL 1M HEPES pH 8.0与0.01mL的SIA(在无水DMF中50mM)在室温下反应2h将3x-DM1-CXTEN的N末端转化为碘乙酰胺。在通过超滤(Amicon Ultra-15，
5kDa MWCO)配制在20mM HEPES pH 7.0、135mM NaCl中期间去除过量的SIA。
5kDa MWCO)配制在20mM HEPES pH 7.0、135mM NaCl中期间去除过量的SIA。
[0501] 实施例14：通过缀合制备碘乙酰胺-3x-MMAE-CXTEN
[0502] 用0.27mL的1M HEPES pH 8.0调节在20mM MES pH 5.5中的1mL的XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422)(30.4mg)半胱氨酸工程化的XTEN区段的pH。向该3x-Cys-XTEN中添加IA-MMAE(5摩尔当量，在无水DMF中64.6mg/mL)，并添加额外的0.3mL DMF以完全溶解混合物中的IA-MMAE。在25℃下将反应温育4h并通过C4 RP-HPLC进行监测。将3x-MMAE-CXTEN产物分成两等份，且每份均通过制备型HPLC(C4，Vydac，250mm x 10mm)进行纯化。通过C4 RP-HPLC分析色谱级分。将含有3x-MMAE-CXTEN的级分集中，用1M HEPES pH 8.0中和，并进行真空浓缩。使用超滤(Amicon Ultra-15，3kDa MWCO)将3x-MMAE-CXTEN产物配制在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中。通过使在15mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中的3x-MMAE-CXTEN(126mg，2940nmol)与0.15mL的SIA(10摩尔当量，在DMF中200mM)在25℃下反应1.5h将3x-MMAE-CXTEN的N末端转化为碘乙酰胺。在通过超滤(Sartorius，Vivacell 100，5kDa MWCO)配制在20mM HEPES pH 7.0中期间去除过量的SIA。ESI-MS(计算MW 43,024.5Da，表观MW
43,022.0Da)的结果以及IA与含半胱氨酸的模式肽HCKFWW(Bachem,H-3524)的87.4％的反应性证明了最终产物的高纯度和反应性。
43,022.0Da)的结果以及IA与含半胱氨酸的模式肽HCKFWW(Bachem,H-3524)的87.4％的反应性证明了最终产物的高纯度和反应性。
[0503] 实施例15：MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN或MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN的制备
[0504] 使30mg的3x-MMAE-CCD-XTEN(来自实施例11)或3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN(来自实施例12)与在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl、3.3％(v/v)DMF中的10摩尔当量的SMCC(溶于DMF中)在25℃下反应1h。通过超滤使用20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl去除过量的SMCC。通过C4 RP-HPLC(>95％，图22A)和SDS-PAGE(图22B)证明产物的高纯度。通过与含半胱氨酸的模式XTEN(XTEN_AE288(Am1,C283)反应来分别评估MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN和MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN的反应性。MCC反应性结果显示出马来酰亚胺产物的高产率(图22B)。
[0505] 实施例16：aHER2-XTEN与3x-DM1-CXTEN缀合以制备aHER2靶向的XTEN-3x-DM1缀合物
[0506] 用0.5mM TCEP在室温下将在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中的10mL的aHER2-XTEN_AE304(C296)-H8(153mg，2722nmol)还原1.5h。通过将每种2.5mL加载至四个脱盐柱(GE，PD-10)并分别用3.5mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl(共14mL)洗脱来去除过量的TCEP。使经还原的aHER2-XTEN_AE304(C296)-H8(153mg，2722nmol)的半胱氨酸侧链与IA-3xDM1-CXTEN(1853nmol，参见实施例13)的N末端碘乙酰胺在用硼酸钠缓冲液将pH调节到
8.5的总体积为28mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中在25℃下反应过夜。通过SDS-PAGE监测反应。将混合物加载至充满Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate
650M，150mL，50mm直径)。在流过物(flow-through)中去除未反应的IA-3x-DM1-CXTEN。用在
20mM磷酸盐pH 7.0中的10mM至100mM咪唑洗脱aHER2靶向的XTEN-药物缀合物。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare，
100mL，50mm直径)上纯化，其中用18个柱体积的在20mM HEPES pH 7.0中的150mM至350mM NaCl的梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将选择的具有aHER2靶向的CXTEN-3x-DM1缀合物的级分集中并使用超滤(Sartorius，Vivacell 100，10kDa MWCO)配制在PBS中。
SDS-PAGE(图25A)、ESI-MS(图25B)和HIC(图25C)分析的结果证明了最终产物的高纯度。
表32：实施例16和17中组分的氨基酸序列
8.5的总体积为28mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中在25℃下反应过夜。通过SDS-PAGE监测反应。将混合物加载至充满Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate
650M，150mL，50mm直径)。在流过物(flow-through)中去除未反应的IA-3x-DM1-CXTEN。用在
20mM磷酸盐pH 7.0中的10mM至100mM咪唑洗脱aHER2靶向的XTEN-药物缀合物。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare，
100mL，50mm直径)上纯化，其中用18个柱体积的在20mM HEPES pH 7.0中的150mM至350mM NaCl的梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将选择的具有aHER2靶向的CXTEN-3x-DM1缀合物的级分集中并使用超滤(Sartorius，Vivacell 100，10kDa MWCO)配制在PBS中。
SDS-PAGE(图25A)、ESI-MS(图25B)和HIC(图25C)分析的结果证明了最终产物的高纯度。
表32：实施例16和17中组分的氨基酸序列
[0507] 实施例17：aHER2-XTEN与3x-MMAE-CXTEN缀合以制备aHER2靶向的XTEN-3x-MMAE缀合物
[0508] 用0.5mM TCEP在室温下将在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中的10mL的aHER2-XTEN_AE304(C296)-H8(153mg，2722nmol)还原1.5h。通过将每种2.5mL加载至四个脱盐柱(GE，PD-10)并分别用3.5mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl(共14mL)洗脱来去除过量的TCEP。使经还原的aHER2-XTEN_AE304(C296)-H8(153mg，2722nmol)的半胱氨酸侧链与IA-3xMMAE-CXTEN(2722nmol，参见实施例14)的N末端碘乙酰胺在用硼酸钠缓冲液将pH调节到
8.5的总体积20mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中在25℃下反应过夜。通过SDS-PAGE监测反应。将混合物加载至充满Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate
650M，150mL，50mm直径)。在流通中去除未反应的IA-3x-MMAE-XTEN。用在20mM磷酸盐pH 7.0中的10mM至100mM咪唑洗脱aHER2靶向的XTEN-药物缀合物。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare，100mL，50mm直径)上纯化，其中用14个柱体积的在20mM HEPES pH 7.0中的150mM至350mM NaCl的梯度进行洗脱。
通过SDS-PAGE分析色谱级分。将选择的具有aHER2靶向的XTEN-3x-MMAE缀合物的级分集中并使用超滤(Sartorius，Vivacell 100，10kDa MWCO)配制在PBS中。SDS-PAGE(图29A)和ESI-MS(图29B)分析的结果证明了最终产物的高纯度。
8.5的总体积20mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中在25℃下反应过夜。通过SDS-PAGE监测反应。将混合物加载至充满Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate
650M，150mL，50mm直径)。在流通中去除未反应的IA-3x-MMAE-XTEN。用在20mM磷酸盐pH 7.0中的10mM至100mM咪唑洗脱aHER2靶向的XTEN-药物缀合物。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare，100mL，50mm直径)上纯化，其中用14个柱体积的在20mM HEPES pH 7.0中的150mM至350mM NaCl的梯度进行洗脱。
通过SDS-PAGE分析色谱级分。将选择的具有aHER2靶向的XTEN-3x-MMAE缀合物的级分集中并使用超滤(Sartorius，Vivacell 100，10kDa MWCO)配制在PBS中。SDS-PAGE(图29A)和ESI-MS(图29B)分析的结果证明了最终产物的高纯度。
[0509] 实施例18：aHER2-XTEN与MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN缀合以制备aHER2靶向的CCD-XTEN-药物缀合物
[0510] 用1mM TCEP在室温下将在1mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中的aHER2-XTEN_AE44(C36)-H8(10.2mg，315nmol)还原1.5h。通过脱盐柱(GE，PD MiniTrap G-25)，用1.5mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl洗脱来去除过量的TCEP。使经还原的aHER2-XTEN_AE44(C36)-H8(10.2mg，315nmol)的半胱氨酸侧链与MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN(13mg，178nmol，参见实施例15)的N末端马来酰亚胺在总体积2.5mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中在25℃下反应2h。通过SDS-PAGE监测反应。将反应混合物用6.5mL的20mM磷酸钠pH 7.0稀释，并加载至充满Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate 650M，9mL，15mm直径)。在流通中去除未反应的MCC-3x-MMAE-CCD-XTEN。用在20mM磷酸盐pH 7.0中的10mM至100mM咪唑洗脱aHER2靶向的XTEN-药物缀合物。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare，10mL，16mm直径)上纯化，其中使用10个柱体积的在20mM HEPES pH 7.0中150mM至350mM NaCl的梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将选择的具有aHER2靶向的XTEN-药物缀合物的组分集中并使用超滤(Sartorius，Vivaspin 15R，5kDa MWCO)配制在PBS中。SDS-PAGE(图23A)、ESI-MS(图23B)和SEC-HPLC(图
23C)分析的结果证明了最终产物的高纯度。
表33：实施例18中组分的氨基酸序列
23C)分析的结果证明了最终产物的高纯度。
表33：实施例18中组分的氨基酸序列
[0511] 实施例19：aHER2-XTEN与MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN缀合以制备具有PCM的aHER2靶向的CCD-XTEN-药物缀合物
[0512] 用0.75mM TCEP在室温下将在2mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中的aHER2-XTEN_AE44(C36)-H8(20.4mg，630nmol)还原1.5h。通过脱盐柱(GE，PD-10)，用3.5mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl洗脱来去除过量的TCEP。使经还原的aHER2-XTEN_AE44(C36)-H8(20.4mg，630nmol)的半胱氨酸侧链与MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN(30mg，403nmol，参见实施例15)的N末端马来酰亚胺在总体积7.3mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中在25℃下反应2h。通过SDS-PAGE监测反应。将混合物用12.7mL的20mM磷酸钠pH 7.0稀释，并加载至充满Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate 650M，20mL，27mm直径)。在流通中去除未反应的MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN。用在20mM磷酸盐pH 7.0中的10mM至100mM咪唑洗脱aHER2靶向的XTEN-药物缀合物。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare，10mL，16mm直径)上纯化，其中使用25个柱体积的在20mM HEPES pH 7.0中150mM至350mM NaCl的梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将选择的具有含有PCM的纯aHER2靶向的XTEN-药物缀合物的组分集中并使用超滤(Sartorius，Vivaspin 15R，5kDa MWCO)配制在PBS中。SDS-PAGE(图24A)、ESI-MS(图24B)和SEC-HPLC(图24C)的分析结果证明了最终产物的高纯度。表34：实施例19中组分的氨基酸序列
[0513] 实施例20：叶酸-AHHAC与IA-3x-MMAE-CCD-XTEN缀合以制备叶酸靶向的CCD-XTEN-药物缀合物
[0514] 通过SIA(10摩尔当量)与叶酸-AHHAC(3摩尔当量)的半胱氨酸侧链在总体积1.8mL的200mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中在25℃下反应过夜，将3x-MMAE-CCD-XTEN(18.1mg，参见实施例11)的N末端转化为碘乙酰胺。将反应混合物加载至充有Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate 650M，20mL，27mm直径)。在流通中去除未反应的IA-3x-MMAE-CCD-XTEN。用在20mM磷酸盐pH 8.0中的50mM咪唑洗脱叶酸靶向的XTEN-药物缀合物。通过MALDI-MS和SDS-PAGE分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，用TFA酸化到pH<3，然后通过制备型HPLC(C4，Vydac，250mm x 10mm)纯化。通过MALDI和RP-HPLC分析色谱级分。将含有叶酸靶向的XDC的级分集中，用1M HEPES pH 8.0中和，并进行真空浓缩。使用超滤(Amicon Ultra-4，3kDa MWCO)将产物配制在PBS中。通过C4 RP-HPLC(图30A)和SDS-PAGE(图30B)证明产物的纯度。
[0515] 实施例21：叶酸-AHHAC与MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN缀合以制备具有PCM的叶酸靶向的CCD-XTEN-药物缀合物
[0516] 使MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN(33.5mg，参见实施例15)与叶酸-AHHAC(3摩尔当量)的半胱氨酸侧链在总体积4.3mL的200mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中在25℃下反应过夜。将反应混合物加载至充满Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate 650M，20mL，27mm直径)。在流通中去除未反应的MCC-3x-MMAE-CCD-PCM-XTEN。用在20mM磷酸盐pH 8.0中的50mM咪唑洗脱具有PCM的叶酸靶向的XTEN-药物缀合物。通过MALDI-MS分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，用TFA酸化到pH<3，然后通过制备型HPLC(C4，Vydac，250mm x 10mm)纯化。通过MALDI-MS和RP-HPLC分析色谱级分。将含有叶酸靶向的XDC的级分集中，用1M HEPES pH 8.0中和，并进行真空浓缩。使用超滤(Amicon Ultra-15，3kDa MWCO)将产物配制在PBS中。通过C4 RP-HPLC(图31A)和SDS-PAGE(图31B)证明产物的纯度。
[0517] 实施例22：从通过N末端连接的单特异性XTEN前体制备双特异性缀合物
[0518] 本实施例描述了通过以N末端至N末端构型连接两个不同的XTEN-有效负载前体产生XTEN-缀合物组合物；一个具有有效负载A，一个具有有效负载B，从而产生双特异性缀合物。
[0519] 作为第一步，如上所述制备含有多个半胱氨酸的XTEN分子(半胱氨酸工程化的XTEN)，并将其配制在20mM HEPES，pH 7.0、50mM NaCl中。根据试剂的溶解度，将有效负载A-马来酰亚胺溶解在水溶液20mM HEPES，pH 7.0、DMF或DMCO或任何其他适当的溶剂中。以相对于XTEN 2-6摩尔过量将有效负载A-马来酰亚胺添加至半胱氨酸工程化的XTEN，并在25℃下温育1hr。通过C18 RP-HPLC监测修饰的完成。使用制备型C4-C18 RP-HPLC从污染物和未反应组分纯化得到的有效负载A-XTEN缀合物。在20mM HEPES，pH 7.0、50mM NaCl中配制有效负载A-XTEN缀合物。随后，通过以相对于XTEN 10-50摩尔过量添加二苄基环辛炔(DBCO)-NHS酯或DBCO-磺基-NHS酯来进一步修饰有效负载A-XTEN缀合物，并在25℃下温育1-2hr。通过分析型C18 RP-HPLC监测修饰的完成。如果缀合效率较低(例如，<90％)或形成了多种非特异性产物，则使用制备型C4-C18 RP-HPLC纯化DBCO-有效负载A-XTEN缀合物。如果DBCO-NHS酯缀合的效率较高(>90％)且无明显副产物，则通过使用10-30kDa MWCO离心装置更换缓冲液、乙腈沉淀或阴离子交换色谱从过量的试剂纯化DBCO-有效负载A-XTEN缀合物。
[0520] 为了产生第二XTEN-有效负载前体，根据试剂的溶解度，将有效负载B-马来酰亚胺溶解在水溶液20mM HEPES，pH 7.0、DMF或DMCO或任何其他适当的溶剂中。以相对于XTEN浓度2-6摩尔过量将有效负载B-马来酰亚胺添加至第二含有半胱氨酸的XTEN中，并在25℃下温育1hr。通过分析型C18 RP-HPLC监测修饰的完成。使用制备型C4-C18 RP-HPLC从污染物和反应物纯化得到的有效负载B-XTEN缀合物。在20mM HEPES，pH 7.0、50mM NaCl中配制有效负载B-XTEN缀合物。以相对于有效负载B-XTEN 10-50摩尔过量添加叠氮化物-PEG4-NHS酯并在25℃下温育1-2hr。通过C18 RP-HPLC监测修饰的完成。如果缀合效率较低(例如，<90％)或形成了多种非特异性产物，则使用制备型C4-C18 RP-HPLC纯化叠氮化物-有效负载B-XTEN缀合物。如果DBCO-NHS酯缀合的效率较高(>90％)且无明显副产物，则通过使用10-
30kDa MWCO离心装置更换缓冲液、乙腈沉淀或阴离子交换色谱从过量的试剂纯化叠氮化物-有效负载B-XTEN缀合物。通过在20mMHEPES pH 7.0缓冲液、50mM NaCl中以等摩尔比混合纯化并浓缩的DBCO-有效负载A-XTEN和叠氮化物-有效负载B-XTEN蛋白来产生最终产物，并在25℃下温育1hr或更久直至反应完成。通过C4或C18 RP-HPLC监测修饰的完成。如果必要，通过制备型RP-HPLC、疏水作用色谱法或阴离子交换色谱法纯化双特异性缀合物有效负载A-XTEN-有效负载B。
30kDa MWCO离心装置更换缓冲液、乙腈沉淀或阴离子交换色谱从过量的试剂纯化叠氮化物-有效负载B-XTEN缀合物。通过在20mMHEPES pH 7.0缓冲液、50mM NaCl中以等摩尔比混合纯化并浓缩的DBCO-有效负载A-XTEN和叠氮化物-有效负载B-XTEN蛋白来产生最终产物，并在25℃下温育1hr或更久直至反应完成。通过C4或C18 RP-HPLC监测修饰的完成。如果必要，通过制备型RP-HPLC、疏水作用色谱法或阴离子交换色谱法纯化双特异性缀合物有效负载A-XTEN-有效负载B。
[0521] 实施例23：从通过N末端连接的单特异性XTEN前体制备三聚体缀合物
[0522] 单特异性XTEN-有效负载前体将制备为与XTEN分子连接的有效负载A的N末端融合物；例如，具有从AE144到AE890的长度范围，在C末端含有单个半胱氨酸。在20mM HEPES，pH 7.0、50mM NaCl、三-(2-马来酰亚胺基乙基)胺(TMEA，Thermo Scientific，货号#33043)中配制纯化的前体并将该前体溶解在DMSO或DMF中。将前体(相对于交联剂4-6摩尔过量)和TMEA试剂混合并在25℃下温育1hr。通过C4或C18 RP-HPLC或尺寸排阻色谱法监测修饰的完成。通过疏水作用色谱法(HIC)、阴离子交换色谱法或制备型C4-C18 RP-HPLC从蛋白质反应物或部分产物混合物纯化得到的三价有效负载A-XTEN缀合物。
[0523] 实施例24：叶酸-XTEN-药物缀合物的体外血清稳定性
[0524] 作为稳定性测量，将叶酸-XTEN-药物缀合物独立地在正常人类、食蟹猴和小鼠血浆中在37℃下温育最长2周，以周期性间隔移取等分试样并存储在-80℃下直至进行分析。通过随时间的游离药物的量或叶酸-XTEN-药物缀合物的完整性来评估叶酸-XTEN-药物缀合物的稳定性。用HPLC和/或LC-MS/MS对游离药物进行定量，而使用XTEN/药物和/或叶酸/药物ELISA确定完整叶酸-XTEN-药物缀合物的量。
[0525] 对于RP-HPLC分析，用有机溶剂如乙腈或丙酮处理血浆样品以使蛋白质沉淀。将可溶性级分真空蒸发，再溶解于加载溶液中，并通过RP-HPLC进行分析。通过与已知药物标准相比在对特定药物具有特异性的波长下的UV吸收来检测分析物。例如，在480nm下检测多柔比星。对于LC-MS/MS分析，将用有机溶剂如乙腈或丙酮处理血浆样品以使蛋白质沉淀。将可溶性级分真空蒸发，再溶解于加载溶液中，并通过RP-HPLC进行分析。将对分析物进行在线监测并通过三重四极杆串联质谱法进行定量。对于每种药物将实验测定亲离子-子离子(Parental ion–daughter ion)对。通过向相应的血浆类型添加已知量的游离药物来制备校准标准，并将该校准标准与实验样品平行处理。对于定量ELISA，使用交叉连续稀释分析确定ELISA中用于叶酸-XTEN-药物缀合物的最佳抗体浓度。将识别缀合物的一个组分的适当捕获抗体通过在4℃下温育过夜而涂覆在96孔微量滴定板上。封闭并洗涤孔，并将血清稳定性样品加入孔中，每种样品处于不同稀释以允许涂覆抗体对叶酸-XTEN-药物缀合物的最佳捕获。在洗涤后，添加识别缀合物的另一种组分的检测抗体，并使该抗体与板上捕获的缀合物结合。然后再次洗涤孔，随后添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶(与检测抗体的生物素化形式互补)或适当的第二抗体-辣根过氧化物酶(与检测抗体的非生物素化形式互补)。在适当的温育和最终的洗涤步骤后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物并在450nM下读板。然后通过比较比色响应与以相关血浆类型用叶酸-XTEN-药物制备的校正曲线，计算在每个时间点完整缀合物的浓度。然后使用对数浓度相对于时间的线性回归分析定义人类、食蟹猴和小鼠血清中缀合物衰变的t1/2。
[0526] 实施例25：aHER2-XTEN-Alexa Fluor 568缀合物的制备
[0527] 用20uL的1M HEPES pH 8中和在0.5mL的20mM MES pH 5.5中的1x-氨基、1x-巯基-XTEN(XTEN_AE864(Am1,C12)，124nmol)。随后使该XTEN的巯基与3摩尔当量的Alexa Fluor 568 C5马来酰亚胺(Thermo Fisher Scientific，货号#A20341，372nmol，在无水DMF中的
0.0372mL的10mM溶液)反应。将反应在室温下温育2h并通过C18 RP-HPLC监测缀合。用TFA将混合物酸化到pH<3，并通过制备型C18 RP-HPLC(C18，Phenomenex，货号#00G-4005-N0，
250mm x 10mm)纯化期望的XTEN-Alexa Fluor 568产物。通过C18 RP-HPLC分析色谱级分。
将含有期望产物的级分集中，用1M HEPES pH 8.0中和，并进行真空浓缩。将选择的具有XTEN-Alexa Fluor 568的级分集中并使用超滤(Sartorius，Vivaspin 15R，5kDa MWCO)配制在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中。通过C18 RP-HPLC(>98％)、SDS-PAGE和完整质量(观察到ESI-MS为+13Da)证明最终产物的高纯度。使用10摩尔当量的SIA(517nmol，在无水DMF中49mg/mL)在室温下在黑暗中2h将在0.4mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中的XTEN-Alexa Fluor 568(51.7nmol)的N末端胺转化为碘乙酰胺。通过超滤(Sartorius，Vivaspin 15R，5kDa MWCO)去除过量的SIA。
0.0372mL的10mM溶液)反应。将反应在室温下温育2h并通过C18 RP-HPLC监测缀合。用TFA将混合物酸化到pH<3，并通过制备型C18 RP-HPLC(C18，Phenomenex，货号#00G-4005-N0，
250mm x 10mm)纯化期望的XTEN-Alexa Fluor 568产物。通过C18 RP-HPLC分析色谱级分。
将含有期望产物的级分集中，用1M HEPES pH 8.0中和，并进行真空浓缩。将选择的具有XTEN-Alexa Fluor 568的级分集中并使用超滤(Sartorius，Vivaspin 15R，5kDa MWCO)配制在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中。通过C18 RP-HPLC(>98％)、SDS-PAGE和完整质量(观察到ESI-MS为+13Da)证明最终产物的高纯度。使用10摩尔当量的SIA(517nmol，在无水DMF中49mg/mL)在室温下在黑暗中2h将在0.4mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中的XTEN-Alexa Fluor 568(51.7nmol)的N末端胺转化为碘乙酰胺。通过超滤(Sartorius，Vivaspin 15R，5kDa MWCO)去除过量的SIA。
[0528] 用0.25mM TCEP在室温下将在0.2mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中的aHER2-XTEN_AE44(C36)-H8(2mg，63nmol)还原1.5h。通过脱盐柱(GE，PD MiniTrap G-25)，用1.5mL的20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl洗脱来去除过量的TCEP。通过超滤(Sartorius，Vivaspin 500，5kDa MWCO)将该还原的aHER2-XTEN浓缩到在20mM HEPES pH 7.0、50mM NaCl中
0.09mL。通过添加0.0055mL的0.4M硼酸钠pH 9.95使经还原的aHER2-XTEN_AE44(C36)-H8(2mg，64nmol)的半胱氨酸侧链与IA-XTEN-Alexa Fluor 568(51.7nmol，在20mM HEPES pH
7.0,50mM NaCl中0.26mL)的N末端碘乙酰胺在接近pH 9下反应。将反应在25℃下温育过夜，然后通过SDS-PAGE进行检查。将反应混合物用20mM磷酸钠pH 8.0稀释到3mL，并加载至充满Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate 650M，3mL，15mm直径)。在流通中去除未反应的IA-XTEN-Alexa Fluor 568。用在20mM磷酸盐pH 8.0中的25mM至100mM咪唑洗脱aHER2靶向的XTEN-荧光团缀合物。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare，10mL，16mm直径)上纯化，其中使用10个柱体积的在20mM HEPES pH 7.0中150mM至350mM NaCl的梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将选择的具有aHER2靶向的XTEN-荧光团缀合物的组分集中并使用超滤(Sartorius，Vivaspin 15R，5kDa MWCO)配制在PBS中。SDS-PAGE和完整质量(观察到ESI-MS为+16Da)的结果证明了最终产物的高纯度。
0.09mL。通过添加0.0055mL的0.4M硼酸钠pH 9.95使经还原的aHER2-XTEN_AE44(C36)-H8(2mg，64nmol)的半胱氨酸侧链与IA-XTEN-Alexa Fluor 568(51.7nmol，在20mM HEPES pH
7.0,50mM NaCl中0.26mL)的N末端碘乙酰胺在接近pH 9下反应。将反应在25℃下温育过夜，然后通过SDS-PAGE进行检查。将反应混合物用20mM磷酸钠pH 8.0稀释到3mL，并加载至充满Cu(II)的固相金属亲和色谱柱(Toyopearl AF-Chelate 650M，3mL，15mm直径)。在流通中去除未反应的IA-XTEN-Alexa Fluor 568。用在20mM磷酸盐pH 8.0中的25mM至100mM咪唑洗脱aHER2靶向的XTEN-荧光团缀合物。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将具有期望缀合物的级分集中，并在MacroCap Q柱(GE Healthcare，10mL，16mm直径)上纯化，其中使用10个柱体积的在20mM HEPES pH 7.0中150mM至350mM NaCl的梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE分析色谱级分。将选择的具有aHER2靶向的XTEN-荧光团缀合物的组分集中并使用超滤(Sartorius，Vivaspin 15R，5kDa MWCO)配制在PBS中。SDS-PAGE和完整质量(观察到ESI-MS为+16Da)的结果证明了最终产物的高纯度。
[0529] 实施例26：aHER2-XTEN-Alexa Fluor 568缀合物的体内和离体成像
[0530] 使用Alexa Fluor 568标记的aHER2-XTEN分子作为替代物来探究aHER2-XTEN-药物缀合物的靶向和生物分布效率。在携带皮下生长的HER2阳性肿瘤细胞的异种移植物的裸小鼠中将使用借助IVIS 50光学成像系统(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)的体内荧光成像随后离体荧光成像进行实验。简言之，对携带HER2阳性肿瘤细胞的雌性nu/nu小鼠给予高或低剂量的aHER2-XTEN-Alexa Fluor 568以及相应剂量的非靶向Alexa Fluor 568标记的XTEN对照的单次静脉内注射。在注射前以及随后在注射后约8、24、48和72小时使用IVIS 50光学成像系统获取活的麻醉动物的全身扫描。在72h的最后时间点测量整个动物中的荧光分布后，切除肿瘤和健康器官，包括肝、肺、心脏、脾和肾，并通过成像系统记录并处理它们的荧光。使用较小且中等分箱(binning)的CCD芯片并优化曝光时间，以从图片中每只小鼠的可观察信号获得至少数千的计数并避免CCD芯片的饱和。为了使图像标准化用于定量，使用用于Alexa Fluor 568光谱区的背景激发和发射滤光器获得背景荧光图像。荧光的强度表示为不同颜色，其中蓝色反映最低强度，而红色指示最高强度，并使用得到的图像评估缀合物和对照的摄取。
[0531] 实施例27：叶酸-XTEN-Cy5.5缀合物的体内和离体成像
[0532] 使用Cy5.5荧光标记的叶酸-XTEN分子作为替代物来探究叶酸-XTEN-药物缀合物的靶向和生物分布效率。在携带皮下生长的叶酸受体阳性肿瘤细胞的异种移植物的裸小鼠中将使用借助IVIS 50光学成像系统(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)的体内荧光成像随后离体荧光成像进行实验。因为培养基含有高叶酸含量，所以将会移植到这些小鼠中的叶酸受体阳性肿瘤细胞将在不具有抗生素的含有5-10％热灭活的FCS的无叶酸细胞培养基中生长。同样，正常的啮齿动物食物含有高浓度的叶酸；此研究中使用的小鼠在肿瘤移植之前和在成像分析期间将会维持无叶酸饮食2周以降低血清叶酸浓度。
[0533] 简言之，对携带叶酸受体阳性肿瘤细胞的雌性nu/nu小鼠给予高或低剂量叶酸-XTEN-Cy5.5以及相应剂量的非靶向Cy5.5标记的XTEN对照的单次静脉内注射。在注射前以及随后在注射后约8、24、48和72小时使用IVIS 50光学成像系统获取活的麻醉动物的全身扫描。在72h的最后时间点测量整个动物中的荧光分布后，切除肿瘤和健康器官，包括肝、肺、心脏、脾和肾，并通过成像系统记录并处理它们的荧光。选择Cy5.5激发(615-665nm)和发射(695-770nm)滤光器以匹配荧光试剂的波长。使用较小且中等分箱的CCD芯片并优化曝光时间，以从图片中的每只小鼠的可观察信号获得至少数千的计数并避免CCD芯片的饱和。为了使图像标准化用于定量，使用用于Cy5.5光谱区的背景激发和发射滤光器获得背景荧光图像。荧光的强度表示为不同颜色，其中蓝色反映最低强度，而红色指示最高强度，并使用得到的图像评估缀合物和对照的摄取。
[0534] 实施例28：用于评价叶酸-XTEN-药物缀合物的人类临床试验设计
[0535] 靶向化疗是针对于提高全身化疗功效并降低其副作用的现代途径。叶酸(folate)，也称叶酸(folic acid)、维生素B9，是所有活细胞对于核苷酸生物合成所需的重要营养物，且在某些生物通路中作为辅因子。叶酸受体是对于治疗快速分割的恶性肿瘤的疗法发展的焦点；尤其是卵巢癌和非小细胞肺癌。尽管叶酸受体表达在正常卵巢中可忽略，但约90％的上皮性卵巢癌和许多肺腺癌均过表达叶酸受体，因此打开了定向疗法的可能性。携带≥1个叶酸复制的XTEN与携带≥3个药物分子的XTEN融合以产生靶向肽-药物缀合物预期会改善治疗指数，且延长的半衰期将使剂量能够处于比最大耐受剂量(MTD)低得多的水平、降低给药频率和费用(减少每次给药需要的药物)。
[0536] 在患有复发性或难治性晚期肿瘤的患者或患有铂耐药性卵巢癌和使用其他化疗失败的非小细胞肺癌的患者中进行叶酸-XTEN-药物组合物的临床评价。设计临床试验以确定叶酸-XTEN-药物缀合物在人类标准疗法中的功效和优势。在患者中这样的研究将包含三个阶段。首先，进行I期安全性和药代动力学研究以确定人类中的MTD并表征剂量限制毒性、药代动力学和初步药效学的特征。这些初始研究可在具有复发性或难治性晚期肿瘤的具有叶酸受体阳性状态的患者中进行，对于该肿瘤，标准治疗物或缓解措施不能使用或不再有效或具有耐药性。I期研究将使用叶酸-XTEN-药物缀合物的单一放大剂量，并将测量生物化学、PK和临床参数以允许确定MTD并建立剂量和组成将会在随后的II期和III期试验中使用的治疗窗的循环药物中的阈值和最大浓度，以及定义将会在未来研究中追踪的潜在毒性和不良事件。
[0537] 人类患者的II期临床研究将在叶酸受体阳性的铂耐药性卵巢癌患者群体、多种化疗失败的非小细胞肺癌患者和患有复发性或难治性晚期肿瘤的患者中独立地进行。试验将单独评估叶酸-XTEN-药物缀合物的功效和安全性，并与特定适应证中使用的当前化疗结合评估。患者将以I期研究中确定的剂量水平和方案伴随或不伴随标准化疗药剂而接受静脉施用的叶酸-XTEN-药物缀合物。将会包括包含化疗药剂加上安慰剂的对照组。主要终点将是通过实体瘤治疗疗效评价标准(RECIST)界定的反应率。次要终点将包括安全性和耐受性、进展时间和总存活率。
[0538] 在叶酸受体阳性的铂耐药性卵巢癌患者、非小细胞肺癌患者或晚期肿瘤复发性或难治性患者癌症患者中进行III期疗效和安全性研究，以测试达到统计上显著的临床终点(如通过RECIST测量的无进展存活率)的能力。试验对于总存活率作为次级终点还将是统计上有力的，计划的参与超过400名患者。使用标准统计学方法确定功效结果。在该研究中也接着进行毒性和不良事件研究以证实当以所述方式使用时该化合物是安全的。
[0539] 实施例29：XTEN在组织匀浆中的生物降解
[0540] 以0.3mg/ml的最终浓度在大鼠血浆(Bioreclamation IVT，Baltimore，MD)、大鼠肾匀浆(Bioreclamation)或PBS缓冲液中在37℃下将纯化的蛋白温育7天。在0、4小时、24小时和7天的时间处取回样品，立刻冷冻并储存在-80℃下，然后在分析之前解冻。通过甲醇沉淀从样品提取XTEN。简言之，将预冷冻在-20℃下的甲醇以2:1的体积比加入样品，并通过涡流混合。将混合物保持在-20℃下30min，然后在8℃下以14,000rpm离心20min。使上清液经受离心蒸发1-2小时，以使样品完全干燥，并然后再悬浮于PBS缓冲液中达到初始体积，随后进行甲醇萃取。通过SDS-PAGE以及使用全染色染料的染色分析重建的样品。结果示于图26中。血浆和PBS缓冲液中的XTEN_AE864在7天的温育期中均只显示出较小的降解迹象。然而，XTEN_AE864在大鼠肾中以24小时的间隔迅速降解。
[0541] 实施例30：XTEN二级结构的表征
[0542] 通过圆二色光谱法评价纯化的XTEN_AE864的二级结构的程度。在具有Peltier热吸收池架的Jasco J850分光计(Jasco,Inc.,Easton,MD)上进行CD光谱法。在pH 7.2的13mM磷酸钠缓冲液或pH 4.0的20mM乙酸钠缓冲液中将蛋白质的浓度调节到0.2mg/mL。使用具有0.1cm的最佳光程长度的石英吸收池进行实验。在20℃下获得CD光谱。在使用1nm带宽从
300nm到180nm的四次重复中记录所有光谱。CD光谱显示出在pH 7.2和pH 4.0下对于XTEN_AE864相似的曲线(图27)。数据与不存在稳定二级结构证据的非结构化多肽的色谱相一致。
300nm到180nm的四次重复中记录所有光谱。CD光谱显示出在pH 7.2和pH 4.0下对于XTEN_AE864相似的曲线(图27)。数据与不存在稳定二级结构证据的非结构化多肽的色谱相一致。
[0543] 实施例31：通过连接至XTEN而增加肽有效负载的溶解度和稳定性
[0544] 为了评估XTEN增强溶解度和稳定性的物理化学性质的能力，制备和评估胰高血糖素加较短长度XTEN的融合蛋白。在pH为中性的Tris缓冲盐水中制备测试物质，并通过反相HPLC和尺寸排阻色谱法表征Gcg-XTEN溶液以确定蛋白质在溶液中是均质和非聚集的。数据列于表35中。为了比较的目的，测量了在相同的缓冲液中60μM(0.2mg/mL)的未修饰胰高血糖素的溶解度极限，并且结果证明对于添加的所有长度的XTEN，实现了溶解度的明显增加。重要的是，在大多数情况下，制备胰高血糖素-XTEN融合蛋白来达到目标浓度，但没有进行评估以确定给定构建体的最大溶解度极限。然而，在胰高血糖素连接到AF-144 XTEN的情况下，测定了溶解度极限，其中结果实现了与未连接至XTEN的胰高血糖素相比，溶解度增加60倍。另外，评估了胰高血糖素-AF144的稳定性，发现液体制剂在冷冻条件下稳定至少六个月，而在37℃下稳定大约一个月(数据未显示)。
[0545] 该数据支持以下结论：较短长度的XTEN多肽连接到生物活性蛋白质例如胰高血糖素，能够通过得到的融合蛋白而显著地增强该蛋白质的溶解度，也赋予了较高蛋白质浓度下的稳定性。表35：胰高血糖素-XTEN构建体的溶解度
测试物质 溶解度
胰高血糖素 60μM
胰高血糖素-Y36 >370μM
胰高血糖素-Y72 >293μM
胰高血糖素-AF108 >145μM
胰高血糖素-AF120 >160μM
胰高血糖素-Y144 >497μM
胰高血糖素-AE144 >467μM
胰高血糖素-AF144 >3600μM
胰高血糖素-Y288 >163μM
测试物质 溶解度
胰高血糖素 60μM
胰高血糖素-Y36 >370μM
胰高血糖素-Y72 >293μM
胰高血糖素-AF108 >145μM
胰高血糖素-AF120 >160μM
胰高血糖素-Y144 >497μM
胰高血糖素-AE144 >467μM
胰高血糖素-AF144 >3600μM
胰高血糖素-Y288 >163μM
[0546] 实施例32：多肽序列的重复性分析
[0547] 在本实施例中，评估了氨基酸序列中不同多肽(包括几种XTEN序列)的重复性。可通过定量较短序列在整个多肽中出现的次数来评估多肽氨基酸序列的重复性。例如，200个氨基酸残基长度的多肽有总共165个重叠的36-氨基酸“区组”(或“36-聚体”)和198个3-聚体“子序列”，但是独特的3-聚体子序列的数目将取决于在此序列内重复的量。对于该分析，通过确定经应用以下方程而获得的平均子序列得分来评估不同的多肽序列的重复性：其中：n＝(多肽的氨基酸长度)–(区组的氨基酸长度)+1；
m＝(区组的氨基酸长度)–(子序列的氨基酸长度)+1；且
Counti＝每个独特的子序列在区组i中出现的累计数
在本实施例的分析中，在计算机程序中使用上述方程确定表36多肽的平均子序列得
分，其中将区组长度设定为36个氨基酸并将子序列长度设定为3个氨基酸。得到的平均子序列得分是多肽内的重复程度的反映。
m＝(区组的氨基酸长度)–(子序列的氨基酸长度)+1；且
Counti＝每个独特的子序列在区组i中出现的累计数
在本实施例的分析中，在计算机程序中使用上述方程确定表36多肽的平均子序列得
分，其中将区组长度设定为36个氨基酸并将子序列长度设定为3个氨基酸。得到的平均子序列得分是多肽内的重复程度的反映。
[0548] 示于表36的结果表明，由2或3种氨基酸类型组成的多肽具有高平均子序列得分，并因此具有高度重复性，而设计为仅具有每种由非重复序列中的四至六种氨基酸组成(即G、S、T、E、P和A)的12种氨基酸基序(例如来自表9的家族的基序)的四种类型的XTEN具有小于10的平均子序列得分，并且在一些情况下小于5，反映了贯穿整个序列的低重复性程度。例如，L288序列具有两种氨基酸类型，并具有短的高度重复区组序列，致使平均子序列得分为8.5。多肽J288具有3种氨基酸类型，但也有短的重复区组序列，致使平均子序列得分为
5.7。Y576也有3种氨基酸类型，但不是由内部重复序列组成，反映在平均子序列得分为4.7。
W576由4种类型的氨基酸组成，但与区组具有较高的内部重复水平，例如，“GGSG”，致使平均子序列得分为4.3。XTEN AD576由四种类型的12个氨基酸基序组成，每个基序由4种类型的氨基酸组成。由于个体基序的低内部重复水平，氨基酸的总体平均子序列得分是2.5。相反，由4个基序组成的XTEN含有6种类型的氨基酸，每个基序都具有低水平的内部重复性，因此具有小于2的子序列得分。对于XTEN序列AE864和AG864，用图表表示程序的输出以显示序列长度重复性的变化。对于AE864和AG864，将对于每个顺序的36-聚体区组的个体序列得分标绘为个体点，对应于作为在x轴中序列中氨基酸数目的每个区组的起始与Y轴中相应区组的子序列得分，显示出对于AE864，序列具有1.7的整体平均子序列得分，对于大多数序列的评分在1和2之间变化，但在氨基酸330、505和725周围起始具有更高重复性的区域。相反，存在大约10个子序列得分接近1的区组，代表完全没有重复性。相似地，对于AG864的图表显示出，序列具有1.9的整体平均子序列得分，对于大多数序列的评分在1.2和2之间变化，但具有四个子序列得分大于3的更高重复性的区域。
5.7。Y576也有3种氨基酸类型，但不是由内部重复序列组成，反映在平均子序列得分为4.7。
W576由4种类型的氨基酸组成，但与区组具有较高的内部重复水平，例如，“GGSG”，致使平均子序列得分为4.3。XTEN AD576由四种类型的12个氨基酸基序组成，每个基序由4种类型的氨基酸组成。由于个体基序的低内部重复水平，氨基酸的总体平均子序列得分是2.5。相反，由4个基序组成的XTEN含有6种类型的氨基酸，每个基序都具有低水平的内部重复性，因此具有小于2的子序列得分。对于XTEN序列AE864和AG864，用图表表示程序的输出以显示序列长度重复性的变化。对于AE864和AG864，将对于每个顺序的36-聚体区组的个体序列得分标绘为个体点，对应于作为在x轴中序列中氨基酸数目的每个区组的起始与Y轴中相应区组的子序列得分，显示出对于AE864，序列具有1.7的整体平均子序列得分，对于大多数序列的评分在1和2之间变化，但在氨基酸330、505和725周围起始具有更高重复性的区域。相反，存在大约10个子序列得分接近1的区组，代表完全没有重复性。相似地，对于AG864的图表显示出，序列具有1.9的整体平均子序列得分，对于大多数序列的评分在1.2和2之间变化，但具有四个子序列得分大于3的更高重复性的区域。
[0549] 结论：结果表明每个由基本上非重复的4至6种氨基酸类型组成的12个氨基酸子序列基序组合成较长的XTEN多肽，得到基本上非重复的整体序列，如由小于3(在许多情况下小于2)的整体平均子序列得分所指示的。即使在此序列中每个子序列基序都可能被多次使用，情况也一样。相反，由较少数目的氨基酸类型构建的聚合物导致较高的平均子序列得分，其中由两种氨基酸类型组成的多肽比由三种氨基酸类型组成的多肽具有更高的评分。表36：多肽序列的平均子序列得分计算
[0550] 实施例33：KB细胞上3xFA(γ),3xMMAE-XTEN的选择性细胞毒性
[0551] 评价了选择性靶向并杀死携带叶酸受体的细胞的能力。在CellTiter-Glo抗增殖测定中使用叶酸受体阳性的KB细胞系评价游离MMAE、非靶向3xMMAE-XTEN缀合物(XTEN与毒素连接)和叶酸受体靶向的3xFA(γ),3xMMAE-XTEN的测试物质。因为培养基含有高叶酸含量，所以在细胞活力实验开始之前，KB细胞在含有10％热灭活的胎牛血清的无叶酸培养基中在37℃、5％CO2下生长至少7天。该培养基还用于进行实验。简言之，将KB细胞以每孔10,000细胞铺在96孔微量滴定测定板上。通过在37℃、5％CO2下温育过夜允许KB细胞附着在板上。然后去除耗费的培养基，并且指定含有叶酸竞争剂的孔接受含有叶酸的测定培养基，而未指定具有叶酸竞争剂的孔只接受测定培养基。将板在37℃、5％CO2下温育30min，随后抽吸测定培养基并用测定培养基洗涤板。然后以适当的剂量范围在存在或缺乏叶酸竞争剂时添加游离的MMAE、3xMMAE-XTEN和3xFA(γ),3xMMAE-XTEN。然后在37℃、5％CO2下将板进一步温育2-4h。然后去除培养基，洗涤板，并引入新鲜培养基，并且允许板额外温育48-72h。在适当的温育期后，添加CellTiter-Glo试剂并在光度计上读取板。使用GraphPad Prism使用
4参数逻辑斯蒂曲线拟合来确定每种测试物质的IC50。
4参数逻辑斯蒂曲线拟合来确定每种测试物质的IC50。
[0552] 结果：游离MMAE药物部分显示出对KB细胞的高效杀伤，IC50为0.8nM，而与非靶向XTEN缀合的MMAE的三个复制均导致细胞杀伤中至少3倍对数的减少(IC50>1,000nM)。值得注意的是，向3xMMAE-XTEN缀合物添加3个叶酸靶向结构域的复制恢复了细胞杀伤，IC 50为4.2nM；与对游离MMAE观察到的活性水平接近。同样重要的是，叶酸作为靶向缀合物的竞争剂的引入损害了KB细胞系上3xFA(γ),3xMMAE-XTEN观察到的细胞杀伤活性。叶酸-XTEN药物缀合物的该有效细胞杀伤的减少(从4.2nM到>1,000nM)支持了在实验条件下通过使用叶酸作为对于药物缀合物抗KB细胞系的靶向机制促进检测的细胞毒性的结论。
[0553] 实施例34：XTEN1-PCM-TM1-XTEN2基于细胞的体外评价
[0554] 进行实验以测试XTEN-缀合物组合物的能力，该组合物包含的组分包括叶酸靶向部分(TM)、肽切割序列(PCM)和细胞毒性药物，所有组分均以设计的构型与XTEN连接，以便在存在或缺乏能够切割组合物并释放组分的蛋白酶的情况下在哺乳动物细胞上的体外细胞毒性测定中展现出不同的程度。在实验中，测试XTEN-缀合物组合物为缀合物#2，由XTEN864作为XTEN1；PLGLAG作为PCM的序列，叶酸作为TM，MMAF作为细胞毒性药物(使用第二XTEN(XTEN2)配置为XTEN432-3xMMAF)所组成。作为相应的对照，在分析中包含不含XTEN1(缀合物#385；PLGLAG-1x叶酸-XTEN432-3xMMAF)或XTEN1-PCM(缀合物#386；1x叶酸-XTEN432-3xMMAF)的缀合物。在CellTiter-Glo抗增殖测定中使用叶酸受体阳性的人KB细胞测试所有三种缀合物。
[0555] 简言之，KB细胞在无叶酸RPMI加上10％热灭活的胎牛血清中生长，并以1X104铺在96孔微量滴定板的每个孔中。通过在37℃、5％CO2下温育过夜允许KB细胞依附在板上。以一式两份的剂量范围引入具有或不具有MMP-9处理的缀合物#2、#386和#385并将板在37℃、
5％CO2下温育3天。在适当的温育期后，向每个孔添加CellTiter-Glo试剂，在定轨摇床上混合2分钟。然后在90xg下将板离心并在室温下温育额外的10分钟以稳定发光信号。然后在光度计上读取发光信号并用GraphPad Prism软件计算IC50(半最大抑制浓度)。
5％CO2下温育3天。在适当的温育期后，向每个孔添加CellTiter-Glo试剂，在定轨摇床上混合2分钟。然后在90xg下将板离心并在室温下温育额外的10分钟以稳定发光信号。然后在光度计上读取发光信号并用GraphPad Prism软件计算IC50(半最大抑制浓度)。
[0556] 结果：示于表37中的结果证明，缀合物#386显示出强效的细胞毒活性，IC50为0.54nM。缀合物#386不含PCM，使用MMP-9处理不影响其体外活性(IC50为0.73nM)。在MMP-9处理和MMP-9未处理的缀合物#385之间未观察到细胞毒活性的变化；该缀合物为含有PCM但不含XTEN1(XTEN864)用于屏蔽作用的构建体(IC50分别为0.94nM和0.75nM)。值得注意的是，虽然MMP-9处理的缀合物#2展现出的体外细胞毒活性与缀合物#386相等；但是未用MMP-9处理的缀合物#2的活性小8倍。数据表明，在实验条件下，XTEN通过MMP-9给予对蛋白水解的屏蔽作用，并且当存在蛋白酶时，具有能够被蛋白酶切割的PCM的构建体能够引起细胞毒性程度增加。
表37：MMP-9处理和未处理的缀合物的细胞毒性
缀合物# MMP-9处理 IC50(nM)
386 否 0.54
386 是 0.73
385 否 0.75
385 是 0.94
2 否 6.88
2 是 0.82
表37：MMP-9处理和未处理的缀合物的细胞毒性
缀合物# MMP-9处理 IC50(nM)
386 否 0.54
386 是 0.73
385 否 0.75
385 是 0.94
2 否 6.88
2 是 0.82
[0557] 实施例35：FA-XTEN432-3xMMAF、XTEN432-3xMMAF、FA-XTEN864-3xMMAF和XTEN864-3xMMAF缀合物的体外细胞毒性和特异性评价
[0558] 在体外测定中比较四种缀合物构建体的细胞毒活性，用于比较影响细胞毒性的能力，该构建体两种具有叶酸(FA)靶向部分，两种不具有该部分，所有四种均具有与XTEN_432和XTEN_864缀合的MMAF的三个分子。在CellTiter-Glo细胞活力测定中使用叶酸受体阳性的KB细胞系在存在和不存在游离叶酸(FA)作为竞争剂下评价FA-XTEN432-3xMMAF、XTEN432-3xMMAF、FA-XTEN864-3xMMAF和XTEN864-3xMMAF(图58和图59)。因为细胞培养基含有高叶酸含量，所以KB细胞在无叶酸RPMI加上10％热灭活的胎牛血清(FCS)中生长并进行测定。简言之，KB细胞以1X104铺在96孔微量滴定板的每个孔中，并通过在37°℃、5％CO2下温育过夜允许依附在板上。具有和不具有叶酸处理的FA-XTEN432-3xMMAF和FA-XTEN864-
3xMMAF缀合物以及XTEN432-3xMMAF和XTEN864-3xMMAF缀合物均以对于XTEN432系列600nM至0.002nM或对于XTEN864系列100nM至0.02nM的4倍连续稀释剂量范围(一式两份)引入板中，并将板在37°℃、5％CO2下温育3天。在适当的温育期后，向每个孔添加CellTiter-Glo试剂，并将板在定轨摇床上混合2分钟。然后在90xg下将板离心并在室温下温育额外的10min以稳定发光信号。然后在光度计上读取发光信号并用GraphPad Prism软件计算IC50(半最大抑制浓度)。
3xMMAF缀合物以及XTEN432-3xMMAF和XTEN864-3xMMAF缀合物均以对于XTEN432系列600nM至0.002nM或对于XTEN864系列100nM至0.02nM的4倍连续稀释剂量范围(一式两份)引入板中，并将板在37°℃、5％CO2下温育3天。在适当的温育期后，向每个孔添加CellTiter-Glo试剂，并将板在定轨摇床上混合2分钟。然后在90xg下将板离心并在室温下温育额外的10min以稳定发光信号。然后在光度计上读取发光信号并用GraphPad Prism软件计算IC50(半最大抑制浓度)。
[0559] 结果：如图58中所示，以等摩尔浓度给药，具有叶酸靶向部分的FA-XTEN432-3xMMAF显示出高效的杀伤，且IC50为0.6nM，而不携带靶向部分的XTEN432-3xMMAF缀合物构建体的效率大幅减少了至少3倍对数，产生最小的细胞毒性(IC50>600nM)。重要的是，叶酸作为竞争剂的添加损害了观察到的KB细胞上FA-XTEN432-3xMMAF的细胞杀伤活性(IC50>
600nM)，证明了叶酸受体介导的细胞毒性的特异性(图58)。使用含有XTEN864的缀合物获得了相似结果。FA-XTEN864-3xMMAF展现出被叶酸抑制(IC50>100nM)的强效细胞毒性(IC50为
1.2nM)，而相应的非靶向XTEN864-3xMMAF不具有任何显著的体外细胞毒活性(IC50>100nM)(图59)。
600nM)，证明了叶酸受体介导的细胞毒性的特异性(图58)。使用含有XTEN864的缀合物获得了相似结果。FA-XTEN864-3xMMAF展现出被叶酸抑制(IC50>100nM)的强效细胞毒性(IC50为
1.2nM)，而相应的非靶向XTEN864-3xMMAF不具有任何显著的体外细胞毒活性(IC50>100nM)(图59)。
[0560] 结论：数据表明，在反应条件下，叶酸部分给予了叶酸受体介导的靶向作用，增强了XTEN-药物缀合物的细胞毒活性。
[0561] 实施例36：FA-XTEN432-3xMMAF、XTEN432-3xMMAF、FA-XTEN864-3xMMAF和XTEN864-3xMMAF缀合物的体内功效和安全性评价
[0562] 叶酸-XTEN-药物缀合物预期用于将毒素组分靶向递送到叶酸受体阳性的肿瘤细胞。表18描述了可用于异种移植研究的肿瘤系的实例。例如，使用叶酸受体阳性的人KB宫颈细胞系确定叶酸-XTEN-药物构建体的体内功效和安全性。在体内功效和安全性研究开始之前，在雌性nu/nu小鼠中进行两个研究以确定：(1)靶向FA-XTEN432-3xMMAF和相应的非靶向XTEN432-3xMMAF分子的药代动力学；以及(2)FA-XTEN432-3xMMAF缀合物的最大耐受剂量(MTD)。两个研究的结果均有助于功效&安全性研究将会使用的适当剂量水平和给药频率的最终设计。因为正常的啮齿动物食物含有高浓度的叶酸(6mg/kg食物)，所以这些研究中使用的所有小鼠在研究起始之前和研究期间维持叶酸缺乏饮食2周以将血清叶酸浓度降低到代表人类生理范围的水平。
[0563] 1)低叶酸饮食的雌性nu/nu小鼠中FA-XTEN432-3xMMAF和XTEN432-3xMMAF的药代动力学
[0564] 对六只雌性nu/nu小鼠静脉注射FA-XTEN432-3xMMAF的2mg/kg的团剂量，并对六只雌性nu/nu小鼠静脉注射XTEN432-3xMMAF的2mg/kg的团剂量。对于每组在给药前、给药后10min、3h、8h、1d、2d和3d的指定时间点抽取血液并加工为血浆。使用夹心ELISA用抗XTEN抗体量化多个血浆样品中存在的FA-XTEN432-3xMMAF和XTEN432-3xMMAF的量。使用PK
Solutions v2软件将FA-XTEN432-3xMMAF的消除半衰期估算为9.1h，且FA-XTEN432-3xMMAF的消除半衰期估算为13.7h(图60)。
Solutions v2软件将FA-XTEN432-3xMMAF的消除半衰期估算为9.1h，且FA-XTEN432-3xMMAF的消除半衰期估算为13.7h(图60)。
[0565] 2)低叶酸饮食的雌性nu/nu小鼠中FA-XTEN432-3xMMAF的MTD
[0566] 用每组5只雌性nu/nu小鼠进行单剂量MTD实验，评价FA-XTEN432-3xMMAF在10、20、50和100mg/kg下的IV给药(分别为0.5、1、2.5和5mg/kg MMAF的摩尔当量)。作为总毒性的测度，在第一周每天监测每只动物的体重，然后每周监测两次直至15天的研究终点。此外，记录任何死亡以及立毛、驼背行为模式、呼吸模式、颤抖、抽搐、俯卧、自残和脱水的临床体征。
当研究期间的组平均体重减少<20％，并且在治疗动物中治疗相关死亡的发生率不超过
10％时，认为XTEN-药物缀合物具有可接受的毒性。将MTD设置为具有可接受毒性的最高剂量。FA-XTEN432-3xMMAF的所有方案均为可接受耐受的，最小体重减少为1％至6％(图61)；
并且未展现出与药物相关副作用相一致的临床体征。因此，将FA-XTEN432-3xMMAF的MTD确定为>100mg/kg。
当研究期间的组平均体重减少<20％，并且在治疗动物中治疗相关死亡的发生率不超过
10％时，认为XTEN-药物缀合物具有可接受的毒性。将MTD设置为具有可接受毒性的最高剂量。FA-XTEN432-3xMMAF的所有方案均为可接受耐受的，最小体重减少为1％至6％(图61)；
并且未展现出与药物相关副作用相一致的临床体征。因此，将FA-XTEN432-3xMMAF的MTD确定为>100mg/kg。
[0567] 3)叶酸-XTEN-药物缀合物的功效和安全性分析
[0568] 基于上述获得的PK和MTD结果，采用下列研究设计用于叶酸-XTEN-药物缀合物的功效和安全性评估。为了降低叶酸含量，将会移植到nu/nu小鼠中的叶酸受体阳性KB胞首先在不具有抗生素的含有10％热灭活的胎牛血清的无叶酸细胞培养基中生长。相似地，为了降低血清叶酸含量，在肿瘤移植前和研究期间，用于异种移植研究的小鼠维持叶酸缺乏饮6
食2周。简言之，将3x10KB细胞皮下注射到nu/nu小鼠的胁中，并允许形成肿瘤，使用卡尺测量肿瘤大小，并将体积计算为0.5x L x W2，其中L＝最长轴测量的毫米数且W＝与L垂直的轴测量的毫米数。根据表38，将携带KB肿瘤大小为75-162mm3的小鼠随机化为7个组，每组8只动物，并静脉内施用各自的XTEN-药物缀合物，每周3x进行1周。
表38：实验剂量方案
食2周。简言之，将3x10KB细胞皮下注射到nu/nu小鼠的胁中，并允许形成肿瘤，使用卡尺测量肿瘤大小，并将体积计算为0.5x L x W2，其中L＝最长轴测量的毫米数且W＝与L垂直的轴测量的毫米数。根据表38，将携带KB肿瘤大小为75-162mm3的小鼠随机化为7个组，每组8只动物，并静脉内施用各自的XTEN-药物缀合物，每周3x进行1周。
表38：实验剂量方案
[0569] 通过卡尺每周测量两次直至研究终点来确定肿瘤生长的停止或消退。研究的终点定义为肿瘤体积2,000mm3或60天，无论哪者首先达到。在研究过程中对于三次连续测量测定的肿瘤体积为其第1天的体积的≤50％，且对于这些测量的一次或多次为≥13.5mm3，将动物评分为部分消退(PR)。当研究期间对于三次连续测定的肿瘤体积为<13.5mm3时，认为动物完全消退(CR)。在研究结束时具有完全消退的任何动物进一步分类为无肿瘤存活(TFS)。为了评估总毒性，分别监测动物的体重，在第一周每天监测，然后每周监测两次直至研究终点。同样记录任何不适、死亡或不良事件的临床体征。
[0570] 结果：如图62和63所示，发现以79mg/kg施用的FA-XTEN432-3xMMAF是有效且耐受良好的，产生2PR、6CR和5TFS，无可见重量减少。相反，XTEN432-3xMMAF注射组展现出侵略性的肿瘤进展且无反应者(图62)。在38mg/kg下，FA-XTEN864-3xMMAF产生1PR，且体重无显著减轻(图64和65)。然而，在151mg/kg下，FA-XTEN864-3xMMAF缀合物是高度有效的，具有8TFS(图64)，且具有可接受毒性，在第11天最大体重减少为12％(图65)。非靶向XTEN864-3xMMAF也引起肿瘤消退到一定程度，具有2PR、2CR和1TFS(图64)。然而，此组在所有缀合物之间具有最高毒性，在第11天最大体重减少为20％(图65)。FA-XTEN864-3xMMAF和XTEN864-3xMMAF组中的所有动物均随时间恢复了体重且康复良好(图65)。
[0571] 结论：数据强有力地表明，在KB异种移植模型的环境中，叶酸靶向部分的存在或不存在以及XTEN长度对XTEN-药物缀合物的性能具有显著影响。携带靶向部分的药物缀合物比它们的非靶向对应物更有效；且含有XTEN864的构建体比含有XTEN432的构建体更有效。
[0572] 实施例37：抗HER2scFv-XTEN432、XTEN432、抗HER2scFv-XTEN864和XTEN864在携带人BT474乳腺癌的雌性无胸腺裸鼠中的药代动力学和生物分布分析
[0573] 在携带人BT474乳腺癌的雌性无胸腺裸鼠中分析靶向XTEN和单独的XTEN分子的药代动力学和生物分布性质。为了使抗HER2scFv-XTEN432、XTEN432、抗HER2scFv-XTEN864和XTEN864在相同小鼠中能够同时评价，并使小鼠与小鼠的变化最小化，经由DOTA(1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7,10-四乙酸)螯合剂用正交的镧系元素稀土离子标记每个抗HER2scFv-XTEN432、XTEN432、抗HER2scFv-XTEN864和XTEN864以产生分别的分子：抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-钬(Ho)、XTEN432-DOTA-铥(Tm)、抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-铽(Tb)和XTEN864-DOTA_镥(Lu)。然后以等摩尔浓度混合所有4种标记的蛋白质，用于以
26nmol/kg和460nmol/kg的两种靶向剂量水平施用。选择26nmol/kg剂量以便不引起HER2受体饱和并避免抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho和抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb之间对于BT474肿瘤细胞上可获得的HER2结合位点的竞争。在另一方面，460nmol/kg剂量可能引起HER2受体饱和以及HER2靶向XTEN化蛋白质之间的竞争。
26nmol/kg和460nmol/kg的两种靶向剂量水平施用。选择26nmol/kg剂量以便不引起HER2受体饱和并避免抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho和抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb之间对于BT474肿瘤细胞上可获得的HER2结合位点的竞争。在另一方面，460nmol/kg剂量可能引起HER2受体饱和以及HER2靶向XTEN化蛋白质之间的竞争。
[0574] 向18只雌性无胸腺裸鼠在胁部皮下注射1x107BT474(ATCC货号#HTB-20)人乳腺癌细胞。监测移植的肿瘤随着它们的体积接近250-350mm3的靶范围，用卡尺测量其大小并将体积计算为0.5x(L x W2)，其中按照肿瘤的毫米数(mm)，L＝长度且W＝宽度。将细胞植入后一个月指定为第0天，将18只小鼠中携带适当BT474肿瘤大小的12只分为4组，每组3只动物。在第0天，12只小鼠的个体肿瘤体积范围为152mm3至381mm3，且组平均肿瘤体积为256mm3至
257mm3。在第0天开始治疗，用26nmol/kg的抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho、XTEN432-DOTA-Tm、抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb和XTEN864-DOTA-Lu混合物对具有已建立的BT474异种移植的6只小鼠静脉内给药。另外6只小鼠注射460nmol/kg的蛋白混合物。
257mm3。在第0天开始治疗，用26nmol/kg的抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho、XTEN432-DOTA-Tm、抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb和XTEN864-DOTA-Lu混合物对具有已建立的BT474异种移植的6只小鼠静脉内给药。另外6只小鼠注射460nmol/kg的蛋白混合物。
[0575] 对于药代动力学分析，对每个治疗组在给药前、给药后3h、8h、1d、2d和3d的指定时间点将血液抽取到锂肝素化管中并加工为血浆。使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对多个血浆样品中存在的抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho、XTEN432-DOTA-Tm、抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb和XTEN864-DOTA-Lu的各自稀土金属的量定量。使用GraphPad Prism(San Diego)确定以26nmol/kg和460nmol/kg施用的每种标记蛋白质的消除半衰期。
[0576] 对于抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho的T1/2估算为9.6h至12.5h；对于XTEN432-DOTA-Tm为9.2h至13.0h；对于抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb为23.1h至31.2h，并且对于XTEN864-DOTA-Lu为22.2h至29.2h(图67和68)。正如预期，XTEN长度对半衰期具有关键影响；更长的864氨基酸XTEN提供了22-31h的T1/2，与之相对，432个氨基酸XTEN具有9-13h的T1/2。在另一方面，抗HER2靶向scFv的存在似乎对血浆暴露具有很小的作用。
[0577] 对于组织生物分布分析，在第24h处死来自每个剂量水平的3只小鼠，并在第72h处死另外3只。在各自的末端终点处，收获肿瘤、心、肾、肝、肺、脾、胰腺和脑，在PBS中冲洗、吸干、称重并速冻。使用ICP-MS通过每种稀土金属对多个组织中存在的抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho、XTEN432-DOTA-Tm、抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb和XTEN864-DOTA-Lu的量定量，并将数据表示为每g组织注射剂量的百分比(％ID/g)。
[0578] 在26nmol/kg下，观察到血浆和健康组织中抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho和XTEN432-DOTA-Tm的浓度均衰减；除此之外，肝和肿瘤中的抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho有相当大的积累(图69A和69B)(值得注意的是，脑具有抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho和XTEN432-DOTA-Tm的最低可检测水平，表明XTEN化蛋白质未穿过血脑屏障并定位在脑中。)。
期望的结果是，与非靶向构建体相比(3±1％ID/g)，HER2靶向导致肿瘤中有效(25±15％ID/g)且持续的积累。虽然目前未知为什么抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho在肾中积累，但是似乎合理的解释可能是抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho经由肾清除，从而由于抗HER2scFv部分的存在经受肾小管重吸收。该解释的支持是观察到非-HER2靶向的XTEN432-DOTA-Tm在清除时不在肾中重吸收或积累。在460nmol/kg剂量水平下观察到相同的生物分布模式，虽然可能由于来自注射混合物中抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb构建体对于HER2结合位点的一些竞争而处于较低的定量水平(图70A和70B)。
期望的结果是，与非靶向构建体相比(3±1％ID/g)，HER2靶向导致肿瘤中有效(25±15％ID/g)且持续的积累。虽然目前未知为什么抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho在肾中积累，但是似乎合理的解释可能是抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho经由肾清除，从而由于抗HER2scFv部分的存在经受肾小管重吸收。该解释的支持是观察到非-HER2靶向的XTEN432-DOTA-Tm在清除时不在肾中重吸收或积累。在460nmol/kg剂量水平下观察到相同的生物分布模式，虽然可能由于来自注射混合物中抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb构建体对于HER2结合位点的一些竞争而处于较低的定量水平(图70A和70B)。
[0579] 在26nmol/kg下，观察到血浆和健康组织中抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb和XTEN432-DOTA-Lu的浓度衰减，除此之外，在肿瘤中抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb显著积累，且XTEN864-DOTA-Lu有一定程度(图71A和71B)。期望的预期是，证明抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb不但在肿瘤中强力积累(35±20％ID/g)，而且比非靶向XTEN864-DOTA-Lu(11±4％ID/g)更好。我们认为，XTEN864-DOTA-Lu由于增强的渗透性在肿瘤中积累，且由于较大的体积产生滞留作用。与抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho缀合物相比，未观察到抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb的肾积累。这可能是由于抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb超过了肾清除的大小。在460nmol/kg剂量下对于抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb和XTEN864-DOTA-Lu观察到了相同的生物分布曲线，虽然对于抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb构建体处于较低定量水平，这可能是由于来自抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho构建体对于HER2结合位点的一些竞争(图72A和72B)。目前未知为什么在第72小时抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb和
XTEN864-DOTA-Lu均在脾中存在一些明显积累。
XTEN864-DOTA-Lu均在脾中存在一些明显积累。
[0580] 此外，还与预期相一致的是，在第24h，较小的抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho在肿瘤中的积累比较大的抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb更快。然而，随时间发展到第72h，由于抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb更长的循环半衰期，因此发现肿瘤中抗HER2scFv-XTEN864-DOTA-Tb比抗HER2scFv-XTEN432-DOTA-Ho积累得明显更多(图73)。
[0581] 实施例38：抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720在携带人BT474乳腺癌细胞的雌性无胸腺裸鼠中的功效和安全性分析
[0582] 利用下列研究设计用于无胸腺裸鼠的BT474异种移植模型中抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720药物缀合物的功效和安全性评估。简言之，将1x107BT474细胞皮下注射到雌性无胸2
腺裸鼠的胁中，并允许形成肿瘤，使用卡尺测量肿瘤大小，并将体积计算为0.5x(L x W)，其中按照肿瘤的毫米数(mm)，L＝长度且W＝宽度。将细胞植入后29天指定为第0天，将携带
100-200mm3的靶向肿瘤大小的小鼠分为4组，每组8只动物。在第0天，参与研究的小鼠的个体肿瘤体积范围为107mm3至278mm3，且组平均肿瘤体积为183mm3至185mm3。在第0天开始治疗，静脉内施用PBS媒介物对照、30、100和300nmol/kg的抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720药物缀合物。
腺裸鼠的胁中，并允许形成肿瘤，使用卡尺测量肿瘤大小，并将体积计算为0.5x(L x W)，其中按照肿瘤的毫米数(mm)，L＝长度且W＝宽度。将细胞植入后29天指定为第0天，将携带
100-200mm3的靶向肿瘤大小的小鼠分为4组，每组8只动物。在第0天，参与研究的小鼠的个体肿瘤体积范围为107mm3至278mm3，且组平均肿瘤体积为183mm3至185mm3。在第0天开始治疗，静脉内施用PBS媒介物对照、30、100和300nmol/kg的抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720药物缀合物。
[0583] 通过卡尺每周测量三次直至研究终点来确定肿瘤生长的停止或消退。研究的终点定义为肿瘤体积800mm3或30天，无论哪者首先达到。对于每个治疗组均用下列公式计算肿瘤生长抑制百分比(％TGI)：((媒介物对照的平均肿瘤体积–HER2缀合物的平均肿瘤体积)/媒介物对照的平均肿瘤体积)x 100。将具有％TGI≥60％的治疗组认为是治疗活性的。作为总毒性的评估，每周三次分别监测动物的体重，直至研究终点。同样记下任何不适、死亡或不良事件的临床体征。
[0584] 正如预期，在施用PBS媒介物的BT474肿瘤携带小鼠中无肿瘤抑制，产生的％TGI为零。相反，且如图74中所示，发现抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720药物缀合物在评价的所有3个剂量下均有效，且耐受性良好，无可见重量减少(图75)。在第30天，对于在30nmol/kg剂量下的抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720的％TGI为90％；在100nmol/kg下为91％，并且在300nmol/kg下为97％；表明30nmol/kg的药物缀合物与300nmol/kg具有几乎等效的功效。
[0585] 上述数据强有力地表明，在BT474异种移植模型的环境中，抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720是高度有效且安全的，可在低达30nmol/kg药物缀合物的剂量下达到功效。
[0586] 实施例39：含有XTEN的PCM的药代动力学测定
[0587] 在雌性无胸腺裸鼠中分析携带不同PCM序列的XTEN的药代动力学性质。首先评价具有RS1(MMP-2/9)、RS2(MMP-7)、RS3(uPA)和RS4(MMP-14)组成的PCM；然后在研究2中评价具有串联蛋白酶释放位点BSRS1、BSRS2和BSRS3的PCM。为了使多种RS&BSRS构型能够在相同小鼠中同时分析XTEN的循环半衰期，并使小鼠与小鼠的变化最小化，经由DOTA(1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7,10-四乙酸)螯合剂用正交的镧系元素稀土离子标记分别的XTEN-RS和XTEN-BSRS以产生相应的分子来支持两个研究。
[0588] 在研究1中，分析XTEN864-RS1-DOTA-钬(Ho)、XTEN864-RS2-DOTA-铽(Tb)、XTEN864-RS3-DOTA-铥(Tm)、XTEN864-RS4-DOTA-铕(Eu)和对照XTEN864-DOTA-镥(Lu)。用每种含有2mg/kg的XTEN864-RS1-DOTA-Ho、XTEN864-RS2-DOTA-Tb、XTEN864-RS3-DOTA-Tm、XTEN864-RS4-DOTA-Eu和XTEN864-DOTA-Lu的混合物对六只雌性nu/nu静脉注射。在每组之间在给药前、给药后3h、8h、1d、2d、3d和4d的指定时间点抽取血液并加工为血浆。使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对多个血浆样品中存在的XTEN864-RS1-DOTA-Ho、XTEN864-RS2-DOTA-Tb、XTEN864-RS3-DOTA-Tm、XTEN864-RS4-DOTA-Eu和XTEN864-DOTA-Lu的各自稀土金属的量定量。使用GraphPad Prism(San Diego)确定以2mg/kg施用的每种标记蛋白质的消除半衰期。
[0589] 对于XTEN864-RS1-DOTA-Ho估算的T1/2为24.7h，XTEN864-RS2-DOTA-Tb为25.3h、XTEN864-RS3-DOTA-Tm为26.0h、XTEN864-RS4-DOTA-Eu为26.7h且XTEN864-DOTA-Lu为25.0h(图76)。结果表明，XTEN上的RS1、RS2、RS3和RS4组成未改变XTEN聚合物的T1/2。
[0590] 在研究2中，用XTEN864-BSRS1-DOTA-Tb、XTEN864-BSRS2-DOTA-Ho、XTEN864-BSRS3-DOTA-Tm、XTEN864-DOTA-Lu和XTEN144-DOTA-Eu评价含有不同串联蛋白酶释放位点的XTEN；TEN864-DOTA-Lu作为不含BSRS的XTEN，且XTEN144-DOTA-Eu代表切割变短部分。以2mg/kg浓度混合所有5种金属标记的蛋白质，并将得到的混合物静脉内施用到六只雌性nu/nu小鼠中。对于药代动力学分析，在六只小鼠之间，在给药前、给药后3h、8h、1d、2d、3d、4d、
5d、6d和7d的指定时间点将血液抽取到锂肝素化管中并加工为血浆。使用ICP-MS对多个血浆样品中存在的XTEN864-BSRS1-DOTA-Tb、XTEN864-BSRS2-DOTA-Ho、XTEN864-BSRS3-DOTA-Tm、XTEN864-DOTA-Lu和XTEN144-DOTA-Eu的各自稀土金属的量定量。使用GraphPad Prism(San Diego)确定以2mg/kg施用的每种标记蛋白质的消除半衰期。
5d、6d和7d的指定时间点将血液抽取到锂肝素化管中并加工为血浆。使用ICP-MS对多个血浆样品中存在的XTEN864-BSRS1-DOTA-Tb、XTEN864-BSRS2-DOTA-Ho、XTEN864-BSRS3-DOTA-Tm、XTEN864-DOTA-Lu和XTEN144-DOTA-Eu的各自稀土金属的量定量。使用GraphPad Prism(San Diego)确定以2mg/kg施用的每种标记蛋白质的消除半衰期。
[0591] 对于XTEN864-BSRS1-DOTA-Tb的T1/2估算为32.5h；对于XTEN864-BSRS2-DOTA-Ho为32.6h；对于XTEN864-BSRS3-DOTA-Tm为32.5h，并且对于XTEN864-DOTA-Lu为30.6h(图77)。
与研究1中观察到的结果相一致，研究2中的数据表明，XTEN上串联配置的由BSRS1、BSRS2或BSRS-3代表的蛋白酶位点也未改变XTEN聚合物的T1/2。然而，一旦切割，以XTEN144-DOTA-Eu作为例证的分子被快速切割，具有约1.8h的非常短的半衰期。
与研究1中观察到的结果相一致，研究2中的数据表明，XTEN上串联配置的由BSRS1、BSRS2或BSRS-3代表的蛋白酶位点也未改变XTEN聚合物的T1/2。然而，一旦切割，以XTEN144-DOTA-Eu作为例证的分子被快速切割，具有约1.8h的非常短的半衰期。
[0592] 实施例40：蛋白酶处理和未处理的抗EpCAMscFv x抗CD3scFv-BSRS1-XTEN864双特异性分子的结合亲和力
[0593] 使用含有双特异性抗EpCAMscFv x抗CD3scFv-BSRS1-XTEN864构建体的PCM用于评价蛋白酶处理对EpCAM配体的结合亲和力的影响。简言之，用MMP-9在37℃下处理重组抗EpCAMscFv x抗CD3scFv-BSRS1-XTEN864分子2h或不处理，并以一定剂量范围在EpCAM/L蛋白夹心ELISA上分析如下：通过在4℃下温育过夜将重组人EpCAM涂覆在96孔微量滴定板上。然后将孔封闭、洗涤，并将一定剂量范围的蛋白酶处理的抗EpCAMscFv x抗CD3scFv和未处理的抗EpCAMscFv x抗CD3scFv-BSRS1-XTEN864蛋白添加到适当的孔。在一小时温育以允许通过涂覆的EpCAM配体最佳捕获蛋白酶处理的抗EpCAMscFv x抗CD3scFv和蛋白酶未处理的抗EpCAMscFv x抗CD3scFv-BSRS1-XTEN864蛋白后，再次洗涤板并添加过氧化物酶缀合的L蛋白。在允许L蛋白与scFv的κ轻链结合的适当温育期后，进行最后的洗涤步骤并添加四甲基联苯胺(TMB)底物。TMB是过氧化物酶的显色底物。一旦达到期望的颜色强度，则引入0.2N硫酸以停止反应，并使用分光光度计在450m下测量吸光度(OD)。相对于抗EpCAMscFv x抗CD3scFv和抗EpCAMscFv x抗CD3scFv-BSRS1-XTEN864蛋白的浓度标绘产生的颜色的强度(即OD)。给出半最大反应(EC50)分析物的浓度来源于4参数逻辑斯蒂回归方程。
[0594] 如图78中所示，相对于蛋白酶未处理的完整双特异性分子(EC50 284nM)，蛋白酶处理的抗EpCAMscFv X抗CD3scFv双特异性分子对EpCAM配体具有更强的结合活性(EC50 106nM)。数据表明，XTEN864的存在使抗XTEN864部分与其配体的结合阻碍了至少2.7倍。
[0595] 实施例41：叶酸-XTEN-药物缀合物的体外选择性评价
[0596] 使用FA-XTEN432-3xMMAF作为代表性叶酸靶向的XTEN药物缀合物在针对一组选自表39的叶酸受体阳性和阴性细胞系的CellTiter-Glo抗增殖测定中体外评价叶酸-XTEN药物缀合物选择性靶向和杀伤携带叶酸受体的细胞的能力。表39：叶酸受体阳性和阴性细胞系
细胞系 组织 叶酸受体状态
KB 鼻咽 阳性
IGROV 卵巢 阳性
SK-OV-3 卵巢 阳性
JEG-3 胎盘 阳性
HeLa 宫颈 阳性
LoVo 结肠直肠 阳性
SW620 结肠直肠 阳性
MDA-MB-231 乳腺 阳性
A549 肺 阴性
A375 多种黑素瘤 阴性
LS-174T 结肠直肠 阴性
SK-BR-3 乳腺 阴性
细胞系 组织 叶酸受体状态
KB 鼻咽 阳性
IGROV 卵巢 阳性
SK-OV-3 卵巢 阳性
JEG-3 胎盘 阳性
HeLa 宫颈 阳性
LoVo 结肠直肠 阳性
SW620 结肠直肠 阳性
MDA-MB-231 乳腺 阳性
A549 肺 阴性
A375 多种黑素瘤 阴性
LS-174T 结肠直肠 阴性
SK-BR-3 乳腺 阴性
[0597] 简言之，在叶酸受体阳性KB(600至0.002nM剂量范围，4倍连续稀释)、JEG-3(1000至0.02nM剂量范围，6倍连续稀释)和SW620(100至0.02nM剂量范围，4倍连续稀释)；以及叶酸受体阴性SK-BR-3(100至0.02nM,4倍连续稀释)上测试叶酸-XTEN432-3xMMAF的选择性评价。因为细胞培养基含有高叶酸含量，所以细胞在补充有10％热灭活的FCS的无叶酸RPMI中4
生长并进行测定。收集对数期的KB细胞，计数，并以每孔1x10 细胞铺在96孔微量滴定测定板上。通过在37℃、5％CO2下温育过夜允许细胞附着在板上。在存在和不存在叶酸时以一式两份的剂量范围引入FA-XTEN432-3xMMAF并将板温育3天。具有叶酸抑制剂的实验孔中的细胞在添加叶酸-XTEN432-3xMMAF之前在37℃、5％CO2下与叶酸预温育30min。在适当的温育期后，向每个孔添加CellTiter-Glo试剂，在定轨摇床上混合2分钟。然后在90g下将板离心并在室温下温育额外的10分钟以稳定发光信号。然后在光度计上读取发光信号并用
GraphPad Prism软件或等效软件计算IC50(半最大抑制浓度)。定量IC50使FA-XTEN-3xMMAF对于叶酸受体阳性与阴性细胞系的细胞毒性选择性能够进行比较。
生长并进行测定。收集对数期的KB细胞，计数，并以每孔1x10 细胞铺在96孔微量滴定测定板上。通过在37℃、5％CO2下温育过夜允许细胞附着在板上。在存在和不存在叶酸时以一式两份的剂量范围引入FA-XTEN432-3xMMAF并将板温育3天。具有叶酸抑制剂的实验孔中的细胞在添加叶酸-XTEN432-3xMMAF之前在37℃、5％CO2下与叶酸预温育30min。在适当的温育期后，向每个孔添加CellTiter-Glo试剂，在定轨摇床上混合2分钟。然后在90g下将板离心并在室温下温育额外的10分钟以稳定发光信号。然后在光度计上读取发光信号并用
GraphPad Prism软件或等效软件计算IC50(半最大抑制浓度)。定量IC50使FA-XTEN-3xMMAF对于叶酸受体阳性与阴性细胞系的细胞毒性选择性能够进行比较。
[0598] 在叶酸抑制剂缺乏情况下的FA-XTEN432-3xMMAF显示出在叶酸受体阳性KB(IC50为0.6nM)(图58)、JEG-3(IC50为0.4nM)(图79A)和SW620(IC50为6.2nM)(图79B)细胞中选择性的强力杀伤；但在叶酸受体阴性SK-BR-3上不存在(IC50>100nM)(图79C)。值得注意的是，在存在叶酸时KB、JEG-3和SW620中FA-XTEN432-3xMMAF的细胞毒性消失，表明了细胞毒活性的特异性(图58、图79A和图79B)。
[0599] 实施例42：FA-3xMMAE-CCD-XTEN717和FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713缀合物的体内功效和安全性评价
[0600] 为了进一步调节叶酸-XTEN药物缀合物用于提高功效和安全性，如实施例36中所观察到的，将下列修饰引入下一代叶酸缀合物：(1)用MMAE置换MMAF毒素；(2)MMAE在接近叶酸靶向部分的N末端聚集，而不是在CXTEN上均匀间隔；以及(3)BSRS1紧接着放置在MMAE毒素聚集体的下游。在低叶酸饮食的雌性nu/nu小鼠中建立的KB异种移植模型中，在体内评价两种得到的蛋白质FA-3xMMAE-CCD-XTEN717和FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713。此外，在此试验研究中仅使用单次团注而不是每周3x注射。
[0601] 将KB细胞植入后7天指定为第0天，将携带100-200mm3的靶向肿瘤大小的处于低叶酸饮食的小鼠分为2组，每组3只动物。在第0天，参与研究的小鼠的个体肿瘤体积范围为83mm3至147mm3，且2个组的平均肿瘤体积为111±33mm3至111±30mm3。在第0天用静脉内施用120nmol/kg等摩尔浓度的FA-3xMMAE-CCD-XTEN717和FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713开始治疗。这与施用9mg/kg的叶酸-XTEN药物缀合物或0.26mg/kg的MMAE对两种蛋白质等效(表40)。
表40：用于给药的实验设计
表40：用于给药的实验设计
[0602] 通过卡尺每周测量三次直至研究终点来确定肿瘤生长的停止或消退。研究的终点定义为肿瘤体积800mm3或42天，无论哪者首先达到。为了评估总毒性，每周三次分别监测动物的体重。同样记录任何不适、死亡或不良事件的临床体征。
[0603] 如图80中所示，发现在120nmol/kg的单次团注剂量下，FA-3xMMAE-CCD-XTEN717和FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713药物缀合物在19-21天均诱导肿瘤消退；随后对于两种缀合物均观察到肿瘤再生长。虽然每组小鼠的数目较小，但是通过学生的t检验，FA-3xMMAE-CCD-XTEN717和FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713的肿瘤减小功效彼此未表现出显著差异。此外，发现FA-3xMMAE-CCD-XTEN717和FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713均耐受性良好，无可见重量减少(图81)。
[0604] 值得注意的是，如图82中所示，并反映在表40中，120nmol/kg(即9mg/kg)的FA-3xMMAE-CCD-XTEN717和FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713比459nmol/kg(即38mg/kg)的FA-XTEN864-3xMMAF在控制肿瘤消退和生长方面有效的多。
[0605] 结论：数据强有力地表明，在KB异种移植模型的环境中，FA-3xMMAE-CCD-XTEN717和FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713均高度有效且耐受性良好，在120nmol/kg的药物缀合物下可达到功效。在具有有限动物数目的此试验KB移植物研究中，BSRS1组成的表现未推断出肿瘤消退中的额外优势。令人印象深刻的是，FA-3xMMAE-CCD-XTEN717和FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713均能够以相对FA-XTEN864-3xMMAF所给予的较低剂量控制肿瘤消退和生长。存在可导致疗效的该剧烈提高的多个因素：(1)作为毒素有效负载，MMAE比MMAF更有效；和/或(2)由于XTEN在循环中可能的蛋白水解切割，毒素在接近靶向部分的N末端处的聚集可提供额外的优势。
[0606] 实施例43：FA-3xMMAE-CCD-XTEN717、FA-3xMMAE-CXTEN864、FA-3xDM1-CCD-XTEN717、FA-3xMMAE-CCD-BSRS5-XTEN713和FA-3xMMAE-CCD-BSRS6-XTEN13缀合物的体内功效和安全性评价
[0607] 为了进一步了解并提高先前实施例中的叶酸-XTEN药物缀合物的性能，将进行下列研究以解决下述：(1)需要在21天给予肿瘤停滞所需的FA-3xMMAE-CCD-XTEN717的最低给药浓度；(2)MMAE在接近叶酸靶向部分的N末端聚集相比MMAE在CXTEN聚合物上均匀间隔的影响；(3)DM1是否将成为比MMAE更好的毒素有效负载；(4)用BSRS5和BSRS6置换BSRS1用于增强功效和安全裕度；以及(5)其他体内叶酸受体阳性异种移植模型。
[0608] 研究1：FA-3xMMAE-CCD-XTEN717、FA-3xMMAE-CXTEN864和FA-3xDM1-CCD-XTEN717缀合物将用于解决问题1、2和3。处于低叶酸饮食的具有100mm3至200mm3肿瘤体积范围的35只雌性nu/nu小鼠将参与研究，作为7个组，每组5只小鼠。将治疗开始指定为第0天，根据表41静脉内施用FA-3xMMAE-CCD-XTEN717、FA-3xMMAE-CXTEN864和FA-3xDM1-CCD-XTEN717：
表41：实验设计
表41：实验设计
[0609] 作为功效的读出数据，通过卡尺每周测量三次直至研究终点来确定肿瘤的消退和生长。研究的终点定义为肿瘤体积800mm3或30天，无论哪者首先达到。作为总毒性的评估，每周三次分别监测动物的体重。记录任何不适、死亡或不良事件的临床体征。
[0610] 我们预计，能够在21天诱导肿瘤停滞的FA-3xMMAE-CCD-XTEN717的剂量浓度属于8.9mg/kg至0.3mg/kg的剂量范围。携带相同性质和数目的MMAE但位置不同的FA-3xMMAE-CCD-XTEN717与FA-3xMMAE-CXTEN864的面对面比较将证实毒素位置是否确实传递了功效优势。我们推测，在N末端聚集的毒素将更有效或等效，但在功效方面确实不比配置为沿CXTEN聚合物均匀分布的毒素更差。通常，认为MMAE在诱导细胞毒性方面比DM1更强。我们将直接比较FA-3xMMAE-CCD-XTEN717与FA-3xDM1-CCD-XTEN717来评价毒素选项。在以等摩尔浓度给药的情况下，我们预测FA-3xMMAE-CCD-XTEN717在诱导肿瘤停止和消退方面比FA-3xDM1-CCD-XTEN717更有效。
[0611] 研究2：如实施例42中所述，BSRS1性能的不足可能受到使用的KB异种移植模型中存在的蛋白酶类型和水平的影响。为了规避这些可能性，将会在附加的高叶酸受体表达异种移植中测试携带不同BSRS组成的叶酸-XTEN药物缀合物，该异种移植包括但不限于OVCAR3、IGROV3、OV-90、NCI-H2110和LXFA-737。特别地，首先FA-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN713将与FA-3xMMAE-CCD-BSRS5-XTEN713和FA-3xMMAE-CCD-BSRS6-XTEN13结合评估它们在KB、OVCAR和IGROV3异种移植中控制肿瘤进展的效力。假定每种拥有不同的蛋白酶敏感性比例的BSRS1、BSRS5和BSRS6PCM可在由不同异种移植代表的不同肿瘤蛋白酶环境中表现不同。当以等摩尔浓度给药时，在每种异种移植的环境中，一种BSRS可能比其他的更有利。
[0612] 实施例44：抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720、XTEN432-3xMMAE、抗HER2scFv-3xDM1-XTEN720和XTEN432-3xDM1缀合物的体外细胞毒性和特异性评价
[0613] 在CellTiter-Glo细胞活力测定中将抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720和抗HER2scFv-3xDM1-XTEN720的特异性细胞毒活性与它们相应的非靶向XTEN432-3xMMAE和XTEN432-
3xDM1前体相比较，以比较它们影响细胞毒性的能力。使用一组HER2表达细胞系，包括但不限于SK-BR-3、BT474、NCI-N87、SK-OV-3和HCC1954，在存在和不存在曲妥珠单抗作为竞争剂的情况下进一步阐明抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720和抗HER2scFv-3xDM1-XTEN720的特异性(图83和图84)。简言之，HER2阳性细胞以1X104铺在96孔微量滴定板的每个孔中，并通过在
37℃、5％CO2下温育过夜允许依附在板上。将具有和不具有曲妥珠单抗处理的抗HER2scFv-
3xMMAE-XTEN720和抗HER2scFv-3xDM1-XTEN720缀合物以及XTEN432-3xMMAE和XTEN432-
3xDM1缀合物以一定剂量范围(一式两份)引入板中，并将板在37℃、5％CO2下温育3天。对于SK-BR-3、BT474、HCC1954，使用包含1000nM至0.05nM剂量范围的3倍连续稀释；对于NCI-N87，使用1000nM至0.06nM剂量范围的5倍连续稀释；以及对于SK-OV-3，使用5000nM至
0.19nM剂量范围的4倍连续稀释。在适当的温育期后，向每个孔添加CellTiter-Glo试剂，并将板在定轨摇床上混合2分钟。然后在90xg下将板离心并在室温下温育额外的10min以稳定发光信号。然后在光度计上读取发光信号并用GraphPad Prism软件计算IC50(半最大抑制浓度)。
3xDM1前体相比较，以比较它们影响细胞毒性的能力。使用一组HER2表达细胞系，包括但不限于SK-BR-3、BT474、NCI-N87、SK-OV-3和HCC1954，在存在和不存在曲妥珠单抗作为竞争剂的情况下进一步阐明抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720和抗HER2scFv-3xDM1-XTEN720的特异性(图83和图84)。简言之，HER2阳性细胞以1X104铺在96孔微量滴定板的每个孔中，并通过在
37℃、5％CO2下温育过夜允许依附在板上。将具有和不具有曲妥珠单抗处理的抗HER2scFv-
3xMMAE-XTEN720和抗HER2scFv-3xDM1-XTEN720缀合物以及XTEN432-3xMMAE和XTEN432-
3xDM1缀合物以一定剂量范围(一式两份)引入板中，并将板在37℃、5％CO2下温育3天。对于SK-BR-3、BT474、HCC1954，使用包含1000nM至0.05nM剂量范围的3倍连续稀释；对于NCI-N87，使用1000nM至0.06nM剂量范围的5倍连续稀释；以及对于SK-OV-3，使用5000nM至
0.19nM剂量范围的4倍连续稀释。在适当的温育期后，向每个孔添加CellTiter-Glo试剂，并将板在定轨摇床上混合2分钟。然后在90xg下将板离心并在室温下温育额外的10min以稳定发光信号。然后在光度计上读取发光信号并用GraphPad Prism软件计算IC50(半最大抑制浓度)。
[0614] 结果：如图83和表42所示，在等摩尔浓度下测试，具有抗HER2scFv靶向部分的抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720比不携带靶向部分的XTEN432-3xMMAE缀合物构建体显示出显著更高的细胞毒性杀伤。重要的是，曲妥珠单抗作为竞争剂的添加损害了在测试的该组细胞系上观察到的抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720的细胞杀伤活性，证明了HER2介导的细胞毒性的特异性。表42：IC50测定
[0615] 使用含有DM1的缀合物获得了相似结果。展现出强力细胞毒性的抗HER2scFv-3xDM1-XTEN720受到曲妥珠单抗的抑制，而相应的非靶向XTEN432-3xDM1缀合物不具有任何显著的体外细胞毒活性(图84和表43)。
表43：IC50测定
表43：IC50测定
[0616] 结论：数据表明，在反应条件下，抗HER2scFv部分给予了HER2介导的靶向作用，增强了XTEN-药物缀合物的细胞毒活性。此外，抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720和抗HER2scFv-3xDM1-XTEN720均在HER2阳性但曲妥珠单抗抗性的HCC1954细胞系中发挥强力的细胞毒活性；表明XTEN-药物缀合物比单独的曲妥珠单抗抗体更有效。
[0617] 实施例45：抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757和抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753缀合物的体外细胞毒性评价
[0618] 使用NCI-N87细胞系作为代表性的高HER2表达细胞系，在CellTiter-Glo细胞活力测定中评价抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753和蛋白酶处理的抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753的细胞毒活性，以评价它们影响细胞毒性的能力。简言之，NCI-N87细胞以1X104铺在96孔微量滴定板的每个孔中，并通过在37℃、5％CO2下温育过夜允许依附在板上。以5倍连续稀释的1000nm至0.06nM的剂量范围(一式两份)将抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753和蛋白酶处理的抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753引入板中；并将板在37℃、5％CO2下温育3天。在适当的温育期后，向每个孔添加CellTiter-Glo试剂，并将板在定轨摇床上混合2分钟。然后在90xg下将板离心并在室温下温育额外的10min以稳定发光信号。然后在光度计上读取发光信号并用GraphPad Prism软件计算IC50(半最大抑制浓度)。
[0619] 结果：如图85中所示，当在等摩尔浓度下测试时，抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757和含有完整抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753的BSRS1PCM显示出相似的细胞毒活性，分别产生2.2nM和3.1nM的IC50。然而，一经蛋白酶处理，切割的抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753展现出比未蛋白酶处理的抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753强5倍的活性，产生0.64nM的IC50(图85)。
[0620] 结论：数据表明，在实验条件下，蛋白酶处理的抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753比其蛋白酶未处理的对应物给予了更强的细胞毒活性。
[0621] 实施例46：抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720、抗HER2scFv-3xDM1-CXTEN720、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753和Kadcyla在携带人BT474乳腺癌的雌性SCID小鼠中的功效和安全性分析
[0622] 设计下列功效研究以破译下列作用(1)MMAE相对于DM1；(2)在接近抗HER2scFv靶向部分的N末端处聚集的MMAE相对于在CXTEN聚合物上均匀间隔的MMAE的影响；(3)BSRS1的影响；以及抗HER2-XTEN药物缀合物相比(4)基准Kadcyla的性能。
[0623] 简言之，将1x107BT474细胞皮下注射到68只雌性无胸腺nu/nu小鼠的胁中，并允许形成肿瘤，使用卡尺测量肿瘤大小，并将体积计算为0.5x(L x W2)，其中按照肿瘤的毫米数(mm)，L＝长度且W＝宽度。在指定为第0天的时候，从68只小鼠选择携带的靶向肿瘤大小为100-150mm3的48只小鼠并分为6组，每组8只动物；每组具有近似相等的平均肿瘤体积。治疗在第0天开始，静脉内施用PBS媒介物对照、30nmol/kg的抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720、抗HER2scFv-3xDM1-CXTEN720、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753和Kadcyla。
[0624] 通过卡尺每周测量三次直至研究终点来确定肿瘤生长的停止或消退。研究的终点定义为肿瘤体积1000mm3或30天，无论哪者首先达到。对每个治疗组计算肿瘤生长抑制百分比(％TGI)，并且％TGI≥60％认为是治疗活性的。作为总毒性的评估，每周三次分别监测动物的体重，直至研究终点。同样记下任何不适、死亡或不良事件的临床体征。
[0625] 预期在施用PBS媒介物的BT474肿瘤携带小鼠中将观察到无肿瘤抑制。基于用抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720药物缀合物在BT474异种移植中获得的结果和文献中记录的Kadcyla的性能，我们预期所有五种药物缀合物(抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720、抗HER2scFv-3xDM1-CXTEN720、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753和Kadcyla)在诱导肿瘤停滞或消退中均比媒介物更有效。(1)我们推测，MMAE将比DM1更有效，并因此预期抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720在肿瘤停滞和/或消退方面比抗HER2scFv-3xDM1-CXTEN720表现得更好。(2)我们认为抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-
XTEN757比抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720更有效或等效；而不是更差。(3)BT474是否将为将要切割的BSRS1PCM提供正确的肿瘤蛋白酶环境，从而为抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753比相应的抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757缀合物表现得更好提供环境还有待观察。(4)当以等摩尔给药时，在一定程度上由于scFv-XTEN比全长IgG具有更好的肿瘤渗透性，因此我们预计抗HER2scFv-XTEN药物缀合物的一种或多种比Kadcyla表现得更好。还预期在30nmol/kg下，所有5种药物缀合物化合物将均耐受良好，无体重减少。
XTEN757比抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720更有效或等效；而不是更差。(3)BT474是否将为将要切割的BSRS1PCM提供正确的肿瘤蛋白酶环境，从而为抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753比相应的抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757缀合物表现得更好提供环境还有待观察。(4)当以等摩尔给药时，在一定程度上由于scFv-XTEN比全长IgG具有更好的肿瘤渗透性，因此我们预计抗HER2scFv-XTEN药物缀合物的一种或多种比Kadcyla表现得更好。还预期在30nmol/kg下，所有5种药物缀合物化合物将均耐受良好，无体重减少。
[0626] 实施例47：抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720、抗HER2scFv-3xDM1-CXTEN720、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753和Kadcyla在携带人BT474胃癌和SK-OV-3卵巢癌的雌性SCID小鼠中的功效和安全性分析
[0627] 作为除BT474之外的肿瘤环境的代表，还将在BT474胃癌和SK-OV-3卵巢癌中评价抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720、抗HER2scFv-3xDM1-CXTEN720、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753和Kadcyla。
[0628] 在NCI-N87异种移植模型中，将1x107NCI-N87细胞皮下施用至68只雌性SCID小鼠的胁中；而在SK-OV-3模型中，将1mm3SK-OV-3肿瘤碎片皮下植入雌性无胸腺nu/nu小鼠的胁中。在指定为第0天的时候，从68只小鼠选择携带的靶向肿瘤大小为100-150mm3的48只小鼠并分为6组，每组8只动物；每组具有近似相等的平均肿瘤体积。治疗在第0天开始，静脉内施用PBS媒介物对照、30nmol/kg的抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720、抗HER2scFv-3xDM1-CXTEN720、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753和Kadcyla。
[0629] 通过卡尺每周测量三次直至研究终点来确定肿瘤生长的停止或消退。NCI-N87研究的终点定义为肿瘤体积800mm3或30天，无论哪者首先达到。SK-OV-3研究的终点定义为2000mm3或30天，无论哪者首先达到。在NCI-N87和SK-OV-3研究中，对每个治疗组均计算肿瘤生长抑制百分比(％TGI)。将具有％TGI≥60％的治疗组认为是治疗活性的。作为总毒性的评估，每周三次分别监测动物的体重，直至研究终点。同样记下任何不适、死亡或不良事件的临床体征。
[0630] 预期在施用PBS媒介物的NCI-N87和SK-OV-3肿瘤携带小鼠中将观察到无肿瘤抑制。基于用抗HER2scFv-3xMMAE-XTEN720药物缀合物在BT474异种移植中获得的结果以及NCI-N87和SK-OV-3模型文献中记录的Kadcyla的性能，我们预期所有五种药物缀合物(抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720、抗HER2scFv-3xDM1-CXTEN720、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757、抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753和Kadcyla)对于两种异种移植模型在诱导肿瘤停滞或消退中均比媒介物更有效。(1)就BT474模型来说，我们推测，MMAE将比DM1更有效，并因此预计抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720在诱导肿瘤停止和/或消退方面比抗HER2scFv-3xDM1-CXTEN720表现得更好。(2)我们认为抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757比抗HER2scFv-3xMMAE-CXTEN720具有更大或等效的功效；而不是更差。(3)NCI-N87和SK-OV-3异种移植的任一者或两者是否将为将要切割的BSRS1PCM提供正确的肿瘤蛋白酶环境，从而为抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-BSRS1-XTEN753比抗HER2scFv-3xMMAE-CCD-XTEN757表现得更好提供环境还有待观察。(4)当以等摩尔给药时，部分由于scFv-XTEN比全长IgG具有更好的肿瘤渗透性，因此我们预计抗HER2scFv-XTEN药物缀合物的一种或多种比Kadcyla表现得更好。还预期在30nmol/kg下，所有5种药物缀合物化合物将均耐受良好，无体重减少。
[0631] 与相应的不含BSRS1的缀合物相比，有可能含有BSRS1PCM的抗HER2-XTEN药物组合物在BT474、NCI-N87或SK-OV-3中可不提供额外的优势。如果真是这样，将用其他PCM置换BSRS1，并且将在HER2阳性异种移植中评价得到的缀合物。
[0632] 实施例48：弹性蛋白酶消化和体外活性测试
[0633] 据推测，弹性蛋白酶，即具有广泛底物特异性的丝氨酸蛋白酶，可能能够降解XTEN。设计实验以证明XTEN对蛋白酶切割的敏感性。将10μM纯化的XTEN_AE864与人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(R&D系统)以1:1000或1:100的摩尔比(弹性蛋白酶:XTEN)在37℃下温育2小时。在SDS-PAGE凝胶上分析然后使用coomassie染色分析消化之前和之后的样品(图
86)。当XTEN_AE864与嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在1:1000的摩尔比下温育时，观察到部分降解，而XTEN_AE864在1:100的摩尔比下被嗜中性粒细胞弹性蛋白酶完全消化。
86)。当XTEN_AE864与嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在1:1000的摩尔比下温育时，观察到部分降解，而XTEN_AE864在1:100的摩尔比下被嗜中性粒细胞弹性蛋白酶完全消化。
[0634] 在靶向缀合物组合物的环境中，其中细胞毒性药物与CCD缀合，设计组合物以便细胞毒性药物与靶向组合物相比更加接近靶向部分，其中有效负载与含有常规半胱氨酸的XTEN缀合，且半胱氨酸分散在XTEN的整个长度。用于设计的原理是，当在XTEN上经受蛋白酶消化时，与连接于XTEN中更远侧的药物相比，与靶向缀合物组合物中CCD连接的药物分子的更高百分比更可能仍然与相关靶向部分连接，将导致当靶向部分与靶肿瘤细胞结合时药物分子内在化的更高可能性，导致细胞死亡。因为体内环境具有大量可降解XTEN的多种蛋白酶，所以具有与CCD连接的有效负载的靶向缀合物组合物将比含有常规半胱氨酸的XTEN产生更好的体内功效。下列所述的方法可用于在体外测试此假设。
[0635] 以如实施例13和实施例20中所述的相似方法制备的叶酸-CCD-XTEN-3xDM1(含有3个DM1分子，作为靶向缀合物组合物的代表)和叶酸-CXTEN-3xDM1(含有3个DM1分子，作为具有与XTEN缀合的DM1有效负载的靶向XTEN的代表)将与嗜中性粒细胞弹性蛋白酶以1:1000的摩尔比在37℃下温育。在不同时间点移取样品，并将通过SDS-PAGE监测以监测降解过程，并将在基于细胞的测定中评价它们在具有叶酸受体的KB细胞中的杀伤活性，如实施例35所述。我们预期，在某个时间点，样品将达到较低百分比的叶酸-CXTEN-3xDM1将仍保留与叶酸连接的所有3个DM1药物，而显著更高百分比的叶酸-CXTEN-3xDM1将保留与叶酸连接的所有3个DM1药物的降解水平。因为与不具有叶酸的XTEN连接的DM1对细胞无毒，所以细胞毒性作用仅由仍与叶酸靶向部分连接的DM1提供。当在基于细胞的测定中测试这些样品时，我们预期对于所有样品的IC50相似，因为这仅与叶酸及其受体之间的亲和力有关，但预期细胞杀伤的百分比将变得更低，因为DM1药物由于组合物的蛋白水解从叶酸脱落。
[0636] 实施例49：FA-CCD1-3xMMAE-AE717、FA-CCD1-3xMMAE-BSRS1-AE713、FA-CCD7-3xMMAE-BSRS4-AE717和相应的非靶向缀合物的体外细胞毒性评价
[0637] 利用叶酸受体阳性的KB细胞系在体外测定中比较FA-CCD1-3xMMAE-AE717、蛋白酶处理和未处理的FA-CCD1-3xMMAE-BSRS1-AE713、蛋白酶处理和未处理的FA-CCD7-3xMMAE-BSRS4-AE717以及相应的非靶向对照CCD1-3xMMAE-AE717、CCD1-3xMMAE-BSRS1-AE713和CCD7-3xMMAE-BSRS4-AE717的细胞毒活性，用于比较影响细胞毒性的能力。KB细胞在无叶酸RPMI加上10％热灭活的胎牛血清(FCS)中生长并进行测定以使细胞培养中的叶酸含量最小化。简言之，KB细胞以1X104铺在96孔微量滴定板的每个孔中，并通过在37℃、5％CO2下温育过夜允许依附在板上。以具有从192nM到81nM的初始浓度范围的4倍连续稀释剂量范围将所有8种蛋白质引入板中。在72h的温育后，根据制造商说明书和光度计上读取的发光信号向每个孔添加CellTiter-Glo试剂；并用GraphPad Prism软件计算IC50。
[0638] 结果：如表44中所示，FA-CCD1-3xMMAE-AE717、FA-CCD1-3xMMAE-BSRS1-AE713和FA-CCD7-3xMMAE-BSRS4-AE717均显示出相似且强力的细胞毒活性，IC50分别为1.41±0.1nM、1.55nM和1.05nM。数据证明，完整CCD和BSRS序列的引入对KB细胞中的体外细胞毒活性无明显影响。正如预期，所有非靶向CCD1-3xMMAE-AE717、蛋白酶切割的非靶向CCD1-
3xMMAE-BSRS1-AE713和蛋白酶切割的非靶向CCD7-3xMMAE-BSRS4-AE717均展现出最小的细胞毒性(IC50>100nM)。有趣的是，蛋白酶处理和未处理的FA-CCD1-3xMMAE-BSRS1-AE713产生等效活性(IC50 1.5nM与1.1±1.7nM)。相似地，蛋白酶处理和未处理的FA-CCD7-3xMMAE-BSRS4-AE717也展现出可比的细胞毒性(IC50 1.05nM与2.4±0.9nM)。
表44：IC50测定
3xMMAE-BSRS1-AE713和蛋白酶切割的非靶向CCD7-3xMMAE-BSRS4-AE717均展现出最小的细胞毒性(IC50>100nM)。有趣的是，蛋白酶处理和未处理的FA-CCD1-3xMMAE-BSRS1-AE713产生等效活性(IC50 1.5nM与1.1±1.7nM)。相似地，蛋白酶处理和未处理的FA-CCD7-3xMMAE-BSRS4-AE717也展现出可比的细胞毒性(IC50 1.05nM与2.4±0.9nM)。
表44：IC50测定
[0639] 结论：数据表明，在所述的实验条件下，XTEN未阻碍叶酸靶向部分与KB细胞上存在的叶酸靶向受体的相互作用。
[0640] 实施例50：H292异种移植模型中BSRS-XTEN864的药代动力学和生物分布分析[0641] 文献中已报道，NCI-H292异种移植拥有成功切割RS3的正确肿瘤环境。所有BSRS PCM均含RS3序列。为了更好地评价并筛选不同BSRS PCM对于体内切割的功效，我们将经由生物分布研究使用NCI-H2892异种移植模型评价BSRS1-XTEN864、BSRS2-XTEN864、BSRS3-XTEN864、BSRS4-XTEN864、BSRS5-XTEN864和BSRS6-XTEN864。将会用两种镧系元素稀土离子正交标记每种携带XTEN864的BSRS和含有XTEN864的非BSRS对照，一种金属在N末端，而另一种金属在BSRS序列紧接的下游。使用6种可获得的稀土金属，每组评价3种缀合物作为混合物。
[0642] 简言之，将携带体积为250-350mm3的NCI-H292肿瘤的雌性SCID小鼠分为6个组，每组3只小鼠，将会用3种缀合物(两种为双标记的BSRS-XTEN864，而一种为双标记的XTEN864对照)的混合物向每组注射。对于组织生物分布分析，在第5天处死3只小鼠。在末端终点处，收获肿瘤、心、肾、肝、肺、脾、胰腺和脑，在PBS中冲洗、吸干、称重并速冻。通过ICP-MS对多个组织中存在的各自金属的量定量，并将数据表示为每g组织注射剂量的百分比(％ID/g)。
[0643] 对于在NCI-H292肿瘤环境中切割的BSRS，在第5天，在肿瘤样品中将仅检测到1种金属(直接与BSRS序列的下游缀合)；由于仅几小时的短半衰期，该BRSR-XTEN864放置在N末端的金属将在5天内消除。对于未被H292肿瘤环境切割的BSRS，将同时检测到两种金属(即放置在N末端和BSRS序列下游)。以这种方式，可鉴别体内功能性BSRS对于靶向-XTEN-药物缀合物中的使用。
[0644] 实施例51：与不同有效负载连接的XTEN的分析型尺寸排阻色谱分析
[0645] 对包含各种治疗蛋白和增加长度的非结构化重组蛋白的融合蛋白进行尺寸排阻色谱分析。示例性的测定使用TSKGel-G4000 SWXL(7.8mm×30cm)柱，其中在20mM磷酸盐(pH 6.8)、114mM NaCl中以0.6ml/min的流速分离浓度为1mg/ml的40μg的纯化胰高血糖素融合蛋白。用OD214nm和OD280nm监测色谱曲线。使用BioRad的尺寸排阻校准标准来进行所有分析的柱校准；分子量标准包括甲状腺球蛋白(670kDa)，牛γ-球蛋白(158kDa)，鸡卵清蛋白(44kDa)，马肌红蛋白(17kDa)和维生素B12(1.35kDa)。根据对所评价的所有构建体的SEC分析，表观分子量、表观分子量因子(用表观分子量与计算分子量的比值表示)和流体动力学半径(RH，以nm计)在表45示出。结果表明，576个氨基酸或更大的不同XTEN的加入赋予融合蛋白以约339kDa至760的表观分子量，并且864个氨基酸或更大的XTEN赋予融合蛋白以大于约800kDA的表观分子量。表观分子量与实际分子量成比例增加的结果符合用来自几个不同基序家族(即，AD、AE、AF、AG和AM)的XTEN构建的融合蛋白增加至少4倍，比例高达约17倍。此外，具有576个氨基酸或更多的XTEN融合配偶体加入具有各种有效负载的融合蛋白(在与Y288融合的胰高血糖素的情况下为288个残基)，导致7nm或者更大的流体动力学半径；远远超出了大约3-5nm的肾小球孔径。向抗Her2的scFv添加3种不同长度的XTEN导致与XTEN的长度增加成比例的表观分子量和流体动力学半径的增加，表明scFv的性质可取决于期望的性质而调节，但具有短至288个氨基酸的XTEN的scFv的流体动力学半径大于肾孔隙大小。因此，相对于相应的未融合生物蛋白或抗体片段，预期包含XTEN的融合蛋白具有降低的肾清除率，有助于增加终末半衰期和提高治疗或生物效应。
表45：对多种多肽的SEC分析
*排除糖基化。
表45：对多种多肽的SEC分析
*排除糖基化。
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