pH/氧化还原双响应磁性纳米载药体系及其构建方法
阅读：68发布：2020-05-08
专利汇可以提供pH/氧化还原双响应磁性纳米载药体系及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种pH/ 氧 化还原双响应 磁性 纳米载药体系及其构建方法，该载药体系是基于介孔 二氧化 硅 纳米粒子 包裹的磁性纳米粒子形成 核壳结构 的纳米颗粒，纳米颗粒的孔道连接上二硫键并负载抗 肿瘤 药物后经酰胺键连接ZnO QD-COOH进行封堵形成的药物转运载体系统。本发明的载药体系为磁靶向，并具有pH响应及GSH响应双重响应，此外，ZnO-QD-COOH在酸性条件下降解成的Zn2+在肿瘤细胞内产生细胞毒性。，下面是pH/氧化还原双响应磁性纳米载药体系及其构建方法专利的具体信息内容。
1.pH/氧化还原双响应磁性纳米载药体系，其特征在于，其是基于介孔二氧化硅纳米粒子包裹的磁性纳米粒子形成核壳结构的纳米颗粒，纳米颗粒的孔道连接上二硫键并负载抗肿瘤药物后经酰胺键连接ZnO QD-COOH进行封堵形成的药物转运载体系统。
2.根据权利要求1所述的载药体系，其特征在于，所述磁性纳米粒子为磁性Fe3O4纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的载药体系，其特征在于，所述抗肿瘤药物为蒽环类抗生素，包括阿霉素、道诺霉素、伊达比星、米托蒽醌或表阿霉素中的一种。
4.根据权利要求2或3所述的pH/氧化还原双响应磁性纳米载药体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过正硅酸乙酯水解成的SiO2在Fe3O4纳米颗粒外层包覆一层SiO2形成Fe3O4@mSiO2核壳结构；
(2)加入正硅酸乙酯和CTAB扩孔后得到MMSN纳米微球；
(3)加入氨水和APTES处理得到含氨基的MMSN-NH2纳米微球；
(4)加入EDC和NHS处理引入醛基得到MMSN-CHO纳米微球；
(5)加入胱胺二盐酸盐经NaOH催化得到含二硫键的MMSN-SS纳米微球；
(6)待加入抗肿瘤药物并成功负载药物得到MMSN-SS@X纳米微球，随后加入ZnO QD-COOH后二硫键经酰胺键连接ZnO QD-COOH得封堵的含药微球MMSN-SS@X-ZnO。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括如下操作：将洗涤好的Fe3O4纳米颗粒分散于一定量的乙醇和蒸馏水混液中，加入氨水，在室温剧烈搅拌下逐滴加入0.06mL TEOS，继续室温下机械搅拌24h；反应结束后，在磁场作用下分离出黑色的磁性纳米微球，依次用去离子水和无水乙醇洗涤3次，以去除多余的反应物，得到Fe3O4@mSiO2核壳结构。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下操作：取350mg CTAB溶于70mL乙醇和70mL蒸馏水混合液中，将磁性纳米微球投入混合液中，加入1.5mL
25％的浓氨水，在室温剧烈搅拌下加入0.2mL TEOS，继续室温下机械搅拌6h；反应完成后，在外加磁场下分离出已经扩孔的磁性纳米微球；用去离子水和无水乙醇洗涤后加入600mg氯化铵的乙醇去离子水混合液在80℃回流1h以去除模板CTAB，得到MMSN纳米微球。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括如下操作：取所得的MMSN纳米微球，加入蒸馏水和乙醇混合液使其粒子分散均匀，加入氨水，室温下机械搅拌
30min之后加入1mL APTES，继续搅拌反应4h，反应结束，分离出磁性纳米粒，用去离子水和乙醇洗涤，得到MMSN-NH2纳米微球。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括如下操作：将0.2g对羧基苯甲醛加入到圆底烧瓶中，然后将30mL的二甲基亚砜(DMSO)加入其中，再加入0.1050g的EDC,HCL和0.1219g NHS，通入氮气10min，在氮气氛围下密闭室温搅拌3h，待对羧基苯甲醛充分活化得活化的对羧基苯甲醛溶液；取MMSN-NH2纳米微球分散在20mL DMSO中，然后慢慢滴加到活化的对羧基苯甲醛溶液中，将混合溶液搅拌过夜(18h)，离心分离收集MMSN-CHO纳米微球。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体包括如下操作：取所得的MMSN-CHO纳米微球，加入15mL无水乙醇，0.0759g的NaOH，再加入40mg胱胺二盐酸盐，在油浴
80℃条件下回流1小时，反应完分别用少量水和乙醇洗涤黑色微球3次，加入适量去离子水使其分散、保存，得MMSN-SS纳米微球。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)具体包括如下操作：向MMSN-SS纳米微球中加入抗肿瘤药物得含药微球MMSN-SS@X；然后将NHS，EDC,HCL分散到DMF得到的混合液中加入ZnO-QD-COOH，放到摇床摇半个小时，将含药微球用磁铁吸附去除上清液，再加2.5ml NHS、EDC,HCL、DMF、ZnO-QD-COOH的混合液后缓慢震摇1h，得到封堵的含药微球MMSN-SS@X-ZnO。
pH/氧化还原双响应磁性纳米载药体系及其构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及纳米治疗技术领域，特别是指一种pH/氧化还原双响应磁性纳米载药体系 及其构建方法，通过温和的化学反应在磁性纳米载体上包裹二氧化硅，经过化学修饰基团 运载抗肿瘤药物并通过ZnO-COOH作为“门控者”构建纳米载药体系。
背景技术
[0002] 癌症是一种致病性极强的破坏性疾病，对人类生命构成严重威胁，而化学疗法仍然是 临床癌症治疗中最广泛的治疗选择。由于传统的抗癌药物无法区分癌细胞和健康细胞，因 此附带损害和不良副作用几乎是不可避免的。现有技术中已经开发了大规模药物递送系 统，例如药物-聚合物缀合物，胶束，脂质体，树状聚合物和无机纳米颗粒，以利用增强 的渗透性和保留力(即被动靶向)并支持位点特异性递送。在这些开发的“智能”DDS中， 介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)引起了极大的关注。它们的独特功能包括可调的粒径和 孔径，高的比表面积，良好的生物相容性等特点而成为强大的药物输送纳米载体。在这些 门控系统中，各种封盖剂(例如纳米颗粒，有机分子和超分子纳米阀)已被用作可以手动 操纵的“守门人”。通过各种刺激，例如氧化还原状态的变化，pH、静电、酶活性、光辐 照、磁激励和电场等改变封盖状态。众所周知，肿瘤和炎性组织的pH值比血液和正常组 织的酸性更高，内体和溶酶体的pH值更低。这激励了我们进行设计可以响应生理病理pH 信号以触发癌细胞中选择性药物释放的纳米载体。
[0003] 研究显示，细胞质及细胞核中谷胱甘肽的含量大约是细胞外液和血液循环中谷胱甘肽 含量的100到1000倍。此外，肿瘤细胞中谷胱甘肽的含量至少是正常细胞的四倍。基于 这些显著地特性，可以将GSH作为细胞内源性刺激物，构建基于GSH刺激响应的药物转 运纳米系统，并用于肿瘤细胞内选择性及特异性药物控制释放。
[0004] 目前己报道的基于GSH刺激响应的药物转运系统往往通过两个巯基间的氧化反应或 者疏基交换反应来形成对GSH敏感的二硫键。然而，这些合成方法既费时又复杂，从而 限制了相关药物转运体系在生物医学领域的应用。因此，发展一种简单、快速的策略用于 结合pH响应、GSH响应和磁响应的药物转运系统有望进一步推进该载药体系在生物医学 领域的应用。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明所要解决的技术问题，就是提出一种pH/氧化还原双响应磁性纳米 载药体系及其构建方法；本发明的pH/氧化还原双响应磁性纳米载体，其是基于介孔二氧 化硅纳米粒子(MSN)包裹的磁性纳米粒子形成核壳结构的纳米颗粒，纳米颗粒的孔道 连接上二硫键并负载抗肿瘤药物后经酰胺键连接ZnO QD-COOH进行封堵形成的药物转 运载体系统。
[0006] 本发明的核壳结构连接的二硫键末端与封堵物-羧基修饰的氧化锌量子点(ZnO QD-COOH)通过酰胺键结合，从而实现化学结合封堵抗肿瘤药物，保护细胞毒性药物免 于过早释放。待药物转运载体系统到达肿瘤区域后，二硫键被肿瘤区域内高表达的谷胱甘 肽(GSH)氧化断裂，同时封堵物ZnO QD-COOH在肿瘤区域的酸性条件下溶解生成Zn2+， 形成“双开关”响应，解除药物封堵作用并释放药物，生成的Zn2+通过导致活性氧(ROS) 生成，炎症激发和细胞死亡而引起细胞毒性。
[0007] 磁响应型纳米药物载体的核心是磁性纳米粒子，相比于其他磁性纳米粒子，磁性 Fe3O4纳米粒子易形成超顺磁性，由于超顺磁性Fe3O4纳米粒子(SPIONs)制作相对简单， 粒径小且易受控制，对正常组织或细胞的毒副作用小，并具有在外部磁场引导作用下能够 靶向定位到特定组织或细胞的能力。
[0008] 所述抗肿瘤药物为蒽环类抗生素，包括阿霉素、道诺霉素、伊达比星、米托蒽醌或表 阿霉素中的一种。
[0009] 本发明基于MSN包裹的Fe3O4，ZnO QD-COOH封堵的新型药物转运系统，结合了 MSN(介孔二氧化硅纳米粒子)、ZnO QD-COOH(接了羧基的氧化锌量子点)和GSH (谷胱甘肽)的优良特性，并用于细胞内GSH刺激响应的药物转运，而ZnO QD-COOH 易于制造，便宜，对酸具有足够的响应性(它们在pH 7.4时稳定，但在pH<5.5时迅速 溶解)，且ZnO QD-COOH不仅可以保护细胞毒性药物免于过早释放，而且它们本身也 可以在目的地释放Zn2+发挥细胞毒性作用。因此，在载有抗癌药物的核壳结构上盖上修 饰后的ZnO QD-COOH盖子具有允许pH触发的药物释放特性，可改善药物的治疗指数并 降低其副作用。
[0010] 磁性纳米粒子Fe3O4颗粒小、比表面积大，还具有超顺磁性的特征，因此可以利用磁 分离技术达到迅速分离的目的。目前该技术已广泛应用于分析检测或用来分离比较复杂的 混合物，但是Fe3O4暴露在空气中极易氧化而使磁性降低，并且磁性粒子由于偶极间相互 作用极易团聚，因此有必要对其表面进行改性。无机SiO2具有无毒、无味、无污染等特 点，且一般微结构呈无定型的絮状或网状结构而使其具有良好的吸附性能，因此通过正硅 酸乙酯水解在磁流体Fe3O4外层包覆一层SiO2，得到Fe3O4@SiO2粒子。
[0011] 为了最大限度地减少药物输送领域的局限性，Fe3O4@SiO2粒子以Fe3O4为核，介孔 纳米SiO2为壳，不仅解决了Fe3O4纳米粒子易团聚和纳米SiO2难分离的问题，还将二者 的优点有效的结合在一起，扩展了Fe3O4和SiO2的应用范围。
[0012] 本发明的pH/氧化还原双响应磁性纳米载药体系的构建方法，包括如下步骤：
[0013] (1)通过正硅酸乙酯水解成的SiO2在Fe3O4纳米颗粒外层包覆一层SiO2形成 Fe3O4@mSiO2核壳结构；具体包括如下操作：将洗涤好的Fe3O4纳米颗粒分散于一定量 的乙醇和蒸馏水混液中，加入氨水，在室温剧烈搅拌下逐滴加入0.06mL TEOS，继续室 温下机械搅拌24h；反应结束后，在磁场作用下分离出黑色的磁性纳米微球，依次用去 离子水和无水乙醇洗涤3次，以去除多余的反应物，得到Fe3O4@mSiO2核壳结构；
[0014] (2)加入正硅酸乙酯和CTAB扩孔后得到MMSN纳米微球；具体包括如下操作： 取350mg CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶于70mL乙醇和70mL蒸馏水混合液中， 将磁性纳米微球投入混合液中，加入1.5mL 25％的浓氨水，在室温剧烈搅拌下加入0.2mL TEOS，继续室温下机械搅拌6h；反应完成后，在外加磁场下分离出已经扩孔的磁性纳 米微球；用去离子水和无水乙醇洗涤后加入600mg氯化铵的乙醇去离子水混合液在80℃ 回流1h以去除模板CTAB，得到MMSN纳米微球；
[0015] (3)加入氨水和APTES处理得到含氨基的MMSN-NH2纳米微球；具体包括如下操 作：取所得的MMSN纳米微球，加入蒸馏水和乙醇混合液使其粒子分散均匀，加入氨水， 室温下机械搅拌30min之后加入1mL APTES，继续搅拌反应4h，反应结束，分离出 磁性纳米粒，用去离子水和乙醇洗涤，得到MMSN-NH2纳米微球；
[0016] (4)加入EDC和NHS处理引入醛基得到MMSN-CHO纳米微球；具体包括如下操 作：将0.2g对羧基苯甲醛加入到圆底烧瓶中，然后将30mL的二甲基亚砜(DMSO) 加入其中，再加入
0.1050g的EDC,HCL和0.1219g NHS，通入氮气10min，在氮气 氛围下密闭室温搅拌3h，待对羧基苯甲醛充分活化得活化的对羧基苯甲醛溶液；取 MMSN-NH2纳米微球分散在20mL DMSO中，然后慢慢滴加到活化的对羧基苯甲醛溶 液中，将混合溶液搅拌过夜(18h)，离心分离收集MMSN-CHO纳米微球；
0.1050g的EDC,HCL和0.1219g NHS，通入氮气10min，在氮气 氛围下密闭室温搅拌3h，待对羧基苯甲醛充分活化得活化的对羧基苯甲醛溶液；取 MMSN-NH2纳米微球分散在20mL DMSO中，然后慢慢滴加到活化的对羧基苯甲醛溶 液中，将混合溶液搅拌过夜(18h)，离心分离收集MMSN-CHO纳米微球；
[0017] (5)加入胱胺二盐酸盐经NaOH催化得到含二硫键的MMSN-SS纳米微球；具体包 括如下操作：取所得的MMSN-CHO纳米微球，加入15ml无水乙醇，0.0759g的NaOH， 再加入40mg胱胺二盐酸盐，在油浴80℃条件下回流1小时，反应完分别用少量水和乙 醇洗涤黑色微球3次，加入适量去离子水使其分散、保存，得MMSN-SS纳米微球；
[0018] (6)待加入抗肿瘤药物并成功负载药物得到MMSN-SS@X，加入ZnO QD-COOH 后二硫键经酰胺键连接ZnO QD-COOH得封堵的含药微球MMSN-SS@X-ZnO，其中X表 示抗肿瘤药物；具体包括如下操作：向MMSN-SS纳米微球中加入抗肿瘤药物得含药微球； 然后将NHS，EDC,HCL分散到DMF得到的混合液中加入ZnO-QD-COOH，放到摇床摇 半个小时，将含药微球用磁铁吸附去除上清液，每根试管加2.5ml混合液；混合溶液缓慢 震摇1h，得到封堵的含药微球在冰箱4℃下保存备用。
[0019] 本发明的Fe3O4是指磁性Fe3O4纳米粒子，其合成过程如下：
[0020] 称取2.69g三氯化铁和0.99g氯化亚铁，与100mL去氧水混溶于500mL三口烧 瓶中，在机械搅拌下，将反应体系升温至80℃并恒温搅拌10min后，在剧烈搅拌下迅 速加入稀释过的25％氨水50mL水，测得pH为10-11，反应30min后停止反应即可 得到磁性四氧化三铁纳米颗粒。将反应液转至烧杯中，在磁场作用下分离出磁性纳米颗粒， 再用去蒸馏水将其洗至中性，最后加适量蒸馏保存并从其中取1mL磁性纳米颗粒于试 管中，用差量法测定其含量。
[0021] 所述封堵物ZnO-QD-COOH合成如下：取0.8130g乙酸锌溶于20mL无水乙醇， 加热至80℃搅拌回流1.5h，冷却至室温后滴加溶于10mL乙醇的0.4592g KOH，并 搅拌1h，加入162μL APTES和250μL的去离子水继续搅拌2h，将反应产物离心后， 弃上清，取白色沉淀分散在DMF中得到ZnO-NH2粒子；进一步地，取0.25g丁二酸酐 溶解于5mL DMF制成反应溶液。取步骤1中合成的ZnO-NH2粒子分散在30mL DMF 转入至三口烧瓶。室温下进行机械搅拌。逐滴加入丁二酸酐溶液，然后继续搅拌反应24 h。反应结束后离心弃上清液，并先用少量DMF洗涤3次，最后用DMF分散保存在试 管中得到羧基氧化锌。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0023] 本发明提供的pH/氧化还原双响应磁性纳米载药体系为磁靶向，并具有pH响应及 GSH响应双重响应，所述磁靶向是指利用外加磁场来引起磁性纳米粒子的移动，pH响应 是利用肿瘤细胞相比正常细胞pH值低，当含药载体到达癌细胞组织时，其酸性的微区环 境(pH＝5.8)使得封盖剂“gatekeeper”降解断键，“gate”打开，从而药物释放出来；由于谷 胱甘肽(GSH)在肿瘤区域的高度表达能够降解二硫键化合物(-S-S-)从而释放抗癌药 物，通过一系列细胞实验监测材料的细胞毒性与定位情况，且随着药物浓度递增发现细胞 凋亡量增强，这种新颖的双重响应的药物控释体系对于癌症的治疗具有潜在的应用价值； 此外，ZnO-QD-COOH在酸性条件下降解成的Zn2+在肿瘤细胞内产生细胞毒性。附图说明
[0024] 图1为DNM、MMSN-SS-DNM、MMSN-SS@DNM-ZnO的紫外光谱图；
[0025] 图2为DNM、MMSN-SS-DNM、MMSN-SS@DNM-ZnO的红外光谱图；
[0026] 图3为本发明中磁性纳米载体的制备过程中各阶段产物的Zeta电位图；
[0027] 图4为本发明磁性纳米载体的磁性分散效果图；
[0028] 图5为自然光和荧光下的ZnO QD-COOH在pH 7.4和pH 5.6条件下的状态图；
[0029] 图6为ZnO OD-COOH、MMSN-SS@ZnO-COOH及MMSN-SS的紫外吸收光谱图；
[0030] 图7为ZnO OD-COOH、MMSN-SS@ZnO-COOH在340nm的紫外激发光下纳米粒子 的荧光发射光谱图；
[0031] 图8为带药的纳米载体在不同条件刺激下的缓释率曲线图；
[0032] 图9为带药的纳米载体在不同介质下的DNM释放效果图；
[0033] 图10为不同浓度的带药载体MMSN-SS@DNM-ZnO、不带药载体本身MMSN和 DNM、ZnO和Zn2+对于细胞存活率的影响；
[0034] 图11为血液相容性实验中不同浓度的带药载体与红细胞悬液混合的溶血照片；
[0035] 图12为光学显微镜下不同载药浓度对于细胞形态变化图；
[0036] 图13为不同浓度的载药纳米粒子在细胞内的荧光强度示意图；
[0037] 图14为本发明的磁性纳米载体系统普鲁士蓝染色后的显微镜照片；
[0038] 图15为磁靶向试验中0h和24h的培养皿中有磁场区域及对侧无磁场区域照片；
[0040] 图17为活性氧检测试验中荧光显微镜下空白组和给药组的细胞状态照片；
[0041] 图18流式细胞仪下检测到的不同加药浓度下的线粒体膜电位检测图；
[0042] 图19为不同MMSN-SS@DNM-ZnO浓度下细胞生长周期图；
[0043] 图20为荧光显微镜在不同浓度的DNM、MMSN-SS@DNM-ZnO条件下检测到的细 胞凋亡图；
[0044] 图21为定量评估由MMSN-SS@DNM-ZnO诱导的细胞凋亡过程图。
具体实施方式
[0045] 为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进 一步的说明。
[0046] 本发明中涉及的药物简称如下：
[0047] DNM：道诺霉素、APTES：3-氨丙基三乙氧基硅烷、EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐、NHS：N-羟基丁二酰亚胺、DMF：N,N-二甲基甲酰胺、TEOS：硅 酸四乙酯、FBS：胎牛血清、MTT：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐、 DMSO：二甲基亚砜。
[0048] 抗肿瘤药物的pH/氧化还原双响应磁性纳米载体的构建方法，包括如下步骤：
[0049] 步骤(1)：取200mgFe3O4纳米颗粒用蒸馏水洗2-3次，将洗涤好的Fe3O4纳米颗 粒分散于140mL乙醇和60mL蒸馏水的混液中，加入1.5mL氨水，在室温剧烈搅拌 下逐滴加入0.06mL TEOS，继续室温下机械搅拌24h。反应结束后，在磁场作用下分离 出黑色的磁性纳米微球。用烧杯装起，依次用去离子水和无水乙醇洗涤3次，以去除多 余的反应物，得到Fe3O4@mSiO2核壳结构。
[0050] 步骤(2)：取350mg CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶于70mL乙醇和70mL 蒸馏水混合液中，并超声溶解，将磁性纳米微球投入混合液中，加入1.5mL 25％的浓氨水， 在室温剧烈搅拌下逐滴慢慢加入0.2mL TEOS，继续室温下机械搅拌6h。在外加磁场下 分离出已经扩孔的磁性纳米微球，并洗涤产物(水和乙醇1：1洗两遍)，用溶有600mg 的氯化铵的100ml乙醇和40ml的超纯水分散，加热至80℃回流1h去除模板CTAB，， 得到MMSN纳米微球；
[0051] 步骤(3)：取所得的MMSN纳米微球，加入蒸馏水和乙醇混合液使其粒子分散均 匀，加入氨水，室温下机械搅拌30min之后加入1mL APTES，继续搅拌反应4h，反 应结束，分离出磁性纳米粒，用去离子水和乙醇洗涤，得到MMSN-NH2纳米微球。
[0052] 步骤(4)：将0.2g对羧基苯甲醛加入到圆底烧瓶中，然后将30mL的二甲基亚砜 (DMSO)加入其中，再加入0.1050g的EDC,HCL和0.1219g NHS，通入氮气10min， 在氮气氛围下密闭室温搅拌3h，待对羧基苯甲醛充分活化得活化的对羧基苯甲醛溶液； 取MMSN-NH2纳米微球分散在20mL DMSO中，然后慢慢滴加到活化的对羧基苯甲醛 溶液中，将混合溶液搅拌过夜(18h)，离心分离收集MMSN-CHO纳米微球。
[0053] 步骤(5)：取所得的MMSN-CHO纳米微球，加入15ml无水乙醇，0.0759g的NaOH， 再加入40mg胱胺二盐酸盐，在油浴80℃条件下回流1小时，反应完分别用少量水和 乙醇洗涤黑色微球3次，加入适量去离子水使其分散、保存，得MMSN-SS纳米微球。
[0054] 步骤(6)：向MMSN-SS纳米微球中加入抗肿瘤药物道诺霉素(DNM)，成功负载 药物后得含药微球MMSN-SS@DNM；然后将NHS，EDC,HCL分散到DMF得到的混合 液中加入ZnO-QD-COOH，放到摇床摇半个小时，将含药微球MMSN-SS@DNM用磁铁 吸附并去除上清液，再加入2.5ml NHS、EDC,HCL、DMF、ZnO-QD-COOH的混合液， 并缓慢震摇1h，得到封堵的含药微球MMSN-SS@DNM-ZnO在冰箱4℃下保存备用。
[0055] 所述封堵物ZnO-QD-COOH合成如下：
[0056] 步骤1：取0.8130g乙酸锌溶于20mL无水乙醇，加热至80℃搅拌回流1.5h， 冷却至室温后滴加溶于10mL乙醇的0.4592g KOH，并搅拌1h，加入162μL APTES 和250μL的去离子水继续搅拌2h，将反应产物离心后，弃上清，取白色沉淀分散在DMF 中，得到ZnO-NH2粒子；
[0057] 步骤2：进一步地，取0.25g丁二酸酐溶解于5mL DMF制成反应溶液。取步骤1 中合成的ZnO-NH2粒子分散在30mL DMF转入至三口烧瓶。室温下进行机械搅拌。逐 滴加入丁二酸酐溶液，然后继续搅拌反应24h。反应结束后离心弃上清液，并先用少量 DMF洗涤3次，最后用DMF分散保存在试管中。
[0058] 实施例1MMSN-SS@DNM-ZnO纳米体系的制备和表征
[0059] 1.MMSN-SS固载DNM及ZnO OD-COOH成功封堵上纳米颗粒的实验研究
[0060] 分别取10ug DNM、MMSN-SS-DNM、MMSN-SS@DNM-ZnO与干燥的溴化钾混合 充分研磨成细粉烘干后进行压片，将压片烘干后放入傅立叶变换红外光谱仪中检测其红外 光谱，波数范围是4000cm-1-400cm-1。
[0061] 2.对所研究的MMSN-SS@DNM-ZnO的结构、表面形态和大小进行了研究。
[0062] 扫描电子显微镜(TEM)，DLS粒径和zeta电位分析仪获得它们的尺寸分布和表面 电荷。
[0063] 紫外吸收光谱结果如图1所示，DNM在480nm处有吸收峰，而纯载体无吸收峰，载 药纳米粒子在480nm处有紫外吸收峰，证明药物已固载上去。
[0064] 红外吸收光谱结果如图2所示，-S-S已成功接上MMSN，纳米复合物已成功载药。
[0065] 载体整个制备过程中各阶段产物的Zeta电位结果如图3所示，结合图6所示的荧光 强度对比表明ZnO-COOH已成功封堵上了MMSN-SS。
[0066] 纳米载体的磁性测试结果如图4所示：纳米复合物有良好的磁性分散性。
[0067] 将pH 7.4和pH 5.6条件下的ZnO QD-COOH放置在365nm荧光下和自然光下。如 图5a所示，自然光下，pH 7.4条件下的ZnO QD-COOH溶液呈乳白色，pH 5.6条件下的 ZnO QD-COOH溶液呈澄清透明。如图5b所示，结合荧光光谱，在pH 7.4条件下的ZnO QD-COOH有荧光
2+
产生，而pH 5.6条件下的ZnO QD-COOH溶解为Zn ，无荧光。
2+
产生，而pH 5.6条件下的ZnO QD-COOH溶解为Zn ，无荧光。
[0068] ZnO OD-COOH、MMSN-SS@ZnO-COOH及MMSN-SS的紫外吸收光谱如图6所示，ZnO QD-COOH(图中简写为ZnO)在342nm处有紫外吸收，MMSN-SS@ZnO-COOH在 344nm处有吸收峰，如图7所示为ZnO OD-COOH、MMSN-SS@ZnO-COOH在340nm的 紫外激发光下纳米粒子的荧光发射光谱图，显示为ZnO OD-COOH和 MMSN-SS@ZnO-COOH的特征发射光谱图。其中样品ZnO OD-COOH在521nm处的荧 光发射峰最强,MMSN-SS@ZnO-COOH在530nm处的荧光发射峰最强，ZnO QD-COOH 由于具有极小的粒径和较高的比表面积，故存有大量的扩O2-/O-缺陷，从而导致可见荧 光的产生。样品MMSN-SS@ZnO-COOH除了荧光强度有所减弱外，仍然保留了ZnO OD-COOH的荧光特性。这可能是由于接上磁流体后引起纳米载体表面能量损失或有机基 团引起荧光淬灭所致。荧光发射光谱分析结果表明，该纳米载体可以被用来跟踪监控药物 的运输。
[0069] 实施例2带药纳米载体MMSN-SS@DNM-ZnO在不同条件刺激下的缓释实验[0070] 为了验证纳米载体复合物在不同pH、不同浓度GSH和不同浓度DTT刺激条件下药 物释放情况，将载药后的纳米粒子分别溶解在相同体积不同浓度，分别在 0h,1h,2h,4h,6h,12h,24h取缓释后的上清液测紫外后算出缓释率，结果见图8。可以明显看 出药物在酸性条件下的释放率强于中性条件下的释放率，很好的反应了药物具有pH响应， 此外药物在相同pH条件下在高浓度的GSH或DTT环境下释放更多，很好的说明了药物 有氧化还原响应，并且在双重刺激环境中(pH5.0同时有还原剂GSH)，随着GSH浓度 逐渐增加24小时的药物累积释放也逐渐上升，这说明酸性和还原性的协同作用下载药磁 流体显示了双重响应性，这个特点对于癌症细胞的智能化靶向治疗是十分重要的。
[0071] 作为细胞内源性刺激响应控制释放系统，有必要对该带药的纳米载体系统在不同介质 下的DNM释放情况进行考察。结果如图9所示，说明该带药的纳米载体系统对GSH具 有专一性的响应。
[0072] 实验例3细胞实验
[0073] 细胞培养
[0074] 细胞系A549细胞(人肺癌细胞)获自广东药科大学基础学院。以含有10％FBS、1％ 青霉素-链霉素的DMEM培养基作为生长环境，于37℃、5％CO2，最适湿度条件下在细 胞培养箱中培养，2-3天更换培养基并传代一次，最后选择状况良好的处于对数生长期细 胞用于实验。
[0075] 细胞活力测定—MTT实验
[0076] 使用MTT测定法测定A549细胞在游离DNM、MMSN-SS@DNM-ZnO、MMSN存 在下的细胞活力。取对数期生长状况良好的A549细胞，分别用0.25％胰酶消化成单细 胞悬液，血球计数板进行细胞计数后，用完全培养基调节细胞密度为2×104cell/ml，分 别接种于96孔板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h；细胞贴壁后， 除培养基，每组每孔加入含有DNM、MMSN-SS@DNM-ZnO、MMSN样品的培养基100 μl，设置5个浓度，每个浓度设置5个复孔，培养箱中培养。在培养结束前4h，吸出板 中含药物的培养基，加入含有10％MTT的培养基100μl，继续培养4h，结束后弃上清， 每孔再加入150μl DMSO，轻微震荡反应10min，使结晶颗粒充分溶解，置酶标仪上于 490nm波长处测定OD值。
[0077] 计算细胞增殖抑制率，存活率＝(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％。将存活 率与药物浓度作图，得出剂量反应曲线，通过SPSS软件根据药物浓度和细胞存活率计算 得出相应细胞株的IC50值，即半数抑制有效浓度。
[0078] Drug DNM MMSN-SS@DNM-ZnOIC50 1.1379ug/ml 2.1086ug/ml
[0079] 如图10所示，为不同浓度的带药载体MMSN-SS@DNM-ZnO和DNM(图10a)、 不带药载体本身MMSN(图10b)对于细胞存活率的影响，说明其细胞毒性。
[0080] 上述数据说明了MMSN-SS@DNM-ZnO载药体系对A549肿瘤细胞有很好的抑制作 用，且载体MMSN-SS具有良好的生物相容性。图10b关于MMSN的生物相容性的图例， 是为了证明载体本身对细胞无毒性作用。
[0081] 此外为了了解ZnO溶解为Zn2+是否具有细胞毒性作用，取相同浓度的ZnO与ZnCl2进行MTT实验，如图10c所示，Zn2+和氧化锌对于细胞存活率的影响结果曲线，证明相 同浓度下的Zn2+相比ZnO具有细胞毒性作用，当ZnO在酸性条件下溶解为Zn2+时可杀死 肿瘤细胞。
[0082] 血液相容性实验
[0083] 分别以去离子水和生理盐水作为阳性和阴性对照，向浓度为0.1mg/ml，0.5mg/ml， 0.8mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，2.5mg/ml的载体各加入2.5ml 2％红细胞悬液，测定OD值， 计算出溶血率，并观察拍下溶血现象。结果如图11所示，显示加有磁流体的试管上清液 淡黄色，而加入超纯水的试管发生了溶血现象，且根据溶血率得知磁流体的溶血率小于医 用材料的溶血率5％，证明载体可安全用于医疗。
[0084] 光学显微镜和流式细胞仪测试细胞摄取
[0085] 于显微镜下观察培养的细胞，选取生长良好，处于对数生长期的细胞进行实验，使用 0.25％的胰蛋白酶消化贴壁的细胞，消化完成后使用完全培养液重悬。计数后，将细胞 接种至12孔板，每孔加入细胞量为8000-10000个。待细胞铺满80％后加入IC50值附近 五个药物浓度梯度的含药完全培养液继续培养24h，用PBS洗去未被完全摄入的纳米粒 子，显微镜下观察细胞形态。取消化后的细胞用PBS洗三次后放入流式管，用流式细胞 仪进行分析。如图12所示，随着药物浓度递增，加药细胞逐渐变亮变圆形态萎缩且数量 明显减少，这是细胞死亡的特征，而空白组24H后形态正常且细胞数量有明显增加，此 外，由于DNM在MMSN-SS@DNM-ZnO纳米粒子里会荧光淬灭，只有释放出来的DNM 才能显示出荧光。所以我们通过流式细胞分析仪得到如图13a，然后根据流式图通过flowjo 软件得出荧光图13b，结果显示，随着载药纳米粒子药物浓度递增，荧光强度相比空白组 增强。对照在光学显微镜下定性分析细胞形态变化，反映药物可以被肿瘤细胞摄取且随着 载药浓度递增细胞毒性越强。
[0086] 普鲁士蓝染色
[0087] 磁性纳米粒子在细胞中的摄取可以通过普鲁士蓝染色实验来验证，将A549细胞接种 于6孔板中，培养24h待细胞贴壁后空白对照组加入正常培养基，实验组加入含有浓度 为2μg/ml的MMSN-SS@DNM-ZnO的培养基培养12h。除上清，用PBS清洗三次，用 4％多聚甲醛溶液在4℃条件下固定30min，再次用PBS洗去固定液。然后按照1:1比例 加入5％亚铁氰化钾(II)三水合物溶液和5％HCl加入到每个孔里，37℃孵育1h，然后 用中性红染液进行复染30s，最后用PBS洗三次，光学显微镜拍照记录。结果如图14所 示，实验组细胞中有出现蓝色颗粒。这证明了MMSN-SS@DNM-ZnO能够很好的进入细 胞中。
[0088] 磁靶向性研究
[0089] 将A549细胞接种于60mm2培养皿中培养贴壁后，加入DNM浓度为2ug/ml的 MMSN-SS@DNM-ZnO。为了进行磁靶向研究，将一块磁铁(约4T)放在培养皿的一侧 下面。孵育24h后，对培养皿中有磁场区域及对侧无磁场区域进行拍照记录。结果如图 15所示，磁靶向区的细胞形态有变化，并且能看到明显的磁性纳米微球聚集，这说明在 外部磁场作用下MMSN-SS@DNM-ZnO磁性纳米体系可以局部富集，达到可控被动靶向 治疗的目的。
[0090] 细胞划痕实验-细胞迁移
[0091] 将A549细胞以每孔5×105个细胞的密度接种在6孔板中的培养基中，过夜培养24h 后，除去上清。在6孔板底部的单层细胞上用10μl无菌白色枪头进行划线，用PBS洗 去划痕过程中脱落的细胞。用含有MMSN-SS@DNM-ZnO的培养基培养48小时，用光学 显微镜记录0h、24h同一位置划痕的变化。结果如图16所示，随着时间的推移，加药组 与空白组相比细胞迁移面积减少，MMSN-SS@DNM-ZnO表现出了对细胞迁移的抑制作 用。
[0092] 活性氧检测
[0093] 为了进一步研究MMSN-SS@DNM-ZnO纳米载药体系在细胞内是否产生ROS，我们 分别通过荧光显微镜进行验证。细胞培养如上所述，将A549细胞接种于6孔板中，待细 胞贴壁后，分别加入含有MMSN-SS@DNM-ZnO的培养基，培养箱中孵育6h，按照碧云 天试剂盒说明装载荧光探针并孵育20min。用预冷的PBS洗三次，然后向每孔中加适量 PBS，荧光显微镜拍照如图17所示，通过空白组和给药组的对比，可以看到在荧光显微 镜白光下细胞状态良好，并且加药组细胞里面有些小黑点，这是纳米粒子在细胞里面，从 而可以说明纳米粒子进入了细胞或者附着在细胞的表面。未加药组细胞能产生微弱的绿色 荧光，而加药组则有明显的绿色荧光，同时通过重合的图明显发现，绿色荧光在细胞里面， 说明纳米粒子在细胞里面可以产生活性氧。
[0094] 线粒体膜电位检测
[0095] 于显微镜下观察培养的细胞，选取生长良好，处于对数生长期的细胞进行实验，使用 0.25％的胰蛋白酶消化贴壁的细胞，消化完成后使用完全培养液重悬。计数后，将细胞接 种至96孔板，每孔加入细胞量为8000-10000个。待细胞铺满80％后加入含药完全培养液 继续培养24h。加药浓度为IC50浓度附近两个浓度，每个浓度的药物加8个副孔，包括 留空白对照和阳性对照孔。首先，使用CCCP处理阳性对照孔中的细胞，降低阳性对照 的线粒体膜电位水平，20min。然后吸去所有孔的培养基，使用PBS清洗一遍。加入JC-1 探针，于37℃避光反应30min。反应完成后吸去染液，使用JC-1染色缓冲液清洗两遍后 加入适量无血清培养液，使用荧光酶标仪检测。根据如图18所示的线粒体膜电位荧光酶 标仪数据，通过线粒体所发绿色荧光和红色荧光的不同比例即可获知线粒体膜电位的大 小。
[0096] 经过纳米粒子处理以后的线粒体膜电位相对于未处理空白组及阳性对照组降低，且药 物浓度越高，线粒体膜电位下降越明显。且细胞往右偏，JC-1由聚合物向单体方向转变， 证明载药纳米粒子可以降低肿瘤细胞线粒体膜电位从而诱导细胞死亡。据此可以初步推测 纳米粒子以线粒体途径引发了细胞凋亡。
[0097] 细胞周期检测
[0098] 取对数期生长的细胞，用胰酶进行消化1-2min,用移液枪吹打成细胞悬液，用血球计 数板进行计数，以1.0×106个每孔的细胞加入到六孔板中，将细胞在37℃，5％CO2的培 养箱中常规培养24h后，取出6孔板，吸去培养基，无菌PBS洗2遍，加入不同浓度 MMSN-SS@DNM-ZnO；空白对照组加新鲜培养液。六孔板继续培养24h后；移去含有 MMSN-SS@DNM-ZnO纳米粒子的培养基，弃去培养基，用PBS清洗几次，加入含ETDA 胰酶进行消化2min,再移除胰酶，加入之前收集的细胞培养液，轻轻的吹打至细胞全部脱 落，在把这些悬浮液进行收集到离心管中进行例行5min,然后吸取离心后的上清液,加入1 ml冷的70％的乙醇，轻轻的进行吹打混匀后，放在4℃冰箱里面固定24h,然后取出离心， 吸取细胞上清液，加入1mL冷的PBS进行重悬，然后再次离心，吸取上清液，用手指轻 轻的弹试管底部，让其分散均匀，最后每管加入0.5ml PI染色液染色，让其充分与细胞重 悬，37℃条件下避光孵育30min后，可进行流式检测。
[0099] 如图19a所示，空白细胞组G0/G1期比例为40.76％，S期比例为29.35％，G2/M期的 比例为29.9％，如图19b所示，MMSN-SS@DNM-ZnO(药物浓度为1uM)在细胞组G0/G1期比例为11.15％，S期比例为55.06％，G2/M期的比例为33.78％，如图19c所示， MMSN-SS@DNM-ZnO(药物浓度为2uM)在细胞组G0/G1期比例为6.4％，S期比例为 51.4％，G2/M期的比例为
42.2％，与空白对照组相比，MMSN-SS@DNM-ZnO主要将A549 细胞阻滞在了S和G2/M期，且随着药物浓度递增，阻滞效果更强。
42.2％，与空白对照组相比，MMSN-SS@DNM-ZnO主要将A549 细胞阻滞在了S和G2/M期，且随着药物浓度递增，阻滞效果更强。
[0100] 荧光显微镜及流式细胞仪测细胞凋亡
[0101] 在对数期生长的细胞，将入胰酶消化1-2min,用移液枪轻轻的吹打细胞，制成悬浮液， 用血球计数板进行计数，以1.0×106个每孔的细胞密度接种到6孔板中，将细胞在37℃， 5％CO2的培养箱中常规培养24h后，取出6孔板，吸去培养基，无菌PBS洗2遍，加入 不同浓度的DNM和载药纳米微球培养24h后，吸取培养基，用PBS清洗三遍，每个空 中加上0.5ml Hoechst 33258染色液，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养20-30min,弃染 色液，用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。
[0102] 取对数期生长的细胞，用胰酶进行消化1-2min,用移液枪吹打成细胞悬液，用血球计 数板进行计数，以1.0×106个每孔加入到六孔板中，将细胞在37℃，5％CO2的培养箱中 常规培养24h后，取出6孔板，吸去培养基，无菌PBS洗2遍，分别加入 MMSN-SS@DNM-ZnO，在空白对照组中加入新鲜培养液，培养24h后；用移液枪将细 胞培养液吸入离心管中，再用PBS清洗2次，加入含有EDTA的胰酶进行消化1min,吸 出胰酶，加入之前收集的培养液，轻轻吹打细胞，再收齐至离心管中，用PBS进行清洗， 然后离心弃掉上清，每个离心管依次加入195μl Annexin V-FITC的结合液和5μl Annexin V-FITC和10ul的PI,轻轻地混匀，室温条件下避光孵育20min，随后避光放在 冰浴中，孵育过程可以进行重悬3次以便改善染色效果，随即进行流式检测。
[0103] 如图20所示，在不同浓度(0.5ug/mL,1ug/mL和1.5ug/mL)下的游离DNM、 MMSN-SS@DNM-ZnO对细胞的影响。药物处理24小时后，对照组细胞核完整，染色质 分布均匀，呈现出淡蓝色微弱荧光。而在游离DNM、MMSN-SS@DNM-ZnO组中，随着 药物浓度的不断增大，蓝色亮点越来越多，细胞中可观察到大量细胞出现染色荧光加强、 核染色质浓缩并偏向一侧呈月牙形的典型细胞凋亡现象，凋亡的细胞越来越多，表明药物 具有剂量依赖性。
[0104] 为了定量评估由MMSN-SS@DNM-ZnO诱导的细胞凋亡过程，我们采用Annexin V/PI 双染色法进行了流式检测。如图21所示，左下象限是正常活细胞(Annexin V-/PI-)；左 上象限是机械损伤坏死的细胞(Annexin V-/PI+)；右下象限是早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)；右上象限(Annexin V+/Pl+)是晚期凋亡细胞与坏死细胞。由上图可知随着药 物浓度的递增，早凋和晚凋数目增多，且细胞机械损伤较少；可知随着药物浓度的递增， 早凋和晚凋数目增多，且细胞机械损伤较少。
[0105] 上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉 本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理 应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领 域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围 之内。
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