技术领域
[0001] 本
发明属于
半导体加工技术领域，具体地讲，涉及一种微流控芯片及其制作方法。
背景技术
[0002] 循环
肿瘤细胞(CTCs)作为癌症转移的重要标志，在癌症早期由病灶处产生，经外周血液向其他器官扩散的肿瘤细胞。灵敏地从外周血液细胞中发现CTCs的存在对于早期肿瘤的诊断、
预防有重要意义。高纯度、高效率的捕获并有效分析CTCs有望进一步了解肿瘤的形成机理进而从根源上阻止病变的发生。然而，由于循环肿瘤细胞的稀有性(1/107)，大量杂质细胞必将成为其高效、高纯分离和捕获过程中的障碍，如何从杂质细胞中得到目标细胞(即循环肿瘤细胞)成为现代医疗诊断的关键。
[0003] 目前已有许多用于分离和捕获的方法能够将CTCs从血细胞中分离出来。其中一种是利用免疫
磁珠法在
磁场的作用下实现细胞分离和捕获；另一种是微流控技术，不同于免疫磁珠法，微流控技术得益于微加工技术的发展，其能够将分离捕获的过程微型化，实现对细胞培养、转移、分离与捕获等过程一步化，进而实现对单个细胞的操控。
[0004] 由于具有高灵敏、高效率、低成本等特点，微流控技术逐渐应用于CTCs的分离与捕获中来。常用的微流控技术依赖于目标细胞区别于其他细胞的一种或多种特征(
生物或物理特征)进行分离和捕获。
[0005] CTCs区别于其他血液细胞的物理特征包括细胞的大小及
变形能
力等。利用CTCs体积较大、变形能力弱的特点制成的微型筛、微流道等结构在一定程度上满足了高效分离的要求。CTCs的生物特性包括
蛋白质表达、突变性质、生存能力等，其中利用细胞表面蛋白与其特异性
抗体的结合的
免疫吸附法实现细胞高效分离的技术得到广泛应用。该方法充分利用了微流控芯片中流道
比表面积较大的特点，使与细胞表面蛋白连接的抗体的数量增多，靶向细胞能够与流道表面形成可靠的特异性的连接从而留在细胞表面，而不能与表面形成有力的连接的非靶向细胞则随
流体流出，分离成功。
[0006] 免疫吸附：高度特异性的
抗原、抗体或有特定物理化学亲和力的物质(配体)与吸附材料(载体)之间的吸附。免疫磁珠法基于细胞表面抗原与连接在磁珠上的特异性的抗体连接，在外磁场的作用下，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，而无抗原的细胞被分离。
[0007] 此外，许多研究者将多种方法集合在同一芯片上。例如：结合磁珠法，其利用包覆抗体的微磁珠与细胞特异性结合，其中，当细胞通过分离区时，在磁场作用下使连接有磁珠的靶向细胞与未连接磁珠的非靶向细胞分离，这种方法可在连续流体中实现高效分离且灵敏度较高；利用
流体力学与免疫法相结合，其中，流体运动增加了细胞与流道
亲和性分子的
接触机会，同时流体的剪切力使非靶向细胞从表面脱离，从而提高了捕获效率和捕获纯度。
[0009] 一、在免疫磁珠法中，分离和捕获过程复杂，分离成本高；并且批量处理使用的样品量较大，分离效率较低。此外，免疫磁珠法需要对细胞进行预处理，细胞在转移过程中不可避免的造成了细胞损失，对于稀有细胞来说可能影响到检测结果。再者，在免疫磁珠法中，虽使用
荧光染料对不同细胞进行区别，但由于细胞污染严重，对细胞识别、技术及细胞分析不利。
[0010] 二、现有的仅通过物理方法进行分离的微流控技术由于细胞在大小、变形等物理特征上没有明显差别，甚至部分特征区域重合，分离的纯度往往较低，仍需要对细胞进一步捕获以得到特定细胞，而且只能针对一种或特定几种细胞有效，对其他分离对象需要重新设计，增加了设计及制造成本。而筛状结构对细胞活性损害较大，且常常会造成应为堵塞而造成结构失效。
[0011] 三、现有的将流体力学与免疫吸附相结合的微流控芯片，流体的剪切力破坏了非靶向细胞与流道表面的接触、增加纯度的同时，大大缩短吸附反应的时间，使得吸附的效率下降。
[0012] 综上，在实际应用中，根据实验目的需要权衡纯度与效率的重要性，很难找到能够同时满足高效率和高纯度的流体剪切力，即在满足捕获高效率的同时有低纯度的特点。
[0013] 因此，现有技术有待改进和发展。
发明内容
[0014] 为了解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种微流控芯片，其包括：
基板；在所述基板上的插齿
电极；在所述基板上且
覆盖所述插齿电极的绝缘层；在所述绝缘层中且与所述插齿电极电接触的电极片；在所述绝缘层上的
图案化粘结件，其中，所述粘结件上图案形成流道结构；在所述图案化粘结件上用盖板封闭以完成流道构型，其中，所述盖板中具有进孔和出孔，所述进孔和所述出孔均与所述流道结构连通。
[0015] 进一步地，所述开口的数量为两个，所述出孔的数量为一个，其中，两个所述开口设置于所述盖板的一端，所述出孔设置于所述盖板的另一端。
[0016] 进一步地，所述插齿电极由
氧化铟
锡制成。
[0017] 进一步地，所述电极片由金属制成以接通电源并
保护电极。
[0018] 进一步地，所述盖板由聚二甲基
硅氧烷制成。
[0019] 本发明的另一目的还在于提供一种微流控芯片的制作方法，其包括：提供一基片；在所述基板上形成插齿电极；在所述基板上形成覆盖所述插齿电极的绝缘层；在所述绝缘层中形成与所述插齿电极电接触的电极片；在所述绝缘层上形成图案化的粘结件形成流道结构；在所述图案化的粘结件上形成封闭所述流道结构的盖板；其中，所述盖板中具有与所述流道结构连通的进孔和出孔。
[0020] 进一步地，利用打孔工艺在所述盖板的一端形成两个所述开口，且在所述盖板的另一端形成一个所述出孔。
[0021] 进一步地，在所述基板上形成插齿电极的具体方法包括：在所述基板上形成氧化铟锡层；对所述氧化铟锡层进行
光刻、
刻蚀工艺，以形成所述插齿电极。
[0022] 进一步地，在所述绝缘层中形成与所述插齿电极电接触的电极片的具体方法包括：在所述绝缘层中形成通孔；其中，所述通孔将所述插齿电极的电极端口暴露；在所述通孔中填充金属，以形成与所述电极端口电接触的电极片。
[0023] 本发明的有益效果包括：
[0024] 一、将生物分子间亲和性吸附捕获细胞与介
电泳原理相结合，模拟细胞在生理溶液中的液体环境，利用负向介电泳力克服细胞亲和性捕获过程中非特异性吸附力对吸附结果的干扰，在保存了对靶向细胞亲和性吸附的高效性同时，也减少了非靶向细胞的吸附，提高分离吸附细胞高纯度的特点；
[0025] 二、细胞吸附过程简单，操作容易，对设备要求不高，捕获的成本较低，且不需对细胞样品进行复杂预处理，避免细胞损失；
[0026] 三、采用图案化的粘结件形成流道，制作方便、成本低廉；直流道设计，为提高通量，可大量集成，大大减小分离吸附速度；
[0027] 四、产生介电泳力的微型电极的制作过程简单，可根据不同的流道结构设计电极结构，改变
电场的分布；介电泳力的作用距离有限，不会对干扰其他捕获方法的实施，易于与其他捕获方法结合，达到更好的捕获效果；
[0028] 五、分离的过程所用的交流电
电压较小，且流体一直处于流动状态，避免了流体中的电效应对细胞活性的损害，对细胞培养、蛋白检测等后续检测有利。
附图说明
[0029] 通过结合附图进行的以下描述，本发明的
实施例的上述和其它方面、特点和优点将变得更加清楚，附图中：
[0030] 图1是根据本发明的实施例的微流控芯片的立体图；
[0031] 图2a至图2f是根据本发明的实施例的微流控芯片的制作
流程图；
[0032] 图3是根据本发明的实施例的产生介电泳力的原理图；
[0033] 图4是根据本发明的实施例的交流电
频率与细胞所受介电泳特性曲线图；
[0034] 图5是根据本发明的实施例的细胞在受介电泳力作用情况下轨迹示意图；
[0035] 图6是根据本发明的实施例的齿电极的电场强度的分布模拟图；
[0036] 图7是根据本发明的实施例的利用微流控芯片进行实验的示意图。
具体实施方式
[0037] 以下，将参照附图来详细描述本发明的实施例。然而，可以以许多不同的形式来实施本发明，并且本发明不应该被解释为限制于这里阐述的具体实施例。相反，提供这些实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够理解本发明的各种实施例和适合于特定预期应用的各种
修改。
[0038] 首先，对以下的描述中即将用到的名词进行必要的解释：
[0039] 介电泳(Dielectrophoresis，DEP)：中性微粒在非均匀电场作用下发生极化而产生移动的现象。介电泳力的大小与物体的大小、电学性质、周围介质的电学性质及外加电场的场强梯度、频率有关。当溶液较微粒更易极化时，微粒将向着电场较弱的区域移动，这种现象叫做负向介电泳(negative dielectrophoresis，n-DEP)。
[0040] 循环肿瘤细胞(CTCs)：存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。
[0041] 上皮细胞吸附分子(EpCAM)：大多数CTCs细胞膜表达的一种跨膜蛋白，在人上皮肿瘤细胞中高度表达，常见的CTCs捕获配体。
[0042] 在本发明中，将介电泳原理加入到利用生物分子亲和性捕获的微流控芯片中，利用介电泳力克服吸附过程中的非特异性吸附力，从而提高捕获的纯度，具体请阅读以下的实施例。
[0043] 图1是根据本发明的实施例的微流控芯片的立体图。图2a至图2f是根据本发明的实施例的微流控芯片的制作流程图。在图1中，为了便于图示，未示出绝缘层和电极片。
[0044] 参照图1和图2a，提供一基板10。在本实施例中，基板10可例如是玻璃基板，但本发明并不限制于此。
[0045] 参照图1和图2b，在基板10上形成插齿电极20。这里，在基板10上形成插齿电极20的具体方法包括：首先，在基板10上形成一层氧化铟锡膜层；其次，对该氧化铟锡膜层进行光刻、刻蚀工艺，以形成插齿电极20。
[0046] 在本实施例中，插齿电极20包括间隔排列的多个齿电极21以及连接多个齿电极21且延伸形成电极端口22，但本发明并不限制于此。
[0047] 参照图1和图2c，在基板10上形成覆盖插齿电极20的绝缘层30。在本实施例中，绝缘层30有
二氧化硅材料制成，但本发明并不限制于此。
[0048] 参照图1和图2d，在绝缘层30中形成与插齿电极20电接触的电极片40。这里，在绝缘层30中形成与插齿电极20电接触的电极片40的具体方法包括：首先，利用光刻、刻蚀工艺在绝缘层30中形成通孔31；其中，该通孔31将插齿电极20的电极端口22暴露；其次，在通孔31中填充金属，以形成与电极端口22电接触的电极片40。
[0049] 在本实施例中，利用金和铬填充通孔31，以形成电极片40；但本发明并不限制于此，例如也可以采用
铝等金属填充通孔31。
[0050] 参照图1和图2e，在绝缘层30上形成图案化的粘结件50；其中，该粘结件50具有中空结构51。在本实施例中，粘结件50为
胶带，其厚度约为100μm，但本发明并不限制于此。
[0051] 参照图1和图2f，在粘结件50上形成封闭中空结构51的盖板60，以形成图案化流道结构；其中，盖板60中具有与中空结构51连通的进孔和出孔。在本实施例中，盖板60由聚二甲基硅氧烷(PDMS)
固化成型而成。
[0052] 在本实施例中，优选地，利用打孔工艺在盖板60的一端形成第一进孔61和第二进孔62，并且利用打孔工艺在盖板60的另一端形成一个出孔63。需要说明的是，在本发明中，盖板60中进孔和出孔的数量并不以图示所示为限，其可以根据实际需求设置。
[0053] 根据本发明的实施例的微流控芯片利用生物亲和性分子之间的特异性连接来捕获细胞，其针对CTCs亲和性捕获应用，选择大多数CTCs表面表达的上皮细胞吸附分子的抗体(Anti-EPCAM antibody)来处理基板10，即通过上皮细胞吸附分子(EpCAM)与其抗体之间的亲和性连接提供细胞捕获的特异性力。然而，在微流控芯片中，细胞与吸附表面不可避免的存在对细胞没有选择性的非特异吸附力，这种非特异吸附力造成了部分非靶向细胞的吸附，从而降低了吸附的纯度。
[0054] 为了消除非靶向细胞的吸附，在基板10上利用微加工方法形成微型插齿电极20，当在插齿电极20上施加一定大小的交流电时，由封闭的中空结构51形成的流道内形成非均匀电场，细胞在非均匀电场的作用下发生极化，产生介电泳力FDEP，其原理图如图3所示。根据FDEP的计算公式： 其中，εm、r分别为溶液
介电常数、细胞半径，为Clausius-Mossotti factor(CM因子，方向因子，与细胞及溶液极化特性、交流电频率有关)，如图4所示反应了细胞在不同介质溶液中方向因子与施加交流电频率的关系，其中，横坐标为交流电频率f(单位为Hz)，纵坐标为介电泳力方向因子，σ溶液表示溶液的介电常数，σ细胞表示细胞的介电常数。CM因子大于0，FDEP为正向，细胞将由低电场区域向高电场区域移动，即正向介电泳(positive dielectrophoresis，p-DEP)；而当CM因子小于0，FDEP为负向，细胞由高电场区域向低电场区域移动，即n-DEP；CM因子为0时，电
信号频率为临界频率，细胞不受介电泳力。
[0055] 在大多数具有高导电率的生理溶液(血液、唾液、尿液等)及细胞培养液中，细胞受到负向介电泳作用(negative-DEP，n-DEP)，即在高电导率溶液中细胞受到介电泳力的作用由高电场的区域向低电场区域移动。利用这一特性，根据本发明的实施例通过在基板10表面设置插齿电极20将高电场区域布置在流道表面，而将低电场区域布置的远离流道表面，细胞将受到背离流道表面的介电泳力以克服流道表面存在的非特异性的吸附力，不同细胞的受力及运动轨迹如图5所示，其中，受到较强的特异性的亲和性吸附力的靶向CTCs将留在流道内，而没有稳定的、足够大的吸附力的非靶向细胞将随流体流出流道。最终，CTCs的捕获纯度提高。
[0056] 根据介电泳原理可知，需要对微流控芯片调节的参数主要包括：所加电压的大小及频率、电极宽度及电极间距。这些参数将影响电场的空间分布。根据所分离的细胞的大小、靶向细胞与流道表面亲和性连接强弱等调节各参数。在本实施例中，电场分布的模拟主要由Ansoft Maxwell
软件完成，如图6所示，齿电极21宽度10um、齿电极21之间的间距40um、交流电电压大小5V时流道中的电场分布。在图6中，纵坐标表示电场强度(V/m)，其中，区域1的电场强度范围为2.0792e+002～1.4331e+004，区域2的电场强度范围为1.4331e+004～2.8453e+004，区域3的电场强度范围为2.8453e+004～4.2576e+004，区域4的电场强度范围为4.2576e+004～5.6698e+004，区域5的电场强度范围为5.6698e+004～8.4944e+004，区域
6的电场强度范围为8.4944e+004～1.5558e+005。区域7的电场强度范围为1.5558e+005～
1.6968e+005。细胞在接近电极表面时，将受到介电泳力，由区域3向区域2、区域1移动。
[0057] 图7是根据本发明的实施例的利用微流控芯片进行实验的示意图。
[0058] 参照图7，注射
泵100用于定量注射样品或缓冲液，信号发生器200用于提供合适的交流电，
显微镜300用于实时观察与检测，样品或缓冲液流出微流控芯片最终被废液管400收集处理，详细步骤如下：
[0059] 首先，启动
注射泵100将缓冲液由第一进孔61(或第二进孔62)推入由封闭的图案化粘结件50形成的流道内，
对流道进行清洗并排出流道中的气泡；
[0060] 接着，气泡排出后打开信号发生器200，信号发生器200提供
电信号，将细胞样品从第二进孔62(或第一进孔61)推入由封闭的中空结构51形成的流道内，观察细胞吸附情况；
[0061] 接着，细胞样品注射完成后，由第一进孔61(或第二进孔62)继续注射适量缓冲液以去除未吸附细胞；
[0062] 最后，整个过程结束之后，对由封闭的中空结构51形成的流道内内细胞计数。
[0063] 在本实施例中，细胞捕获的实施过程简单，由于电压较小且流体一直处于流动状态，电场对细胞活性的影响较小，捕获后的细胞仍保持活性，可进行其他检测。
[0064] 综上所述，根据本发明的实施例，具有以下优点：
[0065] 一、将生物分子间亲和性吸附捕获细胞与介电泳原理相结合，模拟细胞在生理溶液中的液体环境，利用负向介电泳力克服细胞亲和性捕获过程中非特异性吸附力对吸附结果的干扰，既保存了亲和性吸附的高效性，也得到了吸附细胞高纯度的特点；
[0066] 二、细胞吸附过程简单，操作容易，对设备要求不高，捕获的成本较低，且不需对细胞样品进行复杂预处理，避免免细胞损失；
[0067] 三、产生介电泳力的微型电极的制作过程简单，可根据不同的流道结构设计电极结构，改变电场的分布；介电泳力的作用距离有限，不会对干扰其他捕获方法的实施，易于与其他捕获方法结合，达到更好的捕获效果；
[0068] 四、采用图案化的粘结件形成图案化流道结构，制作方便、成本低廉；直流道设计，为提高通量，可大量集成，大大减小分离吸附速度；
[0069] 五、分离的过程所用的交流电电压较小，且流体一直处于流动状态，避免了流体中的电效应对细胞活性的损害，对细胞培养、蛋白检测等后续检测有利。
[0070] 虽然已经参照特定实施例示出并描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解：在不脱离由
权利要求及其等同物限定的本发明的精神和范围的情况下，可在此进行形式和细节上的各种变化。
