霞樱叶绿体基因组及其应用
阅读：1045发布：2020-06-23
专利汇可以提供霞樱叶绿体基因组及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 首次公开了霞樱的叶绿体基因组，并将其应用于霞樱的系统发育研究中，解析了霞樱在李属中的系统发育地位。本研究利用分子系统学和系统发育基因组学方法，通过叶绿体基因组建立樱亚属物种的系统发育关系，在此 基础 上，利用叶绿体全基因组作为樱亚属的一个超级DNA 条形码 ，用于 鉴别 樱花品种，为樱花种质资源的保护、物种鉴定提供技术 支撑 ，对于典型樱亚属 植物 的育种以及遗传多样性评价、保护与利用具有重要意义。，下面是霞樱叶绿体基因组及其应用专利的具体信息内容。
1.霞樱叶绿体基因组，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的霞樱叶绿体基因组在鉴定霞樱品种中的应用。
3.权利要求1所述的霞樱叶绿体基因组在重建李属系统发育树中的应用。
4.一种霞樱品种鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括：
(1)采用mCTAB法提取样品总DNA提取；
(2)对提取的总DNA进行双末端测序；
(3)叶绿体基因组拼接和组装；
(4)将组装好的样品叶绿体基因组核苷酸序列与霞樱的叶绿体基因组核苷酸序列进行比对，当其相似指数达到99.9％以上时，才确定为霞樱。
5.根据权利要求4所述的霞樱品种鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述叶绿体基因组拼接和组装的方法具体为：
(1)利用SPAdes 3.6.1软件对高通量测序数据进行de novo组装，k-mer参数设置为95；
(2)基于已经公开发表的樱花叶绿体基因组序列作为参考序列，利用Sequencher软件从组装的数据中挑选出属于叶绿体基因组的片段，进行初步组装；
(3)利用Geneious软件，将初步组装的结果与原始序列进行比对，确定序列的位置，完成叶绿体基因组的拼接和组装，并进行人工校对；
(4)使用Plann和Sequin软件完成叶绿体基因组的注释和校对，从而获得完整的霞樱叶绿体基因组，利用在线软件DOGMA绘制叶绿体基因组注释图。
霞樱叶绿体基因组及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因技术领域，具体涉及霞樱叶绿体基因组及其应用。
背景技术
[0002] 随着社会的发展，人类对生物多样性的探索、生物资源的合理利用和物种的快速鉴定的需求日益迫切，DNA条形码技术应运而生。最初，DNA条形码是指用于物种鉴定的一段标准的DNA序列。DNA条形码之父Hebert等使用线粒体细胞色素氧化酶亚基1(cytochrome oxidase I，COI)基因的一个长约680bp的片段成功鉴定了两百种鳞翅目的昆虫物种，并首次提出DNA片段作为区分物种，类似于条形码区分商品的DNA条形码这一概念。每个物种都具有区别于其它物种的DNA序列，这是DNA条形码技术的基本原理。因此，通过样本的DNA序列与参考序列库进行比对，即可鉴定样品属于哪个物种。
[0003] 随着研究的不断深入，DNA条形码的概念由最初单一序列的常规DNA条形码发展到基因组水平超级条形码。虽然目前有众多学者提出了各种用于植物鉴定的DNA条形码，但是由于常规条形码的长度短，信息量有限，导致对近期分化的物种鉴别能力欠佳。如果使用叶绿体全基因组序列作为超级DNA条形码来鉴定物种，可能可以显著提高鉴别效率，尤其是亲缘关系较近的物种，这方面已经有不少有益的尝试。
[0004] 被子植物的叶绿体基因组是环状双链，可进行独立的复制和转录。叶绿体基因组大多为母系遗传，结构保守，漫长的进化历程已经使它与线粒体基因组和核基因组形成统一体，共同保持物种的独特性，从而提供物种的系统发育分析信息。
[0005] 植物常规的DNA条形码序列除了少部分为核DNA外，其它大多来自于叶绿体DNA。叶绿体基因组比核基因组小，有较高的种间差异和较低的种内差异。与常规的DNA条形码相比，叶绿体全基因组作为物种鉴定的超级DNA条形码，能提供更多的变异位点和遗传信息，分辨力更强。有学者认为植物叶绿体全基因组包含的变异位点和动物中COI基因的鉴别能力相当。
[0006] DNA条形码技术的核心目的是确定未知样本所属的物种，可用于需要知道生物物种的任何领域，如药用植物鉴定、生态评估、生物多样性检测、生物安全检测和保护生物学研究等。目前，DNA条形码目前已广泛于物种分类、资源保护、系统进化和生物多样性等研究等领域。
[0007] 在分子层面上，对典型樱亚属的系统发育关系的全面研究仍然匮乏。先前的研究者大多是运用常规的分子标记，对属内个别种的种间关系进行了研究，标记类型有RFLP(曹东伟等，2007)、RAPD(Z.Zamani et al.，2012；Cai et al.，2007)、SSR(S.Kato et al.，2012；李苗苗，2009)等，但由于研究涉及的种较少，且常规分子标记分辨率较低，无法建立起系统发育关系。之后，石硕(2013)利用15个叶绿体片段和3个核基因片段对36个樱亚属物种进行系统发育关系重建，结果显示有2个得到较高支持的单系分支，一支包括欧洲酸樱桃(C.vulgaris)、豆樱(C.incisa)、山樱花(C.serrulata)和苦樱桃(C.emarginata)，另一支较为分散，包括了宾州樱桃(C.pensylvanica)、圆叶樱桃(C.mahaleb)、C.eminens和草原樱桃(C.fruticosa)、欧洲甜樱桃和微毛樱桃(C.clarofolia)，余下的26个物种又被分为3支，但多数分枝支持率较低，发育信号不足，重建的系统发育关系可信度较低。至此，典型樱亚属仍未建立起完整且可信度高的系统发育关系，原因可能是：(1)典型樱亚属物种快速的辐射分化及物种形成导致种间基因组变异较少；(2)典型樱亚属物种种间杂交加剧了基因组复杂度，有限的分子标记或基因片段无法有效分辨种间关系(Shi et al.，2013)。因此，在植物资源收集完善的前提下，获取更多的基因变异信息，即系统发育信号，是研究典型樱亚属系统发育关系的必要条件。
[0008] 霞樱(Prunus verecunda)是原产于韩国和日本的一种落叶阔叶树，其叶片秋季变为红褐色或深红色，花朵为白色到淡粉色。霞樱被认为是山樱花-红山樱复合群的一部分，但由于该复合群内物种形态上过于相似，使得山樱花-红山樱复合群的物种划分一直未能得到合理解决。因此，我们组装霞樱的叶绿体基因组，分析其系统发育地位，对今后樱属植物的保护、系统发育和育种等方面的研究具有重要意义。目前霞樱叶绿体基因组的研究还属于空白。
发明内容
[0010] 为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
[0011] 本发明的目的之一在于提供霞樱叶绿体基因组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012] 本发明的目的之二在于提供霞樱叶绿体基因组在鉴定霞樱和/或重建李属系统发育树中的应用。
[0013] 本发明还公开了一种霞樱品种鉴定方法，所述鉴定方法包括：
[0014] (1)采用mCTAB法提取样品总DNA提取；
[0015] (2)对提取的总DNA进行双末端测序；
[0016] (3)叶绿体基因组拼接和组装；
[0017] (4)将组装好的样品叶绿体基因组核苷酸序列与霞樱的叶绿体基因组核苷酸序列进行比对，当其相似指数达到99.9％以上时，才确定为霞樱。
[0018] 具体地，步骤(3)所述叶绿体基因组拼接和组装的方法具体为：
[0020] (2)基于已经公开发表的樱花叶绿体基因组序列作为参考序列，利用Sequencher软件从组装的数据中挑选出属于叶绿体基因组的片段，进行初步组装；
[0021] (3)利用Geneious软件，将初步组装的结果与原始序列进行比对，确定序列的位置，完成叶绿体基因组的拼接和组装，并进行人工校对；
[0022] (4)使用Plann和Sequin软件完成叶绿体基因组的注释和校对，从而获得完整的霞樱叶绿体基因组，利用在线软件DOGMA绘制叶绿体基因组注释图。
[0023] 具体方法如下：
[0024] 霞樱的新鲜叶片采自日本长野县西岳国有林场，北纬N36°38′13.45″，东经E138°12′46.63″，之后被储存于-80℃条件下。采用mCTAB(modified cetyltrimethyl ammonium bromide)法提取叶片DNA，用超声波打断总DNA，切胶回收400-600bp的DNA片段，利用的建库试剂盒构建500bp大小的DNA文库，在Illumina Hiseq 4000 PE150 Platform(Illumina，San Diego，CA)进行双末端测序，获取2x 150bp的双端片段；保证每个个体的测序深度不低于30×(不少于10Gb数据)。利用SPAdes软件进行de novo组装，利用Sequencher(v5.4)软件从组装的数据中挑选出属于叶绿体基因组的片段，之后再利用Geneious(R10.2.3)软件将这些片段进行了拼接和组装，最后使用Plann和Sequin软件完成了叶绿体基因组的注释和校对，从而获得完整的霞樱叶绿体基因组。
[0025] 霞樱的叶绿体基因组大小为157，917bp，总GC含量为36.7％；包含一对26，437bp大小的反向重复序列，GC含量为42.5％；一个大小为19，121bp的小单拷贝区域，GC含量为30.2％；一个大小为85，922bp的大单拷贝区域，GC含量为34.6％。整个叶绿体基因组总共有
129个基因得到注释，包含84个蛋白编码基因，37个转运RNA基因，8个核糖体RNA基因。在这些基因中，大多数基因都是单拷贝基因，除此之外，6个蛋白编码基因，7个转运RNA基因和4个核糖体RNA基因是寡拷贝基因。
129个基因得到注释，包含84个蛋白编码基因，37个转运RNA基因，8个核糖体RNA基因。在这些基因中，大多数基因都是单拷贝基因，除此之外，6个蛋白编码基因，7个转运RNA基因和4个核糖体RNA基因是寡拷贝基因。
[0026] 为了研究霞樱的系统发育位置，我们将得到的霞樱叶绿体基因组和从NCBI网站下载到的18个李属物种的叶绿体基因组进行比对，利用PhyloSuite软件中的最大似然法运行程序对比对结果进行系统发育树重建。通过ModelFinder软件，基于BIC(Bayesian information criterion)筛选最佳模型为GTR+F+R4。结果显示，测试样品中所有樱亚属物种聚为一支，其分化节点的自展支持率为100。
[0027] 本发明具有如下优点：
[0028] 本发明首次公开了霞樱的叶绿体基因组，并将其应用于霞樱的系统发育研究中，解析了霞樱在李属中的系统发育地位。该研究结果对今后李属物种的育种和保护具有重要意义。
[0029] 本研究利用分子系统学和系统发育基因组学方法，通过叶绿体基因组建立樱亚属物种的系统发育关系，在此基础上，利用叶绿体全基因组作为樱亚属的一个超级DNA条形码，用于鉴别樱花品种，为樱花种质资源的保护、物种鉴定提供技术支撑，对于典型樱亚属植物的育种以及遗传多样性评价、保护与利用具有重要意义。附图说明
[0030] 图1是霞樱叶绿体基因组注释图；
[0031] 图2是基于叶绿体基因组的李属系统发育树；
[0032] 图3是标本B的叶绿体基因组与霞樱的叶绿体基因组核苷酸序列比对图；
[0033] 图4是基于标本B叶绿体基因组重建的系统发育树。
具体实施方式
[0034] 下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0035] 如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0036] 如无特殊说明，本发明采用的各种试剂以及材料均能从市场上购买。
[0037] 1、提取样品的总DNA
[0038] 本发明采用mCTAB法对样品的总DNA进行提取，mCTAB法即一种改良的CTAB法技术提取DNA，这种提取方法提取成本低，提取效果稳定，获得的DNA质量较高(李金璐等，2013)。实验步骤如下：
[0039] 将霞樱的干燥叶片材料分别放入2.0mL的离心管中，用镊子将其中不易研磨的部分(如叶梗)剔除，每管各加入适量的石英砂和一至两颗氧化锆珠子，置于震荡研磨仪中以每秒28～29次的震荡速度打磨叶片至细小粉末状。
[0040] 向研磨好的材料中加入1.5mL的buffer A溶液(现加1％的PVP，络合多酚和萜类物质，去除多糖)以去除大部分的次生代谢产物，冰浴约10min，其间充分颠倒混合离心管几次，使溶液与材料粉末均质混匀。4℃下10000g离心8min后，弃掉上清。重复该步骤一次。
[0041] 在沉淀中加入800μL的65℃预热的3％的CTAB(buffer B)溶液(现加2％的PVP和0.5％的β-巯基乙醇，β-巯基乙醇抑制多酚等物质的氧化反应)以促进细胞的裂解和防止DNA氧化，将沉淀混匀后置于65℃水浴锅中1h，其间每隔10min左右轻柔的颠倒混匀溶液。
[0042] 常温10000g离心8min后，用移液枪吸取上层水相清液(约800μL)至另一个新的2.0mL离心管中，加入800μL的CI溶液洗脱蛋白，轻柔颠倒或用摇床混合5mi，重复该步骤一次。
[0044] 取出冰箱中的离心管，4℃下10000g离心8min后，缓慢倾倒离心管弃去上清液，依次加入200μL的ddH2O，50μL的5M的NaCl溶液和750μL冰冷的95％乙醇，充分混合后4℃下10000g离心8min。离心后缓慢倾倒离心管弃去溶液，倒置于干燥的纸上控干液滴。
[0045] 加入1000μL 70％的乙醇，弹起沉淀，离心8min。轻柔弃上清，重复该步骤一次。
[0046] 用真空干燥机干燥抽干残留的乙醇，加70μL的TLE溶液溶解DNA，37℃室温环境静置30mins后置于-20℃冰箱保存备用。提取时采用的试剂配方见表1。
[0047] 表1试剂配方
[0048]
[0049] 2.测序方法
[0050] 用超声波打断总DNA，切胶回收400-600bp的DNA片段，利用 的建库试剂盒构建500bp大小的DNA文库，在Illumina Hiseq 4000 PE150 Platform(Illumina，San Diego，CA)进行双末端测序，获取2x 150bp的双端片段；保证每个个体的测序深度不低于30×(不少于10Gb数据)。
[0051] 3.数据分析方法
[0052] 利用SPAdes 3.6.1软件对高通量测序数据进行de novo组装，k-mer参数设置为95；
[0053] 基于已经发表的樱花叶绿体基因组序列作为参考序列，利用Sequencher(v5.4)软件从组装的数据中挑选出属于叶绿体基因组的片段，进行初步组装；
[0054] 利用Geneious(R10.2.3)软件，将初步组装的结果与原始reads进行mapping，完成叶绿体基因组的拼接和组装，并进行人工校对；
[0055] 使用Plann和Sequin软件完成了叶绿体基因组的注释和校对，从而获得完整的霞樱叶绿体基因组，利用在线软件DOGMA(Dual Organellar Genome Annotator)绘制叶绿体基因组注释图，见图1。
[0056] 结果：霞樱的叶绿体基因组大小为157，917bp，总GC含量为36.7％；包含一对26，437bp大小的反向重复序列，GC含量为42.5％；一个大小为19，121bp的小单拷贝区域，GC含量为30.2％；一个大小为85，922bp的大单拷贝区域，GC含量为34.6％。整个叶绿体基因组总共有129个基因得到注释，包含84个蛋白编码基因，37个转运RNA基因，8个核糖体RNA基因。
在这些基因中，大多数基因都是单拷贝基因，除此之外，6个蛋白编码基因，7个转运RNA基因和4个核糖体RNA基因是寡拷贝基因。
在这些基因中，大多数基因都是单拷贝基因，除此之外，6个蛋白编码基因，7个转运RNA基因和4个核糖体RNA基因是寡拷贝基因。
[0057] 表2霞樱叶绿体基因组的注释基因信息
[0058]
[0059] (×2)Indicates duplicated genes in IR regionsa Indicates genes containing a single intronb Indicates genes containing two introns[0060] 4.系统发育分析方法
[0061] 将组装好的样品叶绿体基因组与GenBank上下载的已公布的18个李属物种叶绿体基因组序列(表3)合并，利用MAFFT(v7)软件进行序列比对，通过BioEdit软件对数据进行手工调整。
[0062] 表3 GenBank中18个李属物种叶绿体基因组序列情况
[0063]
[0064]
[0065] 通过ModelFinder软件，基于BIC(Bayesian information criterion)标准筛选最佳模型；利用PhyloSuite软件中的IQ-TREE模块，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)，自展值设置5000次重复，进行系统发育树重建，得到基于叶绿体基因组的李属系统发育树(图2)。结果显示，测试样品中所有樱亚属物种聚为一支，其分化节点的自展支持率为100。
[0066] 4、樱花品种分子鉴定方法
[0067] 由于樱花品种众多，很多品种之间相似性比较高，其基因差异也不算太大，因此比较难以区分，由于樱花种之间相似度较大，考虑种差异，根据经验并且在经过多次试验总结出，当被试样品的叶绿体基因组与超级DNA条形码的核苷酸序列(该种的叶绿体基因组)进行比对，当其相似指数达到99.9％以上时，才认为是与这个种匹配的序列。
[0068] 本试验对于对从某标本馆采集到的疑似霞樱的标本B进行鉴定，具体步骤如下：
[0069] (1)样品总DNA提取：mCTAB法；
[0070] (2)测序方法：Illumina Hiseq PE150进行双末端测序；
[0071] (3)叶绿体基因组拼接和组装：具体步骤同数据分析方法；
[0072] (4)将将组装好的被试标本B的叶绿体基因组与超级DNA条形码的核苷酸序列进行比对，利用Geneious(R10.2.3)软件的pairwise alignment功能进行比对，发现标本B叶绿体基因组长度为157924bp，与超级条形码157917bp相似指数为99.99％，如图3，可判断该标本B物种来自于超级条形码对应的物种。
[0073] 将标本B的叶绿体基因组与超级DNA条形码的核苷酸序列，以及Prunus persica、Prunus mume、Prunus padus、Prunus serotina、Prunus subhirtella var.subhirtella、Prunus yedoensis、Prunus pseudocerasus、Prunus serrulate var.spontanea、Prunus maximowiczii、Prunus takesimensis序列合并，利用MAFFT(v7)软件进行序列比对，通过BioEdit软件对数据进行手工调整。通过ModelFinder软件，基于BIC(Bayesian information criterion)标准筛选最佳模型；得出最佳模型为TVM+F+I。
[0074] 利用PhyloSuite软件中的IQ-TREE模块，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)，自展值设置5000次重复，进行系统发育树重建。
[0075] 如图4所示，被试标本B与超级DNA条形码Prunus verecunda聚在一起，其分化节点的自展支持率为100。系统发育分析也证明了被试标本B是霞樱。
[0076] 本实施例提供的分子鉴定方法在应用到樱花物种鉴定时，检测结果准确，特异性好；具有操作简单、检测效率高、检测精准、重复性好的特点。
[0077] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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