海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用
阅读：163发布：2024-02-14
专利汇可以提供海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了海州常山干旱胁迫下 荧光 定量内参基因及其专用引物和应用，该荧光定量内参基因为Actin、AP‑2和RAN基因，其中，Actin基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示，AP‑2基因的基因序列如SEQ ID NO.13所示，RAN基因的基因序列如SEQ ID NO.6所示。本发明通过从转录组数据以及前人研究的内参基因中筛选出表达较为稳定的候选基因，通过 软件 对其 稳定性 进行评估，公开了3个适合于海州常山干旱胁迫下表达最稳定的内参基因，并用这些基因为 基础 设计了实时荧光定量PCR引物，填补了海州常山干旱胁迫下没有内参基因的现状，为海州常山干旱胁迫下相关功能基因的精确定量提供有 力 支持，可提高研究的稳定性、重复性和可靠性。，下面是海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用专利的具体信息内容。
1. 海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因，其特征在于，为Actin、AP-2和RAN基因，其中，Actin基因的基因序列如SEQ ID NO .1所示，AP-2基因的基因序列如SEQ ID NO .13所示，RAN基因的基因序列如SEQ ID NO .6所示。
2.权利要求1所述的海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，其特征在于，Actin基因的引物序列如下：
Actin正向引物5’-CGATTCTTGCTTCCCTCAGTA-3’
Actin反向引物5’-ACCATTTTCGCCGCCTTA-3’；
AP-2基因的引物序列如下：
AP-2正向引物5’-CCACAACTAACGCCTCCACC-3’
AP-2反向引物5’-AAATTCACCCTCCGACTCCC-3’；
RAN基因的引物序列如下：
RAN正向引物5’-GGAGACGACAGTTTGGGTGC-3’
RAN反向引物5’-TGCCATACTTGCGGGTGAA-3’。
3.权利要求1所述的海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因在海州常山荧光定量中的应用。
4.权利要求2所述的海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因的专用引物在海州常山荧光定量中的应用。
海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用
技术领域
[0002] 海州常山(Clerodendrum trichotomum Thunb.)又名臭梧桐，马鞭草科(Verbenaceae)大青属(Clerodendrum L.)落叶灌木或小乔木，较耐旱，耐盐碱性较强，有一定耐寒性，极少病虫害，适应性强。此外花形奇特美丽，花期长，果实色彩鲜艳且秋冬经久不落，是优良的秋季观花、观果树种。现有的研究结果表明，海州常山不仅具有非常优良的耐盐碱能力，还有较强的耐早性，是一种对不良环境具有较强抗性的优良园林植物。现在关于海州常山干旱胁迫下基因的研究还未曾有报道。探究海州常山干旱胁迫情况下基因表达的差异的研究过程中，涉及到运用实时荧光定量技术分析和验证基因的表达水平就需要稳定可靠的内参基因，因此筛选海州常山干旱胁迫条件下稳定表达的内参基因是实时荧光定量结果准确的关键因素。
发明内容
[0003] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明目的在提供适于海州常山干旱胁迫条件下的内参基因，该基因能够满足实时荧光定量检测海州常山转录表达水平的要求，提高了海州常山基因表达分析研究的稳定性、可靠性和效率。本发明的另一目的是提供一种上述内参基因的专用引物。本发明还有一目的是提供一种上述内参基因或专用引物的应用。
[0004] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] 海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因，为Actin、AP-2和RAN基因，其中，Actin基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示，AP-2基因的基因序列如SEQ ID NO.13所示，RAN基因的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
[0006] 所述的海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，Actin基因的引物序列如下：
[0007] Actin正向引物5’-CGATTCTTGCTTCCCTCAGTA-3’
[0008] Actin反向引物5’-ACCATTTTCGCCGCCTTA-3’。
[0009] 所述的海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，AP-2基因的引物序列如下：
[0010] AP-2正向引物5’-CCACAACTAACGCCTCCACC-3’
[0011] AP-2反向引物5’-AAATTCACCCTCCGACTCCC-3’。
[0012] 所述的海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，RAN基因的引物序列如下：
[0013] RAN正向引物5’-GGAGACGACAGTTTGGGTGC-3’
[0014] RAN反向引物5’-TGCCATACTTGCGGGTGAA-3’。
[0015] 所述的海州常山干旱胁迫下荧光定量内参基因在海州常山荧光定量中的应用。
[0016] 所述的Actin基因的引物序列在海州常山荧光定量中的应用。
[0017] 所述的AP-2基因的引物序列在海州常山荧光定量中的应用。
[0018] 所述的RAN基因的引物序列在海州常山荧光定量中的应用。
[0019] 本发明通过GeNorm、NormFinder和BestKeeper这三个软件对17个内参进行基因稳定性评价，综合软件分析结果，筛选出在干旱胁迫条件下稳定表达的内参基因。共获得三个稳定表达内参基因分别为Actin、AP-2和RAN。
[0020] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过海州常山的转录组测序库，并参考了常用的内参基因，设计出了适用于海州常山干旱胁迫下的内参基因，同时揭露了这些内参基因序列，并依此设计了实时荧光定量引物，不仅解决了现有海州常山检测中没有内参基因的现状，而且所设计的实时荧光定量引物用于海州常山基因表达分析时引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测海州常山基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。附图说明
[0022] 图2是17个候选内参基因的Ct值；
[0023] 图3是GeNorm确定用于准确定量分析最优的内参基因数目；
[0024] 图4是GeNorm软件对17个候选内参基因表达稳定值(M)排序，稳定值越低，基因表示越稳定结果图；
[0025] 图5是应用ClNHX1验证所筛选出的内参基因结果图。
具体实施方式
[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0027] 以下实施例所使用的主要供试材料为：采用种植于南京林业大学白马基地的泰安种源、盐城种源。采集组织材料植株插穗进行扦插，基质使用珍珠岩∶蛭石∶泥炭∶沙子＝1∶1∶1∶2，栽于培养室(25℃，60％RH)，定期浇灌养护，保证正常生长。胁迫处理均在人工气候培养箱(宁波东南仪器有限公司)中完成，昼夜温度及时间设定为25℃/21℃和13h/11h，湿度为60％RH，光强为100001ux。待需要进行干旱胁迫处理时，将海州常山扦插苗移栽于不含糖、琼脂、有机物及碳源的1/4MS培养基，每瓶加入150mL的培养基，每5天更换一次培养基，适应一个月。进行干旱胁迫时，在培养基中加入15％PEG，并于0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h采集海州常山的嫩叶。叶片均采自于从上至下数2-4对叶片，每次采样均有三个生物学重复，样品用液氮速冻，在-80℃下保存。
[0028] 实施例1
[0029] 1、植物组织总RNA提取及cDNA的合成
[0030] 用EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒(艾德莱生物技术有限公司)提取总RNA，用分光光度计(梅特勒-托利多集团)检测RNA浓度和质量，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测总的完整性。利用北京全式金反转录试剂盒(全式金生物技术有限公司)，按说明书进行RNA的纯化和合成cDNA第一条链。
[0031] 2、内参基因的选择及引物的设计
[0032] 根据文献查询其他植物中主要的内参基因并最终设计出本实施例所需的17个内参基因，分别为Actin(SEQ ID NO.1)、PP2A(SEQ ID NO.2)、RPL(SEQ ID NO.3)、PK(SEQ ID NO.4)、18S(SEQ ID NO.5)、RAN(SEQ ID NO.6)、APT(SEQ ID NO.7)、SAND(SEQ ID NO.8)、PROF(SEQ ID NO.9)、MDH(SEQ ID NO.10)、EF-1A(SEQ ID NO.11)、UBC-E2(SEQ ID NO.12)、AP-2(SEQ ID NO.13)、HSP70(SEQ ID NO.14)、TUA(SEQ ID NO.15)、UBQ(SEQ ID NO.16)、H3(SEQ ID NO.17)。首先在本申请人已经获得的海州常山转录组数据库中寻找各候选基因的保守序列，根据基因保守序列用Primer Premier 5.0设计引物，再用Oligo7进行分析。引物(表1)均在南京金斯瑞公司合成，通过普通PCR初步筛选引物，利用琼脂糖胶和凝胶成像系统观察PCR产物的条带，检测产物特异性。选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物，近一步通过RT-qPCR进一步检测引物特异性，选择峰图单一，没有杂峰，阴性对照无峰的引物作为最终的引物。
[0033] 表1内参基因及其对应的引物
[0034]
[0035]
[0036] 3、内参基因引物标准曲线的建立
[0037] 对每一对内参基因的引物制作各自的标准曲线，计算对应引物的扩增效率。将反转录的cDNA混合后，以5为倍数稀释成5个梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625)，作为建立标准曲线的模板。同时，以dd H2O作为阴性对照模板，来检测实验过程中的试剂或者人为污染。所有的样品均做3次重复，以确保实验数据的可信度。用Applied Biosystems StepOne(Thermo Fisher Scientific，USA)进行RT-q PCR，利用得到的数据结果求得各候选基因的扩增效率及斜率，荧光定量PCR扩增效率要求所选引物的扩增效率在90％-110％之间。
[0038] 4、荧光实时定量
[0039] 使用Applied Biosystems StepOne(Thermo Fisher Scientific，USA)进行RT-q PCR，以叶片样品第一链为模板进行定量分析，首先将模板稀释10倍。利用 Premix Ex TaqTM(TakaRa，Japan)进行实时荧光定量，反应体系为总体积为10uL，正反向引物0.4uL、SYBR5uL、cDNA1 uL、校正液0.2uL、超纯水3uL。扩增程序为95℃预变性30s，1个循环，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环，再运行溶解曲线阶段的1个循环，95℃15s，60℃1min，95℃15s，每个样品设3个重复，并设阴性对照。
[0041] 内参基因稳定性分析，利用软件GeNorm，NormFinder，BestKeeper和在线分析工具RefFinder(http：//150.216.56.64/referencegene.php)综合分析内参基因的表达稳定性。筛选出稳定的内参基因。
[0042] 6、结果
[0043] 1)RNA提取质量及引物特异性检测
[0044] 各样品的OD260/280、OD260/230均符合要求，琼脂糖凝胶电泳图检测显示28S及18S条带清晰，其灰度比约为2∶1，5S条带亮度较暗，无降解现象，满足要求(图1)。17对引物在荧光实时定量中熔解曲线均只有明显的单一峰，且电泳检测也只有单一条带图，说明所用引物可特异扩增各内参基因的相应产物，无引物二聚体，且每个待测样品扩增曲线的重复性好，模板能特异性扩增，实时荧光定量结果准确可信。
[0045] 2)内参基因Ct值分析
[0046] Ct值与基因的表达量呈反比，Ct值越大，基因的表达量越低，反之，Ct值越小，代表基因的表达量越高。17个内参基因Ct值的平均值在18.70-26.47之间，其中Actin表达量最高，APT和PROF的表达量较低(图2)。
[0047] 3)软件分析
[0048] GeNorm软件分析：GeNorm软件是根据平均变异度M值来衡量基因的稳定性，软件默认的取舍值为1.5，高于1.5的基因不适合作为内参使用，M值越低表示基因越稳定。此外GeNorm软件还根据候选内参基因的配对差异值Vn/Vn+1来确定合适的内参基因个数，当Vn/Vn+1＜1.5时，采用n个内参基因个数。根据软件，计算出V3/V4＝0.136＜1.5(图3)，所以适用于海州常山干旱胁迫下应选用三个内参基因，分别为Actin、UBC-E2和PP2A(图4)。
[0049] NormFinder软件分析：NormFinder软件是根据计算候选内参基因的稳定值进行评价，稳定值越高稳定性越差，具有最小稳定值的基因为最稳定的基因。结果如表2所示，AP-2的值为0.283，为最稳定的基因，H3稳定值为2.427，为稳定性最差的基因。
[0050] 表2 NormFinder软件分析结果
[0051] 排名 1 2 3 4 5 6 7 8 9基因 AP-2 RAN Actin SAND UBC-E2 PP2A UBQ HSP70 RPL
稳定值 0.283 0.42 0.427 0.496 0.601 0.634 0.716 0.742 0.796
排名 10 11 12 13 14 15 16 17
基因 EF-1A TUA MDH PK 18S APT PFOF H3
稳定值 0.83 0.833 0.841 0.896 0.924 1.511 1.594 2.427
稳定值 0.283 0.42 0.427 0.496 0.601 0.634 0.716 0.742 0.796
排名 10 11 12 13 14 15 16 17
基因 EF-1A TUA MDH PK 18S APT PFOF H3
稳定值 0.83 0.833 0.841 0.896 0.924 1.511 1.594 2.427
[0052] BestKeeper软件分析：BestKeeper软件是基于内参基因Ct值的标准差(SD)和调节系数标准差SD(±x-fold)来评判基因的表达稳定性，直接对基因表达Ct值进行分析。SD值越小，表达越稳定，程序默认临界值为1，当SD值大于1时，认为该基因表达不稳定。分析结果如表3所示，显示从PROF、H3和APT，SD数值大于1，其余基因SD数值均小于1，基因的稳定性为AP-2＞Actin＞MDH＞RAN＞UBC-E2＞UBQ＞RPL＞SAND＞PP2A＞EF-1A＞TUA＞HSP70＞18S＞PK＞PFOF＞H3＞APT，表达最稳定的是AP-2，最不稳定的为APT。
[0053] 表3 BestKeeper软件分析结果
[0054]排名 1 2 3 4 5 6 7 8 9
基因 AP-2 Actin MDH RAAN UBC-E2 UBQ RPL SAND PP2A
SD 0.4 0.55 0.57 0.75 0.76 0.79 0.8 0.81 0.83
CV 1.73 2.95 2.41 3.06 3.54 3.24 3.65 3.12 3.7
排名 10 11 12 13 14 15 16 17
基因 EF-1A TUA HSP70 18S PK PFOF H3 APT
SD 0.84 0.88 0.89 0.95 0.97 1.15 1.56 1.58
CV 3.87 3.79 4.29 3.81 4.28 4.03 7.06 5.97
基因 AP-2 Actin MDH RAAN UBC-E2 UBQ RPL SAND PP2A
SD 0.4 0.55 0.57 0.75 0.76 0.79 0.8 0.81 0.83
CV 1.73 2.95 2.41 3.06 3.54 3.24 3.65 3.12 3.7
排名 10 11 12 13 14 15 16 17
基因 EF-1A TUA HSP70 18S PK PFOF H3 APT
SD 0.84 0.88 0.89 0.95 0.97 1.15 1.56 1.58
CV 3.87 3.79 4.29 3.81 4.28 4.03 7.06 5.97
[0055] 4)内参基因稳定性验证
[0056] 综合考虑Ct值和BestKeeper、GeNorm和Normfinder 3个软件的分析结果得出，Actin、AP-2和RAN是适合于海州常山干旱胁迫条件下适用的内参基因(表4)。
[0057] 表4综合排名
[0058]
[0059]
[0060] 选用ClNHX1(SEQ ID NO.18)，来验证所筛选的内参基因，荧光定量PCR程序上同，并用表达不稳定的H3基因来做比较，发现用所筛选出的内参基因来作为内参时ClNHX1有着相似的变化趋势，但用H3基因来做内参时，ClNHX1基因表达情况不同，说明筛选出的内参基因是准确可靠的(图5)。
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