牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法专利检索-箭头键导航键键盘外围设备电脑零配件专利检索查询-专利查询网

牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法

阅读：1019发布：2020-09-16

专利汇可以提供牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法，属于动物寄生虫病诊断技术领域。试纸条由样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC 基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成。免疫探针干片是以聚苯乙烯乳胶微球的羧基与兔抗牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以锚固在硝酸纤维素膜上的血吸虫可溶性抗原为检测线、羊抗兔IgG抗体为质控线制成；可快速检测牛血清中的血吸虫抗体，操作简便，结果直观、准确。可广泛用于牛血吸虫病的诊断、普查和检疫。，下面是牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种检测牛日本血吸虫病抗体的试纸条，其特征在于该试纸条由部件样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成；其中，免疫探针干片是以红色或其它颜色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的羧基，与兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后作为免疫探针的检测试剂液吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以硝酸纤维素膜为膜基，用划膜喷金机将血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体分别在该膜上画出检测T线和质控C线而成；先将上述前四部件按头尾部分重叠粘合装配在PVC基板上，再将箭头标签胶膜粘贴在免疫探针干片上，另将手柄标签胶膜粘贴在吸水纸上后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。
2.一种制备权利要求1所述牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的方法，其特征在于按以下步骤进行：
（1）免疫探针干片的制备：包括
1）兔抗黄水牛IgG的制备：
① 黄水牛IgG的制备：采集健康黄牛、水牛血液，分别分离血清后取血清各5ml混合，加等量0.85% NaCl，用30%硫酸铵沉淀法提取黄水牛IgG，沉淀的黄水牛IgG用原血清体积
2倍量的0.85% NaCl溶解，再用35%硫酸铵沉淀法重复提取2次，最后用5ml 0.85% NaCl+ 2-
溶解离心沉淀的黄水牛IgG，用透析法除去溶液中的NH4 及SO4 后，再用蒸馏水稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，调节蛋白浓度至10mg/ml后，于-20℃密封贮存备用；
② 黄水牛IgG免疫兔：将黄水牛IgG与弗氏完全佐剂按体积3:7比例制成油乳剂，按黄水牛IgG 6mg/只兔用量，对体重2.5kg的健康雄性家兔，在兔颈部皮下和兔双侧后足蹠垫皮下注射进行首次免疫；后除用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂外，再按上述同样配比、方法，每隔两周进行一次加强免疫，共进行三次；第4次后10天，取耳静脉少量血分离血清，用琼脂扩散法测定免疫血清效价，当血清效价≥1:64时，即可心脏大量釆血、分离血清后，备用；
③ 兔抗黄水牛IgG抗体的制备：取兔抗黄水牛IgG血清10ml，以35%硫酸铵沉淀法提取兔抗黄水牛IgG抗体，以2倍于血清量的0.85% NaCl溶解沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体，如此反复提取3次后，将第3次硫酸铵沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体的离心沉淀物以5ml 0.85% + 2-
NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4 及SO4 ；在蛋白测定仪上测定兔抗黄水牛IgG抗体蛋白含量后，用pH7.20 0.1M的硼酸缓冲液稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，将蛋白浓度调节至4mg/ml后，于-20℃密封贮存备用；
2）乳胶微球的洗涤：将直径200nm红色或其它颜色的聚苯乙烯乳胶微球液，在10000 rpm，4℃条件下离心10min，去上清液，沉淀物用高纯水还原为原体积，用超声波分散沉淀的乳胶微球成为均匀悬浮液后，再用上述相同的方法重复离心、重悬浮1～2次；
3）乳胶微球羧基的激活：将pH6.5 0.1mol MES，10%带色乳胶微球的悬液，20mg/mL的EDC·HCl和20mg/mL的NHS，按体积9:2:1:0.75的比例混合、反应2hr；然后在11000 rpm
4℃条件下离心25min，除去上清液，沉淀物以所用带色乳胶体积5倍量的pH7.20 0.1M的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液；用垂直混合仪混合15min，在11000 rpm，4℃条件下离心25min 除去上清液，沉淀物以所用带色乳胶体积2.5倍量的pH7.20
0.1 M的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液，即为羧基活化的乳胶微球；
4）乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG抗体：往装有羧基活化乳胶微球悬浮液的离心管中加入等体积以pH7.20 0.1M的硼酸缓冲液稀释成蛋白浓度为1～4mg/mL的兔抗黄水牛IgG抗体，在垂直混合仪上混合反应2hr以上；再加入总体积十分之一量的20%BSA 振荡反应1hr，反应后的混合物以11000 rpm 4℃离心25min，除去上清液，沉淀物以含酪蛋白
0.2%～0.5%、蔗糖5%～10%、NaN3 0.02%～0.05%的 pH7.2 0.05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液原体积重悬，超声波击打还原成均匀的悬浮液，在垂直混合仪上混合15min，再次以11000rpm 4℃离心25min，除去上清液，沉淀物以相当于乳胶微球悬浮液和兔抗黄水牛IgG抗体两者总体积75%的同上封闭液重悬，超声波击打还原成均匀的悬浮液，该液即为红色或其它颜色的免疫探针检测试剂液；
5）免疫探针干片的制备：将上述的免疫探针检测试剂液用划膜喷金机以2～5μl/cm的流速喷涂在已经过含酪蛋白0.2%～0.5%，蔗糖5%～10%，NaN3 0.02%～0.05%,Tween-20
0.2%～0.5%的pH7.2 0.05M Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液预处理后的长300mm×宽8.5mm的聚酯膜上，经37℃,1hr烘干，即为免疫探针干片；
（2）层析膜的制备：
1）血吸虫卵可溶性抗原的制备：按体重2.5～3kg的健康新西兰兔，每只接种血吸虫尾蚴2000条，实验感染兔于接种后45日屠宰取肝脏，分离和纯化血吸虫虫卵，经冷冻干燥后研磨破碎，用0.85%NaCl溶液配成3%～5%悬浮液，2～8℃浸泡3日，再反复冻融10次，冰浴超声波破碎30min，10000r/min离心1hr，取上清液，装透析袋，用pH7.0 0.01M PB透析
16小时，每隔4小时换透析液1次，透析结束后，以10000rp离心60min，上清液即为血吸虫卵可溶性抗原；检测其蛋白含量后，用pH8.2～8.5 0.05M TBS稀释至1～7mg/mL浓度，即可用于层析膜上检测T线的绘制；
2）羊抗兔IgG的制备：
①兔IgG的制备：以心脏采血法采集健康新西兰兔的血液，分离血清，取兔血清10ml，再加10ml 0.85% NaCl混匀，用35%硫酸铵沉淀法提取兔IgG，反复沉淀提取3次，沉淀物用
5ml 0.85% NaCl溶解后，用透析法除去硫酸铵，并在蛋白测定仪上测定兔IgG的蛋白含量；
②羊抗兔IgG抗体的制备：用弗氏佐剂将兔IgG溶液配制成1mg/ml，用超声波制成乳浊液；按照每千克体重2mg的剂量皮下注射免疫羊，每间隔2周，再用弗氏不完全佐剂和兔IgG制备成相同浓度的乳浊液，以相同剂量与方法免疫羊，第3次免疫后10d颈静脉采血分离血清，以琼脂免疫扩散法测定血清中羊抗兔IgG抗体效价≥1:32以上时，即可大量采集羊血并制取血清；
分离羊抗兔IgG抗体先用30%硫酸铵沉淀法提取粗羊抗兔IgG抗体一次，再用45%硫+
酸铵沉淀法提取2次，离心沉淀物用5ml 0.85% NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4 及
2-
SO4 ，3000rpm离心30min，检测上清液蛋白含量后，用pH8.2～8.5 0.05M TBS将上清液稀释成0.1～2mg/mL的浓度，即可用于层析膜上质控C线的绘制；
3）检测线和质控线的制作：将长25mm×宽300mm的硝酸纤维素膜放在划膜喷金机的操作平台上，在该机1#泵的试剂瓶中加入血吸虫卵可溶性抗原，2#泵的试剂瓶中加入羊抗兔IgG，以1～3μl/cm的流速，在硝酸纤维素膜上划出检测T线和质控C线，两线相距5～
6mm，置室内晾干即为层析膜；
（3）样品垫的制备：将23mm×300mm玻璃纤维膜在由含酪蛋白0.01%～0.05%,蔗糖
5%～10%、NaN3 0.02%～0.05%和Tween-20 0.2%～0.5%的pH7.2 0.04M Tris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液中浸泡1hr，取出，37℃烘干即成；
（4）吸水纸的制备：CH37吸水纸裁成长300mm×宽28mm的纸条，置37℃烘干即成；
（5）PVC基板的制备：PVC板其结构为三层，第一层为保护纸，第二层为不干胶，第三层为PVC基板；在保护纸上刻有三条刻痕，分别位于距离一侧长边的20mm、27mm和53mm处；将PVC板按长300mm×宽80mm规格裁剪后备用；
（6）标签胶膜的制备：用不干胶贴纸印制而成；其中，
1）箭头标签胶膜：其规格为长300mm×宽18mm，在距一侧长边1mm处印有一条直线，在该直线的上方，每隔1.3mm印有一条“←MAX”字样，箭头与直线垂直；指示试纸条样品垫可浸入待测溶液的最大深度不得超过这条直线；
2）手柄标签胶膜：其规格为长303mm×宽30mm，绿底白字，与长边呈15°夹角印有4列“SjAb”字样，SjAb为Schistosoma japonicum Antibody的缩写，表示该试纸条用于检测日本血吸虫抗体，该部位为试纸条拿取时的手柄部位；
（7）试纸条各部件的组装、切条、包装和贮存：
1）试纸条各部件的组装：试纸条以长300mm×宽80mm的PVC为基板，依次将300mm ×23mm的样品垫、300mm×8.5mm的免疫探针干片、300mm×25mm的层析膜及300mm×28mm的吸水纸，按头尾各有1～2mm的重叠连接、粘贴在带不干胶面的PVC基板上；再在吸水垫的尾部与免疫探针干片上粘贴上箭头标签胶膜；另在样品垫上粘贴上手柄标签胶膜；各部件压平，粘贴牢固即成试纸条大卡；
2）切条：将试纸条大卡放在切条机上，按3mm宽度连续切割，即成宽3mm×长80mm的试纸条；
3）包装与贮存：试纸条抽检合格后，按包装规格要求装入铝箔袋中，放入1小包干燥剂后，封口，即成产品；在 2～8℃保存，有效期为12个月。
3.应用权利要求1所述试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法，其特征在于按以下步骤进行：
（1）血清稀释液的配制：将 Na2HPO4、KH2PO4、NaCl与蒸馏水按重量体积
0.199g∶0.082g∶1g∶200ml比例混合，37～40℃水浴加热溶解、冷却后即成血清稀释液；
（2）待检牛血清的稀释：将待检牛血清与血清稀释液按体积1:1～2比例混合稀释；
（3）检测操作：吸取稀释的待检血清0.05ml滴在平放的试纸条的样品垫上，或将试纸条的样品垫端插入待检稀释血清中至箭头标签胶膜所印的直线条15s后，平放在操作台面上；
（4）结果判定：5～15min后观察结果，检测T线和质控C线均呈现红色或其它颜色的同色条带，则判为阳性；仅质控C线呈现1条红色或其它颜色的条带，则判为阴性；检测T线和质控C线均不呈现条带，则说明该试纸条已失效或试验操作有误。

说明书全文

牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及家畜寄生虫病的诊断技术领域，具体涉及牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法。【背景技术】

[0002] 血吸虫病是人畜共患的寄生虫病。当前我国尚有7省（自治区）100多个县未达到血吸虫病的传播控制标准。牛是血吸虫病的重要传染源。由于受长江季节性洪水等自然因素及人畜流动频繁等社会因素的影响，近年来我国血吸虫病疫情又出现了反复，患病的人畜增加。我国一直来均将血吸虫病列为动物疫病监测及检疫的重要对象。因此，对调运家畜的血吸虫病的过境检疫、对现疫区家畜的血吸虫病普查及对历史上曾经发生过血吸虫病流行区的牲畜的监测是一项长期而艰巨的任务。因此，研究家畜血吸虫病快速检测的方法对防制和消灭血吸虫病具有重要意义。

[0003] 目前诊断家畜血吸虫病的方法主要有粪孵血吸虫毛蚴法、ELISA法、IHA法和金标免疫渗滤法。粪孵毛蚴法只有在动物感染血吸虫后5周以上才能粪孵出血吸虫毛蚴，并且粪便中的虫卵数量有波动，轻度感染的病畜尤易漏检，且用粪孵法检测一个样品需耗时5～6个小时，随着劳动力工资大幅上涨，该法在家畜血吸虫病的普查中已很少被采用。ELISA方法操作繁琐、时间长、酶试剂难以保存、影响因素多，检测需专用仪器设备、试验中使用的某些材料易造成环境污染，对人健康有害。IHA稳定性较差，敏感性不如ELISA法，实验所需时间也较长。ELISA法和IHA法都不能满足现场检疫的要求。金标免疫渗滤法具有检测速度快、操作简便不需特殊仪器等特点，适合于血吸虫病的现场检疫、诊断和普查。但其诊断试剂为液体，稳定性较差，保存要求高（需4℃冰箱保存），保存期短(仅6个月)，试剂及反应板体积大，邮寄和航空运输受限，增加了保存、运输费用及运输所需的时间。金标免疫层析法可以克服金标免疫渗滤法的这些缺点。国内有数家单位对人血吸虫病金标免疫层析法进行过研究，但由于各种原因都没有批量生产和实践中推广开来。

[0004] 从理论上分析，胶体金与抗原或抗体的结合均是通过正负电荷的静电引力结合在一起的。这种结合的牢固程度容易受溶液pH值和其他离子强度的影响，因此其最适pH范围往往很小，检测的可重复性较差。胶体金与抗原或抗体的结合还可能被血液中或试剂中加入的称作为稳定剂的其它蛋白与胶体金之间竞争性结合的影响，使试剂较快失效或者出现假阳性。可以说这是金标方法本身具有的局限性。

[0005] 从理论上说，通过共价键使分子之间结合的牢固程度要强于由静电引力结合的强度。乳球免疫层析技术正是继免疫胶体金技术后新近发展起来的一种以共价键结合为特点的免疫标记新技术。本发明的检测试剂为乳胶微球标记的兔抗黄水牛IgG抗体，乳胶微球与兔抗黄水牛IgG抗体之间以共价键结合，所以该复合物稳定性好，且乳胶微球的直径比胶体金大10～20倍，信号强度大，可提高试剂的灵敏度和阳性样本的检出率。【发明内容】

[0006] 本发明目的是，针对牛日本血吸虫病ELISA和IHA诊断法存在操作步骤多、速度慢、不能满足现场检疫需求，和金标免疫渗滤法检测试剂系液体，保存期较短，不能空运或邮寄等缺陷，为牛日本血吸虫病的诊断、检疫和普查提供一种敏感、特异、安全、稳定性好、信号强度大，且为固体状态、没有污染的检测试纸条，及在5～15分钟内即可完成的快速，简便的检测方法。

[0007] 本发明的原理是：采用有机化学方法使红色或其它颜色的聚苯乙烯乳胶微球羧基化后，使兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基与乳胶微球的羧基形成共价键，使该染色乳胶微球标记的兔抗黄水牛IgG抗体的结合物作为检测试剂(免疫探针)；再将该液状的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物以喷雾法使之吸附在聚脂膜上，经烘干成固体状的免疫探针干片；另以硝酸纤维素膜作为层析膜，并用划膜喷金仪在该膜的不同位置上画出血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体两条直线，分别作为检测线（T线）和质控线（C线）；然后按照样品垫、免疫探针干片、层析膜和吸水滤纸的顺序，以头尾部分重叠的形式装配在PVC基板上，再贴上箭头标签胶膜与手柄标签胶膜后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。

[0008] 检测时，将待检稀释血清滴在试纸条的样品垫上(或将裸露的样品垫插入待检稀释血清中10s)，血清液通过毛细管作用流经免疫探针干片，将吸附在聚酯膜上的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物溶解成游离状，如果血样中存在有牛抗血吸虫抗体(即阳性牛血样)，则该血样中的抗体将会与部分游离状的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物相结合，形成牛抗血吸虫抗体-兔抗黄水牛IgG抗体-乳胶微球的三联红色或其它颜色的复合物后，并沿着硝酸纤维素膜继续向前移行，当这种红色或其它颜色的复合物移行到预先锚固着血吸虫抗原的检测线(T线)上时，该血吸虫抗原将会与复合物中的牛抗血吸虫抗体相结合，而形成更大的四联复合物而使T线呈显红色或其它颜色的条带；而剩余的未与牛抗血吸虫抗体相结合的游离状乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物将继续往前移行，当与锚固在硝酸纤维素膜上的羊抗兔IgG抗体质控线（C线)相遇时，便形成羊抗兔IgG抗体-兔抗黄水牛IgG抗体-乳胶微球的三联红色复合物，使C线呈现红色条带；如果血样中不存在牛抗血吸虫抗体(即阴性牛血样)，则就不能形成牛抗血吸虫抗体-兔抗黄水牛IgG抗体-乳胶微球的三联复合物，而单纯的乳胶微球-兔抗黄水牛IgG抗体结合物是不能与T线上的血吸虫抗原相结合的，所以检测线（T线）不能呈现红色或其它颜色的条带，而只有质控线（C线）仍呈显红色或其它颜色的条带；如果检测线与质控线均没有出现红色条带，则说明该试纸条已失效或者检测操作有误。

[0009] 本发明目的通过以下技术方案予以实现：

[0010] 1、一种检测牛日本血吸虫病抗体的试纸条，该试纸条由部件样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成；其中，免疫探针干片是以红色或其它颜色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的羧基，与兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后作为免疫探针的检测试剂液吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以硝酸纤维素膜为膜基，用划膜喷金机将血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体分别在该膜上画出检测T线和质控C线而成；先将上述前四部件按头尾部分重叠粘合装配在PVC基板上，再将箭头标签胶膜粘贴在免疫探针干片上，另将手柄标签胶膜粘贴在吸水纸上后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。

[0011] 2、一种制备牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的方法，该方法按以下步骤进行：

[0012] （1）免疫探针干片的制备：包括

[0013] 1）兔抗黄水牛IgG的制备：

[0014] ①黄水牛IgG的制备：采集健康黄牛、水牛血液，分别分离血清后取血清各5ml混合，加等量0.85%NaCl，用30%硫酸铵沉淀法提取黄水牛IgG，沉淀的黄水牛IgG用原血清体积2倍量的0.85%NaCl溶解，再用35%硫酸铵沉淀法重复提取2次，最后用5ml 0.85%NaCl+ 2-溶解离心沉淀的黄水牛IgG，用透析法除去溶液中的NH4 及SO4 后，再用蒸馏水稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，调节蛋白浓度至10mg/ml后，于-20℃密封贮存备用；

[0015] ②黄水牛IgG免疫兔：将黄水牛IgG与弗氏完全佐剂按体积3:7比例制成油乳剂，按黄水牛IgG 6mg/只兔用量，对体重2.5kg的健康雄性家兔，在兔颈部皮下和兔双侧后足蹠垫皮下注射进行首次免疫；后除用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂外，再按上述同样配比、方法，每隔两周进行一次加强免疫，共进行三次；第4次后10天，取耳静脉少量血分离血清，用琼脂扩散法测定免疫血清效价，当血清效价≥1:64时，即可心脏大量釆血、分离血清后，备用；

[0016] ③兔抗黄水牛IgG抗体的制备：取兔抗黄水牛IgG血清10ml，以35%硫酸铵沉淀法提取兔抗黄水牛IgG抗体，以2倍于血清量的0.85%NaCl溶解沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体，如此反复提取3次后，将第3次硫酸铵沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体的离心沉淀物以5ml + 2-0.85%NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4 及SO4 ；在蛋白测定仪上测定兔抗黄水牛IgG抗体蛋白含量后，用pH7.200.1M的硼酸缓冲液稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，将蛋白浓度调节至4mg/ml后，于-20℃密封贮存备用；

[0017] 2）乳胶微球的洗涤：将直径200nm红色或其它颜色的聚苯乙烯乳胶微球液，在10000rpm，4℃条件下离心10min，去上清液，沉淀物用高纯水还原为原体积，用超声波分散沉淀的乳胶微球成为均匀悬浮液后，再用上述相同的方法重复离心、重悬浮1～2次；

[0018] 3）乳胶微球羧基的激活：将pH6.50.1mol MES，10%带色乳胶微球的悬液，20mg/mL的EDC·HCl和20mg/mL的NHS，按体积9:2:1:0.75的比例混合、反应2hr；然后在11000rpm4℃条件下离心25min，除去上清液，沉淀物以所用带色乳胶体积5倍量的pH7.200.1M的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液；用垂直混合仪混合15min，在
11000rpm，4℃条件下离心25min除去上清液，沉淀物以所用带色乳胶体积2.5倍量的pH7.200.1M的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液，即为羧基活化的乳胶微球；

[0019] 4）乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG抗体：往装有羧基活化乳胶微球悬浮液的离心管中加入等体积以pH7.200.1M的硼酸缓冲液稀释成蛋白浓度为1～4mg/mL的兔抗黄水牛IgG抗体，在垂直混合仪上混合反应2hr以上；再加入总体积十分之一量的20%BSA振荡反应1hr，反应后的混合物以11000rpm 4℃离心25min，除去上清液，沉淀物以含酪蛋白0.2%～0.5%、蔗糖5%～10%、NaN3 0.02%～0.05%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液原体积重悬，超声波击打还原成均匀的悬浮液，在垂直混合仪上混合15min，再次以
11000rpm 4℃离心25min，除去上清液，沉淀物以相当于乳胶微球悬浮液和兔抗黄水牛IgG抗体两者总体积75%的同上封闭液重悬，超声波击打还原成均匀的悬浮液，该液即为红色或其它颜色的免疫探针检测试剂液；

[0020] 5）免疫探针干片的制备：将上述的免疫探针检测试剂液用划膜喷金机以2～5μl/cm的流速喷涂在已经过含酪蛋白0.2%～0.5%，蔗糖5%～10%，NaN30.02%～
0.05%,Tween-200.2%～0.5%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液预处理后的长300mm×宽8.5mm的聚酯膜上，经37℃,1hr烘干，即为免疫探针干片；

[0021] （2）层析膜的制备：

[0022] 1）血吸虫卵可溶性抗原的制备：按体重2.5～3kg的健康新西兰兔，每只接种血吸虫尾蚴2000条，实验感染兔于接种后45日屠宰取肝脏，分离和纯化血吸虫虫卵，经冷冻干燥后研磨破碎，用0.85%NaCl溶液配成3%～5%悬浮液，2～8℃浸泡3日，再反复冻融10次，冰浴超声波破碎30min，10000r/min离心1hr，取上清液，装透析袋，用pH7.00.01M PB透析16小时，每隔4小时换透析液1次，透析结束后，以10000rp离心60min，上清液即为血吸虫卵可溶性抗原；检测其蛋白含量后，用pH8.2～8.50.05M TBS稀释至1～7mg/mL浓度，即可用于层析膜上检测T线的绘制；

[0023] 2）羊抗兔IgG的制备：

[0024] ①兔IgG的制备：以心脏采血法采集健康新西兰兔的血液，分离血清，取兔血清10ml，再加10ml 0.85%NaCl混匀，用35%硫酸铵沉淀法提取兔IgG，反复沉淀提取3次，沉淀物用5ml 0.85%NaCl溶解后，用透析法除去硫酸铵，并在蛋白测定仪上测定兔IgG的蛋白含量；

[0025] ②羊抗兔IgG抗体的制备：用弗氏佐剂将兔IgG溶液配制成1mg/ml，用超声波制成乳浊液；按照每千克体重2mg的剂量皮下注射免疫羊，每间隔2周，再用弗氏不完全佐剂和兔IgG制备成相同浓度的乳浊液，以相同剂量与方法免疫羊，第3次免疫后10d颈静脉采血分离血清，以琼脂免疫扩散法测定血清中羊抗兔IgG抗体效价≥1:32以上时，即可大量采集羊血并制取血清；

[0026] 分离羊抗兔IgG抗体先用30%硫酸铵沉淀法提取粗羊抗兔IgG抗体一次，再用45%+硫酸铵沉淀法提取2次，离心沉淀物用5ml 0.85%NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4 及
2-
SO4 ，3000rpm离心30min，检测上清液蛋白含量后，用pH8.2～8.50.05M TBS将上清液稀释成0.1～2mg/mL的浓度，即可用于层析膜上质控C线的绘制；

[0027] 3）检测线和质控线的制作：将长25mm×宽300mm的硝酸纤维素膜放在划膜喷金机的操作平台上，在该机1#泵的试剂瓶中加入血吸虫卵可溶性抗原，2#泵的试剂瓶中加入羊抗兔IgG，以1～3μl/cm的流速，在硝酸纤维素膜上划出检测T线和质控C线，两线相距5～6mm，置室内晾干即为层析膜；

[0028] （3）样品垫的制备：将23mm×300mm玻璃纤维膜在由含酪蛋白0.01%～0.05%,蔗糖5%～10%、NaN30.02%～0.05%和Tween-200.2%～0.5%的pH7.20.04MTris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液中浸泡1hr，取出，37℃烘干即成；

[0029] （4）吸水纸的制备：CH37吸水纸裁成长300mm×宽28mm的纸条，置37℃烘干即成；

[0030] （5）PVC基板的制备：PVC板其结构为三层，第一层为保护纸，第二层为不干胶，第三层为PVC基板；在保护纸上刻有三条刻痕，分别位于距离一侧长边的20mm、27mm和53mm处；将PVC板按长300mm×宽80mm规格裁剪后备用；

[0031] （6）标签胶膜的制备：用不干胶贴纸印制而成；其中，

[0032] 1）箭头标签胶膜：其规格为长300mm×宽18mm，在距一侧长边1mm处印有一条直线，在该直线的上方，每隔1.3mm印有一条“←MAX”字样，箭头与直线垂直；指示试纸条样品垫可浸入待测溶液的最大深度不得超过这条直线；

[0033] 2）手柄标签胶膜：其规格为长303mm×宽30mm，绿底白字，与长边呈15°夹角印有4列“SjAb”字样，SjAb为Schistosoma japonicum Antibody的缩写，表示该试纸条用于检测日本血吸虫抗体，该部位为试纸条拿取时的手柄部位；

[0034] （7）试纸条各部件的组装、切条、包装和贮存：

[0035] 1）试纸条各部件的组装：试纸条以长300mm×宽80mm的PVC为基板，依次将300mm×23mm的样品垫、300mm×8.5mm的免疫探针干片、300mm×25mm的层析膜及300mm×28mm的吸水纸，按头尾各有1～2mm的重叠连接、粘贴在带不干胶面的PVC基板上；
再在吸水垫的尾部与免疫探针干片上粘贴上箭头标签胶膜；另在样品垫上粘贴上手柄标签胶膜；各部件压平，粘贴牢固即成试纸条大卡；

[0036] 2）切条：将试纸条大卡放在切条机上，按3mm宽度连续切割，即成宽3mm×长80mm的试纸条；

[0037] 3）包装与贮存：试纸条抽检合格后，按包装规格要求装入铝箔袋中，放入1小包干燥剂后，封口，即成产品；在2～8℃保存，有效期为12个月。

[0038] 3、应用试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法，该方法按以下步骤进行：

[0039] （1）血清稀释液的配制：将Na2HPO4、KH2PO4、NaCl与蒸馏水按重量体积0.199g∶0.082g∶1g∶200ml比例混合，37～40℃水浴加热溶解、冷却后即成血清稀释液；

[0040] （2）待检牛血清的稀释：将待检牛血清与血清稀释液按体积1:1～2比例混合稀释；

[0041] （3）检测操作：吸取稀释的待检血清0.05ml滴在平放的试纸条的样品垫上，或将试纸条的样品垫端插入待检稀释血清中至箭头标签胶膜所印的直线条15s后，平放在操作台面上；

[0042] （4）结果判定：5～15min后观察结果，检测T线和质控C线均呈现红色或其它颜色的同色条带，则判为阳性；仅质控C线呈现1条红色或其它颜色的条带，则判为阴性；检测T线和质控C线均不呈现条带，则说明该试纸条已失效或试验操作有误。

[0043] 本发明的有益效果是：

[0044] （1）用本发明试纸条检测牛血吸虫病无需复杂仪器和专门知识技能，操作简便、快捷，5～15min就可得出结果。

[0045] （2）本发明试纸条体积小、重量轻、全固态，可方便邮寄或航空托运。

[0046] （3）试纸条有效期可达1年以上，比免疫金标渗滤法检测试剂的保存期长。

[0047] （4）本发明试纸条的检测特异性与IHA和ELISA方法相当，重复性好，适合于工厂化生产。

[0048] （5）本发明用黄、水牛IgG免疫兔以制备兔抗黄水牛IgG抗体，与单纯使用黄牛IgG免疫兔的方法相比，①产生的兔抗黄水牛IgG抗体效价高4倍(1:64vs 1：16)，兔抗黄水牛IgG抗体效价高可以相对减少用量，降低成本；②使用黄、水牛IgG免疫兔制备的兔抗黄水牛IgG抗体可以提高血吸虫阳性水牛血清中抗体检测的敏感性。用兔抗黄牛IgG抗体制备的试纸条检测实验感染血吸虫尾蚴49天的2倍稀释水牛血清，呈现阳性反应，检测3倍稀释血清只呈现弱阳性反应(+)，但用兔抗黄水牛IgG抗体制备的试纸条检测同样3倍稀释血清，却呈现强阳性反应(+++)。所以用本发明的兔抗黄水牛IgG抗体制备免疫探针试剂液比使用通常的兔抗黄牛IgG抗体更具优势。【附图说明】

[0049] 图1贴标签胶膜前试纸条的结构示意图

[0050] 图2贴标签胶膜后试纸条的结构示意图

[0051] 其中，1样品垫、2免疫探针干片、3层析膜、4吸水纸、5PVC基板、6检测T线、7质控C线、8箭头标签胶膜、9手柄标签胶膜

[0052] 本发明以图2作为摘要附图。

[0053] 【实施方式】

[0054] 通过以下实施例和试验例并结合附图对本发明作进一步的详细描述，但本发明的内容并不局限于此。

[0055] 实施例1：（检测牛日本血吸虫病抗体试纸条的制备1）

[0056] 1试纸条的制备

[0057] 1.1免疫探针干片制备

[0058] 1.1.1兔抗黄水牛IgG的制备

[0059] ⑴黄水牛IgG的提取

[0060] ①无菌操作采集健康黄牛及水牛血液，分别分离血清。

[0061] ②取黄牛及水牛血清各5ml混合，再加10ml 0.85%NaCl混匀，逐滴加入饱和硫酸铵(SAS)8.6ml使之达到30%饱和度，边加边搅拌，并用浓氨水调节pH值至7.0，置4℃过夜，取出室温平衡1hr，以3000r/min离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml 0.85%NaCl溶解。再逐滴加入SAS 10.8ml使之达到35%饱和度，边加边搅拌，用浓氨水调节pH值至7.0，置4℃3hr后取出，室温平衡1hr，以3000r/min离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml
0.85%NaCl溶解。用35%饱和度硫酸铵再重复提取一次。离心后沉淀物用5ml 0.85%NaCl溶解后，装入直径2cm的透析袋透析内密封。

[0062] ③在4℃条件下进行透析，开始先用蒸馏水透析8小时，换液4次，再用0.01mol + 2pH7.0 磷酸盐缓冲液(PB)透析6小时，换液2次，以除去NH4 及SO4。透析后的黄水牛IgG即可达到免疫兔的纯度要求。

[0063] ④用紫外分光光度法测得黄水牛IgG蛋白质浓度为5.3mg/ml，PEG浓缩调整为10mg/ml。

[0064] ⑵黄水牛IgG免疫兔

[0065] ①试验动物选体重2.5kg健康雄性家兔2只。

[0066] ②黄水牛IgG的乳化首免的油乳剂由黄水牛IgG与弗氏完全佐剂按3:7比例混合，超声波击打使之乳化，直至将黄水牛IgG油乳剂滴于冷水表面，能较长时间保持完整而不分散，即可应用。2-4免的油乳剂由黄水牛IgG与弗氏不完全佐剂按3:7比例制成。

[0067] ③免疫首次免疫在兔头颈部皮下、兔双侧后足蹠垫皮下各注射黄水牛Ig乳剂4ml(黄水牛IgG的蛋白总量为12mg)，两周后，每周用黄水牛IgG加强免疫1次，免疫黄水牛IgG的蛋白总量为12mg。如次重复3次，末次免疫10天后，耳静脉取少量血，分离出血清，用琼脂扩散法测定免疫血清的效价，待血清效价达1：64或以上时即心脏采血，分离血清。

[0068] ⑶兔抗黄水牛IgG抗体的提取

[0069] ①取兔抗黄水牛IgG血清10ml，加入等量的0.85%NaCl混匀，逐滴加入SAS10.8ml使之达到35%饱和度，边加边搅拌，并用浓氨水调节pH值至7.0，置4℃过夜后取出，室温平衡1小时，以3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml 0.85%NaCl溶解。置
4℃3hr后取出，室温平衡1hr，逐滴加入SAS10.8ml使之达到35%饱和度，边加边搅拌，用浓氨水调节pH值至7.0，置4℃3hr后取出，室温平衡1小时，以35%饱和度硫酸铵再重复提取一次，离心后沉淀物用5ml 0.85%NaCl溶解后，装入直径2cm的透析袋内。

[0070] ⑷透析提纯透析在4℃下进行，开始先用蒸馏水透析8小时，换液4次，再用+ 2-0.01mol pH7.0磷酸盐缓冲液(PB)透析6小时，换液2次，以除去NH4 及SO4 。

[0071] ⑸蛋白含量测定用紫外分光光度法测得兔抗黄水牛IgG的蛋白质浓度为5.0mg/ml，用pH7.20.1M硼酸缓冲液稀释成含蛋白4mg/ml，-20℃贮存备用。

[0072] 1.1.2试剂配制

[0073] ⑴1N NaOH称取NaOH 2.000g,蒸馏水定容至50ml。

[0074] ⑵pH6.50.1mol MES称取MES 0.4881g，蒸馏水定容至25ml，滴加1N NaOH使溶液pH达到6.5。

[0075] ⑶20mg/ml NHS称取NHS 0.050g，加蒸馏水2.5ml溶解。

[0076] ⑷20mg/ml EDC·HCl称取EDC·HCl 0.050g，加蒸馏水2.5ml溶解

[0077] ⑸0.1M硼酸溶液称取硼酸0.6183g，用蒸馏水定容至100ml。

[0078] ⑹0.025M硼砂溶液称取硼砂0.4767g，用蒸馏水定容至50ml。

[0079] ⑺pH7.20.1M硼酸缓冲液取0.1mol硼酸溶液95ml加0.025mol硼砂溶液5ml混合。

[0080] ⑻0.2M Tris称取Tris 12.114g,用蒸馏水定容至500ml。

[0081] ⑼0.1N HCl 吸取12N浓盐酸4.167ml，放入容量瓶，用蒸馏水定容至500ml[0082] ⑽0.05M Tris-HCl缓冲液

[0083] ①pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液取0.2M Tris 25ml加0.1N HCl 45ml混合，再加蒸馏水至100ml。

[0084] ②pH8.20.05M Tris-HCl缓冲液取0.2M Tris 25ml加0.1N HCl 22.5ml混合，再加蒸馏水至100ml。

[0085] ⑾pH7.2封闭液称取酪蛋白0.500g、蔗糖5.00g、NaN30.020g全部放入100ml pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液中，37～40℃水浴加热至完全溶解。即成含酪蛋白0.5%，蔗糖5%，NaN30.02%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液。

[0086] ⑿2.0mg/ml兔抗黄水牛IgG抗体吸取兔抗黄水牛IgG(5mg/ml)8ml加入到12ml pH7.20.05mol硼酸缓冲液中混合均匀。

[0087] ⒀20%BSA溶液称取进口BSA 2.000g，用10ml蒸馏水溶解。

[0088] 1.1.3乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物的制备

[0089] ⑴乳胶微球的洗涤红色乳胶微球，直径300nm，在10000rpm，4℃条件下离心10min，去上清液，沉淀用适量的高纯水还原为原体积，用超声波分散沉淀的乳胶微球，使之成为均匀的悬浮液，再用上述相同的参数重复洗涤(即离心及重悬浮)1～2次。

[0090] ⑵取1.5ml塑料离心管24支，往每支离心管中加入0.9ml pH6.50.1molMES,0.2ml红色乳胶微球，混合均匀。再加入0.1ml EDC·HCl(20mg/ml)和0.075mlNHS(20mg/ml)混合均匀。

[0091] ⑶在垂直混合仪上振荡混合2hr。

[0092] ⑷10000rpm，4℃，离心10min，去上清，每支离心管的沉淀用1ml pH7.20.1M硼酸缓冲液重悬，超声波(2s×5次)匀质。在垂直混合仪上振荡混合15min。

[0093] ⑸重复⑷的操作，只是每支离心管的沉淀用0.5ml硼酸缓冲液重悬。

[0094] ⑹往每支离心管中加入蛋白含量1mg/ml的兔抗黄水牛IgG0.5ml,在垂直混合仪上振荡混合2hr。

[0095] ⑺往每支离心管中加入20%BSA 0.1ml,在垂直混合仪上振荡混合1hr。

[0096] ⑻11000rpm，4℃，离心25min，去上清，每支离心管的沉淀用1ml封闭液重悬，超声波(2s×5次)匀质。在垂直混合仪上振荡混合15min。

[0097] ⑼重复⑺的操作，只是每支离心管的沉淀用0.75ml pH7.2封闭液重悬。超声波(2s×5次)匀质。最后得到的不透明红色悬浮液即为乳胶微球标记的兔抗黄水牛IgG结合物,即免疫探针检测试剂液。

[0098] 1.1.4免疫探针干片的制备

[0099] 1.1.4.1聚酯膜处理液的配制0.2M Tris 125ml，0.1N HCl 225ml,酪蛋白2.5g,蔗糖25g，NaN30.1g混合，37℃水浴溶解，再加入吐温-201.0ml搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀，即成含酪蛋白0.5%，蔗糖5%，NaN30.02%，吐温-200.2%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液。

[0100] 1.1.4.2聚酯膜的预处理将聚酯膜切成300mm×17mm的小条，放入聚酯膜处理液中浸泡4hr，取出平放在搪瓷盆中，37℃烘干，装入封口塑料袋中，置4～8℃冰箱中冷藏保存备用。

[0101] 1.1.4.3免疫探针干片制作用划膜喷金机将乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物以5μl/cm的流速喷涂在已处理过的聚酯膜上，每条聚酯膜(300mm×17mm)以纵向中心线为轴，对称地喷2条乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物条带，37℃烘干，切成300mm×8.5mm的小条，则成免疫探针干片。将免疫探针干片密封在塑料袋中，置4～8℃冰箱中冷藏保存，备用。

[0102] 1.2层析膜的制备

[0103] 1.2.1血吸虫抗原的制备

[0104] 1.2.1.1血吸虫虫卵的制备

[0105] 1.2.1.1.1血吸虫尾蚴接种兔将保存在4℃冰箱中的日本血吸虫阳性钉螺，用前取出200个，置25℃室温1～2hr后，放在装有脱氯水的100ml烧杯内逸放尾蚴。兔腹部剃毛，使皮肤裸露。用接种环小心在液面挑取液体，置于载玻片上，在显微镜下对尾蚴计数后，将有尾蚴的载玻片贴于兔(体重2.5～3kg的健康新西兰兔)腹部皮肤暴露处5～10min，完成感染，每只兔感染尾蚴约2000条。1.2.1.1.2血吸虫虫卵的分离将感染45d的兔取出肝脏，除去胆囊、胆管、血管及结缔组织，用4℃预冷的1%NaCl洗净血污，将肝脏剪成碎块，加1%NaCl，一并倒入捣碎机内快速捣碎（8000rpm）捣碎过程分4次，间隔进行，每次捣2min，停2min。捣碎的肝脏加1%NaCl稀释，用60、80、100和120目的标准筛过滤。滤液再用260目尼龙网过滤。将尼龙网上虫卵粗提物用1%NaCl洗脱。

[0106] 将洗脱液倒入50ml的消毒离心管内，以3500rpm离心1min，弃去上、中层，下层金黄色虫卵反复用1%NaCl洗涤，离心，直至看不到灰褐色的肝组织为止。将获得的虫卵再用尼龙绢(140、260目)重叠过滤，除去残留的肝组织细胞，260孔尼龙绢上物，经离心沉淀反复除去白褐色絮状物，即得纯净的血吸虫卵。将纯净虫卵分装于1.5ml Eppendorf管中，12000r/min离心30s，以进一步去除虫卵中的水分。

[0107] 1.2.1.1.2血吸虫虫卵的干燥和保存将虫卵置平血中，用冷冻干燥机冻干。密封，置-20℃保存。

[0108] 1.2.1.2血吸虫抗原的提取

[0109] ⑴取血吸虫虫卵1g先用玻璃匀浆器研磨30min，再加少量0.85%NaCl研磨30min，然后配成3%悬液，置4℃冰箱浸泡3d，-20℃反复冻融10次，冰浴超声裂解30min(400W)，13000rpm离心1hr，取上清即成未透析血吸虫可溶性抗原1。-20℃保存，或者直接进行下一步处理。

[0110] ⑵将⑴步骤离心沉淀物用5ml 0.85%NaCl重悬，冰浴超声裂解10min(400W)，垂直混合仪上作用15min,10000rpm离心1hr，取上清即为未透析血吸虫可溶性抗原2。

[0111] ⑶取血吸虫虫卵1g先用玻璃匀浆器研磨30min，再加少量0.85%NaCl研磨30min，然后配成3%悬液，置4℃冰箱浸泡3d，-20℃反复冻融10次，冰浴超声裂解30min(400W)，10000r/min离心1hr，取上清即成未透析血吸虫可溶性抗原3。

[0112] 1.2.1.3血吸虫抗原的透析

[0113] 取血吸虫抗原适量，装入透析袋，用pH7.00.01M PB透析16hr，每隔4hr换透析液1次，透析结束后，以10000r/min离心60min，上清液即为已透析血吸虫抗原。测蛋白含量后，或按体积定量分装，放-20℃保存，或按蛋白量定量分装，冻干，-20℃保存备用，或直接配制生产用抗原。

[0114] 1.2.1.4抗原蛋白含量测定(蛋白测定仪的测定原理相同,已实现程序化和微量化测定)

[0115] 随机取已透析血吸虫抗原3瓶，用pH7.00.01molPB作为稀释液和空白对照，于紫外分光光度计测定吸收值(A280及A260)。按公式：蛋白含量(mg/ml)＝(1.45×A280-0.74×A260)×稀释倍数，计算每1ml抗原的蛋白含量，取平均值。

[0116] 1.2.1.5生产用血吸虫抗原的配制

[0117] 1.2.1.5.1抗原稀释液的配制

[0118] ⑴0.2mol Tris溶液配制称取Tris 2.4228g，蒸馏水定容至100ml，即为0.2M Tris溶液。

[0119] ⑵0.1N HCl溶液配制吸取分析纯浓盐酸4.167ml，蒸馏水定容至500ml。

[0120] ⑶pH8.20.05M TBS缓冲液配制0.2M Tris溶液25ml和0.1N HCl 22.5ml混合，加入NaCl 0.85g，溶解，再用蒸馏水加至100ml即成。

[0121] 1.2.1.5.2生产用血吸虫抗原的配制

[0122] 根据透析处理后抗原蛋白的含量，用pH8.20.05M TBS缓冲液将已透析的抗原稀释成含蛋白1mg/ml的生产用抗原。

[0123] 1.2.2羊抗兔IgG的制备

[0124] 1.2.2.1兔IgG的制备

[0125] ⑴兔血清的制备按无菌操作要求，用心脏采血法采集健康新西兰肉兔的血液，分离血清。

[0126] ⑵兔IgG的提取取兔血清10ml，再加10ml 0.85%NaCl混匀，逐滴加入SAS 10.8ml使之达到35%饱和度，边加边搅拌，并用浓氨水调节pH值至7.0，置4℃过夜后取出，室温平衡1小时，以3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml 0.85%NaCl溶解。再用35%饱和度硫酸铵同法沉淀2次。只是4℃静置时间改为3hr。第3次离心后沉淀物用5ml 0.85%NaCl溶解后，装入直径2cm的透析袋透析内。

[0127] ⑶透析提纯透析于4℃条件下进行，开始先用蒸馏水透析8小时，换液4次，再用+ 2-pH7.00.01M磷酸盐缓冲液(PB)透析6小时，换液2次，以除去以除去NH4 及SO4 。

[0128] ⑷蛋白浓度测定用蛋白测定仪测得兔IgG蛋白质浓度为7.7mg/ml，用PEG浓缩后调整为10mg/ml。-20℃保存备用。

[0129] 1.2.2.2兔IgG免疫羊

[0130] ⑴实验动物选健康雄性波尔山羊2只，体重20kg/只。

[0131] ⑵兔IgG的乳化首免兔IgG油乳剂由兔IgG与弗氏完全佐剂按3:7比例乳化，冰浴超声波击打至将兔IgG油乳剂滴于冷水表面，较长时间保持完整而不分散，即可应用。2-4免的IgG油乳剂由兔IgG与弗氏不完全佐剂按3:7比例制备。

[0132] ⑶免疫首次免疫在羊头颈部皮下、羊双侧后足蹠垫皮下各注射兔IgG油乳剂6.4ml(兔IgG的蛋白含量为19.2mg)，两周后，每2周用兔IgG加强免疫1次，免疫兔IgG的蛋白总量为19.2mg。如此重复3次，末次免疫8天后，耳静脉取少量血，分离出血清，用琼脂扩散法测定免疫血清的效价，待血清效价达1:32时即可釆血，分离血清。即为含羊抗兔IgG的血清。

[0133] 1.2.2.3羊抗兔IgG的提取

[0134] ⑴羊抗兔IgG提取取羊抗兔IgG血清10ml，再加10ml 0.85%NaCl混匀，逐滴加入SAS 8.6ml使之达到30%饱和度，边加边搅拌，并用浓氨水调节pH值至7.0，置4℃过夜后取出，室温平衡1小时，以3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml 0.85%NaCl溶解。再逐滴加入SAS16.4ml使之达到45%饱和度，边加边搅拌，用浓氨水调节pH值至7.0，置
4℃3hr后取出，室温平衡1hr，以3000rpm离心30min，弃上清，沉淀物加入20ml 0.85%NaCl溶解。再用45%饱和度硫酸铵提取一次，离心后沉淀物用5ml 0.85%NaCl溶解后，装入直径
2cm的透析袋透析内。

[0135] ⑵透析提纯透析于4℃条件下进行，开始先用蒸馏水透析8hr，换水4次，再用pH7.00.01M磷酸盐缓冲液(PB)透析6hr，换液2次。透析液3000rpm离心30min取上清液。即为羊抗兔IgG抗体溶液。

[0136] ⑶蛋白浓度测定用紫外分光光度法测得羊抗兔IgG抗体的蛋白质浓度为10mg/ml，-20℃贮存备用。

[0137] 1.2.2.4生产用羊抗兔IgG的配制

[0138] ⑴羊抗兔IgG稀释液的配制羊抗兔IgG稀释液与抗原稀释液相同，配制方法见1.2.1.5.1。

[0139] ⑵生产用羊抗兔IgG的配制

[0140] 0.5mg/ml羊抗兔IgG的配制蛋白含量10mg/ml的羊抗兔IgG 0.5ml与pH8.20.05M TBS缓冲液9.5ml混合即成。

[0141] 1.2.3硝酸纤维素膜的裁剪和贴片

[0142] 选用的硝酸纤维素膜为伊能膜业有限公司的YN120BLF膜，先将膜裁剪成300mm×25mm的小段，取PVC 底板(300mm×80mm)，揭去中间一条保护纸，露出不干胶层，将硝酸纤维素膜有塑料膜背衬的一面粘贴在PVC底板上。

[0143] 1.2.4在硝酸纤维素膜上划出T线和C线

[0144] 将稀释后的血吸虫抗原和羊抗兔IgG抗体用划膜喷金机以3μl/cm的流速，在已粘贴在PVC底板上的硝酸纤维素膜中间划检测T线和质控C线，其中血吸虫抗原划在靠近将来粘贴免疫探针干片一侧，羊抗兔IgG抗体划在靠近粘贴吸水纸一侧，两条线相距5～6mm。

[0145] 1.2.5烘膜与保存

[0146] 将已划好T线和C线的硝酸纤维素膜连同底板置室内晾干，装入密封塑料袋中置4～8℃冰箱中保存备用。

[0147] 1.3样品垫的制作

[0148] 1.3.1样品垫处理液的配制

[0149] 1.3.1.1pH7.2样品垫处理液0.2M Tris 100ml，0.1N HCl 180ml,酪蛋白0.250g,蔗糖25.000g,NaN30.100g混合，37℃水浴溶解，再加入1.0ml吐温-20搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀，即成含酪蛋白0.5%，蔗糖5%，NaN30.02%，吐温-200.2%的pH7.20.04M Tris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液。

[0150] 1.3.2样品垫的制作将玻璃纤维素膜切成23mm×300mm小条，用样品垫处理液浸泡1hr，取出，在37℃烘箱中烘干，即成样品垫。

[0151] 1.4吸水纸的制作

[0152] 将吸水纸(型号：CH37)裁剪成28mm×300mm的小条，在37℃烘箱中烘干即成。

[0153] 1.5标签胶膜的制作

[0154] 1.5.1箭头标签胶膜的制作

[0155] 箭头标签胶膜是一种300mm×18mm的不干胶粘贴纸，在距一条长边1mm处有一条直线，紧挨着这条直线，每隔1.3mm印有“←MAX”字样，箭头与直线垂直。其作用,一方面是指示试纸条插入待检样品液的最大深度；另一方面是保护免疫探针干片不被污染。

[0156] 1.5.2手柄标签胶膜的制作

[0157] 绿色标签保护贴纸由300mm×30mm的不干胶粘贴纸印制，与短边呈15°角，印有4排绿底白字的“SjAb”字样，表示用于检测血吸虫抗体，并保护吸水纸在手拿取时免受污染。

[0158] 1.6试纸条大卡的组装

[0159] 1.6.1取2.2步骤已粘贴好层析膜的PVC底板，揭掉PVC板边上宽度最大的一块保护纸，露出不干胶层，将吸水纸粘贴上去，使之与层析膜重叠约1～2mm。

[0160] 1.6.2取手柄标签胶膜，揭去保护纸，露出不干胶层，将它粘贴在吸水纸上。

[0161] 1.6.3揭掉PVC板上层析膜边上一小条保护纸，露出不干胶层，将免疫探针干片(300mm×8.5mm)粘贴在PVC板的不干胶上，使免疫探针干片与层析膜重叠约1mm。

[0162] 1.6.4揭掉PVC板上在免疫探针干片边上的保护纸，露出不干胶层，将预处理过的样品垫粘贴上去，使之与聚酯膜重叠约1～2mm。

[0163] 1.6.5取箭头标签胶膜粘贴在免疫探针干片和与之相邻的部分样品垫上，使保护膜的空白侧紧贴在层析膜边缘重叠约1mm，箭头侧紧贴样品垫，免疫探针干片完全被标签胶膜覆盖，各部件压平压实即组成大卡。

[0164] 1.7切条、包装和贮存

[0165] 1.7.1切条

[0166] 将试纸条大卡用切条机切成80mm×3mm的试纸条，即为本发明的牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。

[0167] 1.7.2包装

[0168] 1.7.3试纸条的包装

[0169] 80mm×3mm的试纸条按10条/包、20条/包或50条/包的规格，用铝箔袋密封包装。

[0170] 1.7.4贮存

[0171] 试纸条在2～8℃贮存，有效期为12个月。15～30℃室温贮存，有效期为6个月。

[0172] 实施例2：（检测牛日本血吸虫病抗体试纸条的制备2）

[0173] 1试纸条的制作

[0174] ⑴免疫探针干片制备同实施例1中1.1，但有5处不同：

[0175] ①使用300nm蓝色乳胶微球。

[0176] ②在乳胶微球标记时所用兔抗黄水牛IgG蛋白含量为2mg/ml。

[0177] ③封闭液配制称取酪蛋白0.500g、蔗糖10.000g、NaN30.020g全部放入100ml pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液中，37～40℃水浴加热至完全溶解。即配制成含酪蛋白0.5%，蔗糖10%，NaN30.02%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液。

[0178] ④聚酯膜处理液配制0.2M Tris 125ml，0.1N HCl 225ml,酪蛋白2.500g,蔗糖50.000g，NaN30.100g混合，37℃水浴溶解，再加入吐温-201.5ml搅拌均匀，加蒸馏水至
500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0.5%，蔗糖10%，NaN30.02%，吐温-200.3%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液。

[0179] ⑤将乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物喷涂在已处理过的聚酯膜上时，划膜喷金机设定的流速为4μl/cm。

[0180] ⑵层析膜的制备同实施例1中1.2，但有数处不同：

[0181] ①稀释抗原和羊抗兔IgG抗体的缓冲液为pH8.50.05M TBS缓冲液，配制方法为：0.2mol Tris溶液25ml和0.1N HCl 15ml混合，加入NaCl 0.850g，溶解，再用蒸馏水加至
100ml即成。

[0182] ②划线用血吸虫虫卵抗原的蛋白含量为3mg/ml。

[0183] ③划线用羊抗兔IgG抗体的蛋白含量为0.1mg/ml。

[0184] ④血吸虫虫卵抗原和羊抗兔IgG抗体的划膜流速均为2μl/cm。

[0185] ⑤样品垫处理液的配制0.2M Tris 100ml，0.1N HCl 180ml,酪蛋白0.250g,蔗糖50.000g,NaN30.1g混合，37℃水浴溶解，再加入1.0ml吐温-20搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0.5%，蔗糖10%，NaN30.02%，吐温-200.2%的pH7.20.04M Tris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液。

[0186] 其余如样品垫制备、吸水纸制备、试纸条大卡的组装和切条等制作步骤均与实施例1相同。

[0187] 实施例3：（检测牛日本血吸虫病抗体试纸条的制备3）

[0188] 1试纸条的制作

[0189] ⑴免疫探针干片制备同实施例1中1.1，但有4处不同：

[0190] ①在乳胶微球标记时所用兔抗黄水牛IgG蛋白含量为3mg/ml。

[0191] ②封闭液配制称取酪蛋白0.300g、蔗糖5.000g、NaN30.030g全部放入100ml pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液中，37～40℃水浴加热至完全溶解。即配制成含酪蛋白0.3%，蔗糖5%，NaN30.03%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液。

[0192] ③聚酯膜处理液配制0.2M Tris.125ml，0.1N HCl 225ml,酪蛋白1.500g,蔗糖25.000g，NaN30.150g混合，37℃水浴溶解，再加入吐温-202.0ml搅拌均匀，加蒸馏水至
500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0.3%，蔗糖5%，NaN30.03%，吐温-200.4%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液。

[0193] ④将乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物喷涂在已处理过的聚酯膜上时，划膜喷金机设定的流速为3μl/cm。

[0194] ⑵层析膜的制备同实施例1中1.2，但有数处不同：

[0195] ①稀释抗原和羊抗兔IgG抗体的缓冲液为pH8.50.05M TBS缓冲液，配制方法见实施例2。

[0196] ②划线用血吸虫虫卵抗原的蛋白含量为5mg/ml。

[0197] ③划线用羊抗兔IgG抗体的蛋白含量为1mg/ml。

[0198] ④血吸虫虫卵抗原和羊抗兔IgG抗体的划膜流速均为1μl/cm。

[0199] ⑤样品垫处理液的配制0.2M Tris 100ml，0.1N HCl 180ml,酪蛋白0.150g,蔗糖25.000g,NaN30.250g混合，37℃水浴溶解，再加入2.0ml吐温-20搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0.03%，蔗糖5%，NaN30.05%，吐温-200.4%的pH7.20.04M Tris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液。

[0200] 其余如样品垫制备、吸水纸制备、试纸条大卡的组装和切条等制作步骤均与实施例1相同。

[0201] 实施例4:(检测牛日本血吸虫病抗体试纸条的制备4)

[0202] 1试纸条的制作

[0203] ⑴免疫探针干片制备同实施例1中1.1，但有5处不同：

[0204] ①使用200nm蓝色乳胶微球。

[0205] ②在乳胶微球标记时所用兔抗黄水牛IgG蛋白含量为4mg/ml。

[0206] ③封闭液配制称取酪蛋白0.200g、蔗糖10.000g、NaN30.050g全部放入100ml pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液中，37～40℃水浴加热至完全溶解。即配制成含酪蛋白0.2%，蔗糖10%，NaN30.05%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液。

[0207] ④聚酯膜处理液配制0.2M Tris 125ml，0.1N HCl 225ml,酪蛋白1.000g,蔗糖50.000g，NaN30.250g混合，37℃水浴溶解，再加入吐温-202.5ml搅拌均匀，加蒸馏水至
500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0.2%，蔗糖10%，NaN30.05%，吐温-200.5%的pH7.20.05M Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液。。

[0208] ⑤将乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG结合物喷涂在已处理过的聚酯膜上时，划膜喷金机设定的流速为2μl/cm。

[0209] ⑵层析膜的制备同实施例1中1.2，但有数处不同：

[0210] ①稀释抗原和羊抗兔IgG抗体的缓冲液为pH8.50.05M TBS缓冲液，配制方法见实施例2。

[0211] ②划线用血吸虫虫卵抗原的蛋白含量为7mg/ml。

[0212] ③划线用羊抗兔IgG抗体的蛋白含量为2mg/ml。

[0213] ④血吸虫虫卵抗原和羊抗兔IgG抗体的划膜流速均为1μl/cm。

[0214] ⑤样品垫处理液的配制0.2M Tris 100ml，0.1N HCl 180ml,酪蛋白0.050g,蔗糖50.000g,NaN3 0.250g混合，37℃水浴溶解，再加入2.5ml吐温-20搅拌均匀，加蒸馏水至500ml混合均匀。即配制成含酪蛋白0.01%，蔗糖10%，NaN30.05%，吐温-200.5%的pH7.20.04M Tris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液。

[0215] 其余如样品垫制备、吸水纸制备、试纸条大卡的组装和切条等制作步骤均与实施例1相同。

[0216] 实施例5：（应用试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法）

[0217] 1待检血清

[0218] 1.1血吸虫阳性牛血清实验感染血吸虫尾蚴1000～1500条感染35～49d的2头牛血清6份，湖北自然感染血吸虫并经粪孵确诊的牛血清4份。

[0219] 1.2血吸虫阴性牛血清采自血吸虫非疫区浙江金华健康牛血清10份，实验感染锥虫牛血清5份，自然感染肝片吸虫病牛血清5份。

[0220] 2试纸条本试验所用试纸条为实施例2工艺参数制备的试纸条。

[0221] 3检测步骤

[0222] 3.1血清稀释液的配制将Na2HPO4、KH2PO4、NaCl与蒸馏水按重量体积0.199g∶0.082g∶1g∶200ml比例混合，37～40℃水浴加热溶解、冷却后即成血清稀释液；

[0223] （2）待检牛血清的稀释：取1.5ml塑料离心管60支，编号，其中30支离心管每管加入血清稀释液0.05ml，另30支管加入血清稀释液0.1ml,每支离心管中再加入待检血清0.05ml，将待检牛血清与血清稀释液分别按体积1:1和1:2比例混合稀释；

[0224] （3）检测操作：取试纸条60支，平放在操作台上，吸取稀释后的待检血清0.05ml滴在试纸条的样品垫上；

[0225] （4）结果判定：5～15min后观察结果，无论是待检牛血清与血清稀释液按体积1:1或1:2比例稀释，6份实验感染血吸虫病牛血清和4份自然感染牛血清，试纸条的检测T线和质控C线均呈现蓝色条带，判为阳性；而10份非疫区健康牛血清、5份锥虫病牛血清和5份肝片吸虫病牛血清，仅在试纸条的质控C线位置呈现1条蓝色条带，故判为阴性。本试验测试的试纸条按照试纸条的使用方法检测和判断结果，能够正确地检测出血吸虫病阳性牛血清，未见与锥虫病、肝片吸虫病牛血清有交叉反应。

[0226] 试验例1：（试纸条的敏感性试验）

[0227] 1试纸条本试验所用试纸条为实施例3工艺参数制备的试纸条。

[0228] 2待检血清样品用血吸虫尾蚴感染10头健康黄牛，每头感染尾蚴500～1000条，于感染前(0d)和感染后不同时间采血，制备血清。

[0229] 3检测操作待检血清用血清稀释液(配方见“应用试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法”)2倍稀释，吸取0.05ml稀释血清滴加到试纸条的样品垫上，进行免疫层析反应。5～15min根据T线和C线位置显现的颜色判定阴阳性，2条红线判阳性，1条红线判阴性。

[0230] 4检测结果见表1。

[0231] 表1试纸条的敏感性检测情况表

[0232]

[0233] 结果，试纸条检测感染前10头牛血清，全部为阴性反应。检验感染后28d牛血清，有2头牛血清检出阳性反应。实验感染35d～49d的10头牛血清全部检出血吸虫抗体(检出率100%)。据另外的试验，IHA法能够检出实验感染血吸虫35d以及35d以上的血样。说明试纸条的敏感性与IHA法相似或略高。但IHA法检测一个样品约需1～2hr,而用试纸条检测，操作更简单，5～15分钟就能得出结果。

[0234] 试验例2：（试纸条的特异性试验）

[0235] 1试纸条本试验所用试纸条为实施例1工艺参数制备的试纸条。

[0236] 2待检血清样品非疫区健康牛血清20份；血吸虫病阳性牛血清40份，其中实验感染血吸虫尾蚴35～49d牛血清20份，自然感染血吸虫并经粪孵毛蚴法证实阳性的牛血清20份；自然感染东毕吸虫，并经粪检确诊的牛血清20份；自然感染肝片吸虫，经粪检虫卵法证实的奶牛血清15份；实验感染锥虫牛血清15份。

[0237] 3检测操作与结果判定见“应用试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法”。

[0238] 4检测结果见表2。

[0239] 表2试纸条的特异性检测情况表

[0240]

[0241] 用试纸条检测实验感染和自然感染血吸虫病40头牛血清，均为阳性反应。检测东毕吸虫、肝片吸虫、锥虫病牛和健康牛的血清，均为阴性反应。说明该试纸条有较强的特异性，在所检测的样品中未见与其他寄生虫病有交叉反应。试验例3：（试纸条批内批间可重复性试验）

[0242] 1试纸条本试验所用试纸条的批次为：20091103、20091105、20091109、20091111、20091113。按照实施例2工艺参数制备。只是制作T线的血吸虫抗原，前2批所用血吸虫可溶性抗原是由5%虫卵悬液开始制备，而后3批可溶性抗原是由3%虫卵悬液开始制备。用于划线时的浓度均稀释成含蛋白3mg/ml。其他制备条件均相同。

[0243] 2待检血清血吸虫病阳性血清50份(实验感染血吸虫尾蚴500～1000条35～49d的牛血清30份，湖北、四川等疫区自然感染血吸虫并经粪孵法证实的牛血清20份)，血吸虫病阴性牛血清80份(浙江金华、衢州等地牛血清60份，采自浙江富阳屠宰场来自吉林、山东等省黄牛血清20份)。

[0244] 3检测操作待检血清前4次重复用血清稀释液作2倍稀释，第5次重复血清稀释液作3倍稀释，加样量为0.05ml。各批次的试纸条重复检测5次，比较检测结果，观察试纸条批内批间检测结果的可重复性。

[0245] 4检测结果测定结果总结在表3中。

[0246] 表3试纸条的批间和批内的重复性测定结果情况表

[0247]

[0248]

[0249] 每批次前后5次的测定结果均相同，各批次试纸条之间的测定结果也相同，说明制备虫卵抗原时虫卵悬液的初始浓度对试纸条的可重复性影响可以忽略，血清作2倍稀释与作3倍稀释对检测结果没有明显影响。该试纸条的批间和批内重复性均较好，适宜于批量标准化生产。

[0250] 试验例4：（试纸条的保存期试验）

[0251] 1试纸条5批次试纸条与试验例3所用的试纸条相同。在本试验例中，将每批次的试纸条分成两部分保存，一部分置2～8℃冰箱保存，另一部分置15～35℃室温保存。

[0252] 2待检血清实验感染血吸虫病的阳性牛血清20份，健康牛血清20份。

[0253] 3检测方法在保存期试验开始后的第1个月以及试验开始后每隔3个月，取以不同方法保存的试纸条对实验感染血吸虫病的阳性牛血清及健康牛血清各20份进行检测，检测操作的血清稀释与血清用量及结果判断均与试验例3相同。

[0254] 4检测结果见表4。试纸条置4～8℃冰箱保存15个月的阳性检岀率仍为100%，保存18个月的试纸条阳性检出率为80%。而试纸条置室温保存6个月阳性检出率仍为100%，保存9个月就只有70%了。因此，试纸条的保存条件为：4～8℃冰箱保存，有效期定为12个月应该没有问题。

[0255] 表4牛血吸虫病诊断试纸条不同温度条件下保存的测定结果表

[0256]

[0257]

[0258] 试验例5：（用试纸条检测治疗前后实验感染血吸虫病牛的血清抗体消长情况）[0259] 1试纸条本试验所用试纸条为实施例4工艺参数制备的试纸条。

[0260] 2待检血清选用健康黄牛5头，在实验感染血吸虫尾蚴前，牛颈静脉采血，制备的血清作为0w血清。每头牛感染血吸虫尾蚴1000～1500条，牛从感染后第1w至第10w，每周采血一次，分离血清，-20℃保存。牛感染后第11w用吡喹酮进行治疗，每隔7d治疗一次，连续治疗3次。治疗后第1～3w每周采血1次，治疗后第4～24w每两周采血1次，分离血清，-20℃保存待检。

[0261] 3检测操作待检血清用血清稀释液作2倍稀释，吸取0.05ml稀释血清滴加到试纸条的样品垫上，进行免疫层析反应。5～15min根据T线和C线位置显现的颜色判定阴阳性。T线与C线均出现红色条带判为阳性。血清中的抗体水平越高，T线颜色越深，根据T线颜色深浅可判为：呈现浓郁的红色条带为强阳性，以“+++”表示，呈现清晰可见的红色条带，为阳性，以“++”表示，呈现浅红色条带为弱阳性，以“＋”表示。只有C线出现清晰可见红色条带判为阴性，以“－”表示。C线出现一条颜色清晰可见的红色线，而T线出现一条颜色很浅，若隐若显的红色带判为可疑，以“±”表示。

[0262] 4检测结果见表5。

[0263] 表5治疗前后实验感染血吸虫病牛的血清抗体消长情况

[0264]

[0265] 由上表可见，血吸虫感染后第4～5w的牛血清中检测到了抗体，在感染后第8～10w及治疗后第1～4w时，抗体水平达高峰，然后从治疗后第6w开始，抗体水平逐渐下降，
1、2、3、4和5号牛依次在治疗后第24、16、22、20和20w抗体转阴。其结果暗示本试纸条具有一定的早期诊断与疗效考核价值。

[0266] 试验例6：（试纸条与粪孵毛蚴法、IHA法和DIFA法的符合率试验）[0267] 迄今我国还没有被批准上市的血吸虫病诊断试剂。目前常用的检测方法有粪孵毛蚴法、IHA法和DIFA法。

[0268] 1检测试剂

[0269] 1.1试纸条本试验用的试纸条为实施例3工艺参数制备的试纸条，批号为：20091115。

[0270] 1.2血吸虫间凝抗原诊断试剂IHA法所用血吸虫间凝抗原诊断试剂由江西省寄生虫病防治研究所生产，批号为：20091023。

[0271] 1.3斑点金标免疫渗滤法试剂DIFA法所用斑点金标免疫渗滤法试剂由浙江省农科院畜牧兽医研究所试制，批号为：20091015。

[0272] 2待检血清在湖北和四川的重疫区，用粪孵法检测阳性牛中分别采制50头和70头牛血清。从粪孵阴性的牛中采集200头和300头牛的血清。从血吸虫非疫区浙江金华等地采集500头牛血清。实验感染血吸虫尾蚴28d、35d、42d的牛血清各5份。

[0273] 2检测方法

[0274] 2.1试纸条法(免疫层析法)待检血清用血清稀释液作2倍稀释，吸取0.05ml待检稀释血清滴加在试纸条的样品垫上。5～15min判定结果：出现2条蓝线判为阳性，仅出现1条蓝线判为阴性。

[0275] 2.2IHA法每支抗原加蒸馏水1ml溶解，混匀使用。使用U型血凝反应板，用定量滴管(或25μl移液器)滴加0.85%NaCl于血凝反应板第一排第一孔内4滴第二孔加1滴。用定量滴管(或25μl移液器)吸待检血清1滴加入第一排第一孔内，经充分混匀后吸出1滴加入到第二孔内，混匀后弃去1滴，使血清稀释度为1:10。用定量滴管(或25μl移液器)吸取混匀抗原液1滴加入到第二孔内，立即旋转振摇约1min钟(或振荡器摇匀约0.5min)。室温下静置1hr观察结果。红细胞全部沉入孔底，肉眼见边缘光滑、致密的小圆点为阴性。红细胞形成薄层凝集，边缘呈现不规则的皱褶，判为“++++”阳性；红细胞形成薄层凝集，充满整个孔底，判为“+++”阳性；红细胞形成薄层凝集，面积较“+++”小者，判为“++”阳性；红细胞大部分沉集于孔底，形成一圆点，肉眼见周边模糊或中间出现较为明显的空白点，判为“+”阳性。

[0276] 2.3DIFA法使用斑点金标免疫渗滤法试剂盒。待检血清先用0.85%NaCl溶液作80倍稀释。从反应板左边第一孔开始点样，用玻璃毛细管蘸取稀释血清，在反应板小孔的硝酸纤维素膜上轻贴0.5s，每孔点2个样品，每块反应板点10个样品，一次边连续点样5块反应板。点样后3min钟，从最早点样的反应板第一孔滴加甲液0.05ml,间隔5～7s再滴第二孔，依此类推。待甲液渗进反应板中，每孔滴加乙液0.05ml，待乙液渗入后，每孔滴加丙液0.05ml。点样处显现红色斑点，判为阳性，黄色斑点或无色判为阴性。

[0277] 2.4粪孵法粪便孵化血吸虫毛蚴法采用一粪三检的快速粪便毛蚴孵化方法。每一次粪检取新鲜牛粪50g，直接投入260目尼龙筛兜内淘洗至水清，将粪渣放入500ml烧瓶中，于25～26℃下进行孵化。孵化后的1、3、5小时观察毛蚴一次，每次观察时间不少于1分钟。如果观察到毛蚴就判为阳性。没有观察到毛蚴判为阴性。同时要注意在前两次观察以后，应将烧瓶搅拌或振摇数次，以便让积压在粪渣底部的少数虫卵孵出毛蚴。

[0278] 4结果

[0279] 4.1试纸条与粪孵毛蚴法的符合率

[0280] 在湖北和四川的重疫区，用粪孵法检测已确诊的阳性牛血清50份和70份，阴性牛血清200份和300份，血吸虫非疫区浙江采集的粪孵阴性牛血清500份。用试纸条进行检测。比较试纸条法与粪孵毛蚴法的符合率。结果(见表6)对于粪孵阳性牛血清，试验条法与粪孵法的阳性符合率为100%，对粪孵阴性牛血清，试验条法与粪孵法的阴性符合率为99.6%。

[0281] 表6试纸条与粪孵确诊为阴阳性的符合率的检验

[0282]

[0283] 粪孵法操作繁琐，需要近1天的时间才出结果，在虫卵密度低的情况下容易漏检。但阳性结果可靠是其优点。在考察血吸虫病诊断方法可靠性时常被用于对照。试纸条法能够全部检出粪孵阳性牛的血清抗体，说明试纸条检测方法有较高的可靠性。

[0284] 4.2试纸条与IHA法和DIFA法的符合率

[0285] 用试纸条、IHA法和DIFA法分别检测实验感染血吸虫尾蚴28d、35d、42d牛血清各5份，粪卵法确诊自然感染血吸虫病牛血清60份，非疫区健康牛血清60份。检测结果见表
7。

[0286] 表7试纸条检测方法与IHA法和DIFA法的符合率

[0287]

[0288]

[0289] 由上表可见，实验感染28d的牛血清，只有DIFA法可以全部检测出来，除实验感染28d的牛血清之外，对于其余血清，试纸条、IHA和DIFA三种方法的检测结果完全一致。试纸条与两种常用的血清学方法符合率均为100%。但IHA法操作步骤较多，检测速度较慢，完成一次检测需要1～2小时。DIFA法检测速度较快，只需5分种可测40～50个样品。但其试剂制作影响因素多，较难实现程序化、工厂化生产。其试剂为液体，不能通过航空和邮局邮寄。试纸条法操作最简单，只需加样1步，5～15分钟出结果。试纸条为固体，邮寄不受限制。每条试纸条测试一个样品，使用非常灵活。其制备工艺也适于批量化生产。

[0290] 从以上实施例和试验例可见，本发明的牛血吸虫病诊断试纸条具有与IHA法相当的敏感性，较优秀的特异性和可重复性，使用简便灵活，保存期长达1年以上，适于批量工厂化生产。可广泛用于牛血吸虫病的诊断、普查、检疫和治疗药物的疗效考核，具有良好的应用前景。

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