技术领域
[0001] 本
发明涉及降血压肽KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP，尤其是涉及一种基于蛋白折叠指纹条形码设计降血压肽的制备。
背景技术
[0002] 自重组胰岛素问世以来，
蛋白质和多肽类药物引起了人们的广泛关注。蛋白质
水解产生的肽
片段可能具有多种
生物活性，如抗血栓作用和降压作用。其中，降血压肽(Angiotensin-converting Enzyme Inhibitory Peptides，ACEIP)是一类能够降低生物体内血压的小分子多肽，它是血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting Enzyme，ACE)的
抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素II的生成而达到降低血压的目的。由于其具有降血压效果明显，且对正常血压无影响和无
副作用等优点，已成为目前研究的热点。近年来，研究学者们扩大了ACEI肽的蛋白质源，成功从鱼贝类、大豆、玉米和
酒糟等众多食物蛋白中获得了ACE抑制肽。发现和分离鉴定新的降血压肽仍然是降血压肽研究的一个重要方向。
[0003] 蛋白质结构是开展基因组学，药物研发等生物技术研究的重要的信息。蛋白质的生物功能主要取决于蛋白质的
氨基酸序列排列组合及空间折叠构象情况。意图从大量的
数据库中提取出有意义的蛋白信息从而发现或合成出新型的蛋白物仍然是一个新的药物研究热点。然而，目前蛋白质的三维结构解析也基本只能通过X-射线衍射或
核磁共振等较为繁琐复杂的实验方法获得，成本较高，仅只有约1％不到的蛋白质单位结构被成功解析出来。了解并试图改进蛋白质的空间构象可能会找到
疾病的最新靶点，从而实现更好的
治疗效果。因此，如何从大量的蛋白数据库中提取和发现有意义的信息支持后续的生物药物的研发亟需实施。
[0004] 蛋白指纹条形码技术取每五个连续的氨基酸作为一个基本单元，依次推算每一个基本单元的折叠构象，进而得到全部的蛋白质片段构象。其中，每5个氨基酸片段在蛋白质中的任意折叠形状可以通过27个向量条形码来表示。运用这种技术，从蛋白多肽数据库中选择高
频率，高重复性，活性较好的肽，对其进行分析整合，并模拟其相似的空间构象，保持其关键氨基酸不变的情况下，设计了新肽KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP，并对其体内外的降血压活性进行验证。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种基于蛋白折叠指纹条形码设计降血压肽的制备。
[0006] 本发明包括以下步骤：
[0007] 1)分析现有降血压肽数据库，筛选出8％～12％、降压活性IC50小于10μM的高亲和
力的实验多肽，进一步对降血压肽数据库进行比较分析，筛选出高重复率降血压肽数据库列出的文献支持的多肽序列作为参考；
[0008] 2)用蛋白折叠指纹数据
软件对步骤1)中所得多肽序列在保留关键氨基酸及物理化学性质的
基础上，通过蛋白构象全信息，分别选择构象相似进行重新设计，检索确认为未被发现的新型多肽序列KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP；
[0009] 3)将步骤2)得到的新型多肽KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP进行体外ACE活性试验，验证其体外降血压活性；
[0010] 4)将步骤2)得到的新型多肽KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP进行SHR大鼠体内ACE活性试验，验证其体内降血压活性。
[0011] 在步骤1)中，所选用的数据库为降血压肽数据库，可从现有的3340个降血压肽中筛选出8％～12％、降压活性IC50小于10μM的高亲和力的实验多肽；对前10％的肽进行进一步的文献数据库降压数据的比较分析，进而筛选出高重复率文献支持的多肽序列。
[0012] 在步骤3)中，对所得到的新型未被报道过的多肽序列KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP进行体外ACE活性试验，可通过肽与ACE特异性结合的原理，致使ACE催化
马尿酸生成的含量减少，通过马尿酸生成量减少量来量化验证其体外降血压活性。
[0013] 在步骤4)中，对新型多肽KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP进行SHR大鼠体内ACE活性试验，所采用的动物模型为SHR大鼠，即为自发性
高血压大鼠；所采用的阳性对照模型药物为ACEI一线用药卡托普利，并用生理盐水组形成对照组；所采用的体内
给药模式为口服灌胃给药。
[0014] 本发明基于蛋白折叠指纹条形码为设计理念设计了降血压肽KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP，并对其体外ACE抑制活性实验及SHR大鼠口服灌胃给药后的体内降血压活性进行了分析验证。
附图说明
[0015] 图1为KYLCY的体外ACE抑制曲线。
[0016] 图2为SHR大鼠口服灌胃KYLCY降压药效图。
[0017] 图3为RYIGY的体外ACE抑制曲线。
[0018] 图4为SHR大鼠口服灌胃RYIGY降压药效图。
[0019] 图5为IKPNM的体外ACE抑制曲线。
[0020] 图6为SHR大鼠口服灌胃IKPNM降压药效图。
[0021] 图7为IRIPVA的体外ACE抑制曲线。
[0022] 图8为SHR大鼠口服灌胃IRIPVA降压药效图。
[0023] 图9为FKGKYYP的体外ACE抑制曲线。
[0024] 图10为SHR大鼠口服灌胃FKGKYYP降压药效图。
具体实施方式
[0025] 以下
实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0026] 1、设计新肽
[0027] 所选用的数据库为降血压肽数据库，从现有的3340个降血压肽中筛选出10％左右、降压活性IC50小于10μM的高亲和力的实验多肽。对前10％的肽进行进一步的文献数据库降压数据的比较分析，进而筛选出高重复率文献支持的多肽序列。用蛋白折叠指纹数据软件对所得多肽序列在保留关键氨基酸及物理化学性质的基础上，通过蛋白构象全信息，分别选择构象相似的以进行重新设计，检索确认为未被发现的新型多肽序列，得到降血压肽KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP。
[0028] 2、新肽的体外ACE活性抑制实验
[0029] 2.1测定原理
[0030] 测定原理：血管紧张素转化酶(ACE)在37℃、pH8.3下能够水解马尿酰组氨酰亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)生成马尿酸(Hippuric acid)，而降血压肽通过抑制ACE酶活性降低马尿酸的产量，马尿酸在228nm处有最大吸收，反应生成的马尿酸可用乙酸乙酯特异性的提取出来。通过检测在一定时间内生成的马尿酸的量就可计算出降血压肽对ACE酶活性抑制率。
[0031] 抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(Ec-Es)/(Ec-Eb)×100％，其中，Ec为不加入抑制剂条件下得到的光
密度值；Es为加入抑制剂后测得的峰面积；Eb为反应发生前加入HCL阻止反应发生最后测得的峰面积。
[0032] 降血压肽的活性用IC50来表示，IC50的定义为在一定条件下抑制ACE酶活性一半时所需要的抑制剂浓度。
[0033] 2.2反应液的制备
[0034] 取不同浓度的降血压肽溶液10μL，加入5μLACE溶液，在37℃下保温5min，充分反应后加入50μL HHL溶液开始催化反应，在37℃条件下反应30min，然后加入85μL 1.0mol/L HCL中止反应，最终得到反应液。检测反应液中马尿酸的含量来量化不同肽的ACE抑制活性。反应液过0.22μm滤膜后按照如下方法进行测定，记录峰面积。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，进行线性回归。马尿酸检测的HPLC色谱条件如下：色谱柱：( Symmetry C18色谱柱，250×4.6mm，4μm)；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液：乙腈(70:30，v/v)；流速：1mL/min；
检测
波长：228nm；柱温：30℃；进样量：20μL。
[0035] 2.3IC50曲线绘制及统计学分析
[0036] 每个试验重复3次，结果以 表示；采用Graphpad Prism 5绘制IC50曲线及SPSS
数据处理软件进行统计分析。
[0037] 2.4体外IC50评价
[0038] 按照上述方法，绘制不同肽链的IC50曲线，如图1，3，5，7，9所示；并拟合计算IC50值，分别为0.0048,0.23,7.8,76.71,29.07μM。实验表明基于蛋白折叠条形码理念设计的此五条肽体外效果显著，具有明显的抑制ACE的效果。
[0039] 3、新肽体内降压试验
[0040] 3.1动物
[0041] SPF级自发性高血压大鼠(SHR)，雄性，13周龄，体重300±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0042] 3.2动物分组及给药方案
[0043] SHR大鼠三只一笼，单笼喂养，自由进水，保持环境
温度(22±2)℃，
相对湿度(60±5)％，每天光照和黑暗各12h循环。大鼠适应环境一周后，测定其体重和血压，选择收缩压(SBP)>180mmHg、＜220mmHg的大鼠用于实验。符合实验要求的SHR随机分组，每组6只，口服灌胃给药。SHR分为空白Control组(生理盐水)、阳性药物Captopril组(5mg/kg)游离低、中、高不同剂量的KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP(3mg/kg)、YF4-NPs(15mg/kg)、YF4-LNPs(30mg/kg)组。单次灌胃上述制剂后，分别测定各组大鼠不同时间点(0、3、6、9、12、24h)的尾动脉收缩压变化情况，应用GraphPad Prism 5软件进行数据统计处理，采用重复测量的方差分析比较各组间给药前后的血压变化，组内给药前后的血压变化采用
配对t检验，P<
0.05时差异有统计学意义。
[0044] 3.3统计分析
[0045] 每个试验重复3次，结果以x±s表示。采用Graphpad Prism 5及SPSS数据处理软件进行统计分析，当P<0.05时认为差异显著。
[0046] 3.4SHR大鼠体内药效实验
[0047] 研究了给药后24小时内降血压肽降血压效果，结果如图2，4，6，8，10所示，SHR灌喂降血压肽后，收缩压下降，而且降压效果与灌喂剂量呈对应关系。与空白对照组相比，灌胃低剂量KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP多肽组SHR在灌喂降血压肽3h后收缩压下降到最低，SBP分别降低了8，21，22，24，14mmHg，其中三条肽的最大降压效应与阳性药卡托普利组(23mmHg)比较，无统计学差异。中、高剂量组SHR降压效果更为显著，可维持24h。此外，降压肽的降压持续时间要比卡托普利的降压持续时间长。体内外活性实验表新合成的多肽具有明显的降血压作用。
[0048] 由于本发明基于蛋白折叠指纹条形码为设计理念设计的降血压肽KYLCY、RYIGY、IKPNM、IRIPVA和FKGKYYP，方法创新，且体内外数据均显示有良好的药理效果，因此，可开发为具有降血压作用的功能性药物和食品。
