一种基质材料及其制备方法和应用、生物样本检测方法
阅读：0发布：2021-01-20
专利汇可以提供一种基质材料及其制备方法和应用、生物样本检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种基质材料及其制备方法和应用、 生物 样本检测方法，属于检测技术领域。基质材料包括 核壳结构 的颗粒物，颗粒物包括核层、第一壳层以及第二壳层，第一壳层包覆核层，第二壳层包覆第一壳层，其中，核层、第一壳层以及第二壳层均为颗粒，核层主要由 铁 氧 化物构成，第一壳层主要由 二氧化 硅 构成，第二壳层主要由 银 单质构成。基质材料易于合成，且制作成本低，可实现批量生产。另外，其重现性好， 耐盐性 高。采用所述的基质材料可以在减少的检测样品要求用量的前提下，实现快速检测，且可有效抗干扰。，下面是一种基质材料及其制备方法和应用、生物样本检测方法专利的具体信息内容。
1.一种基质材料，其特征在于，所述基质材料包括核壳结构的颗粒物，所述颗粒物包括核层、第一壳层以及第二壳层，所述第一壳层包覆所述核层，所述第二壳层包覆所述第一壳层，其中，核层、第一壳层以及第二壳层均为颗粒，所述核层主要由铁氧化物构成，所述第一壳层主要由二氧化硅构成，所述第二壳层主要由银单质构成。
2.根据权利要求1所述的基质材料，其特征在于，所述核壳结构的颗粒物的粒度为380～400nm，优选地，所述第二壳层具有粗糙的表面，更优选地，构成所述第二壳层的银单质颗粒直径为25～30nm。
3.根据权利要求1或2所述的基质材料，其特征在于，所述铁氧化物包括三氧化二铁、四氧化三铁中的任一种或两种的混合物。
4.一种如权利要求1～3中任一项所述的基质材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
提供颗粒状的铁氧化物；
将所述铁氧化物加入用于反应生成二氧化硅的第一溶液体系中进行反应获得二氧化硅包覆铁氧化物的颗粒；以及将所述二氧化硅包覆铁氧化物的颗粒加入用于反应生成银单质的第二溶液体系中进行反应。
5.根据权利要求4所述的基质材料的制备方法，其特征在于，所述颗粒状的铁氧化物通过以下方式获得：三氯化铁、柠檬酸溶解在乙二醇中，再混入乙酸钠、均相，反应釜内200℃反应10小时，冲洗后在60℃下干燥。
6.根据权利要求4所述的基质材料制的备方法，其特征在于，所述铁氧化物是以分散于乙醇中的形式被加入所述第一溶液体系，所述第一溶液体系包括作为硅源的正硅酸乙酯、作为催化剂的氨水，优选地，在所述第一溶液体系中，反应得到的二氧化硅包覆铁氧化物的颗粒经过冲洗后在60℃下干燥。
7.根据权利要求4所述的基质材料的制备方法，其特征在于，第二溶液体系是含有作为还原剂的聚乙烯聚吡咯烷酮的银氨溶液，优选地，所述二氧化硅包覆铁氧化物的颗粒加入第二溶液体系中进行反应的温度为70℃，优选地，在所述第二溶液体系中，反应得到的所述核壳结构的颗粒物经过冲洗后在60℃下干燥。
8.一种生物样本检测方法，其特征在于，所述检测方法是采用基质辅助激光解吸电离质谱仪进行的，其中，所述基质含有如权利要求1～3中任一项所述的基质材料，所述检测方法包括：
将细菌代谢产物和所述基质材料分别点样于所述基质辅助激光解吸电离质谱仪的靶板，干燥后进行开机检测；
其中，细菌代谢产物是由细菌孵育收集得到的代谢产物按照预设比例稀释得到的具有浓度梯度的多个稀释液。
9.根据权利要求8所述的生物样本检测方法，其特征在于，所述预设的比例是小于1000倍的稀释倍数，优选地，所述检测方法的检测分子量在10000Da以下，且所述基质辅助激光解吸电离质谱仪的检测条件是：正离子检测，且检测到的信噪比大于10的质谱信号为可进行分析的有效信号。
10.如权利要求1～3中任一项所述的基质材料在抗菌方面的应用，所述菌包括大肠杆菌。
一种基质材料及其制备方法和应用、生物样本检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种基质材料及其制备方法和应用、生物样本检测方法。
背景技术
[0002] 基质辅助激光解吸电离质谱作为一种新型的软电离生物样品分析方式，能够对不同分子量级别的物质进行分析。它代表了一种简单、快速、精准的方式，能够同时对多种生物分子进行检测。这种方法的有效性不仅在理论上，也在实际应用中得到了印证。仪器核心部分主要包括基质辅助激光解吸电离离子源和质量分析器。在基质辅助激光解吸电离离子源中，当激光照射在基质和分析物形成的共结晶上时，基质将吸收绝大多数的激光能量，然后将能量传递给分析物。在此过程中将会有质子转移到分析物或者有质子从分析物中脱离出来以促使分析物形成带电离子，完成电离过程。在检测器中，通过测定带电离子的质荷比(m/z)确定待测物质的分子量，并据此用来鉴定不同的物质。基质辅助激光解吸电离质谱所具有的独特优势使其广泛应用于细胞组学，蛋白组学，基因组学的研究当中。
[0003] 1988年，Tanaka和Hillenkamp各自提出了基质辅助激光解吸电离质谱技术，这种方法的成功之处是在质谱中引入了基质(Matrix)。在基质辅助激光解吸电离质谱中，基质起着吸收、传递激光能量，使样品离子化的决定性作用，而且辅助基质的引入还解决了非挥发性和热不稳定性的生物大分子在质谱中的解吸离子化问题，使其能被成功检测。目前，市场上出售的常用基质为α—氰基—4—羟基肉桂酸(CHCA)、2,5—二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、纳米硅膜、类金刚石材料及其衍生物等。基质的存在对于能量传递以及保持分子的完整性及其重要，但基质的引入不可避免地导致了低分子量区域内基质峰的存在，因此大大限制了该方法在小分子分析中的应用。因此，基质种类的选择，浓度的大小，样品和基质的比例大小等选择因素使样品制备更加复杂，很难实现对小分子化合物的快速分析。
[0004] 如上所述，传统的基质容易在小分子量端(m/z<1000)产生背景噪声，对于小分子的检测带来极大的干扰。且在实际的生物体系当中，生物样品通常十分复杂。各种生物大分子的存在，以及不同的酸碱度，含盐量都会对小分子的检测带来阻碍。因此传统的基质难以满足对于小分子检测的需求，一种新型的可以用于生物体系检测，且具有一定的抗干扰和一定的耐盐性的基质材料亟待开发。
[0005] 细菌例如大肠杆菌在生物体中广泛分布，并且在生物医学、腐烂和工业生产中有重大研究意义。逐渐兴起的多重耐药(MDR)细菌造成危害极大的公共安全隐患，而现在对于抗药微生物的有效监测研究却遭遇了瓶颈。细菌的代谢产物的精确检测给上述难题提供了很好的方案，微生物如细菌产生的代谢产物调节自身生长，同时也有利于我们理解和发现其内在的代谢通路和生命活动。传统的分析方法如生化法和电喷雾电离质谱(ESI)因为其繁杂的样品预处理方法难以实现对于小分子快速高效的检测。同时，现在普遍使用的方法中单次检测通常需要毫升级别的样品量，这些给小分子的检测都带来了极大的障碍。
发明内容
[0006] 为改善、甚至解决现有技术中的存在的问题，本发明提出了一种基质材料及其制备方法、生物样本检测方法。
[0007] 本发明是这样实现的：
[0008] 根据本发明的第一方面，提供了一种基质材料。
[0009] 基质材料包括核壳结构的颗粒物，颗粒物包括核层、第一壳层以及第二壳层，第一壳层包覆核层，第二壳层包覆第一壳层，其中，核层、第一壳层以及第二壳层均为颗粒，核层主要由铁氧化物构成，第一壳层主要由二氧化硅构成，第二壳层主要由银单质构成。
[0010] 根据本发明的第二方面，提供了一种前述基质材料的制备方法。制备方法包括：提供颗粒状的铁氧化物；将铁氧化物加入用于反应生成二氧化硅的第一溶液体系中进行反应获得二氧化硅包覆铁氧化物的颗粒；以及将二氧化硅包覆铁氧化物的颗粒加入用于反应生成银单质的第二溶液体系中进行反应。
[0011] 根据本发明的第三方面，提供了一种生物样本检测方法。检测方法是采用基质辅助激光解吸电离质谱仪进行的，其中，基质含有如前述的基质材料，检测方法包括：将细菌代谢产物和所述基质材料分别点样于所述基质辅助激光解吸电离质谱仪的靶板，干燥后进行开机检测。其中，细菌代谢产物是由细菌孵育收集得到的代谢产物按照预设比例稀释得到的具有浓度梯度的多个稀释液。
[0012] 根据本发明的第四方面，提供了一种前述基质材料在抗菌方面的应用，其中所述的菌包括大肠杆菌。
[0013] 本发明实施例的有益效果：
[0014] 本发明实施例提供的基于前述基质材料的检测方法可以一定程度上排除其他生物分子的干扰，选择性地检测特定生物分子，且避免了基质带来的强背景噪声。生物样本检测预处理简单，易于操作：如在检测中只需要通过一定比例的稀释，不需要其他的预处理过程，极大地简化了检测过程。检测要求的样品用量极少：选择合适的稀释比例情况下，只需要极少的样本用于检测，极大促进了生物样品库微型化的进展。整个过程快速高效：整个检测过程，只需要几分钟就可以得到最后的检测结果。基质材料的制作成本低，且易于合成，可以大批量制作。另外，基质重现性好，高耐盐性。待检测样品点与点之间的重复性良好，且基质在高盐的情况下依旧能高效的离子化目标分析物。附图说明
[0015] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0016] 图1为本发明实施例1中制备得到的铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒的工艺流程示意图；
[0017] 图2为本发明实施例1中制备得到的铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒的表征图片，其中，a为扫描电镜表征图片，b为透射电镜(TEM)表征图片；
[0018] 图3为本发明实施例1提供的铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒基于扫描电镜标准的抗菌效果图；
[0019] 图4为本发明实施例2中的以铁氧化物/二氧化硅/银为基质的标准小分子的质谱检测结果；
[0020] 图5为本发明实施例3中的生物样本在培养过程中加入铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒产生的代谢产物的质谱检测结果；
[0021] 图6为本发明实施例3中的生物样本在培养过程中不加入铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒产生的代谢产物的质谱检测结果。
具体实施方式
[0022] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0023] 鉴于现有技术中的生物样本检测的缺陷，有必要提出一种用于生物体系检测的方法，尤其是针对小分子检测的方法。本发明提出了一种用于通过基质辅助激光解吸电离质谱检测小分子的检测方法，以及其适用的基质物质，以改善现有技术中的缺陷。
[0024] 采用本发明提出的基质材料以及基于其的检测方法可以克服传统基质的不足，直接分析。同时，很大程度上削减了细菌样品的用量，对于生物样品库的建立以及微型化有着很大的促进作用。
[0025] 以下针对本发明实施例的基质材料及其制备方法、生物样本检测方法进行具体说明：
[0026] 一种基质材料，其含有核壳结构的颗粒物。所述的颗粒物为多层的核壳结构。本发明实施例中，颗粒物大体上由三层构成。即颗粒物包括核层、第一壳层以及第二壳层，并且第一壳层包覆核层，第二壳层包覆第一壳层。
[0027] 其中，核层、第一壳层以及第二壳层均为颗粒，且核层主要由铁氧化物构成，第一壳层主要由二氧化硅构成，第二壳层主要由银单质构成。
[0028] 构成核层的铁氧化物存在多种可选的材料，例如，三氧化二铁、四氧化三铁中的任一种或两种的混合物。在本发明的其他实施例中，铁氧化物还可以存在其他的各种选择。
[0029] 整体上而言，本发明实施例提出的基质材料是纳米尺度的颗粒物，且进一步地，其中的核层、第一壳层以及第二壳层也均为纳米尺度。换言之，核层由铁氧化物纳米颗粒组合而成，是纳米颗粒的团聚体。第一壳层由二氧化硅纳米颗粒构成，且包裹在核层外。第二壳层由银单质纳米颗粒构成，且包裹在第一壳层外。
[0030] 需要说明的是，在一些示例中，前述的第一壳层包覆在核层外，并非意在限定，第一壳层必须完全地包裹在核层外。例如，构成的第一壳层的二氧化硅纳米颗粒也可以有适当量被混杂于核层的铁氧化物颗粒中。对于包覆在第一壳层外的第二壳层亦然。
[0031] 在本发明的一些示例中，包含于基质材料的核壳结构的颗粒物的粒度为380～400nm，进一步地，粒度为382～388nm，更进一步地，粒度为390～397nm。构成第二壳层的银单质颗粒直径为25～30nm，或进一步地为26～28nm，或更进一步地为27～29nm。
[0032] 优选地，第二壳层具有粗糙的表面。例如，构成第二壳层的银单质纳米颗粒是以松散的形式堆积在第一壳层外，银单质纳米颗粒之间形成适当的纳米尺度的间隙。在一些示例中，构成第一壳层的二氧化硅纳米颗粒可以是紧密地堆积在核层，即第一壳层具有相对较光滑的表面。
[0033] 在本发明实施例中，包括于基质材料的核壳结构的颗粒物的核层、第一壳层以及第二壳层是通过逐次(逐层)反应获得。本实施例中，首先通过反应合成核层(主要包括铁氧化物)，再基于核层合成第一壳层(主要包括二氧化硅)，进一步地，基于第一壳层合成银单质。
[0034] 以下针对基质材料的制作方法进行更详实的阐述。
[0035] 基质材料的制备方包括：
[0036] 步骤S101,提供颗粒状的铁氧化物。
[0038] 在本发明实施例中，铁氧化物是含铁化合物在有机相体系中通过反应合成。例如，三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；在上述的混合溶液中加入乙酸钠，并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系；反应在特氟龙高压反应釜中进行，在200摄氏度下反应10小时以形成铁氧化物纳米颗粒。进一步地，反应获得的铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗，最后在60摄氏度下干燥以备使用。
[0039] 通过前述的方法获得铁氧化物颗粒的粒度可以通过调整氯化铁和柠檬酸钠的用量进行调节，以满足实际的要求。
[0040] 在反应合成铁氧化物颗粒的反应体系中，乙二醇作为溶剂以及还原剂。乙酸钠(醋酸钠)可以增加铁氧化物粒子的静电稳定性，从而阻止其团聚。柠檬酸钠也可以作为稳定剂，与铁离子络合，从而阻止铁离子团聚。
[0041] 步骤S102，将铁氧化物加入用于反应生成二氧化硅的第一溶液体系中进行反应获得二氧化硅包覆铁氧化物的颗粒。
[0042] 本实施例中，铁氧化物是以分散于乙醇中的形式被加入第一溶液体系的。即将铁氧化物分散在乙醇中形成的液相加入第一溶液体系中，通过反应使二氧化硅依附在铁氧化物颗粒生长，从而获得二氧化硅包裹铁氧化物颗粒(如四氧化三铁)的表面。其中，第一溶液体系包括作为硅源的正硅酸乙酯(TEOS)、作为催化剂的氨水。反应获得产物经过洗涤、干燥即可备用。例如，通过乙醇和去离子水冲洗，再于60℃下烘干。
[0043] 本发明实施例中，制作二氧化硅是基于溶胶凝胶法进行的。在整个反应体系中，发生水解和缩聚反应，进而获得二氧化硅。其中，水和醇促进正硅酸乙酯水解形成凝胶，碱性的氨水作为催化剂则可促进二氧化硅微球的形成。
[0044] 步骤S103，将所述二氧化硅包覆铁氧化物的颗粒加入用于反应生成银单质的第二溶液体系中进行反应。
[0045] 本发明实施例中，银单质纳米颗粒主要是通过银离子还原生成。具体是，银氨溶液通过还原剂进行还原制备而得。银氨溶液可以通过如下方式制备：在洁净的容器里加入硝酸银水溶液，再加入氢氧化钠水溶液，振荡至形成白色沉淀。然后，逐渐滴加氨水，直到白色沉淀溶解。
[0046] 作为一种可选的示例中，第二溶液体系是含有作为还原剂的聚乙烯聚吡咯烷酮的银氨溶液。二氧化硅包覆铁氧化物的颗粒加入第二溶液体系中进行反应的温度为70℃。优选地，在第二溶液体系中，反应得到的核壳结构的颗粒物后，经过冲洗并60℃下干燥。作为一种可选的具体冲洗方式，将获得颗粒物用乙醇、水反复冲洗。
[0047] 基于上述的基质材料，本发明还提出了一种生物样本检测方法。所述的检测方法采用基质辅助激光解吸电离质谱仪来实现。其中，基质辅助激光解吸电离质谱仪采用的基质即前述的基质材料。
[0048] 检测方法包括以下步骤：
[0049] 首先，将基质材料与细菌共同孵育并收集细菌的代谢产物。
[0050] 利用基质材料制作孵育体系对细菌进行孵育。具体的孵育条件可以采用发明人已知各种方式进行。作为一种可选的示例，细菌可以是大肠杆菌，或者其他类型的细菌。
[0051] 其次，将代谢产物按照预设比例稀释以获得具有浓度梯度的多个稀释液。本发明实施例中，将收集获得的代谢产物以小于1000倍的稀释倍数进行稀释。
[0052] 再次，将前述的多个稀释液分别点样于基质辅助激光解吸电离质谱仪的靶板，干燥后进行开机检测。
[0054] 本发明提出的利用基质辅助激光解吸电离质谱检测生物样本的方法能够有效的检测出细菌并且可以从500nL生物样本中定性定量检测出生物代谢小分子(例如分子量在10000Da以下)，同时还可以去除由传统基质带来的强烈背景噪声干扰。
[0055] 以下结合实施例对本发明的基质材料及其制备方法、生物样本检测方法作进一步的详细描述。
[0056] 实施例1
[0057] 参阅图1，基质材料制备方法如下：
[0058] 步骤1：三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；步骤2：在上述的混合溶液中加入乙酸钠，并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系；步骤3：反应在铁氟龙高压反应釜中进行，在200摄氏度下反应10小时以形成铁氧化物纳米颗粒；步骤4：将步骤3中得到的铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗，最后在60摄氏度下干燥以备使用；步骤5：将上述氧化铁纳米材料溶于乙醇中；步骤6：以正硅酸乙酯为硅源,氨水为催化剂，生成铁氧化物/二氧化硅纳米颗粒；步骤7：铁氧化物/二氧化硅纳米颗粒通过乙醇和去离子水反复冲洗并在60℃保存烘干以备使用；步骤8：制备银氨溶液，并加入聚乙烯聚吡咯烷酮，加入上述溶液并保持70℃持续反应，通过聚乙烯聚吡咯烷酮还原银氨溶液制备铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒；步骤9：获得的铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒通过乙醇和去离子水反复洗涤并在60℃烘干，作为基质使用。
[0059] 基质的表征：
[0060] 表征所用仪器有：透射电镜(TEM)成像在JEOL JEM-2100F仪器上进行；扫描电镜(SEM)在Hitachi S-4800仪器上进行；动态光散射(DLS)测量在Malvern Zetasizer Nano ZS仪器上进行；接触角测试在EasyDrop设备上进行。
[0061] 表征结果如图2和图3所示：通过SEM图像(图2-a)可以看出铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒基质粒径分布均一，平均粒径在380nm左右。DLS的测量结果为471nm，与之前的SEM结果相一致。根据DLS的测量，颗粒的多分散系数为0.122，证明颗粒具有较好的溶解性和稳定性。最后通过TEM图像(图2-b)可以看出，该粒子由尺寸极小的纳米颗粒组成，其稳定的结构和独特的表面特性都有利于生物样品中分子的检测。
[0062] 本实施例制备的铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒基质抗菌效果可参见图3。
[0063] 下面通过几个典型的应用实施实例来进一步阐明基质辅助激光解吸电离质谱在细菌代谢产物检测体系当中的应用。
[0064] 实施例2
[0065] 本实施例中，采用基质辅助激光解吸电离质谱仪对各种标准小分子样品进行检测。其中，标准小分子可以是葡萄糖标准品、乳糖标准品、半乳糖标准品、亮氨酸标准品、谷氨酸标准品。
[0066] 检测方法如下：
[0067] (1)仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离质谱仪；采用反射模式，正离子检测，去离子水仪器Millipore Milli-Q system。
[0068] (2)对样品进行比例稀释。
[0069] (3)在质谱靶板上进行样品制备，室温下干燥。
[0070] (4)铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒在去离子水中超声震荡分散，当样品干燥后，在样品表面滴加基质混悬液，样品与基质形成二次重结晶。
[0071] (5)干燥后，用于激光解吸离子化质谱分析。
[0072] 检测结果如图4所示。
[0073] 其中，图4-a示出了葡糖糖分子的检测结果：
[0074] 葡萄糖峰值:m/z 203.2053[M+Na]+、219.1834[M+K]+、287.1806[M+107Ag]+、289.1642[M+109Ag]+。
[0075] 其中，图4-b示出了谷氨酸分子的检测结果：
[0076] 谷氨酸峰值:m/z 170.1727[M+Na]+、186.1542[M+K]+、254.1560[M+107Ag]+、256.1738[M+109Ag]+。
[0077] 实施例3
[0078] 代谢小分子的定性检测，分别采取在采用基质和不采用基质的情况下进行检测。
[0079] (1)仪器与试剂的准备：AB 5800MALDI TOF质谱仪，氮激光器，波长355nm，采用反射模式，正离子检测；去离子水仪器Millipore Milli-Q system。数据分析软件Data Explore；图标绘制软件Origin Pro8。
[0080] (2)对细菌代谢产物样品按比例进行稀释。
[0081] (3)分别取不同稀释比例后的样品溶液0.5ul，点样在靶板上。
[0082] (4)对样品体系中的小分子进行定量分析。
[0083] (5)在靶板上点上样品，室温下干燥。
[0084] (6)点样铁氧化物/二氧化硅/银纳米颗粒基质在靶板上，室温下干燥。
[0085] (7)对质谱检测结果进行分析，得出结论。
[0086] 检测结果如图5、图6所示。
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