氯吡格雷、他汀及阿司匹林相关药物代谢基因分型检测复合
扩增体系及试剂盒
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种基于多重
荧光PCR技术和毛细管
电泳技术。利用该技术同时检测氯吡格雷、他汀和阿司匹林药物代谢速率相关的CYP2C19、ApoE、SLCO1B1和PTGS1 4个基因共8个位点多态性，为临床在
治疗心血管等
疾病的个体化用药中提供参考，属于
生物医学领域中的临床分子检测技术。
背景技术
[0002] 心
血管疾病发病率在全世界都有逐年增高的趋势，已成为影响人类健康的第一杀手。然而目前临床上常用的心血管疾病治疗药物，由于个体差异，不同患者服用相同剂量的药物所获得的治疗效果明显不同，这使临床医生应用该药物进行治疗时存在一定困扰。越来越多的研究发现遗传变异是造成药效个体差异的重要因素之一。
[0003] 心血管疾病发病率在全世界都有逐年增高的趋势，已成为影响人类健康的第一杀手。然而目前临床上常用的心血管疾病治疗药物，由于个体差异，不同患者服用相同剂量的药物所获得的治疗效果明显不同，这使临床医生应用该药物进行治疗时存在一定困扰。越来越多的研究发现遗传变异是造成药效个体差异的重要因素之一。研究发现，临床上常用的口服抗凝药、调血脂药以及其他
预防性药物如阿司匹林等，其服用疗效或剂量均与基因多态性相关。下面就临床上常见几大类药物及其可能影响其用药的相关基因进行简单描述。
[0004] 1、氯吡格雷：氯吡格雷是临床上治疗急性
冠状动脉综合征应用最广泛的抗血小板药物，氯吡格雷是药物前体，需经过小肠的吸收和肝脏细胞色素P450的代谢才能转化为有活性的代谢产物。氯吡格雷药物抵抗被认为与遗传因素有关，已有充分研究表明CYP2C19酶在氯吡格雷的代谢中起重要作用。CYP2C19基因存在多个多态性位点，导致个体间CYP2C19酶活存在明显的个体差异。其中CYP2C19*2和CYP2C19*3位点突变均会降低CYP2C19酶的活性，这两种突变可以解释>99％的东方人弱代谢者以及约88％的白种人弱代谢者的表型。而CYP2C19*17位点的突变则使CYP2C19酶活性明显增加，CYP2C19*17携带者有着显著的氯吡格雷强
反应性以及出血
风险明显增加。
[0005] 2、
他汀类药物：他汀类药物是羟甲基
戊二酸单酰辅酶A还原酶
抑制剂，为调节血脂药物，用于心血管疾病和中风的一级和二级预防。他汀类的药物相关候选基因主要为影响药动学的溶质载体有机阴离子转运蛋白1B1(SLCO1B1)和影响其药效学的载脂蛋白E(ApoE)。SLCO1B1的基因多态性与辛伐他汀、普伐他汀引起的肌病强相关。ApoE的主要生理功能是通过与LDL受体结合并参与LDL代谢过程，ApoE基因的变异可影响LDL受体结合活性而影响脂质代谢，不同多态性患者服用他汀类药物疗效存在差异。
[0006] 3、阿司匹林：阿司匹林是很多家庭必备药品，有很好的解热
镇痛作用，不但可以治疗感冒发热，头痛牙痛，还可用于治疗关节痛、风湿病等。此外，阿司匹林可以抑制血小板聚集，所以也可以作为抗栓
基础治疗，主要用于预防和治疗缺血性心脏病、心绞痛、心
肺梗塞、脑血栓形成。
[0007] 综上，药物遗传多态性可表现为药物代谢酶的多态性、药物转运蛋白的多态性，以及药物作用受体或靶点多态性等。这些多态性可能导致了许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异，通过对患者特定药物相关位点基因型的检测，指导制定每个患者的
治疗方案，使患者获得最佳治疗效果，避免药物不良反应，达到用药个体化的目的。
[0008] 目前用于检测基因多态性的方法很多，如直接测序法、荧光定量PCR法、
基因芯片法、高通量测序等。这些检测方法均存在各种不同程度的
缺陷，如操作过程繁琐、重复性差、结果不易判读、检测位点少、检测通量低、检测周期长、检测
费用高等。1、直接测序法：设计测序引物，提取DNA进行PCR扩增与产物测序。该方法的主要缺点在于：(1)PCR反应前需要对样本进行提取DNA，检测
质量与浓度，操作复杂，存在混淆样本的风险。(2)检测多个位点时一个样本需要进行多个反应，检测成本高，对模板量的需求高，操作强度大，并容易造成操作错误和污染。(3)PCR反应后需要对产物进行纯化和测序化学反应等步骤。总体来说就是步骤繁琐，试验周期长，成本高，不利于临床大面积推广。2、RFLP分析法：基于基因突变导致的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定
片段，再利用限制性内切酶进行酶切反应，电泳观察片段的大小，但其具有酶切位点局限性，并且难以进行高通量平行分析。3、荧光定量PCR：实时荧光定量PCR操作简单快速，实验灵敏度高，结果快捷可量化等优点，但是该技术存在样品易污染，易发生交叉反应，
假阳性率高。且通常的荧光定量PCR只能利用一至四个荧光通道，于是最多只能检测4个位点，不能满足多个SNP位点的同时检测。4、基因芯片(gene chip)：基因芯片是通过微加工技术，将数以万计甚至百万计的特定序列的基因探针，有规律地排列固定与
硅片、玻片等支持物上，构成一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行定性和定量分析。其可进行高通量检测，但该方法费用高，对模板需求量大，操作及数据分析复杂，耗时长。
[0009] 因此有必要建立一种同时快速检测这三种基因突变的方法，为医院及其它医疗机构提供一种操作简单、特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强和成本低的检测方案。
发明内容
[0010] 本发明的目的是提供一种与氯吡格雷、他汀及阿司匹林个性化用药相关基因多态性检测的复合扩增体系。该体系具有操作简单、特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强和成本低的检测特点。
[0011] 一种用于氯吡格雷、他汀及阿司匹林个性化用药指导的基因多态性检测PCR复合扩增体系，在该PCR复合扩增体系中能同时对以下8个检测位点进行扩增：CYP2C19*2基因681G>A位点、CYP2C19*3基因636G>A位点、CYP2C19*17基因-806C>T位点、ApoE基因388T>C位点、ApoE基因526C>T位点、SLCO1B1基因521T>C位点、SLCO1B1基因388A>G位点、PTGS1基因-
842A>G位点；所述该PCR复合扩增体系中含有扩增该检测位点的引物组合物：
[0012] ApoE基因388T>C位点：
[0013] 正向野生型引物：5’-GCGGTACTGCACCAGGCGGCCGCA-3’，
[0014] 正向突变型引物：5’-GCGGTACTGCACCAGGCGGCCGCG-3’，
[0015] 反向共用引物：5’-TCGGAACTGGAGGAACAACTGAC-3’；
[0016] ApoE基因526C>T位点：
[0017] 正向野生型引物：5’-CCCGGCCTGGTACACTGCCAGGCG-3’，
[0018] 正向突变型引物：5’-CCCGGCCTGGTACACTGCCAGGCA-3’，
[0019] 反向共用引物：5’-TCGGAACTGGAGGAACAACTGAC-3’；
[0020] CYP2C19*2基因681G>A位点：
[0021] 正向野生型引物：5’-TTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG-3’，
[0022] 正向突变型引物：5’-TTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCA-3’，
[0023] 反向共用引物：5’-AACTAGTCAATGAATCACAGATACGC-3’；
[0024] CYP2C19*3基因636G>A位点：
[0025] 正向野生型引物：5’-ATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGG-3’，
[0026] 正向突变型引物：5’-ATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGA-3’，
[0027] 反向共用引物：5’-GATATTCACCCCATGGCTGTCTA-3’；
[0028] CYP2C19*17基因-806C>T位点：
[0029] 正向野生型引物：5’-GCATTATCTCTTACATCAGAGATG-3’，
[0030] 正向突变型引物：5’-GCATTATCTCTTACATCAGAGATA-3’，
[0031] 反向共用引物：5’-ATCTCTCGGGCTGTTTTCCTTAGATAA-3’；
[0032] PTGS1基因-842A>G位点：
[0033] 正向野生型引物：5’-GATAACTGAGCACCTACTACATGCTGGA-3’，
[0034] 正向突变型引物：5’-GATAACTGAGCACCTACTACATGCTGGG-3’，
[0035] 反向共用引物：5’-CAAGGTACTTATCTTTTCTAGCCCTC-3’；
[0036] SLCO1B1基因388A>G位点：
[0037] 正向野生型引物：5’-AGGTCGATGTTGAATTTTCTGATGAATT-3’，
[0038] 正向突变型引物：5’-AGGTCGATGTTGAATTTTCTGATGAATC-3’，
[0039] 反向共用引物：5’-CACATGCTGGGAAATTGACAGAAAGTA-3’；
[0040] SLCO1B1基因521T>C位点：
[0041] 正向野生型引物：5’-GAATCTGGGTCATACATGTGGATATATGT-3’，
[0042] 正向突变型引物：5’-GAATCTGGGTCATACATGTGGATATATGC-3’，
[0043] 反向共用引物：5’-TAGACAAAGGGAAAGTGATCATACA-3’。
[0044] 在该PCR复合扩增体系中还能扩增下述对照位点：性别Amel基因、人类身份识别位点D5S818和Th01，所述该PCR复合扩增体系中含有扩增该对照位点的引物组合物：
[0045] 对照Amel位点：
[0046] 正向引物：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’，
[0047] 反向引物：5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’；
[0048] 对照D5S818位点：
[0049] 正向引物：5’-GTGGTGTCCCAGATAATCTGTAC-3’，
[0050] 反向引物：5’-GGTGAATAACTCCAAATACTCC-3’；
[0051] 对照Th01位点：
[0052] 正向引物：5’-AGGCTCTAGCAGCAGCTCATG-3’，
[0053] 反向引物：5’-CTGGAAATGACACTGCTACAACTC-3’。
[0054] 所述引物的序列上添加有修饰或以修饰
碱基取代正常碱基，所述修饰为荧光基团修饰、磷
酸化修饰、硫代
磷酸化修饰、
锁核酸修饰或肽核酸修饰。
[0055] 所述引物3’端-2至-15位改动1至3个碱基或/和在引物3’端-15位之后的序列进行改动，所述改动包括末端增加其他序列、删除部分末端序列、改变部分碱基序列。
[0056] 所述8个SNP位点和3个对照位点分别由两种
颜色的荧
光标记，相同荧光标记视为同一组，两组分别为：第一组PTGS1基因-842A>G位点、CYP2C19*3基因636G>A位点、CYP2C19*17基因-806C>T位点、CYP2C19*2基因681G>A位点、D5S818位点；第二组Amel位点、ApoE基因
388T>C位点、SLCO1B1基因521T>C位点、SLCO1B1基因388A>G位点、ApoE基因526C>T位点、Th01位点。
[0057] 所述第一组荧光标记为FAM，第二组荧光标记为HEX。
[0058] 所述8个SNP位点的荧光标记位于反向共用引物的5’端，所述对照位点的荧光标记位于正向引物的5’端。
[0059] 所述氯吡格雷、他汀及阿司匹林个性化用药相关基因联合检测体系，能同时扩增4个基因的8个多态性位点和3个对照位点。该体系中包含11个位点及在体系中的分组见表1：
[0060] 表1检测位点列表
[0061]
[0062] 所述第一组荧光标记为FAM，第二组荧光标记为HEX，其中所述两组位点从上往下的顺序均为实际检测结果图中从小到大的片段排列顺序。
[0063] 优选方案：
[0064] ApoE基因388T>C位点：
[0065] 正向野生型引物：
[0066] 正向突变型引物：
[0067] 反向共用引物：5’-HEX-TCGGAACTGGAGGAACAACTGAC-3’；
[0068] ApoE基因526C>T位点：
[0069] 正向野生型引物：
[0070] 正向突变型引物：
[0071] 反向共用引物：5’-HEX-TCGGAACTGGAGGAACAACTGAC-3’；
[0072] CYP2C19*2基因681G>A位点：
[0073] 正向野生型引物：5’-TTTCCCACTATCATTGACTATTTCCAG-3’
[0074] 正向突变型引物：
[0075] 反向共用引物：5’-FAM-AACTAGTCAATGAATCACAGATACGC-3’
[0076] CYP2C19*3基因636G>A位点：
[0077] 正向野生型引物：
[0078] 正向突变型引物：
[0079] 反向共用引物：5’-FAM-GATATTCACCCCATGGCTGTCTA-3’
[0080] CYP2C19*17基因-806C>T位点：
[0081] 正向野生型引物：
[0082] 正向突变型引物：
[0083] 反向共用引物：5’-FAM-ATCTCTCGGGCTGTTTTCCTTAGATAA-3’
[0084] PTGS1基因-842A>G位点：
[0085] 正向野生型引物：5’-AACTGAGCACCTACTACATGCTGCA-3’，
[0086] 正向突变型引物： 反向共用引物：5’-CAAGGTACTTATCTTTTCTAGCCCTC-3’；
[0087] SLCO1B1基因388A>G位点：
[0088] 正向野生型引物：5’-AGGTCGATGTTGAATTTTCTGATGAAAT-3’
[0089] 正向突变型引物：5’-GATTAGGTCGATGTTGAATTTTCTGATGATTC-3’
[0090] 反向共用引物：5’-HEX-CACATGCTGGGAAATTGACAGAAAGTA-3’
[0091] SLCO1B1基因521T>C位点：
[0092] 正向野生型引物：
[0093] 正向突变型引物：5’-GAATCTGGGTCATACATGTGGATATGTGC-3’
[0094] 反向共用引物：5’-HEX-TAGACAAAGGGAAAGTGATCATACA-3’
[0095] 对照Amel位点：
[0096] 正向引物：5’-HEX-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’
[0097] 反向引物：5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’
[0098] 对照D5S818位点：
[0099] 正向引物：5’-FAM-GTGGTGTCCCAGATAATCTGTAC-3’
[0100] 反向引物：5’-GGTGAATAACTCCAAATACTCC-3’
[0101] 对照Th01位点：
[0102] 正向引物：5’-HEX-AGGCTCTAGCAGCAGCTCATG-3’
[0103] 反向引物：5’-CTGGAAATGACACTGCTACAACTC-3’。
[0104] 本发明所述检测体系，采用的是等位基因特性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)结合定量荧光PCR(Quantitive Fluorescent PCR，QF-PCR)的方法对目的位点进行扩增，通过毛细管电泳进行扩增产物的检测，完成对目的位点分型的检测。对于每个检测位点设置三条引物，对两种分型分别设置一条不同长度的特异引物，以及一条荧光标记的下游引物。每条特异引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增。完成PCR扩增和毛细管电泳检测后，通过特定荧光标记、特定长度的扩增产物的有无即可判定样本特
定位点是否存在特定基因型。
[0105] 上述氯吡格雷、他汀及阿司匹林个性化用药相关基因联合检测体系所对应的检测试剂盒，包括酶
混合液、扩增缓冲液、引物混合物，或以上成分的预混液(PCR Master Mix)。
[0106] 所述试剂盒还包含以下成分：
热启动DNA Taq酶、UDG酶和2×Buffer、阳性对照DNA、阴性对照和内标ROX500。
[0107] 所述氯吡格雷、他汀及阿司匹林个性化用药相关基因联合检测体系的使用方法，主要包括以下步骤：PCR扩增、遗传分析仪检测扩增产物、数据分析、检测结果的判断。
[0108] 本发明方法的特点：
[0109] 1)使用遗传分析仪通过毛细管电泳检测扩增产物：
[0110] 遗传分析仪检测平台是广泛使用的主流检测平台之一，通过毛细管电泳对荧光标记的扩增产物进行检测，检测的主要技术优势在于：
[0111] ①，检测灵敏度高。
[0112] 毛细管电泳结合使用
荧光染料大幅提高了检测灵敏度，比琼脂糖电泳检测灵敏度高100倍以上。能更灵敏地检测到扩增产物，并且明确区分扩增野生型和突变型。另一方面，由于检测灵敏度高，为复合PCR扩增反应提供了更大调整空间。更重要的是，由于检测灵敏度高，降低了对PCR扩增产物量的要求，可以降低PCR反应模板用量、可以降低PCR扩增循环数，节约检材。
[0114] 在通常利用的100-500bp检测范围内可清晰、有效地区分1bp差异。如此高的分辨率使得不会由于产物大小接近而产生误判，也避免了非特异扩增引起的结果误判。另一方面，高分辨率还使得同时检测更多位点成为可能。
[0115] ③，可以同时对2种荧光
信号检测。更进一步拓展了检测范围，使得同时检测更多位点成为可能。
[0116] ④，检测速度快(40分钟)、需要操作少、可自动化大批量检测。
[0117] ⑤，检测结果可利用
软件自动分析判型。
[0118] 2)通过一个多重复合PCR扩增体系能够同时扩增多个位点：
[0119] 本
专利利用一个多重复合PCR扩增体系，实现与心血管个性化用药有关4个基因8个多态性位点的检测。其优势在于：
[0120] ①，极大降低操作强度和检测成本。只一个PCR扩增和一个遗传分析仪检测反应即可完成全部检测。
[0121] ②，单管扩增检测，最大程度上避免了污染和样品混淆等错误。
[0122] 3)位点全面：
[0123] 本体系涵盖了与氯吡格雷、他汀及阿司匹林个性化用药相关基因多态性位点8个，可以为多种药物的个性化用药提供参考，为临床医生提供了更多的患者信息。
[0124] 4)直扩体系与防污染措施：
[0125] 本扩增体系可以直接使用血液、血卡等检材扩增，免除了DNA提取的步骤，操作更加简便，适合于批量操作。另体系中加入了UDG-dUTP防污染措施，可以有效防止产物污染，避免引起假阳性结果。
[0126] 综上，本专利技术路线应用于氯吡格雷、他汀及阿司匹林个性化用药相关基因多态性联合检测。主要优点包括：每个样品只需一个扩增检测反应，一管反应可以得到8个位点的检测结果，相对于市面上的其它检测方法极大降低了操作强度；4小时内可得到结果。
[0127] 本发明与
现有技术相比具有下列优点和效果：
[0128] 1、本发明基于多重PCR和毛细管电泳技术，一管式扩增，同时对与氯吡格雷、他汀和阿司匹林这三类药物代谢相关的4个基因，8个SNP位点进行检测，用于与这4个基因多态性有关的药物用量的指导，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率；此外引入Amel性别位点为内参照用于监测整个反应系统以及评估模板的质量，避免假阴性结果，引入D5S818、Th01两个个体识别位点为内对照，监测操作中可能出现的样本之间的交叉污染。
[0129] 2、增加了CYP2C19*17分型(超快代谢型)检测，分型功能更加全面；
[0130] 3、本发明可以实现血液和血卡的直接扩增，无需任何处理，免除了提取DNA的步骤，同时整合UDG酶-dUTP防污染体系，缩短了样本处理时间，减少了污染的发生；
[0131] 4、本发明利用测序仪检测平台，通过毛细管电泳对荧光标记的扩增产物进行检测，灵敏度高，操作简单，分型结果直观易判读。整个流程3小时内完成全部检测，人工操作时间小于30分钟；
[0132] 5、本发明检测通量高，具备大批量扩增检测能
力。
附图说明
[0133] 图1为遗传分析仪对样品A的血液扩增产物进行检测的结果图谱，
[0134] 图2为遗传分析仪对样品A的DNA扩增产物进行检测的结果图谱。
具体实施方式
[0135] 下面结合
实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0136] 实施例：一种氯吡格雷、他汀及阿司匹林个性化用药相关基因联合检测试剂盒及其对血液和DNA样本进行扩增检测的方法
[0137] 一、检测体系
[0138] 试剂盒包含PCR Master Mix、阳性对照、阴性对照、内标。其中PCR Master Mix主要组分包含热启动DNA Taq酶、UDG酶、扩增缓冲液及各位点引物等。
[0139] 根据等位基因特异性PCR原理，每条特异引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增。为此目的，对各引物进行了一系列特定的改动或修饰。为了协调扩增效率、改进产物峰型、便于毛细管电泳检测，也对引物进行了一系列特定的改动或修饰。本实施例所采用的经过改进优化的引物序列如下：
[0140] ApoE基因388T>C位点：
[0141] 正向野生型引物：
[0142] 正向突变型引物：
[0143] 反向共用引物：5’-HEX-TCGGAACTGGAGGAACAACTGAC-3’；
[0144] ApoE基因526C>T位点：
[0145] 正向野生型引物：
[0146] 正向突变型引物：
[0147] 反向共用引物：5’-HEX-TCGGAACTGGAGGAACAACTGAC-3’；
[0148] CYP2C19*2基因681G>A位点：
[0149] 正向野生型引物：5’-TTTCCCACTATCATTGACTATTTCCAG-3’
[0150] 正向突变型引物：
[0151] 反向共用引物：5’-FAM-AACTAGTCAATGAATCACAGATACGC-3’
[0152] CYP2C19*3基因636G>A位点：
[0153] 正向野生型引物：
[0154] 正向突变型引物：
[0155] 反向共用引物：5’-FAM-GATATTCACCCCATGGCTGTCTA-3’
[0156] CYP2C19*17基因-806C>T位点：
[0157] 正向野生型引物：
[0158] 正向突变型引物：
[0159] 反向共用引物：5’-FAM-ATCTCTCGGGCTGTTTTCCTTAGATAA-3’
[0160] PTGS1基因-842A>G位点：
[0161] 正向野生型引物：5’-AACTGAGCACCTACTACATGCTGCA-3’，
[0162] 正向突变型引物：
[0163] 反向共用引物：5’-CAAGGTACTTATCTTTTCTAGCCCTC-3’；
[0164] SLCO1B1基因388A>G位点：
[0165] 正向野生型引物：5’-AGGTCGATGTTGAATTTTCTGATGAAAT-3’
[0166] 正向突变型引物：
[0167] 反向共用引物：5’-HEX-CACATGCTGGGAAATTGACAGAAAGTA-3’
[0168] SLCO1B1基因521T>C位点：
[0169] 正向野生型引物：
[0170] 正向突变型引物：5’-GAATCTGGGTCATACATGTGGATATGTGC-3’
[0171] 反向共用引物：5’-HEX-TAGACAAAGGGAAAGTGATCATACA-3’
[0172] 对照Amel位点：
[0173] 正向引物：5’-HEX-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’
[0174] 反向引物：5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’
[0175] 对照D5S818位点：
[0176] 正向引物：5’-FAM-GTGGTGTCCCAGATAATCTGTAC-3’
[0177] 反向引物：5’-GGTGAATAACTCCAAATACTCC-3’
[0178] 对照Th01位点：
[0179] 正向引物：5’-HEX-AGGCTCTAGCAGCAGCTCATG-3’
[0180] 反向引物：5’-CTGGAAATGACACTGCTACAACTC-3’。
[0181] 注：1.“－”单下划线代表各引物在引物3’端-2至-15位改动1至3个碱基。
[0182] 2“. ＝”双下划线代表各引物可以在引物3’端-15位之后的序列进行改动，包括末端增加其他序列、删除部分末端序列、改变部分碱基序列。
[0183] 3.所有检测位点反向共用引物均在5’端进行FAM或HEX荧光标记。
[0184] 4.对照位点正向引物均在5’端进行FAM或HEX荧光标记。
[0185] 二、检测方法
[0186] 步骤1：PCR扩增反应
[0187] 1)PCR预混溶液分装(在试剂准备区完成)
[0188] 振荡混匀PCR预混溶液(PCR Master Mix)，预计进行4个检测数，每个PCR反应管分装19μL。
[0189] 2)加入模板(在标本制备区完成)
[0190] 检测模板为
血液样本和DNA样本，向对应PCR反应管中加入模板，1μL血液样本、1μL DNA样品、1μL阳性对照和1μL阴性对照。
[0191] 3)PCR扩增(在扩增区完成)
[0192] 将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内，设置反应体系为20μL。
[0193] 按表2反应程序进行PCR扩增：
[0194] 表2PCR扩增反应程序
[0195]
[0196] 步骤2：扩增产物进行毛细血管电泳检测
[0197] 配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液：(0.5μL分子量内标+8.5μL甲酰胺)×检测样品数，涡旋振荡混匀10-15秒；用移液器给每个检测孔分装9μL的甲酰胺和内标混合物；取1μL扩增产物加入甲酰胺和内标混合物里，盖上封板胶盖。如果需要可以使用离心机短暂离心将样品中的气泡除掉；把样品放置95℃变性3分钟，迅速放置
冰浴上3分钟。按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。检测建议设置进样时间为10秒、进样
电压为3kV、运行时间为1800秒。
[0198] 步骤3：数据分析
[0199] 向GeneMapper软件中导入相关文件，包括Panel、Bin、对应的Analysis Method、ROX500内标。输入样品源数据(.fsa文件)，在相关参数选择栏中
选定之前导入的文件，分析数据。
[0200] 步骤4：检测结果的判定
[0201] 如图所示，图1为血液样本的扩增检测结果图，图2为DNA样本的扩增结果图，其中图中野生型SNP标识为“WT”，突变型则标识为“Mu”。Amel位点男性样本显示为“XY”，女性样本则显示为“X”。
[0202] 各位点分型结果如下表3：
[0203] 表3样本检测结果
[0204]
[0205] 由此可分别获得血液样本和DNA样本4个基因8个多态性位点的基因型，结果显示本体系对血液和DNA可兼容扩增且对结果无影响。
[0206] 临床医师可根据所检测的基因型对患者使用到的药物进行个性化用药。具体的个性化用药指导方案如下表4：
[0207] 表4用药指导方案
[0208]
[0209]
[0210] 基于本实施例的样本基因分型检测结果，可对该患者的用药进行如下方案的调整：
[0211]
[0212] 综上所述，本发明的技术要领及特点，其目的在于让熟知此技术的业内人士能够了解本发明的内容并能以此实施。本发明的内容并不局限在上述的实施例中，凡根据本发明技术思想实质所作的等效变化或修饰，都在本发明的保护范围之内。
