一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法
专利汇可以提供一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，属于分析化学及环境污染检测技术领域。本 发明 采用具有特殊切割位点的切刻内切酶Nb.bpu10I和强链置换效应的Bsm DNA聚合酶通过链置换扩增反应获得大量单链DNA扩增序列。将扩增序列加入到 电极 系统中，与MB序列完全互补，打开三链结构，使G四链体电化学 信号 释放。通过电化学信号与金黄色葡萄球菌数量的关联，实现了对湖 水 中的金黄色葡萄球菌的数量检测。本发明方法具有回收率高，灵敏度高，特异性强等优点。，下面是一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法专利的具体信息内容。
1.一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征是：基于链置换扩增技术和三螺旋分子开关；步骤如下：
首先将生物素修饰的适配体和cDNA序列高温变性，复性后在适宜温度下形成部分互补双链结构；将互补双链溶液加入链霉亲和素磁珠体系中共同孵育，通过生物素-链霉亲和素的结合使部分互补双链修饰到磁珠表面；
同时，电极上修饰包含有G四链体结构的捕获探针，与MB序列茎端互补形成三螺旋结构而捕获MB序列，此时G四链体信号关闭；在金黄色葡萄球菌存在的情况下，磁珠上部分互补双链中适配体与金黄色葡萄球菌结合，使cDNA释放；
将引物，Nb.bpu10I切刻内切酶和Bsm DNA聚合酶加入到cDNA溶液中，Bsm DNA聚合酶通过聚合反应合成完全互补的双链，Nb.bpu10I切刻内切酶在双链分子切割位点处形成切口，Bsm DNA聚合酶从断裂位点处继续合成DNA链，替换旧链，实现循环放大扩增出大量单链DNA；
该单链DNA与电极上MB序列形成完全互补序列双链，从而破坏了电极上原有的三螺旋结构，使得捕获探针释放G四链体电化学信号；建立电化学信号强度与金黄色葡萄球菌数量间线性关系的标准曲线，利用该标准曲线计算样品中的金黄色葡萄球菌含量。
2.根据权利要求1所述检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）磁珠靶标置换系统：将1 μmol•L-1 适配体序列与1 μmol•L-1 cDNA在95℃高温变性
5min 后缓慢降温至37℃复性，形成部分互补双链；取100 μL磁珠悬液，磁性分离后用1 mL PBS缓冲液清洗3次；去除PBS缓冲液，加入200 μL部分互补双链，置于37℃摇床，220 r·min-1 孵育45 min，使部分互补双链的DNA偶联到磁珠表面；
将含有金黄色葡萄球菌的样品在3000 r·min-1离心5 min，使用PBS缓冲液清洗沉淀3次，最后重悬于PBS缓冲液；取100μL含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液加入修饰有部分互补双链DNA的磁珠中，混匀，在37℃摇床中220 r·min-1孵育45 min；使用磁珠分离系统将磁珠移除体系，保留含有游离cDNA的上清液；
（2）链置换扩增体系：取上述步骤（1）溶液加入5μmol•L-1 引物序列，2.5 mmol•L-1 游离的脱氧核糖核苷三磷酸，0.0625U•μL-1 Nb.bpu10I切刻内切酶，0.025 U•μL-1 Bsm聚合酶，1×Buffer R，混匀后37℃孵育1 h；
（3）金电极三螺旋序列修饰与封闭：取粒径为0.5µm和0.05µm的氧化铝粉末分别用双蒸水分散于两块不同的抛光布上，匀速打磨直至金电极表面洁净平滑；
用0.5mol•L-1的H2SO4溶液对电极表面进行电化学清洗，其参数设置为：扫描范围-0.35~ -1.5 V，扫描速率0.1 V·s-1，样品间隔为0.01 V；
分别取0.5 μmol·L-1捕获探针和0.5 μmol·L-1MB序列混合，于37℃水浴120 min，以形成三螺旋DNA结构；将获得的混合溶液浸没金电极表面，28℃下自组装18h，然后用PBS缓冲液洗去多余DNA；立即将金电极放入1 mmol•L-1 巯基己醇MCH溶液，室温暗处反应60 min，冲洗电极；
使用电化学阻抗谱EIS检测表征每一步电极修饰情况；将电极置于0.1 mmol·L-1 [Fe
3-/4-
(CN)6] 中，扫描频率：0.1 Hz 10 kHz；
~
（4）电化学信号释放：将步骤（2）链置换扩增后的混合溶液置80℃孵育20min灭活Nb.bpu10I切刻内切酶和Bsm聚合酶；然后将混合溶液浸没金电极，并在37℃孵育120min并冲洗干净；完成杂交后的金电极在G四链体形成液中浸没反应30min，确保捕获探针能够形成G四链体结构；加入0.2mmol•L-1血红素储存液至溶液中继续进行反应1h，从而得到G4-hemin复合物；提前向检测液中通入氮气30min除去氧气，之后将金电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极分别与电化学工作站连接并浸没于除氧后的检测液中，进行DPV扫描；扫描电压-0.6
0.15V；
~
（5）实际样品检测：将含有金黄色葡萄球菌的水样以步骤（1）（4）所述操作，测定出相~
应的DPV峰电流值，从标准曲线中计算出相应的菌浓度。
3.根据权利要求1或2所述检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征在于：所述适配体序列如SEQ ID No.1所示； cDNA序列如SEQ ID No.2所示；引物序列如SEQ ID No.3所示；
捕获探针如SEQ ID No.4所示；MB序列如SEQ ID No.5所示。
4.根据权利要求2所述检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征在于：步骤（1）中所
3 7 -1
述含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液中的菌浓度为3×10 6×10 CFU·mL 。
~
5.根据权利要求2所述检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征在于：步骤（3）所述捕获探针为5’端修饰HS-(CH2)6的DNA序列。
一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法
技术领域
背景技术
传统的金黄色葡萄球菌检测方法包括微生物学培养法，快速测试片法等，虽然技术成熟，准确性较高，设备易得，但往往需要专业工作人员操作实验，检测周期长，效率低，耗费大量人力物力；新型金黄色葡萄球菌检测方法如酶底物快速检测法，实时荧光定量PCR法等虽然检测流程较短，但依旧回避不了成本较高、灵敏度较低、重复性较差等等诸多问题。
发明内容
5 min 后缓慢降温至37℃复性，形成部分互补双链。取100 μL磁珠悬液，磁性分离后用1 mL PBS缓冲液清洗3次。去除PBS缓冲液，加入200 μL部分互补双链，置于37℃摇床，220 r·min-1 孵育45 min，使部分互补双链DNA偶联到磁珠表面。
具体实施方式
将含有不同浓度金黄色葡萄球菌的样品在3000 r·min-1离心5 min，使用PBS缓冲液清洗沉淀3次后重悬于PBS缓冲液中。将1μmol·L-1适配体序列与1μmol·L-1 cDNA在95℃高温变性5min 后缓慢冷却至37℃孵育120min。取100μL磁珠悬液，置磁力架，磁性分离后用1 mL PBS缓冲液清洗磁珠3次。加入200μL部分互补双链，置37℃摇床，220 r·min-1孵育
45min。磁珠清洗后重悬于100μL含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液，同时用100μL PBS缓冲液代替菌液作为无菌液的对照组，混匀，置37℃摇床中，220 r·min-1孵育45 min，使用磁珠分离系统将磁珠移除体系，保留含有cDNA序列的上清液。加入5μmol•L-1 引物序列，
2.5mmol•L-1 dNTPs，0.0625 U•μL-1 Nb.bpu10I，0.025 U•μL-1 Bsm聚合酶，1× buffer R，混匀后37℃孵育1h。
0.2 mmol•L-1 血红素储存液中继续进行反应1 h，得到 G4-hemin复合物。将金电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极分别与电化学工作站连接并浸没于除氧后的检测液中，进行DPV扫描（扫描电压：-0.6 0.15V），读取不同浓度金黄色葡萄球菌溶液样品对应的峰电流值。根据峰~
电流与金黄色葡萄球菌的浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线。如图2所示，电化学信号强度随着金黄色葡萄球菌浓度的增加而增加，其线性回归方程是y=29.06*logx+
326.69，R2为0.9951，其中y表示峰电流（nA），x表示Log ([金黄色葡萄球菌]/CFU/mL)，该方法的检测限为39 CFU·mL-1。
100 μL水样中。将1 μmol·L-1适配体序列与1 μmol·L-1 cDNA在95℃高温变性5 min 后缓慢冷却至37℃孵育120 min。取100 μL磁珠悬液，置磁力架，磁性分离后用1 mL PBS缓冲液清洗磁珠3次。加入200 μL部分互补双链，置37℃摇床，220 r·min-1孵育45 min。磁珠清洗后重悬于100 μL含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液，同时用100 μL PBS缓冲液代替菌液作为无菌液的对照组，混匀，置37℃摇床中，220 r·min-1孵育45 min，使用磁珠分离系统将磁珠移除体系，保留含有cDNA序列的上清液。加入5 μmol•L-1 引物序列，2.5 mmol•L-1 dNTPs，0.0625 U•μL-1 Nb.bpu10I，0.025 U•μL-1 Bsm聚合酶，1x buffer R，混匀后37℃孵育1 h。
DPV曲线中的峰电流，代入标准曲线可计算出金黄色葡萄球菌浓度。具体测试数据如表2所示。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种从锗单晶多线切割加工油锗混合物中回收锗的方法 | 2020-11-11 | 2 |
| 使用突变的胱硫醇γ-合酶从O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制备L-甲硫氨酸的方法 | 2021-03-27 | 0 |
| 一种增加柑橘甜度的有机复合肥及其制备方法 | 2021-06-20 | 2 |
| 一种黄腐酸型复合肥及其制备方法和应用 | 2020-09-26 | 0 |
| 从废旧锂离子电池负极片中回收石墨片和金属的方法 | 2020-12-19 | 2 |
| 具有密封相容性的润滑组合物 | 2020-09-17 | 1 |
| 一种基于石墨烯电极的亚精胺电化学发光检测法 | 2022-11-04 | 1 |
| 一种矩形纤芯的光子晶体光纤 | 2020-09-04 | 0 |
| 一种不充电锂电池 | 2020-09-19 | 0 |
| 一种解淀粉芽孢杆菌培养工艺方法 | 2020-10-25 | 0 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
