一种提高Kunkel反应突变效率的方法
阅读：397发布：2023-12-09
专利汇可以提供一种提高Kunkel反应突变效率的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种提高Kunkel反应突变效率的方法，通过对DNA模板及其突变引物的密码子进行优化，降低DNA模板与突变引物互补区域的GC含量，并减小突变引物互补区域上、下游的GC含量差异，同时结合一个多级的 退火 程序，有效地提高Kunkel反应突变效率。实验证明上述方法能够显著提高Kunkel反应在单一位点和多位点突变的效率，进而有效提高 噬菌体 展示库的多样性和库容。，下面是一种提高Kunkel反应突变效率的方法专利的具体信息内容。
1.一种提高Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，
通过对DNA模板dU-ssDNA和突变引物的密码子进行优化，降低DNA模板与突变引物互补区域的GC含量，并降低DNA模板与突变引物突变区的上游和下游互补区域的GC含量差异，再进行Kunkel反应。
2.根据权利要求1所述的一种提高Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，Kunkel反应中，针对多位点突变，退火时采用多级冷却程序。
3.根据权利要求1所述的一种提高Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，Kunkel反应具体包括以下步骤：
(1)向突变引物中加入多核苷酸激酶进行磷酸化反应；
(2)将反应产物与dU-ssDNA混合，升温变性，然后退火；
(3)用T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶进行延伸反应合成CCC-dsDNA。
4.根据权利要求1所述的一种提高Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，降低DNA模板与突变引物突变区的上游和下游互补区域的GC含量差异，可以通过密码子优化实现，还可通过调整引物突变区的上游和/或下游互补区域的长度实现。
5.根据权利要求1所述的一种提高Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，优化后的突变引物上游和下游互补区域的GC含量差≤5.0％。
6.根据权利要求1所述的一种提高Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，DNA模板的密码子优化方法为：通过分别将分泌信号肽、酶切位点和pIII的基因依次插入到pbluescript质粒中，构建P Short噬菌粒。
7.一种提高D2E7单链抗体Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)野生型D2E7单链抗体的六个CDR中选取L3、H1、H2和H3用于突变；
2)分别设计四个针对L3、H1、H2和H3的突变引物，四个突变引物分别为LGC L3-Oligo、LGC H1-Oligo、LGC H2-Oligo、LGC H3-Oligo，分别具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；
3)单链抗体DNA模板密码子优化：利用噬菌粒电穿孔入大肠杆菌CJ236细胞培养，再提取dU-ssDNA；
4)采用Kunkel法合成CCC-dsDNA；
5)大肠杆菌电转CCC-dsDNA。
8.根据权利要求7所述的一种提高D2E7单链抗体Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，步骤4)中，Kunkel法合成CCC-dsDNA的具体步骤如下：
41)使用多聚核苷酸激酶对突变引物LGC L3-Oligo、LGC H1-Oligo、LGC H2-Oligo和LGC H3-Oligo中的一条或多条进行磷酸化；
42)将磷酸化引物与dU-ssDNA混合，进行退火反应；
43)加入含有T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶的反应混合物进行延伸反应，合成CCC-dsDNA。
9.根据权利要求8所述的一种提高D2E7单链抗体Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，步骤42)中，突变引物为多个时，退火采用多级冷却，步骤5)中，电转结束后，测定CCC-dsDNA突变效率。
10.根据权利要求7所述的一种提高D2E7单链抗体Kunkel反应突变效率的方法，其特征在于，步骤3)中，针对H3的突变引物还可以为LGC H3-Oligo-B，其具有如SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。
一种提高Kunkel反应突变效率的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因定点突变技术领域，具体涉及一种提高Kunkel反应突变效率的方法。
背景技术
[0002] 定点突变在基因工程和蛋白质工程中是一项广泛应用的重要技术。其中有一种由TA Kunkel发明定点突变方法，其通过将含有编码突变的引物退火到含有尿嘧啶的单链DNA(dU-ssDNA)模板的特定位点上以引入突变。Kunkel突变法是构建多肽、蛋白质和抗体噬菌体展示文库的常用方法。此外，该方法可在一次反应中在抗体的所有互补决定区(CDRs)同时发生多个位点的突变。
[0003] 在蛋白质或者抗体库构建期间，简并引物可在特定区域，如突变热点，野生型CDR中引入数十亿种的突变。一般来说，一个库的多样性和容量取决于Kunkel突变反应效率，即含有预期突变的子代DNA的比例。有报道，Kunkel法突变效率，在单一位点突变时大于50％，多个位点突变时大于30％。采用与Huang等人之前的报道类似的方法，我们的研究结果显示，单一位点诱变的突变效率在0～100％之间，而三位点诱变的效率下降到11.1％(表1)。
[0004] 在定点突变之后去除野生型模板也是一种可以提高抗体库中突变体比例的另一种策略。如果用于诱变的区域含有唯一的限制性核酸内切酶酶切位点，则可以使用相应的限制性内切酶进行消化去除野生型模板。这样可以提高突变效率至99-100％。然而，这种策略增加了额外的实验步骤，包括使用限制性内切酶消化，以及随后的切胶回收，这些步骤不仅会增加实验的时长，同时也会对显著降低库的多样性并使得产物的转化效率降低1/7-1/5。
[0005] 在之前的研究当中，我们对几个实验参数进行控制以提高突变效率，例如控制引物的长度，引物与ssDNA的比例，延伸时间。然而，没有一个带来显著的改善。
发明内容
[0006] 为了解决Kunkel反应突变效率低的技术问题，本发明公开一种提高Kunkel反应突变效率的方法，该方法通过密码子优化、调整模板和引物互补区的GC含量，显著提高Kunkel反应在单一位点和多位点突变的效率，进而提高噬菌体库的多样性和库容。
[0007] 本发明通过下述技术方案实现：
[0008] 一种提高Kunkel反应突变效率的方法，通过对DNA模板dU-ssDNA和突变引物的密码子进行优化，降低DNA模板与突变引物互补区域的GC含量，并降低DNA模板与突变引物突变区的上游和下游互补区域的GC含量差异，再进行Kunkel反应。
[0009] 进一步的，Kunkel反应中，针对多位点突变，退火时采用多级冷却程序。
[0010] 进一步的，如图1所述，Kunkel反应具体包括以下步骤：
[0012] (2)将反应产物与dU-ssDNA混合，升温变性，然后退火；
[0013] (3)用T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶进行延伸反应合成CCC-dsDNA。
[0014] 进一步的，降低DNA模板与突变引物突变区的上游和下游互补区域的GC含量差异，可以通过密码子优化实现，还可通过调整引物突变区的上游和/或下游互补区域的长度实现。
[0015] 进一步的，优化后的突变引物上游和下游互补区域的GC含量差≤5.0％。
[0017] 一种提高D2E7单链抗体Kunkel反应突变效率的方法，包括以下步骤：
[0018] 1)野生型D2E7单链抗体的六个CDR中选取L3、H1、H2和H3用于突变；
[0019] 2)分别设计四个针对L3、H1、H2和H3的突变引物，四个突变引物分别为LGC L3-Oligo、LGC H1-Oligo、LGC H2-Oligo、LGC H3-Oligo，分别具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；
[0020] 3)单链抗体DNA模板密码子优化：利用噬菌粒电穿孔入大肠杆菌CJ236细胞培养，再提取dU-ssDNA；
[0021] 4)采用Kunkel法合成CCC-dsDNA；
[0022] 5)大肠杆菌电转CCC-dsDNA。
[0023] 其中，针对H3的突变引物还可以为LGC H3-Oligo-B，其具有如SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。
[0024] D2E7单链抗体野生型基因WT D2E7 scFV和优化产物基因LGC D2E7 scFV分别具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示核苷酸序列。与野生型模板WT D2E7 scFV相比，密码子优化产物LGC D2E7 scFV在上下游互补区GC含量更低，且不高于50％。
[0025] 其中，步骤4)中，Kunkel法合成CCC-dsDNA的具体步骤如下：
[0026] 41)使用多聚核苷酸激酶(T4 PNK)对突变引物LGC L3-Oligo、LGC H1-Oligo、LGC H2-Oligo和LGC H3-Oligo(或LGC H3-Oligo-B)中的一条或多条进行磷酸化；
[0027] 42)将磷酸化引物与dU-ssDNA混合，进行退火反应；
[0028] 43)加入含有T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶的反应混合物进行延伸反应，合成CCC-dsDNA。
[0029] 本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
[0030] 本发明一种提高Kunkel反应突变效率的方法，通过对DNA模板和突变引物的密码子进行优化，降低DNA模板与突变引物互补区域的GC含量，并降低DNA模板与突变引物突变区的上游和下游互补区域的GC含量差异，大大提高了单一位点突变的突变效率，针对多位点突变，退火时的采用多级冷却系统，提高了多位点突变的效率。附图说明
[0032] 图1为本发明Kunkel突变中引物-模板退火模式图：每条突变引物包括2个部分：一是有简并碱基随机分布的“突变区”；二是位于突变区上、下游的与模板序列互补的“互补区”。
[0033] 图2为本发明实施例4突变效率示意图：(A)不同温度条件下培养宿主菌所得ssDNA产量比较；(B)使用不同温度培养宿主菌所提取的ssDNA(1％琼脂糖凝胶电泳)；(C)使用400ng ssDNA通过Kunkel法合成的CCC-dsDNA(1％琼脂糖凝胶电泳)；(D)以不同温度培养宿主菌所提取的ssDNA为模板，对其CDRH1进行Kunkel突变的效率比较。
[0034] 图3为本发明使用野生型或低GC含量模板及对应引物进行Kunkel突变的效率比较：(A)单一位点(CDRH1或CDRH3)突变效率比较；(B)双位点(CDRL3+CDRH3)突变效率比较；(C)多位点(CDRL3+CDRH1+CDRH2+CDRH3)突变效率比较。
[0035] 图4为本发明不同退火程序对Kunkel突变效率的影响：(A)使用上、下游GC含量“平衡”引物和单级退火程序(90℃，3分钟；50℃或者60℃，5分钟；20℃，5分钟)，单一位点(CDRH3)Kunkel突变效率比较；(B)使用上、下游GC含量“平衡”引物和多级退火程序(90℃，3分钟；65℃、60℃、50℃，各5分钟；20℃，5分钟)，双位点(CDRL3+CDRH3)Kunkel突变效率比较；(C)使用上、下游GC含量“平衡”引物和多级退火程序(90℃，3分钟；65℃、60℃、50℃，各5分钟；20℃，5分钟)，多位点(CDRL3+CDRH1+CDRH2+CDRH3)Kunkel突变效率比较。
具体实施方式
[0036] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
[0037] 本发明中，scFV:单链抗体；dU-ssDNA:含尿嘧啶单链DNA；CCC-dsDNA：共价闭合环状双链DNA；CDR:抗体互补决定区；WT：野生型；LGC：低GC含量。
[0038] 实施例1
[0039] 一、dU-ssDNA的合成
[0040] 噬菌粒pShort(ABLINK Biotech，Chengdu，China)由pBluescript改造来的(通过将分泌信号肽、酶切位点和pIII基因依次插入到pbluescript质粒中(genescript)，构建P Short噬菌粒)，用于展示融合到M13 pIII蛋白的scFvs。大肠杆菌dut-ung-CJ236因缺乏dUTP酶和尿嘧啶-N-糖苷酶，可用于合成dU-ssDNA。dut+/ung+株则用于合成新的链并且消化掉含有尿嘧啶的模板。
[0041] 将噬菌粒电穿孔入CJ236细胞中，第二天，挑五个克隆接种在3毫升含有羧苄青霉素(50μg/ml)，氯霉素(15μg/ml)2YT培养基里，并加入1010pfu/ml M13K07辅助噬菌体(新英格兰生物学实验室)在37℃，200rpm的条件下培养2h。然后加入卡那霉素(25μg/毫升)，培养6小时。最后将所有培养物转入50ml 2YT/Carb50/Kan25/Uridine0.25培养基中，25℃，
200rpm孵育18～20h。在此之后，6000g离心10min，去除细胞。上清液中噬菌体颗粒用PEG8000/NaCl沉淀，1ml PBS重悬。噬菌体的dU-ssDNA由Spin M13试剂盒(Omega)提取，后用NanoDrop1000分光光度计定量，并用琼脂糖凝胶电泳分析。
200rpm孵育18～20h。在此之后，6000g离心10min，去除细胞。上清液中噬菌体颗粒用PEG8000/NaCl沉淀，1ml PBS重悬。噬菌体的dU-ssDNA由Spin M13试剂盒(Omega)提取，后用NanoDrop1000分光光度计定量，并用琼脂糖凝胶电泳分析。
[0042] 二、体外合成CCC-dsDNA
[0043] 采用经典的Kunkel法三步合成异质双共价闭合环状双链DNA(CCC-dsDNA)。具体为：将0.1μg突变引物加入10μl T4多聚核苷酸激酶反应体系中，在37℃磷酸化反应1小时。然后，取6μl产物与1μg的dU-ssDNA混合，在90℃变性3分钟，再采取不同退火方案进行退火。
最后，在20℃条件下，用T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶进行延伸反应合成CCC-dsDNA。
最后，在20℃条件下，用T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶进行延伸反应合成CCC-dsDNA。
[0044] 三、大肠杆菌电转及诱变效率的测定
[0045] CCC-dsDNA用产物纯化试剂盒(Axygen)纯化回收，之后取2μl纯化的CCC-dsDNA与50μlSS320宿主细胞轻轻混合，然后转移到冰冻的离心管里。将混合产物用Bio-Rad电转仪进行电转，电转条件为:电压：2.5kv，电阻200Ω电阻和电容25μf。然后立即向电转细胞中加入已经预热好的SOC培养液0.5ml，重悬电转后的细胞。再将电转杯中的菌液转入1.5ml离心管中于200rpm摇床37℃活化1h，取20μl上述培养液涂布并划线接种于LB/Carb50平板上37℃过夜培养。第二天，在培养皿中随机挑选单克隆。3个平板上至少需要挑取24个克隆，并进行DNA测序。突变效率计算为突变克隆数除以总克隆数。
[0046] 实施例2
[0047] 本实施例与实施例1的区别在于：制备的dU-ssDNA为WT D2E7 scFv；引物采用WT L3-Oligo、WT H1-Oligo、WT H2-Oligo和WT H3-Oligo中的一种或多种，采用单级退火程序：90℃，3min；50℃，5min；20℃，5min。引物核苷酸序列如表2所示，Kunkel反应突变效率如表
3、图3所示。
3、图3所示。
[0048] 实施例3
[0049] 本实施例与实施例1的区别在于：制备的dU-ssDNA为LGC D2E7 scFv；引物采用LGC L3-Oligo、LGC H1-Oligo、LGC H2-Oligo和LGC H3-Oligo中的一种或多种，采用单级退火程序：90℃，3min；50℃，5min；20℃，5min。引物核苷酸序列如表2所示，Kunkel反应突变效率如表3所示。
[0050] 实施例4
[0051] 本实施例与实施例1的区别在于：制备的dU-ssDNA为WT D2E7 scFv，引物采用WT H1-Oligo，dU-ssDNA的合成中，加入1010pfu/ml M13K07辅助噬菌体后培养温度变为25℃。
[0052] 本实施例与实施例2的37℃培养相比，25℃培养CJ236细胞显著提高了ssDNA的产量和纯度(图2A和图2B)。这一结果与之前的研究结果一致。在25℃的培养条件下，从35ml培养上清液中得到21μg的ssDNA，而在在37℃培养条件下，从相同体积的培养液中获得ssDNA 9μg(图2A)。琼脂糖凝胶电泳结果表明有一个条带的大小与在25℃培养得到的ssDNA大小(1.5kb～2kb)符合。而37℃培养得到的ssDNA琼脂糖凝胶电泳结果显示出多条比预期条带更大的非特异性条带(图2b)。然而，使用不同温度培养相同数量的ssDNA，我们没有观察到CCC-dsDNA合成的任何宏观差异(图2C)，且Kunkel突变过程中CDRH1突变效率的任何差异(图2D)。
[0053] 实施例5
[0054] 本实施例与实施例1的区别在于：制备的dU-ssDNA为WT D2E7 scFv；使用引物WT H3-Oligo-B，采用单级退火程序：90℃，3min；50℃或60℃，5min；20℃，5min。
[0055] 本实施例Kunkel反应突变效率如表4、图4A所示。
[0056] 实施例6
[0057] 本实施例与实施例1的区别在于：制备的dU-ssDNA为LGC D2E7 scFv；使用引物LGC H3-Oligo-B，采用单级退火程序：90℃，3min；50℃或60℃，5min；20℃，5min。
[0058] 本实施例Kunkel反应突变效率如表4、图4A所示。
[0059] 实施例7
[0060] 本实施例与实施例1的区别在于：制备的dU-ssDNA为WT D2E7 scFv；使用引物WT H3-Oligo和WT L3-Oligo，采用多级退火程序：90℃，3min；；65℃，5min；；60℃，5min；50℃，5min；20℃，5min。
[0061] 本实施例Kunkel反应突变效率如表5、图4B所示。
[0062] 实施例8
[0063] 本实施例与实施例7的区别在于：制备的dU-ssDNA为LGC D2E7 scFv；引物采用LGC H3-Oligo-B和LGC L3-Oligo，退火温度相同。
[0064] 本实施例Kunkel反应突变效率如表5、图4B所示。
[0065] 实施例9
[0066] 本实施例与实施例1的区别在于：制备的dU-ssDNA为WT D2E7 scFv；使用引物WT L3-Oligo、WT H1-Oligo、WT H2-Oligo和WT H3-Oligo，采用多级退火程序：90℃，3min；；65℃，5min；；60℃，5min；50℃，5min；20℃，5min。
[0067] 本实施例Kunkel反应突变效率如表6、图4C所示。
[0068] 实施例10
[0069] 本实施例与实施例9的区别在于：制备的dU-ssDNA为LGC D2E7 scFv；引物采用LGC L3-Oligo、LGC H1-Oligo、LGC H2-Oligo、LGC H3-Oligo-B，退火程序相同。
[0070] 本实施例Kunkel反应突变效率如表6、图4C所示。
[0071] 表1基于Kunkel突变的定点突变效率统计示例
[0072]
[0073]
[0074] 注:突变区/点经粗体及下划线标识，对互补区上下游的GC％进行分别统计(overlap区上游--下游)。*：对Oligo6而言，其overlap区上游的GC％和Tm值包含了“C”碱基的单点替换。
[0075] 表2各引物互补区上下游的GC％和Tm值统计
[0076]
[0077]
[0078] 注:突变区/点经粗体及下划线标识，LGCD2E7scFv模板的互补区优化碱基为倾斜加粗字体标识，对互补区上下游的GC％进行分别统计(overlap区上游--下游)。
[0080] N表示腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸；M表示腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和胞嘧啶脱氧核糖核苷酸；S表示胞嘧啶脱氧糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸；R表示腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸；Y表示胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，所有寡核苷酸均由Invitrogen合成。引物的GC含量、Tm值和上下游引物互补区的计算是利用在线资源:
[0081] multiprimerAnalyser(ThermoFisher Scientific)以及
[0082] https://www.biophp.org/minitools/melting_temperature/demo.php？formula＝basic完成的。
[0083] 表3野生型和LGC模板多个位点的突变效率比较
[0084]
[0085]
[0086] 表4两种模板使用上下游“GC％平衡”引物和单级退火后的单位点突变效率比较[0087]
[0088] 表5两种模板使用上下游“GC％平衡”引物和多级退火后的双位点突变效率比较[0089]
[0090] 表6两种模板使用上下游“GC％平衡”引物和多级退火后的多位点突变效率比较[0091]
[0092] 本发明中，通过实施例2、3及表2、3可知：通过对D2E7 scFv模板及突变引物密码子的优化，能够显著提升Kunkel反应单位点突变和多位点突变的突变效率。
[0093] 通过实施例5、6及表4可知：通过密码子优化结合退火温度的调整，能够显著提升Kunkel反应单位点突变效率，并且，从实施例5可知，野生型D2E7 scFv模板的CDR H3中，简单的引物长度的延长(WT H3-Oligo-B)和退火温度的升高并没有增加突变效率，反而降低。
[0094] 通过实施例7、8、表5并与实施例2、3对比可知：以WT D2E7 scFv为模板，WT L3-Oligo、WT H3-Oligo为引物进行的Kunkel双位点突变反应中，通过对退火温度的优化，L3 CDR区的突变效率反而下降，H3 CDR区的突变效率略微提升。
[0095] 以LGC D2E7 scFv为模板，LGC L3-Oligo、LGC H3-Oligo-B为引物进行的Kunkel双位点突变反应中，通过对退火温度的优化，L3、H3 CDR区的突变效率均显著提升。即：通过密码子优化结合分级退火的方式，能够显著提升Kunkel反应多位点突变的效率。
[0096] 通过实施例9、10、表6并与实施例2、3对比可知：以WT D2E7 scFv为模板，WT L3-Oligo、WT H1-Oligo、WT H2-Oligo、WT H3-Oligo为引物进行的Kunkel多位点突变反应中，通过对退火温度的优化，各个CDR区的突变效率略有提升，因此，仅通过退火温度的优化难以提高Kunkel反应突变效率。
[0097] 而以LGC D2E7 scFv为模板，LGC L3-Oligo、LGC H1-Oligo、LGC H2-Oligo、LGC H3-Oligo-B为引物进行的Kunkel多位点突变反应中，通过对退火温度的优化，L3和H3 CDR区的突变效率显著提升，即引物LGC L3-Oligo和LGC H3-Oligo-B对退火温度的变化更加敏感，总的突变效率也明显提升。通过密码子优化结合分级退火的方式，能够显著提升Kunkel反应多位点突变的效率。
[0098] 以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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