一种髓过氧化物酶检测试剂及其制备和使用方法
专利汇可以提供一种髓过氧化物酶检测试剂及其制备和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种髓过 氧 化物酶检测 试剂 及其制备和使用方法。应用该检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对髓过氧化物酶含量的自动化测定，可以高通量、快速化、精确地测定 生物 样本中髓过氧化物酶的含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低髓过氧化物酶检测成本，有利于临床广泛推广使用。，下面是一种髓过氧化物酶检测试剂及其制备和使用方法专利的具体信息内容。
1.一种髓过氧化物酶检测试剂，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1中包含抗髓过氧化物酶特异性抗体和均相酶底物溶液；所述试剂R2包含髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物和R2缓冲液。
2.根据权利要求1所述的髓过氧化物酶检测试剂，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
A.试剂R1的制备：将质量分数5.0%的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、5.0%的葡萄糖-
6-磷酸、0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3的用55 mmol/L、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗髓过氧化物酶特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到试剂R1，所述抗髓过氧化物酶特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:100～1:10000；
优选地，所述抗髓过氧化物酶特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:450；
B.试剂R2的制备：将质量分数0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3用120 mmol/L、pH=8.2的Tris缓冲液溶解制成R2缓冲液，再将髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物加入所述R2缓冲液中混匀，得到试剂R2，所述髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:1350。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的髓过氧化物酶均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的抗髓过氧化物酶特异性抗体，由髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原免疫实验动物后产生，所述抗体为完整抗体分子，或者为保留与髓过氧化物酶氨基末端三肽特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种，优选为兔；
所述抗髓过氧化物酶特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
a.用PBS缓冲液将髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原稀释至3.0 mg/ml，得到免疫原溶液，然后用3.0 ml所述免疫原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
b.2周后，再用3.0 ml相同的免疫原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔2～5周注射一次，共计注射3～8次；
c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到抗髓过氧化物酶特异性抗体。
4.根据权利要求3所述的髓过氧化物酶均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原由髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物与载体连接而成，其结构式如下述式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）；
所述载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白；
所述髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（1）将质量分数1.0%的载体蛋白溶解于0.2 mmol/L，pH=8.5的磷酸缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（2）将质量分数0.5%的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物、5.0%的二甲基甲酰胺、5.0%的乙醇溶解于10 mmol/L，pH=5.0的磷酸钾缓冲液中，再加入质量分数0.5%的1-乙基-3-(-
3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学物质在25～35℃下搅拌反应30～60分钟；
（3）将步骤（2）中溶解好的溶液缓慢滴加至步骤（1）中的载体蛋白溶液中，并在-4～0℃下搅拌12～24小时，得到偶联物溶液，将反应后的偶联物溶液进行透析纯化，纯化后所得溶液即为髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原溶液，在髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原溶液中加入质量分数0.10%的NaN3，于-20℃下储存。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的髓过氧化物酶均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物由髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）；
所述髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤：
①葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将质量分数2.5%的规格为200KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下溶解于含有0.05 mol/L Tris、3.6 mmol/L MgCl2和1.8 mmol/L NaCl，pH=8.5～9.0的溶液中；在此溶液中加入质量分数10.0%的还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、
7.5%的葡萄糖-6-磷酸以及1.5%的卡必醇；加热到30～35℃，再缓慢加入质量分数0.5%的二甲基亚砜，摇匀后静置15～25秒；
②髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物的激活：在无水状态下将质量分数0.5%的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物，溶解于5.0%的二甲基甲酰胺中；将此溶液温度降到-10～-15℃；然后加入1.5%的三丁胺、2.5%的氯甲酸异丁酯、1.5%的碳二亚胺；0.5%的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；-10～-15℃搅拌30～60分钟；
③葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物的连接：将步骤②中激活的温度为-10～-15℃的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物溶液逐滴加入到步骤①中溶解的温度为30-35℃的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2～8℃搅拌12～24小时；
④纯化产物：将反应后的连接产物通过G-25葡聚糖凝胶层析柱进行纯化，纯化后所得溶液即为髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物溶液，在髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物溶液中加入质量分数0.65%的BSA和质量分数0.10%的NaN3，于2～8℃下储存。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的髓过氧化物酶均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物，其结构式如下述式（Ⅲ）所示：
式（Ⅲ）；
上述式（Ⅲ）所示的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物的合成路线如下：
。
7.根据权利要求6所述的髓过氧化物酶均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物的合成路线，具体制备步骤如下：
（Ⅰ）合成化合物3：将22 g化合物1溶解于100 ml 二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入32 g 四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU）、10 g化合物2和20 g三乙胺（TEA）制成反应混合物，将上述混合物在室温下搅拌2小时，然后倒入200ml的纯化水中，过滤，将滤饼在真空中干燥，得到化合物3；
（Ⅱ）合成化合物4：在100 ml 二氯甲烷（DCM）中加入24 g化合物3，在0℃下加入20 ml的HCl/MeOH（2 mol/L），将此混合物在室温下搅拌12小时，然后减压蒸发，得到化合物4；
（Ⅲ）合成化合物6：将15 g化合物4和8 g 三乙胺在100 ml二氯甲烷（DCM）中搅拌混合，然后加入15 g N,N'-二环己基卡二亚胺和12 g化合物5，将反应混合物在室温条件下搅拌5小时，然后用饱和碳酸氢钠水溶液冲洗，使用无水硫酸镁进行干燥，过滤后在真空中进行浓缩，所得粗产物经硅胶层析纯化，经洗脱得到化合物6；
（Ⅳ）合成化合物7：在100 ml 二氯甲烷（DCM）中加入17 g化合物6，在0℃下加入15 ml的HCl/MeOH（2 mol/L），将此混合物在室温下搅拌12小时，然后减压蒸发，得到化合物7；
（Ⅴ）合成化合物9：将13 g化合物7溶解于100 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入26 ml二异丙基乙胺（DIEA）、23 g四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）和15 g化合物8，将此反应混合物在室温下搅拌12小时，反应结束后在反应混合物中加入250 mL纯化水，过滤，将滤饼在真空中干燥，得到化合物9；
（Ⅵ）合成髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物：将20 g化合物9溶解于250ml HCl溶液（6mol/L）中，在25℃下搅拌12小时，然后进行减压浓缩，浓缩产物在室温下用乙腈研磨12小时，所得浆料经过滤后减压干燥过夜，得到髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物；
。
8.一种如权利要求1所述的髓过氧化物酶检测试剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂，混匀，37℃温育3-5分钟；
（二）加入R2试剂，混匀，37℃恒温5-10分钟后，340 nm波长进行检测，连续监测3分钟内的吸光度变化率，由全自动生化分析仪自动计算待测样本中髓过氧化物酶的含量；
所述试剂R1与试剂R2按1:1～4:1的体积比使用，优选按4∶1的体积比使用。
9.根据权利要求8所述的髓过氧化物酶检测试剂的使用方法，其特征在于，所述的待测样本为生理样本；优选地，所述的生理样本为血清、血浆、尿液、唾液；更优选地，所述的生理样本为血清或血浆。
一种髓过氧化物酶检测试剂及其制备和使用方法
技术领域
背景技术
发明内容
6-磷酸、0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3的用55 mmol/L、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗髓过氧化物酶特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到试剂R1，所述抗髓过氧化物酶特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:100～1:10000；
优选地，所述抗髓过氧化物酶特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:450；
B.试剂R2的制备：将质量分数0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3用120 mmol/L、pH=
8.2的Tris缓冲液溶解制成R2缓冲液，再将髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物加入所述R2缓冲液中混匀，得到试剂R2，所述髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:1350。
b.2周后，再用3.0 ml相同的免疫原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔2～5周注射一次，共计注射3～8次；
c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到抗髓过氧化物酶特异性抗体。
所述载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白。
（2）将质量分数0.5%的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物、5.0%的二甲基甲酰胺、5.0%的乙醇溶解于10 mmol/L，pH=5.0的磷酸钾缓冲液中，再加入质量分数0.5%的1-乙基-3-(-
3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学物质在25～35℃下搅拌反应30～60 分钟；
（3）将步骤（2）中溶解好的溶液缓慢滴加至步骤（1）中的载体蛋白溶液中，并在-4～0℃下搅拌12～24小时，得到偶联物溶液，将反应后的偶联物溶液进行透析纯化，纯化后所得溶液即为髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原溶液，在髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原溶液中加入质量分数0.10%的NaN3，于-20℃下储存。
7.5%的葡萄糖-6-磷酸以及1.5%的卡必醇；加热到30～35℃，再缓慢加入质量分数0.5%的二甲基亚砜，摇匀后静置15～25秒；
②髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物的激活：在无水状态下将质量分数0.5%的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物，溶解于5.0%的二甲基甲酰胺中；将此溶液温度降到-10～-15℃；然后加入1.5%的三丁胺、2.5%的氯甲酸异丁酯、1.5%的碳二亚胺；0.5%的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；-10～-15℃搅拌30～60分钟；
③葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物的连接：将步骤②中激活的温度为-10～-15℃的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物溶液逐滴加入到步骤①中溶解的温度为30～35℃的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2～8℃搅拌12～24小时；
④纯化产物：将反应后的连接产物通过G-25葡聚糖凝胶层析柱进行纯化，纯化后所得溶液即为髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物溶液，在髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物溶液中加入质量分数0.65%的BSA和质量分数0.10%的NaN3，于2～8℃下储存。
上述式（Ⅲ）所示的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物的合成路线如下：
（Ⅱ）合成化合物4：在100 ml 二氯甲烷（DCM）中加入24 g化合物3，在0℃下加入20 ml的HCl/MeOH（2 mol/L），将此混合物在室温下搅拌12小时，然后减压蒸发，得到化合物4；
（Ⅲ）合成化合物6：将15 g化合物4和8 g 三乙胺在100 ml二氯甲烷（DCM）中搅拌混合，然后加入15 g N,N'-二环己基卡二亚胺和12 g化合物5，将反应混合物在室温条件下搅拌5小时，然后用饱和碳酸氢钠水溶液冲洗，使用无水硫酸镁进行干燥，过滤后在真空中进行浓缩，所得粗产物经硅胶层析纯化，经洗脱得到化合物6；
（Ⅳ）合成化合物7：在100 ml 二氯甲烷（DCM）中加入17 g化合物6，在0℃下加入15 ml的HCl/MeOH（2 mol/L），将此混合物在室温下搅拌12小时，然后减压蒸发，得到化合物7；
（Ⅴ）合成化合物9：将13 g化合物7溶解于100 ml二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入26 ml二异丙基乙胺（DIEA）、23 g四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）和15 g化合物8，将此反应混合物在室温下搅拌12小时，反应结束后在反应混合物中加入250 mL纯化水，过滤，将滤饼在真空中干燥，得到化合物9；
（Ⅵ）合成髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物：将20 g化合物9溶解于250ml HCl溶液（6mol/L）中，在25℃下搅拌12小时，然后进行减压浓缩，浓缩产物在室温下用乙腈研磨12小时，所得浆料经过滤后减压干燥过夜，得到髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物。
（一）在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂，混匀，37℃温育3-5分钟；
（二）加入R2试剂，混匀，37℃恒温5-10分钟后，340 nm波长进行检测，连续监测3分钟内的吸光度变化率，由全自动生化分析仪自动计算待测样本中髓过氧化物酶的含量；
所述试剂R1与试剂R2按1:1～4:1的体积比使用，优选按4∶1的体积比使用。
附图说明
具体实施方式
式（Ⅲ）。
利用VARIAN MERCURY plus 400MHz对上述棕色固体化合物进行1H核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ4.48-4.53 (m, 1H), 4.01-
4.08 (m, 2H), 3.47-3.56 (m, 3H), 2.61-2.68 (m, 1H), 2.41-2.49 (m, 4H), 2.09-
2.17 (m, 5H), 1.09-1.12 (m, 6H)。
式（Ⅰ）。
（2）将质量分数0.5%的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物、5.0%的二甲基甲酰胺、5.0%的乙醇溶解于10 mmol/L，pH=5.0的磷酸钾缓冲液中，再加入质量分数0.5%的1-乙基-3-(-
3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学物质在30℃下搅拌反应45分钟；
（3）将步骤（2）中溶解好的溶液缓慢滴加至步骤（1）中的载体蛋白溶液中，并在-4℃下搅拌18小时，得到偶联物溶液，将反应后的偶联物溶液进行透析纯化，纯化后所得溶液即为髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原溶液，在髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原溶液中加入质量分数0.10%的NaN3，于-20℃下储存。
a.用PBS缓冲液将髓过氧化物酶氨基末端三肽免疫原稀释至3.0 mg/ml，得到免疫原溶液，然后用3.0 ml所述免疫原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射；
b. 2周后，再用3.0 ml相同的免疫原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物兔注射一次，之后每隔3周注射一次，共计注射5次；
c.对免疫后的实验动物兔取血，分离纯化得到抗髓过氧化物酶特异性抗体，测定其效价为1∶9500。
式（Ⅱ）；
该髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物的合成方法具体步骤如下：
①葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将质量分数2.5%的规格为200KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下溶解于含有0.05 mol/L Tris、3.6 mmol/L MgCl2和1.8 mmol/L NaCl，pH=8.8的溶液中；在此溶液中加入质量分数10.0%的还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、7.5%的葡萄糖-6-磷酸以及1.5%的卡必醇；加热到33℃，再缓慢加入质量分数0.5%的二甲基亚砜，摇匀后静置20秒；
②髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物的激活：在无水状态下将质量分数0.5%的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物，溶解于5.0%的二甲基甲酰胺中；将此溶液温度降到-12℃；然后加入1.5%的三丁胺、2.5%的氯甲酸异丁酯、1.5%的碳二亚胺；0.5%的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；-12℃搅拌45分钟；
③葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物的连接：将步骤②中激活的温度为-12℃的髓过氧化物酶氨基末端三肽衍生物溶液逐滴加入到步骤①中溶解的温度为33℃的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；4℃搅拌18小时；
④纯化产物：将反应后的连接产物通过G-25葡聚糖凝胶层析柱进行纯化，纯化后所得溶液即为髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物溶液，在髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物溶液中加入质量分数0.65%的BSA和质量分数0.10%的NaN3，于4℃下储存。
6-磷酸、0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的 NaN3的用55 mmol/L、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗髓过氧化物酶特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到试剂R1，所述抗髓过氧化物酶特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1: 450；
B.试剂R2的制备：将质量分数0.1%的牛血清白蛋白、0.05%的NaN3用120 mmol/L、pH=
8.2的Tris缓冲液溶解制成R2缓冲液，再将髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物加入所述R2缓冲液中混匀，得到试剂R2，所述髓过氧化物酶氨基末端三肽酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1: 1350。
（1）设置迈瑞 BS480全自动生化分析仪反应参数（表1）。
样本浓度 (ng/mL) 50.00 250.00 750.00
1 52.54 257.33 763.27
2 53.29 255.19 759.18
3 49.77 245.78 741.60
4 51.53 251.22 765.15
5 52.01 256.10 750.34
6 53.50 247.43 759.89
7 50.69 255.92 740.56
8 47.83 252.00 759.67
9 52.51 247.58 762.03
10 49.75 250.21 759.20
平均值(ng/mL) 51.34 251.88 756.09
标准差（SD） 1.81 4.13 8.82
精密度（CV%） 3.53 1.64 1.17
回收率（%） 102.68 100.75 100.81
检测结果：本发明的髓过氧化物酶均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率均在
95%-105%之间；精密度高，CV均低于5%。
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