检测还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法
阅读：149发布：2023-03-26
专利汇可以提供检测还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种基于表面增强拉曼 光谱 技术的检测还 原型 谷胱甘肽(GSH)和/或 氧 化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，还涉及用于检测GSH和/或GSSG的 试剂 盒 。本发明的检测方法和试剂盒操作简便、检测速度快和灵敏度高，可以很好地应用于烷基化试剂染毒细胞样品中GSH和GSSG含量的测定，从而实现烷基化试剂快速筛查检测。，下面是检测还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法专利的具体信息内容。
1.一种试剂盒，包括：
SERS固态增强基底，和
5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，
优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。
2.权利要求1的试剂盒，其中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或
PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。
3.权利要求1或2的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的用途。
4.一种试剂盒，包括：
SERS固态增强基底，
5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，
N-乙基马来酰亚胺(NEM)，
硼氢化钠，和
乙酸，
优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。
5.权利要求4的试剂盒，其中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或
PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。
6.权利要求4或5的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。
7.一种试剂盒，包括：
SERS固态增强基底，
5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，和
硼氢化钠，
优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。
8.权利要求7的试剂盒，其中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或
PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。
9.权利要求7或8的试剂盒用于检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。
10.一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的方法，包括以下操作：
向待测溶液中加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，孵育；
将孵育后的溶液滴加到SERS固态增强基底，干燥，采集SERS图谱；
可选地，判断样品中是否存在GSH，若SERS图谱在波数为约1066cm-1、约1338cm-1和/或约-1 -1
1558cm 处出现特征峰，确定样品中存在GSH；优选若SERS图谱在波数为约1338cm 处出现特征峰，确定样品中存在GSH；
可选地，利用特征峰的强度对样品中的GSH进行定量。
11.一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：
向待测溶液中加入硼氢化钠，将GSSG还原为还原型谷胱甘肽(GSH)；
可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，
采用权利要求10的检测方法检测GSH，
可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。
12.一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：
向待测溶液中加入N-乙基马来酰亚胺(NEM)，掩蔽样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基，
加入硼氢化钠，将GSSG还原为GSH，
可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，
采用权利要求10的检测方法检测GSH，
可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。
13.一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值的方法，包括以下操作：
采用权利要求10的检测方法检测样品中GSH的含量，
采用权利要求12的检测方法检测样品中GSSH的含量，
计算GSH和GSSH的比值。
14.权利要求1、2、4、5、7、8中任一项的试剂盒或权利要求10-13中任一项的检测方法，其中所述固态纳米银基底为原位还原法制备得到的固态纳米银基底，
优选地，所述原位还原法包括以下操作：
将单晶硅片置于浓硫酸与双氧水的混合液中，加热，
将加热后的单晶硅片用水(例如超纯水)冲洗，干燥，
将干燥的单晶硅片置于HF溶液中浸泡，取出放入AgNO3和HF的混合溶液中，反应，得到固态纳米银基底，
可选地，将固态纳米银基底用水(例如超纯水)冲洗，干燥，
可选地，将固态纳米银基底固定于载玻片，
可选地，将固态纳米银基底真空储存，
优选地，所述浓硫酸与双氧水的混合液中浓硫酸与双氧水的体积比为(0.5～4):1，(1～3.5):1，(1.5～3):1或(2～2.5):1，例如1.8:1，2.1:1，2.2:1，2.3:1，2.4:1，2.8:1；
优选地，加热的时间为10～20分钟，例如12分钟，15分钟，18分钟；
优选地，加热的温度为50℃～90℃，例如70℃，65℃，55℃，68℃，72℃，75℃，80℃，85℃；
优选地，干燥的方式为N2吹干；
优选地，所述HF水溶液的质量浓度为2％～8％，例如3％，4％，5％，6％，7％；
优选地，浸泡的时间为10～30分钟，例如12分钟，15分钟，18分钟，20分钟，22分钟，25分钟，28分钟；
-1 -1
优选地，AgNO3和HF的混合溶液中AgNO3的浓度为1～4mmol L (例如2mmol L 、2.5mmol L-1、3mmol L-1、3.5mmol L-1)，HF的浓度为8％～12％，例如9％，10％，11％；
优选地，反应在室温下进行；
优选地，反应的时间为8～12分钟，例如9分钟、10分钟、11分钟。
15.权利要求1、2、4、5、7、8中任一项的试剂盒或权利要求10-13中任一项的检测方法，其中所述固态纳米银基底为包括以下操作的方法制备得到的固态纳米银基底，制备纳米银粒子溶胶，
对单晶硅片进行氢氟酸或硅烷化形式预处理，
将纳米银粒子溶胶滴加到预处理后的单晶硅片上，干燥，得到固态纳米银基底，可选地，将固态纳米银基底用水(例如超纯水)冲洗，干燥(例如N2吹干)，可选地，将固态纳米银基底固定于载玻片，
可选地，将固态纳米银基底真空储存，
优选地，制备纳米银粒子溶胶的方法为盐酸羟胺还原硝酸银的方法；
优选地，纳米银粒子的平均粒径为约1-200nm，例如：约10-100nm，约10-150nm，约30～
70nm，约50-55nm，约40-60nm，约50nm；
优选地，对单晶硅片进行3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTMS)预处理。
16.权利要求3、6、9中任一项的用途或权利要求10-13中任一项的检测方法，其中所述样品为生物样品(例如血液、细胞，包括但不限于动物细胞、植物细胞、真菌细胞、原生动物细胞等)或化学样品(例如药品、食品(包括固体食品、液体食品)、食品添加剂)。
17.权利要求10或12或13的检测方法，其中所述样品为细胞(例如人肺上皮细胞系(HLF))，所述待测溶液为细胞提取液，
优选地，制备细胞提取液的方法包括以下操作：
制备细胞悬浮液，
冻融细胞悬浮液，离心，收集第一上清液，
向第一上清液中加入乙腈和甲醇的混合液，混合，沉淀蛋白，收集第二上清液，即得；
优选地，制备细胞悬浮液的方法包括：
用PBS缓冲溶液收集细胞，离心，弃去上清液，
用PBS缓冲溶液重悬细胞，得到细胞悬浮液；
优选地，细胞悬浮液被冻融两次；
优选地，乙腈和甲醇的混合液中乙腈和甲醇的体积比为1～5:1，例如2～4:1，例如3:1；
优选地，第一上清液与乙腈和甲醇的混合液的体积比为1:1～5，例如1:2～4，例如1:3；
优选地，采用涡旋混合法使第一上清液与乙腈和甲醇的混合液混合；
优选地，使用离心法进行沉淀蛋白。
18.权利要求10-13中任一项的检测方法，其中滴加到SERS固态增强基底的孵育后的溶液的体积为1～10μL，例如2～9μL，3～8μL，4～7μL，5～6μL；
优选地，使用便携式拉曼光谱仪采集SERS图谱，优选使用激光功率为30～60mW(例如
40mW，45mW，50mW，55mW)采集SERS图谱。
19.权利要求10-13中任一项的检测方法，其中所加入的DTNB的终浓度为1-4μmol L-1，优选为2μmol L-1；
-1 -1
优选地，所加入的NEM的终浓度为0.1～4mmol L ，例如0.5～3.5mmol L ，1～3mmol L-1，1.5～2.5mmol L-1，2mmol L-1；
优选地，所加入的NaBH4的终浓度为4～8mmol L-1，例如4.4～7.2mmol L-1，4.8～6mmol L-1，5.2～6.4mmol L-1，5～5.4mmol L-1。
检测还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法
技术领域
背景技术
[0002] 谷胱甘肽分为还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，其中GSH的化学名称为N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸，是细胞内含量最高的非蛋白巯基化合物，具有抗氧化、调节免疫应答、抵御外源性毒物等重要生理功能。GSH和GSSG组成了细胞内最重要的氧化还原系统之一，它们的比值GSH/GSSG是氧化应激的重要指标，该比值通常保持在一个相对稳定的范围内，但在异常生理条件下可能会发生改变。除了作为抗氧化剂，在细胞受到外源性毒物沾染时，GSH还可以通过直接或酶促的方式与亲电试剂如卤代烷烃、环氧化合物、重金属离子等发生加合反应保护细胞，降低损伤。因此，细胞内GSH和GSSG的含量检测可作为筛查GSH耗竭事件的重要指标。
[0003] 目前已有许多针对细胞中GSH和GSSG含量检测试剂盒，多为基于酶循环方法和紫外-可见光吸收光谱(Ultraviolet–visible spectroscopy，UV-Vis)的分析检测，通常能达到μM或nM的高灵敏度，但是其操作步骤较为繁琐和耗时、成本较高。因此目前仍然需要开发快速、简单、灵敏且能够同时检测细胞GSH和GSSG的产品，以实现对GSH耗竭事件的快速筛查确证。
[0004] 表面增强拉曼光谱(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，简称SERS)技术是一种指纹光谱技术，具有分辨率高、实时分析、无损检测、无需复杂的样品预处理、适合痕量分析等独特的优势。目前，已有针对细胞中谷胱甘肽的SERS检测方法，包括直接法和间接法两种，其中直接检测法受GSH和GSSG分子极化率低的影响，灵敏度很低；间接检测法的操作复杂耗时，难以广泛应用。
发明内容
[0005] 本发明利用DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))与GSH迅速发生氧化还原反应生成TNB，将TNB作为高活性SERS探针，以原位还原法制备的固态纳米银基底作为SERS固态增强基底，成功区分DTNB和TNB信号，从而实现了GSH的间接检测；对于GSSG，本发明首先用N-乙基马来酰亚胺(NEM)将GSH中的巯基掩蔽，然后用还原剂NaBH4将GSSG还原为GSH，然后再对GSH进行检测。本发明所建立的检测方法操作简便、检测速度快和灵敏度高，可以很好地应用于烷基化试剂染毒细胞样品中GSH和GSSG含量的测定，从而实现烷基化试剂快速筛查检测。
[0006] 本发明的第一方面涉及一种试剂盒，包括：
[0007] SERS固态增强基底，和
[0008] 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。
[0009] 在某些实施方案中，本发明第一方面所述的试剂盒中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。
[0010] 本发明的第二方面涉及本发明第一方面所述的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的用途。
[0011] 本发明的第三方面涉及一种试剂盒，包括：
[0012] SERS固态增强基底，
[0013] 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，
[0014] N-乙基马来酰亚胺(NEM)，
[0015] 硼氢化钠，和
[0016] 乙酸。
[0017] 在某些实施方案中，本发明第三方面所述的试剂盒中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。
[0018] 本发明的第四方面涉及本发明第三方面所述的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。
[0019] 本发明的第五方面涉及一种试剂盒，包括：
[0020] SERS固态增强基底，
[0021] 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，和
[0022] 硼氢化钠。
[0023] 在某些实施方案中，本发明第五方面所述的试剂盒中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。
[0024] 本发明的第六方面涉及本发明第五方面所述的试剂盒用于检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。
[0025] 本发明的第七方面涉及一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的方法，包括以下操作：
[0026] 向待测溶液中加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，孵育；
[0027] 将孵育后的溶液滴加到SERS固态增强基底，干燥，采集SERS图谱；
[0028] 可选地，判断样品中是否存在GSH，若SERS图谱在波数为约1066cm-1、约1338cm-1和/或约1558cm-1处出现特征峰，确定样品中存在GSH；优选若SERS图谱在波数为约1338cm-1处出现特征峰，确定样品中存在GSH；
[0029] 可选地，利用特征峰的强度对样品中的GSH进行定量。
[0030] 在某些实施方案终，本发明第七方面涉及的检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的方法，其中孵育在15～40℃(例如15～37℃，15～25℃，20～30℃)下进行，优选孵育1～15分钟(例如5～10分钟，8～12分钟)。
[0031] 本发明的第八方面涉及一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：
[0032] 向待测溶液中加入硼氢化钠，将GSSG还原为还原型谷胱甘肽(GSH)；
[0033] 可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，
[0034] 采用本发明第七方面所述的检测方法检测GSH，
[0035] 可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。
[0036] 本发明第九方面涉及一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：
[0037] 向待测溶液中加入N-乙基马来酰亚胺(NEM)，掩蔽样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基，
[0038] 加入硼氢化钠，将GSSG还原为GSH，
[0039] 可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，
[0040] 采用本发明第七方面所述的检测方法检测GSH，
[0041] 可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。
[0042] 在某些实施方案终，本发明第八或第九方面涉及的检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，其中向待测溶液中加入硼氢化钠后，于40～55℃(例如48～52℃，45～50℃)下反应8～15分钟(例如10分钟，12分钟)。
[0043] 在某些实施方案终，本发明第八或第九方面涉及的检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，其中加入乙酸的量能够除去过量的硼氢化钠即可。
[0044] 本发明的第十方面涉及一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值的方法，包括以下操作：
[0045] 采用本发明第七方面所述的检测方法检测样品中GSH的含量，
[0046] 采用本发明第九方面所述的检测方法检测样品中GSSH的含量，
[0047] 计算GSH和GSSH的比值。
[0048] 在某些实施方案中，本发明的第七至十方面涉及的检测方法，所述样品为细胞，其检测流程如图1所示。
[0049] 在某些实施方案中，本发明所述的SERS固态增强基底为固态纳米银基底。所述固态纳米银基底可以为原位还原法制备得到的固态纳米银基底，也可以是组装法制备得到的固态银纳米基底。
[0050] 在某些实施方案中，所述原位还原法包括以下操作：
[0052] 将加热后的单晶硅片用水(例如超纯水)冲洗，干燥，
[0053] 将干燥的单晶硅片置于HF水溶液中浸泡，取出放入AgNO3和HF的混合溶液中，反应，得到固态纳米银基底，
[0054] 可选地，将固态纳米银基底用水(例如超纯水)冲洗，干燥，
[0055] 可选地，将固态纳米银基底固定于载玻片，
[0056] 可选地，将固态纳米银基底真空储存。
[0057] 在某些实施方案中，所述原位还原法中，所述浓硫酸与双氧水的混合液中浓硫酸与双氧水的体积比为(0.5～4):1，(1～3.5):1，(1.5～3):1或(2～2.5):1，例如1.8:1，2.1:1，2.2:1，2.3:1，2.4:1，2.8:1；
[0058] 在某些实施方案中，所述原位还原法中，将单晶硅片置于浓硫酸与双氧水的混合液中后，加热的时间为10～20分钟，例如12分钟，15分钟，18分钟。优选的加热温度为50℃～90℃，例如70℃，65℃，55℃，68℃，72℃，75℃，80℃，85℃。在某些实施方案中，可以采用恒温反应箱进行加热。
[0059] 在某些实施方案中，固态纳米银基底用水(例如超纯水)冲洗后，可以采用N2吹干的方式进行干燥。
[0060] 在某些实施方案中，所述HF水溶液的质量浓度为2％～8％，例如3％，4％，5％，6％，7％。
[0061] 在某些实施方案中，将干燥的单晶硅片置于HF溶液中浸泡的时间为10～30分钟，例如12分钟，15分钟，18分钟，20分钟，22分钟，25分钟，28分钟。
[0062] 在某些实施方案中，AgNO3和HF的混合溶液中AgNO3的浓度为1～4mmol L-1(例如2mmol L-1、2.5mmol L-1、3mmol L-1、3.5mmol L-1)，HF的浓度为8％～12％，例如9％，10％，
11％。
11％。
[0063] 在某些实施方案中，单晶硅片放入AgNO3和HF的混合溶液中，在室温下进行反应，优选的反应时间为8～12分钟，例如9分钟、10分钟、11分钟。
[0064] 在某些实施方案中，所述组装法包括以下操作：
[0065] 制备纳米银粒子溶胶，
[0066] 对单晶硅片进行氢氟酸或硅烷化形式预处理(例如对单晶硅片进行3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTMS)预处理)，
[0067] 将纳米银粒子溶胶滴加到预处理后的单晶硅片上，干燥，得到固态纳米银基底，[0068] 可选地，将固态纳米银基底用水(例如超纯水)冲洗，干燥(例如N2吹干)，[0069] 可选地，将固态纳米银基底固定于载玻片，
[0070] 可选地，将固态纳米银基底真空储存。
[0071] 在某些实施方案中，制备纳米银粒子溶胶的方法为盐酸羟胺还原硝酸银的方法。所述纳米银粒子可以为球形、星形、爆米花形等，优选为球形，其平均粒径优选为约1-
200nm，例如：约10-100nm，约10-150nm，约30～70nm，约50-55nm，约40-60nm，约50nm。
200nm，例如：约10-100nm，约10-150nm，约30～70nm，约50-55nm，约40-60nm，约50nm。
[0072] 在某些实施方案中，对单晶硅片进行氢氟酸或硅烷化形式预处理前，先用Piranha洗液洗涤，然后超纯水冲洗，干燥(例如N2吹干)，然后后再进行预处理。
[0073] 在某些实施方案中，用Piranha洗液对单晶硅片进行洗涤包括：将单晶硅片置于Piranha洗液(由浓硫酸与双氧水体积比7:3配制)中，在60～80℃(例如70℃)恒温振荡器中加热10～20分钟(例如15min)，取出硅片后用超纯水冲洗干净，N2吹干备用。
[0074] 在某些实施方案中，对单晶硅片进行氢氟酸预处理包括：将硅片置于5wt％水HF溶液中浸泡10～30分钟(例如20min)，
[0075] 可选地，乙醇冲洗，
[0076] 可选地，用水冲洗，
[0077] 可选地，干燥(例如N2吹干)。
[0078] 在某些实施方案中，对单晶硅片进行硅烷化预处理包括：将单晶硅片置于APTMS甲苯溶液中振摇过夜，优选地APTMS甲苯溶液的浓度为8～12mmol L-1(例如10mmol L-1，[0079] 可选地，乙醇冲洗，
[0080] 可选地，用水冲洗，
[0081] 可选地，干燥(例如N2吹干)。
[0082] 在某些实施方案中，本发明所述样品为生物样品(例如血液、细胞，包括但不限于动物细胞、植物细胞、真菌细胞、原生动物细胞等)或化学样品(例如药品、食品(包括固体食品、液体食品)、食品添加剂)。
[0083] 在某些实施方案中，本发明第七至十方面涉及的检测方法，其中所述样品为细胞(例如人肺上皮细胞系(HLF))，所述待测溶液为细胞提取液。
[0084] 在某些实施方案中，制备细胞提取液的方法包括以下操作：
[0085] 制备细胞悬浮液，
[0086] 冻融细胞悬浮液，离心，收集第一上清液，
[0087] 向第一上清液中加入乙腈和甲醇的混合液，混合，沉淀蛋白，收集第二上清液，即得。
[0088] 在某些实施方案中，制备细胞提取液的方法中，制备细胞悬浮液的方法包括：
[0089] 用PBS缓冲溶液收集细胞，离心，弃去上清液，
[0090] 用PBS缓冲溶液重悬细胞，得到细胞悬浮液。
[0091] 在某些实施方案中，制备细胞提取液的方法中，细胞悬浮液被冻融两次。
[0092] 在某些实施方案中，制备细胞提取液的方法中，细胞悬浮液被冻融的方式为在分别使细胞液分别在液氮和37℃水浴中冷冻和融化。
[0093] 在某些实施方案中，制备细胞提取液的方法中用到的乙腈和甲醇的混合液中乙腈和甲醇的体积比为1～5:1，例如2～4:1，例如3:1。在某些实施方案中，第一上清液与乙腈和甲醇的混合液的体积比为1:1～5，例如1:2～4，例如1:3。在某些实施方案中，采用涡旋混合法使第一上清液与乙腈和甲醇的混合液混合。
[0094] 在某些实施方案中，使用离心法进行沉淀蛋白。
[0095] 在某些实施方案中，本发明第七至十方面涉及的检测方法，其中滴加到SERS固态增强基底的孵育后的溶液的体积为1～10μL，例如2～9μL，3～8μL，4～7μL，5～6μL。
[0096] 在某些实施方案中，本发明使用便携式拉曼光谱仪采集SERS图谱，便携式拉曼光谱仪的激光功率优选设置为30～60mW(例如40mW，45mW，50mW，55mW)。
[0097] 在某些实施方案中，本发明第七至十方面涉及的检测方法，其中所加入的DTNB的终浓度为1-4μmol L-1，优选为2μmol L-1。
[0098] 在某些实施方案中，本发明第七至十方面涉及的检测方法，其中所加入的NEM的终浓度为0.1～4mmol L-1，例如0.5～3.5mmol L-1，1～3mmol L-1，1.5～2.5mmol L-1，2mmol L-1。
[0099] 在某些实施方案中，本发明第七至十方面涉及的检测方法，其中所加入的NaBH4的-1 -1 -1 -1终浓度为为4～8mmol L ，例如4.4～7.2mmol L ，4.8～6mmol L ，5.2～6.4mmol L ，5～
5.4mmol L-1。
5.4mmol L-1。
[0100] 本发明中，术语“DTNB”是5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid))的简称。
[0101] 本发明中，术语“TNB”是5-巯基-2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acid)的简称。
[0102] 本发明中，术语“NEM”是N-乙基马来酰亚胺的简称。
[0103] 本发明中，术语“硼氢化钠”的分子式为NaBH4。
[0104] 本发明中，术语“室温”是指20℃±5℃。
[0105] 本发明中，术语“药品”是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应症或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药材、中药饮片、中成药、化学原料药及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。
[0106] 本发明中，术语“食品”指各种供人食用或者饮用的成品和原料以及按照传统既是食品又是中药材的物品，但是不包括以治疗为目的的物品。一般包括固体食品、液体食品，例如不含酒精的饮料、含有酒精的饮料(包括白酒、啤酒、葡萄酒、黄酒、米酒、药酒等)。
[0107] 本发明中，术语“食品添加剂”是指为改善食品品质和色、香、味以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或者天然物质，包括营养强化剂。
[0108] 本发明中，术语“约”在用于修饰某一数值或数值范围时，是指包括该数值或数值范围以及该数值或数值范围的本领域技术人员可接受的误差范围，例如该误差范围为±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％等。
[0109] 在某些实施方案中，检测对象可以是细胞样品中GSH和GSSG，针对GSH，可将细胞液去蛋白处理后，直接取适量样品加入DTNB，反应完成后滴加于固态银纳米基底，采集反应产物TNB的SERS图谱；针对GSSG，可将细胞液去蛋白处理后，加入NEM使GSH巯基掩蔽，适当稀释后再向样品中加入NaBH4，使GSSG还原为GSH，后续检测与GSH检测部分相同。
[0110] 在某些实施方案中，采用便携式拉曼光谱仪检测样品中的GSH与GSSG含量，采用干法检测方式，用标准曲线校正方程换算GSH和GSSG的浓度，当DTNB过量时，GSH的浓度与TNB浓度为1:1对应关系，GSSG的浓度与TNB浓度为1:2对应关系。
[0111] 本发明的有益技术效果
[0112] 本发明利用DTNB与GSH迅速发生氧化还原反应生成TNB，将难以直接检测的GSH和GSSG转化为具有高拉曼活性的报告分子TNB，同时采用固态银纳米基底增加拉曼检测热点，大幅增强了特征峰强度，成功对DTNB和TNB进行区分，解决了GSH直接检测灵敏度低的问题。对于GSSG，本发明首先用N-乙基马来酰亚胺(NEM)将GSH中的巯基掩蔽，然后用还原剂NaBH4将GSSG还原为GSH，然后再对GSH进行检测。
[0113] 本发明所建立的检测方法和试剂盒，操作简便、检测速度快和灵敏度高，可以很好地应用于烷基化试剂染毒细胞样品中GSH和GSSG含量的测定，从而实现烷基化试剂快速筛查检测。
[0114] 本发明的检测方法和试剂盒可以对细胞中GSH与GSSG进行同时检测，可将细胞提取液分为两份，一份进行GSH检测，另一份用N-乙基马来酰亚胺(NEM)将GSH中的巯基掩蔽，然后用还原剂NaBH4将GSSG还原为GSH，然后再对GSH进行检测，从而实现了细胞样品中GSH和GSSG含量的同时检测。
[0116] 图1为细胞中GSH与GSSG检测流程图；
[0117] 图2为原位还原法制备的固态银纳米粒子基底SEM表征图；
[0118] 图3为DTNB溶液或GSH与DTNB的反应溶液在固态金纳米基底或固态银纳米基底上的SERS谱图，其中：
[0119] a为GSH与DTNB的反应溶液在固态金纳米基底上的SERS谱图，
[0120] b为DTNB溶液在固态金纳米基底上的SERS谱图，
[0121] c为GSH与DTNB的反应溶液在固态银纳米基底上的SERS谱图，
[0122] d为DTNB溶液在固态银纳米基底上的SERS谱图；
[0123] 图4为不同条件下GSSG的SERS谱图，其中：
[0124] a为GSSG与DTNB混合孵育后在固态银纳米基底上的SERS谱图，
[0125] b为GSSG被NaBH4还原为GSH后，再与DTNB反应后的产物在固态银纳米基底上的SERS谱图，
[0126] c为GSH与GSSG同时存在时，加入DTNB后的反应产物在固态银纳米基底上的SERS谱图，
[0127] d为GSH与GSSG同时存在时，先用NEM封闭GSH的巯基，再用NaBH4将GSSG还原为GSH，然后加入DTNB，反应产物在固态银纳米基底上的SERS谱图；
[0128] 图5为位于1338cm-1处SERS峰强度-GSH浓度(50-1500nmol L-1)工作曲线；
[0129] 图6为位于1338cm-1处SERS峰强度-GSSG浓度(200-2000nmol L-1)工作曲线；
[0130] 图7为芥子气及其相关化合物化学结构式；
[0131] 图8为GSH浓度随着与芥子气及其相关化合物孵育时间的变化曲线。
具体实施方式
[0132] 下面结合本发明的具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，应理解，以下实施例仅用于说明本发明，但并不以此来限定本发明的保护范围。下面实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的进行。所用药品或试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0133] 虽然以下实施例中所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，如果未特别说明，下面实施例中所用的材料和操作方法是本领域公知的。
[0134] 下面实施例中用到的GSH和GSSG购于Acros Organics(New Jersey,USA)，DTNB和NEM购于Sigma-Aldrich(MO,USA)，NaBH4购于国药集团化学试剂有限公司。
[0135] 下面实施例中采用便携式拉曼光谱仪(型号为：i-Raman，购自美国B&W TEK)对样品进行SERS光谱检测，激光功率设置为45mW，积分时间设置为5s，每个样品采集1次。
[0136] 下面实施例中用到的PB缓冲溶液的配制方法为：
[0137] 分别配制浓度为0.2mol L-1的Na2HPO4和NaH2PO4溶液，将81mL Na2HPO4与19mL -1 -1NaH2PO4溶液混合，得到0.2mol L 的PB缓冲溶液。将0.2mol L 的PB缓冲溶液用超纯水稀释，分别得到50mmol L-1的PB缓冲溶液和10mmol L-1的PB缓冲溶液。
[0138] 下面实施例中用到的PBS缓冲溶液的配制方法为：称取71.6g Na2HPO4·12H2O溶于1000mL超纯水得0.2mol/L Na2HPO4溶液，称取31.2g NaH2PO4·2H2O溶于1000mL水得0.2mol/L NaH2PO4溶液，将19mL 0.2mol/L NaH2PO4溶液与81ml 0.2mol/L Na2HPO4溶液混合均匀，加入0.9g NaCl溶解，即得pH为7.4的PBS缓冲溶液。
[0139] 实施例1固态银纳米基底的制备
[0140] 1.1原位还原法制备固态银纳米基底
[0141] 将单晶硅片尺寸裁剪为0.5×0.5cm2，置于浓硫酸与双氧水组成的混合液(体积比7:3)中，在70℃恒温反应箱中加热15min，取出硅片后用超纯水冲洗干净，N2吹干备用。将洗净的硅片置于5wt％HF水溶液中浸泡20min，取出后迅速放入含10wt％HF的3mM AgNO3溶液中，室温下反应10min，取出用超纯水冲洗，N2吹干，固定于干净玻璃片，立即使用或抽真空储存备用。原位还原法制备的固态银纳米基底的扫描电子显微镜(SEM，日本Hitachi，型号S4800)照片见图2。
[0142] 1.2组装法制备固态银纳米基底
[0143] a)银纳米粒子溶胶的制备
[0144] 通过盐酸羟胺还原硝酸银的方法制备平均粒径约50nm的纳米银粒子(AgNPs)。
[0145] 首先用超纯水配置浓度为1.68mmol L-1的盐酸羟胺和浓度为10mmol L-1的硝酸银-1溶液。向90mL盐酸羟胺溶液中加入0.1mL浓度为3mol L 的NaOH溶液，倒入圆底烧瓶，在搅拌下向其中迅速加入20mL配置好的硝酸银溶液，继续搅拌15min，得到AgNPs溶胶。用紫外-可见分光光度计(Cary 300,Varian Inc.,CA,USA)和透射电子显微镜(Hitachi H-7650,Hitachi Technologies Co.,Tokyo,Japan)对所制备的AgNPs溶胶进行表征，并确定其平均粒径约为50nm。将制备完成的AgNPs溶胶于4℃冰箱中保存。
[0146] b)将单晶硅片尺寸裁剪为0.5×0.5cm2/片，置于Piranha洗液(Piranha洗液由浓硫酸与双氧水体积比7:3混合得到)中，在70℃恒温振荡器中加热15min，取出硅片后用超纯水冲洗干净，N2吹干备用。将洗净的单晶硅片以氢氟酸或硅烷化形式预处理，优选为以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTMS)预处理。氢氟酸处理方法为将洗净的硅片置于5wt％HF水溶液中浸泡20min，硅烷化处理为将洗净的硅片置于10mL 10mmol L-1APTMS甲苯溶液中振摇过夜，再分别用乙醇和大量水冲洗，N2吹干备用。
[0147] c)取适量AgNPs溶胶，经离心浓缩后，用移液器每次取少量均匀滴加于经APTMS预处理的硅片上，静置数分钟，例如30min，待溶胶接近挥干时，用超纯水冲洗并以氮气吹干，最后用粘胶将其硅片固定于干净载玻片上，即得；
[0149] 1.3组装法制备固态金纳米基底
[0150] 通过柠檬酸钠还原四氯金酸的方法制备平均粒径约50nm的纳米金粒子(AuNPs)。
[0151] 首先用超纯水配置浓度为1％的柠檬酸钠和浓度为0.1mg/mL的四氯金酸溶液，将100mL四氯金酸溶液倒入250mL三颈圆底烧瓶中，油浴加热至110℃，快速搅拌下加热至沸，待冷凝回流后迅速加入0.85mL柠檬酸三钠水溶液，继续加热搅拌40min，得到AuNPs溶胶，用紫外-可见分光光度计(Cary 300,Varian Inc.,CA,USA)和透射电子显微镜(Hitachi H-
7650,Hitachi Technologies Co.,Tokyo,Japan)对所制备的AuNPs进行表征，并确定其平均粒径约为55nm。将所得AuNPs溶胶储存于4℃。后续将AuNPs组装至硅片的方法与1.2中b)-d)相同。
7650,Hitachi Technologies Co.,Tokyo,Japan)对所制备的AuNPs进行表征，并确定其平均粒径约为55nm。将所得AuNPs溶胶储存于4℃。后续将AuNPs组装至硅片的方法与1.2中b)-d)相同。
[0152] 实施例2不同基底对GSH的SERS谱图的影响
[0153] 2.1溶液的配制
[0154] 用10mmol L-1的PB缓冲溶液配制浓度为10mmol L-1的DTNB溶液，
[0155] 用超纯水配制浓度为10mmol L-1的GSH溶液。
[0156] 2.2拉曼光谱测试
[0157] 将浓度为10mmol L-1的DTNB溶液用浓度为10mmol L-1的PB缓冲溶液稀释，得到浓度为2μmol L-1的DTNB溶液。取5μL浓度为2μmol L-1的DTNB溶液，将其滴加于原位还原法制备的固态银纳米基底(实施例1中1.1制备)，另取5μL DTNB溶液滴加于固态金纳米基底(实施例1中1.3制备)，待干燥后进行SERS光谱检测。
[0158] 分别取一定体积的10mmol L-1的DTNB溶液和10mmol L-1的GSH溶液，混合后用10mmol L-1的PB缓冲溶液稀释，使混合液中DTNB的终浓度为2μmol L-1，GSH的终浓度为1μ-1
mol L 。混合液在37℃下反应10min，取5μL反应液滴加于原位还原法制备的固态银纳米基底(实施例1中1.1制备)，另取5μL反应液滴加于固态金纳米基底(实施例1中1.3制备)，待干燥后SERS光谱检测。
mol L 。混合液在37℃下反应10min，取5μL反应液滴加于原位还原法制备的固态银纳米基底(实施例1中1.1制备)，另取5μL反应液滴加于固态金纳米基底(实施例1中1.3制备)，待干燥后SERS光谱检测。
[0159] 所得SERS图谱见图3。DTNB与GSH分子中的巯基反应生成TNB，图3中位于1066cm-1、-1 -11338cm 和1558cm 波数的特征峰分别归属于TNB分子的C-N弯曲振动、硝基对称伸缩振动和苯环伸缩振动。结果显示，DTNB和TNB在银基底表面能被区分，检测到的TNB可以准确反应GSH浓度。此外，DTNB在金基底表面部分发生自发分解产生TNB，使测得GSH浓度高于其真实浓度。因此优选采用固态银纳米基底对GSH进行SERS光谱检测。
[0160] 实施例3不同条件对GSSG的SERS图谱的影响
[0161] 3.1溶液的配制
[0162] 用10mmol L-1的PB缓冲溶液配制浓度为1mmol L-1的DTNB溶液，
[0163] 用超纯水配制浓度为0.5μmol L-1的GSSG溶液，
[0164] 用超纯水配制GSH与GSSG的混合溶液，其中GSH的浓度为1000μmol L-1，GSSG的浓度为10μmol L-1。
[0165] 3.2拉曼光谱测试
[0166] (a)取200μL浓度为0.5μmol L-1的GSSG溶液，加入1mmol L-1的DTNB溶液，使混合物中DTNB的终浓度为2μmol L-1，将混合物于37℃下孵育10min，进行SERS光谱检测。
[0167] (b)取200μL浓度为0.5μmol L-1的GSSG溶液，加入NaBH4水溶液使混合物中NaBH4终浓度为5mmol L-1，将混合物于50℃下孵育10min，加入乙酸水溶液使混合物中乙酸的终浓度为5mmol L-1，除去多余NaBH4，然后加入1mmol L-1的DTNB溶液使混合物中DTNB的终浓度为2μmol L-1，于37℃下孵育10min，进行SERS光谱检测。
[0168] (c)取200μL GSH(1000μmol L-1)与GSSG(10μmol L-1)的混合溶液，向其中加入终浓度为2mmol L-1NEM水溶液混合5min后，进行SERS光谱检测。
[0169] (d)取200μL GSH(1000μmol L-1)与GSSG(10μmol L-1)的混合溶液，向其中加入NEM水溶液(NEM的终浓度为2mmol L-1)，混合5min后，加入NaBH4水溶液(NaBH4的终浓度为5mmol -1 -1L )，于50℃下孵育10min，加入乙酸水溶液(乙酸的终浓度为5mmol L )除去多余NaBH4，加入1mmol L-1的DTNB溶液(DTNB的终浓度为2μmol L-1)，于37℃下孵育10min，进行SERS光谱检测。
[0170] 本实施例中SERS光谱检测的方法为：取5μL样品滴加于原位还原法制备的固态银纳米基底(实施例1中1.1制备)，干燥后用便携式拉曼光谱仪进行光谱检测。
[0171] SERS检测结果如图4所示。结果显示，当GSH和GSSG同时存在时，首先用NEM将GSH的巯基封闭，然后利用NaBH4将GSSG高效还原为GSH，进而将生成的GSH与DTNB反应，在固态银纳米基底上进行SERS检测，生成TNB浓度与GSSG浓度为2:1的关系，由此可准确推算GSSG的浓度。采用NEM作为GSH巯基掩蔽剂、NaBH4为还原剂时，过量的NaBH4能使未反应完的NEM失活，避免NEM对GSSG转化为GSH后的检测产生干扰。
[0172] 实施例4GSH与GSSG标准曲线的建立
[0173] 4.1用超纯水配制不同浓度的GSH标准溶液。对不同浓度的GSH标准溶液进行SERS光谱检测。检测方法为：向200μL GSH标准溶液中加入浓度为10mmol L-1的DTNB的PB溶液，使混合物中DTNB的终浓度为2μmol L-1，混合后在37℃下反应10min，取5μL反应液滴加于原位还原法制备的固态银纳米基底(实施例1中1.1制备)，干燥后用便携式拉曼光谱仪进行光谱检测。以位于1338cm-1波数的特征峰强度为纵坐标，浓度为横坐标，建立标准曲线，如图5所示。结果显示，GSH浓度在50-1500nmol L-1范围内与1338cm-1峰强度呈良好的线性关系(y＝38x+2268，R2＝0.994)，检测限为10nM。
[0174] 4.2用超纯水配制不同浓度的GSSG标准溶液。对不同浓度GSSG标准溶液进行SERS光谱检测。检测方法为：取200μL的GSSG标准溶液，加入NaBH4水溶液使混合物中NaBH4的终浓度为5mmol L-1，于50℃下孵育10min，加入乙酸水溶液(混合物中乙酸的终浓度为5mmol L-1)除去多余NaBH4，加入浓度为10mmol L-1的DTNB的PB溶液使混合物中DTNB的终浓度为2μmol L-1，然后于37℃下孵育10min，取5μL反应液滴加于原位还原法制备的固态银纳米基底(实施例1中1.1制备)，干燥后用便携式拉曼光谱仪进行光谱检测。以位于1338cm-1波数的特征峰强度为纵坐标，浓度为横坐标，建立标准曲线，如图6所示。结果显示，GSSG浓度在200-2000nM范围内与1338cm-1峰强度呈良好的线性关系(y＝9512x+14269，R2＝0.992)，检测限为10nM。
[0175] 以上实施例表明本发明的检测方法和试剂盒可用作GSH与GSSG的高灵敏定量检测，且样品前处理过程较为简单，GSH和DTNB的反应仅需10min即可完成，而每个处理完毕的样品，其SERS检测只需5s，使得该试剂盒非常适合于大批量样品的快速检测。
[0176] 实施例5对HLF细胞中的GSH和GSSG进行检测
[0177] 5.1制备细胞提取液
[0178] 用PBS缓冲溶液收集HLF细胞(由中国科学院上海细胞库提供)，将悬浮细胞于14000rpm转速下高速离心10min后，弃去上清液，再向下层的细胞液中添加PBS缓冲溶液使细胞重悬，并将细胞悬浮液分别在液氮和37℃水浴中快速冻融两次后再进行高速离心，收集上清液作为第一上清液。
[0179] 向20μL浓度为10mmol L-1的PB缓冲溶液加入10μL第一上清液，再加入60μL乙腈/甲醇混合液(乙腈与甲醇体积比为3:1)，涡旋混匀，14000rpm转速下离心10min后，取上清液作为第二上清液，即为细胞提取液。
[0180] 5.2检测GSH
[0181] 将5.1得到的细胞提取液用2mL 10mmol L-1PB缓冲溶液稀释，加入浓度为10mmol L-1的DTNB PB溶液使混合物中DTNB的中浓度为2μmol L-1，室温下反应10分钟，取5μL反应液滴加于原位还原法制备的固态银纳米基底(实施例1中1.1制备)，干燥后用便携式拉曼光谱仪进行光谱检测。根据位于1338cm-1波数的特征峰强度和实施例4建立的GSH标准曲线，计算得到细胞内GSH的浓度。
[0182] 5.3检测GSSG
[0183] 向5.1中所得细胞提取液中加入终浓度为2mmol L-1巯基掩蔽剂NEM水溶液，然后再加入400μL 10mmol L-1PB缓冲溶液和终浓度为5mmol L-1NaBH4水溶液，于50℃孵育10min，然后再加入8μL乙酸水溶液(250mmol L-1)淬灭多余的NaBH4，取5μL反应液滴加于原位还原法制备的固态银纳米基底(实施例1中1.1制备)，干燥后用便携式拉曼光谱仪进行光谱检测。根据位于1338cm-1波数的特征峰强度带入实施例4建立的GSSG标准曲线，计算得到细胞内GSSG的浓度。然后计算GSH/GSSG比值。
[0184] 实施例6
[0185] 6.1溶液的配制
[0186] 以乙腈为溶剂配制浓度为40mmol L-1的芥子气(SM)、芥子亚砜(SMO)、芥子砜(SMO2)、二乙烯砜(DVS)、二乙烯亚砜(DVSO)、2-氯乙基乙基硫醚(CEES)、2-氯乙基乙基亚砜(CEESO)母液，储存于-20℃。将母液逐级稀释得到标准工作液。其中SM和CEES由军事医学研究院毒物药物研究所毒剂库提供，SMO、SMO2、DVS、DVSO、CEESO由本实验室合成，纯度大于98％。芥子气及其相关化合物的结构式参见图7。
[0187] 以超纯水为溶剂配制浓度为100μmol L-1的GSH溶液。
[0188] 6.2芥子气及其相关化合物对溶液中GSH浓度的影响
[0189] 将GSH(终浓度100μmol L-1)溶液与芥子气及其相关化合物(终浓度200μmol L-1)在0.05mol L-1PB溶液中进行孵育(37℃)，在不同时间点取10μL反应液，用10mmol L-1PB缓冲溶液稀释100倍后，加入DTNB溶液，使混合物中DTNB的终浓度为2μmol L-1，于37℃下反应10min，取5μL反应液滴加于原位还原法制备的固态银纳米基底(实施例1中1.1制备)，干燥后用便携式拉曼光谱仪进行光谱检测。根据测得的位于1338cm-1波数的特征峰强度和实施例4中建立的标准曲线计算得实时GSH浓度，作时间-浓度曲线图，如图8所示。
[0190] 结果显示，芥子气及其相关化合物对GSH的损伤效应为DVS＞SM(≈CEES)＞SMO2＞SMO(≈CEESO≈DVSO)。本实施例表明本发明的检测方法和试剂盒能够实时、快速检测溶液中GSH浓度，在评估不同化合物对GSH的耗竭活性方面具有很好的应用前景。
[0191] 实施例7
[0192] 用DVS和SM对HLF细胞染毒，并同时对细胞进行丁硫氨酸-亚砜胺(L-Buthionine-sulfoximine，BSO，GSH合成酶抑制剂，购于美国Acros Organics)染毒作为阳性对照。收集对数生长期的细胞，细胞计数后调整浓度至2.5×105cell/mL，按2mL/孔铺于6孔板，放置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中隔夜培养后，弃去培养基，向细胞中加入含不同浓度毒剂的1640培养基(含10％胎牛血清，1640培养基和胎牛血清购于美国Gibco)，继续培养4h。收集完成染毒的细胞，对细胞中的GSH和GSSG进行检测，检测方法同实施例5，检测结果如表1所示。结果显示，DVS对细胞中GSH的耗竭活性强于SM，与实施例6中的趋势相符。
[0193] 表1不同剂量DVS/SM染毒细胞4h后GSH与GSSG浓度及比值变化
[0194]
[0195] 本实施例证明本发明的检测方法和试剂盒能够用于烷基化试剂染毒细胞中GSH与GSSG的快速检测，也可以应用于其它GSH耗竭剂的筛查检测，以及其它涉及细胞GSH/GSSG的生物医学研究。
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