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用于免疫治疗癌症的尺寸可调的微 生物模拟物

阅读：949发布：2020-05-08

专利汇可以提供用于免疫治疗癌症的尺寸可调的微生物模拟物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明描述了旨在针对癌症细胞触发宿主免疫应答的新型免疫原性复合物，通过利用免疫系统的自然能力来消除病原体感染的宿主细胞。免疫原性复合物，称为微生物模拟物，具有独特的物理和生物化学性质，旨在模拟细菌和病毒类似大小的病原性感染，允许肿瘤相关和肿瘤特异性肽抗原作为微生物成分呈递给免疫细胞。所述MM非常适合模拟主要由肿瘤抗原组成的微生物大小的颗粒的系统性感染。在此框架下，肿瘤细胞可在随后的免疫应答被消除。所述MM展现出独特性质，包括尺寸可调性、含有与免疫刺激分子复合的抗原物质，其协同作用增强免疫应答。所述MM构成了一个通用平台，用于触发针对表达表位的细胞的免疫应答，而所述表位包含在所述复合的抗原物质中。，下面是用于免疫治疗癌症的尺寸可调的微生物模拟物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种通过给予癌症患者免疫原性复合物(“微生物模拟物”)治疗癌症的方法所述免疫原性复合物由RNA248(SEQ.ID NO.1)和具有8至35个氨基酸的肿瘤特异性或肿瘤相关多肽(“抗原物质”)组成，所述多肽氨基末端或羧基末端与RRHRKRR(SEQ.ID NO.7)连接序列共价结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中免疫原性复合物可包括其他免疫刺激分子，例如嘎德莫特、瑞喹莫德、聚(1：C)、聚-ICLC、STING激动剂或CpG DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中脂肽例如Pam(2)CSK4或Pam(3)CSK4通过与RRHRKRR修饰的多肽在氨基末端共价结合而整合入微生物模拟物中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中脂肽例如Pam(2-半胱氨酸或Pam(3)-半胱氨酸通过与RRHRKRR修饰的多肽在氨基末端共价结合而整合入微生物模拟物中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中脂肽例如Pam(2)-半胱氨酸-丝氨酸-丝氨酸或Pam(3)-半胱氨酸-丝氨酸-丝氨酸通过与RRHRKRR修饰的多肽在氨基末端共价结合而整合入微生物模拟物中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物模拟免疫原性复合物与DNA4(SEQ.ID NO.2)是非共价结合。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物模拟免疫原性复合物与DNA10(SEQ.ID NO.3)是非共价结合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物模拟物可以通过在合适的缓冲液中滴加每种组分的浓度，并改变每种组分的最终浓度来调节几个数量级，具体而言调节其大小至与细菌和病毒相似尺寸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性复合物可以与其他癌症疗法联合给药，包括激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂，例如靶向作用于各种免疫检查点的抑制剂，如PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CD27、CTLA-4或CD137。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性复合物可用于体外激活和扩增肿瘤特异性或肿瘤相关T细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性复合物可与自体热灭活或冻融灭活的肿瘤细胞混合，并给药于人类患者以治疗癌症。
12.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原性复合物可被合成为高肿瘤抗原含量，其总肽质量、肿瘤特异性或肿瘤相关性多肽的质量超过30％。
13.根据权利要求1所述的方法，其中可以使用注射器和针头将所述免疫原性复合物直接注射至受试者的肿瘤中。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤特异性多肽序列与具有单个非同义氨基酸置换的突变肿瘤特异性蛋白质相对应。
15.免疫原性复合物(“微生物模拟物”)由RNA248(SEQ.ID NO.1)和由8至35个氨基酸组成的肿瘤特异性或肿瘤相关性多肽(“抗原物质”)组成，所述多肽在氨基末端或羧基末端与RRHRKRR(SEQ.ID NO.7)连接序列共价结合。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述微生物模拟免疫原性复合物与DNA4(SEQ.ID NO.2)是非共价结合。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述微生物模拟免疫原性复合物与DNA10(SEQ.ID NO.3)是非共价结合。
18.根据权利要求15所述的组合物，其中脂肽例如Pam(2)CSK4或Pam(3)CSK4通过与RRHRKRR修饰的多肽在氨基末端共价结合而整合入微生物模拟物中。
19.根据权利要求15所述的组合物，其中脂肽例如Pam(2)-半胱氨酸或Pam(3)-半胱氨酸通过与RRHRKRR修饰的多肽在氨基末端共价结合而整合入微生物模拟物中。
20.根据权利要求1所述的方法，其中对SEQ.ID.NO.1和SEQ ID NO.7分别进行保守变异
1-2个核苷酸和/或保守变换1-2个氨基酸。

说明书全文

用于免疫治疗癌症的尺寸可调的微 生物模拟物

[0001] 申请人：

[0002] INGENOVAX公司(INGENOVAX，LLC)

[0003] 发明人：蒂莫西·安德鲁·埃里克森

[0004] 相关美国申请数据

[0005] 本申请要求2017年3月22日提交的美国临时申请第62/474,926号的优先权，并交叉参考2017年6月23日提交的美国专利申请第15/631,843号和2017年2月17日提交的美国专利申请第15/436,525号。

[0006] 引用的参考文献

[0007] 美国专利文献

[0008] 5,662,907 A 9/1997 Kubo等.

[0009] 6,727,230 A 4/2004 Hutcherson等.

[0010] 其他出版物

[0011] Erhard，Michael H.，et al.“lipopeptide，Pam2Cys-Ser-(Lys)4：an alternative adjuvant to Freund′s adjuvant for the immunisation of chicken to produce egg yolk antibodies.”Alternatives to laboratory animals：ATLA(1997).[0012] Zeng，Weiguang，David C.Jackson，and Keith Rose.“Synthesis of a New Template with a Built-in Adjuvant and Its Use in Constructing Peptide Vaccine Candidates Through Polyoxime Chemistry.”Journal of Peptide Science 2.1(1996)：66-72.

[0013] Deres，Karl，et al.“In vivo priming of virus-specific cytotoxic T lymphocytes with synthetic lipopeptide vaccine.”Nature 342.6249(1989)：561-564.
发明领域

[0014] 本发明的实施方案涉及癌症的治疗，更具体而言，涉及具有增强的理化性质、用于激发宿主针对实体瘤免疫应答的免疫原性复合物。

[0015] 相关美国申请数据

[0016] 本申请要求2017年3月22日提交的美国临时申请第62/474,926号的优先权，并交叉参考2017年6月23日提交的美国专利申请第15/631,843号和2017年2月17日提交的美国专利申请第15/436,525号。

[0017] 发明背景

[0018] 目前转移癌的护理标准

[0019] 转移癌通常是致命的，对所有年龄段和背景的人都有影响。尽管近年来通过使用新型药物，如分子靶向疗法和免疫检查点抑制剂，已经实现了患者护理的巨大进步，但是目前大多数转移性(IV期)癌症是无法治愈的。因此，需要新的方法来改善转移性疾病患者的预后，而现有的治疗方法难以治疗转移性疾病。

[0020] 应用新型免疫治疗方法治疗实体瘤的基本原理

[0021] 一种改善人类癌症治疗的策略是激发针对表达肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的细胞的强大且有靶向细胞免疫应答，例如通过给予靶向作用于癌细胞引发免疫应答的免疫原性组合物。出于本公开的目的，肿瘤特异性抗原被定义为仅在肿瘤细胞中表达的抗原(特异性氨基酸序列)，而肿瘤相关抗原被定义为被推定仅在最初产生癌细胞的器官中表达的抗原。

[0022] 使用组织限制性抗原靶向作用于非重要细胞

[0023] 虽然与免疫系统结合以消除表达肿瘤特异性抗原的细胞具有极高的治疗指数，由此只有癌细胞被靶向消除，而诱导免疫介导的表达肿瘤相关抗原(自身抗原)的细胞破坏，意味着激发靶向性自身免疫疾病，并存在固有的风险。在肿瘤相关抗原的情况下，只有对维持生命不重要的细胞中存在的抗原才可以安全地靶向作用。因此，无法安全地靶向作用于普遍表达的抗原、或通常在重要器官中表达的抗原，所述重要器官如脑、肝、肾、肺、免疫细胞和骨髓。

[0024] 然而，由于组织限制抗原表达，靶向作用于表达某些自身抗原的细胞可具有一定的安全界限。例如，甲状腺、卵巢、前列腺和乳房组织都具有重要功能，而患者可以在没有这些器官的情况下存活。此外，非同义编码突变，其使癌细胞在遗传上与宿主不同，也可作为可行的肿瘤特异性靶标。

[0025] 实现未被满足的临床需求

[0026] 近年来，癌症免疫疗法领域见证了许多操纵宿主免疫系统来消除肿瘤细胞的新方法。然而，肿瘤展示了“冷”免疫原性特征，其特征在于缺乏浸润性免疫细胞，通常对靶向于PD-1和CTLA-4轴的免疫检查点抑制剂具有抗性。通过引发强烈的细胞免疫应答使“冷”肿瘤“变热”，可能与免疫检查点抑制剂协同作用而产生持久的反应。本发明的动机在于，对于当前护理标准难以治愈的转移性肿瘤缺乏有效治疗选择。本发明描述了合成旨在预防和治疗转移癌的新型免疫原性复合物(微生物模拟物)的方法，通过免疫系统具有的自然能力消灭微生物感染细胞，而微生物感染的细胞含有活化T细胞的抗原靶标。在微生物模拟物(“microbial mimetics”，MM)的背景下，无论是肿瘤特异性抗原还是肿瘤相关抗原均可称为“抗原物质”(“antigenic cargo”)或“抗原靶标”。

[0027] 发明概述

[0028] 本发明公开了微生物模拟物(免疫原性组合物)，所述微生物模拟物旨在通过模拟主要由肿瘤相关或肿瘤特异性抗原组成的微生物感染激发针对癌细胞的免疫应答。所述微生物模拟物(MM)由肽抗原和免疫活化分子基序组成，其表现出独特的理化性质，如尺寸可调性和增强免疫原性。在某种程度上，增强免疫原性源于利用新的制剂和肽设计基序，其与多种免疫刺激分子形成稳定的微生物模拟物(MM)复合物。MM由脂肽组合物、稳定的氨基酸连接序列和免疫原性的DNA和RNA序列组成，其中所述氨基酸连接序列和与肿瘤抗原序列具有同源性的氨基酸序列共价结合，免疫原性DNA和RNA序列被氨基酸连接序列离子吸引(图1)。MM旨在触发针对肿瘤细胞的细胞免疫应答，其通过诱导免疫细胞释放抗肿瘤细胞因子、并刺激树突细胞激活T细胞靶向作用于表达肿瘤特异性和/或肿瘤相关抗原的肿瘤细胞来实现细胞免疫应答。

[0029] MM的一般概念

[0030] MM被设计成病毒和细菌大小、载有肿瘤抗原和多种免疫增强分子基序的颗粒，呈现在免疫系统中，由此激发针对肿瘤细胞的免疫应答。简言之，免疫系统视之为微生物攻击，而所述微生物主要由肿瘤抗原组成的，而携带这些抗原的细胞被免疫系统视为被微生物所感染，并且在随后的免疫应答中成为受害者。通过修饰抗原物质，可以容易地修饰MM以治疗各种形式的癌症，因此可以作为通用的免疫原性平台。

[0031] MM与重组载体的优势比较

[0032] 重要的是，与表达肿瘤抗原的重组病毒或细菌相比，其中所述肿瘤抗原主要由病毒或细菌抗原组成，本发明所公开的MM含有非常高含量的肿瘤抗原，在所有实施方案中都超过30％，并且在其他实施方案中抗原含量占大部分。与病毒或细菌载体相比，这更有利，因为免疫应答更集中于激活和扩增肿瘤特异性T细胞。由于免疫系统中的病毒和细菌具有大量外来抗原，它们很容易扩增和激活对病毒或细菌抗原特异的T细胞。此外，病毒和细菌抗原通常为激活T细胞提供更强的抗原刺激，因此诱导T细胞更快速的扩增。由于指数增长，更快速扩增的T细胞成为主要的免疫应答。比如，在急性病毒感染期间，T细胞在强有力的刺激下可每两小时翻倍。与由于刺激较弱而每6小时翻倍的T细胞相比，倍增时间缩短3倍，意味着24小时内产生256倍增长。因此，本发明所公开的的MM使用了较多含量的肿瘤抗原，因此具有免疫刺激的优势，其更聚焦于扩增抗肿瘤T细胞，而不是激活针对病毒或病菌载体的免疫应答。附图说明

[0033] 图1为含有Pam(2)CSK4部分的单个MM元件的通式。MM含有肽连接序列，其由精氨酸、组氨酸和赖氨酸残基组成，并与免疫刺激性DNA和RNA序列离子化复合。所述连接序列通过肽键与抗原核心肽序列共价连接。抗原核心序列通过Pam(2)CSK4的末端赖氨酸残基处的共价肽键与Pam(2)CSK4分子结合。

[0034] 图2为没有Pam(2)CSK4部分和Pam(3)CSK4部分的单个MM元件的通式。

[0035] 图3为RNA248/DNA4：肽以4∶1比例合成的MM的显微镜图像。

[0036] 图4为RNA248/DNA4：肽以2∶1比例合成的MM的显微镜图像。

[0037] 图5为RNA248/DNA4：肽以1∶1比例合成的MM的显微镜图像。

[0038] 图6为RNA248/DNA4：肽以2∶1比例合成的MM的显微镜图像。

[0039] 图7为使用马尔文动态光散射粒度分析仪产生的图像，其显示了SEQ.ID NO.4(1mg/mL)和DNA4/RNA248(每一核苷酸浓度为0.5mg/mL，总浓度为1mg/mL)以1∶1比例混合时合成的MM的粒径分布。这些浓度下，颗粒的粒径范围为150nm至2μm。

[0040] 图8为使用马尔文动态光散射粒度分析仪产生的图像，其示意SEQ.ID NO.4(1mg/mL)和DNA4/RNA248(每一核苷酸浓度为0.5mg/mL，总浓度为1mg/mL)以1∶1比例混合合成的MM的粒径分布。这些浓度下，颗粒的粒径范围为300nm至7μm。

[0041] 图9为凝胶电泳实验(20V/cm)产生的图像，其中SEQ.ID NO.4(1mg/mL)与DNA4/RNA248(1mg/mL)以1∶4(2号泳道)、1∶2(3号泳道)、1∶1(4号泳道)、2∶1(5号泳道)和4∶1(6号泳道)混合。作为参考，只将DNA4/RNA248置于1号泳道中。由于其带有负电荷，DNA4/RNA248混合物在凝胶中远离负电极(顶部)。值得注意的是，在5号泳道和6号泳道中没有见到含有最高浓度肽的核苷酸条带。这表明在这些肽比率下，所述DNA4/RNA248被完全中和并与肽保持稳定复合。

[0042] 图10为示意PBMC暴露于以下物质诱导分泌白介素-6(IL-6)的柱状图：PolylC、RNA248、DNA4、DNA10、PolylC与SEQ.ID NO.4(CAL2)的复合物、RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA10与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4和RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、Pam(2)CSK4结合SEQ.ID NO.4与DNA4的复合物以及单独的SEQ.ID NO.4。每孔加入总体积为100μL的RPMI培养基，其中含有约300000个新鲜PBMC。SEQ.ID NO.4、PolylC、DNA4、DNA10、Pam(2)CSK4-结合SEQ.ID NO.4的各溶液预先混合至浓度为50μg/mL(对于每种肽试剂)，然后以100μL的体积加入孔中，使得每孔含有200μL体积的PBMC和试剂。重复三次实验并计算平均值。所有实验的标准偏差均不超过18％。

[0043] 图11为示意PBMC暴露于以下物质诱导分泌白介素-10(IL-10)的柱状图：PolylC、RNA248、DNA4、DNA10、PolylC与SEQ.ID NO.4(CAL2)的复合物、RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA10与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4和RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、Pam(2)CSK4结合SEQ.ID NO.4与DNA4的复合物以及单独的SEQ.ID NO.4。每孔加入总体积为100μL的RPMI培养基，其中含有约300000个新鲜PBMC。SEQ.ID NO.4、PolylC、DNA4、DNA10、Pam(2)CSK4-结合SEQ.ID NO.4的各溶液预先混合至浓度为50μg/mL(对于每种肽试剂)，然后以100μL的体积加入孔中，使得每孔含有200μL体积的PBMC和试剂。重复三次实验并计算平均值。所有实验的标准偏差均不超过22％。

[0044] 图12为示意PBMC暴露于以下物质诱导分泌白介素-12(IL-12)的柱状图：PolylC、RNA248、DNA4、DNA10、PolylC与SEQ.ID NO.4(CAL2)的复合物、RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA10与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4和RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、Pam(2)CSK4结合SEQ.ID NO.4与DNA4的复合物以及单独的SEQ.ID NO.4。每孔加入总体积为100μL的RPMI培养基，其中含有约300000个新鲜PBMC。SEQ.ID NO.4、PolylC、DNA4、DNA10、Pam(2)CSK4-结合SEQ.ID NO.4的各溶液预先混合至浓度为50μg/mL(对于每种肽试剂)，然后以100μL的体积加入孔中，使得每孔含有200μL体积的PBMC和试剂。重复三次实验并计算平均值。所有实验的标准偏差均不超过17％。

[0045] 图13为示意PBMC暴露于以下物质诱导分泌白介素-15(IL-15)的柱状图：PolylC、RNA248、DNA4、DNA10、PolylC与SEQ.ID NO.4(CAL2)的复合物、RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA10与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4和RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、Pam(2)CSK4结合SEQ.ID NO.4与DNA4的复合物以及单独的SEQ.ID NO.4。每孔加入总体积为100μL的RPMI培养基，其中含有约300000个新鲜PBMC。SEQ.ID NO.4、PolylC、DNA4、DNA10、Pam(2)CSK4-结合SEQ.ID NO.4的各溶液预先混合至浓度为50μg/mL(对于每种肽试剂)，然后以100μL的体积加入孔中，使得每孔含有200μL体积的PBMC和试剂。重复三次实验并计算平均值。所有实验的标准偏差均不超过25％。

[0046] 图14为示意PBMC暴露于以下物质诱导分泌干扰素-α(IFN-α)的柱状图：PolylC、RNA248、DNA4、DNA10、PolylC与SEQ.ID NO.4(CAL2)的复合物、RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA10与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4和RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、Pam(2)CSK4结合SEQ.ID NO.4与DNA4的复合物以及单独的SEQ.ID NO.4。每孔加入总体积为100μL的RPMI培养基，其中含有约300000个新鲜PBMC。SEQ.ID NO.4、PolylC、DNA4、DNA10、Pam(2)CSK4-结合SEQ.ID NO.4的各溶液预先混合至浓度为50μg/mL(对于每种肽试剂)，然后以100μL的体积加入孔中，使得每孔含有200μL体积的PBMC和试剂。重复三次实验并计算平均值。所有实验的标准偏差均不超过22％。

[0047] 图15为示意PBMC暴露于以下物质诱导分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的柱状图：PolylC、RNA248、DNA4、DNA10、PolylC与SEQ.ID NO.4(CAL2)的复合物、RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA10与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4和RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、Pam(2)CSK4结合SEQ.ID NO.4与DNA4的复合物以及单独的SEQ.ID NO.4。每个孔加入总体积为100μL的RPMI培养基，其中含有约300000个新鲜PBMC。
SEQ.ID NO.4、PolylC、DNA4、DNA10、Pam(2)CSK4-结合SEQ.ID NO.4的各溶液预先混合至浓度为50μg/mL(对于每种肽试剂)，然后以100μL的体积加入孔中，使得每孔含有200μL体积的PBMC和试剂。重复三次实验并计算平均值。所有实验的标准偏差均不超过27％。

[0048] 图16为示意PBMC暴露于以下物质诱导分泌干扰素-γ(IFN-γ)的柱状图：PolylC、RNA248、DNA4、DNA10、PolylC与SEQ.ID NO.4(CAL2)的复合物、RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA10与SEQ.ID NO.4的复合物、DNA4和RNA248与SEQ.ID NO.4的复合物、Pam(2)CSK4结合SEQ.ID NO.4与DNA4的复合物以及单独的SEQ.ID NO.4。每孔加入总体积为100μL的RPMI培养基，其中含有约300000个新鲜PBMC。SEQ.ID NO.4、PolylC、DNA4、DNA10、Pam(2)CSK4-结合SEQ.ID NO.4的各溶液预先混合至浓度为50μg/mL(对于每种肽试剂)，然后以100μL的体积加入孔中，使得每孔含有200μL体积的PBMC和试剂。重复三次实验并计算平均值。所有实验的标准偏差均不超过14％。

[0049] 图17为证明可改变RNA248与MEL2(SVYDFFVWLRRHRKRR)比例来调节MM平均粒径的图。最初以1mg/mL的原液浓度混合RNA248和MEL2，然后以100μL的增量将MEL2滴加到1mL的RNA248中，以产生具有指定比例的溶液。随着MEL2浓度的增加，平均粒径减小。使用马尔文动态光散射粒度分析仪测量粒径。

[0050] 图18为证明可改变RNA248与MEL4(Pam(2)CSKKKKSVYDFFVWLRRHRKRR)比例来调节MM平均粒径的图。最初以1mg/mL的原液浓度混合RNA248和MEL4，然后以100μL的增量将MEL4滴加到1mL的RNA248中，以产生具有指定比例的溶液。随着MEL4浓度的增加，平均粒径减小，平均粒径从大约4μm减小到约700nm。

[0051] 图19是显示在完善的和侵袭性B16鼠黑素瘤模型中MM对肿瘤生长的影响图。显示了四组数据(n＝5)，包括对照组、仅佐剂(DNA4/RNA248)、佐剂+MEL2(SVYDFFVWLRRHRKRR)MM治疗组、和佐剂+MEL4((Pam(2)CSKKKKSVYDFFVWLRRHRKRR)MM治疗组。MEL2和MEL4肽都包括SWDFFVWL Trp2表位。使用MEL2 MM和MEL4 MM治疗都抑制了肿瘤生长，而MEL4 MM具有最好的抑制效果，在肿瘤植入后16天、治疗第12天MEL4 MM对肿瘤生长的抑制作用比对照组高71％。

[0052] 详述说明所公开实施方案

[0053] 实施方案范围

[0054] 通过下述详细说明并结合附图和所附权利要求，可容易理解实施方案。实施方案通过实施例的形式进行阐述说明，而不为所述附图所限制。以下将结合附图进行说明，所述附图构成说明书的一部分，并且其中显示通过图示的方式示实施所阐述的实施方案。应当理解，可以利用其他实施例，并且进行结构或逻辑上的改变并不背离本发明的范围。因此，下述详细说明不应被视为具有限制意义，实施方案的范围由所附权利要求及其等同物所限定。

[0055] 可以以有助于理解实施方案的方式依次将各种操作说明为多个独立的操作；但是，说明顺序不应被解释为暗示这些操作是依赖于顺序的。

[0056] 就本说明书目的而言，“A/B”形式或“A和/或B”形式的短语表示(A)、(B)或(A和B)。出于本说明书目的，“A、B和C中的至少一种”形式的短语表示(A)、(B)、(C)、(A和B)、(A和C)、(B和C)、或(A、B和C)。就本说明书目的而言，“(A)B”形式的短语表示(B)或(AB)，即A是可选成分。本说明书可使用术语“实施方案”或“实施方案(复数)”，各指一个或多个相同或不同的实施方案。此外，就实施方案使用的术语“包含”、“包括”、“具有”等是同义的，通常作为“开放”术语(例如，术语“包括”应当被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。

[0057] 关于本发明中使用的任何复数和/或单数术语，本领域技术人员可以根据上下文和/或申请适当地从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为清楚起见，在此可明确阐述各种单数/复数排列。

[0058] 除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可在下述文献中找到：Benjamin Lewin，Genes IX，J ones和Bartlet出版，2008(ISBN 0763752223)；Kendrew等，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd出版，1994(ISBN 0632021829)；Robert A.Meyers等，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc出版，1995(ISBN
9780471185710)；和其他类似的参考。

[0059] 用于实施或测试本发明的合适方法和材料说明如下。这些方法和材料只是为了说明本发明，而不是希望限制本发明。可以使用与本发明所述相似或等同的其他方法和材料。例如，在各种一般和更具体的参考文献中描述了本发明所涉及的本领域公知的常规方法，包括，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Sambrook etal.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3d ed.，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，1992(and Supplements to 2000)；Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，4th ed.，Wiley&Sons，1999；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990；Harlow and Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999。此外，所述材料、方法和实施例仅是为说明本发明而不是限制于本发明。

[0060] MM在多种肿瘤类型治疗中的应用

[0061] 本发明公开的MM也可作为免疫原性平台或载体，通过修饰抗原物质来治疗其他癌症。修饰的MM可用于治疗以下肿瘤：例如，实体瘤，如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌(如结肠癌)、胃癌(如胃腺癌，如肠型胃腺癌和弥漫型胃腺癌)、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌(如腺癌)、肺癌，妇科癌症(如子宫类癌症(例如子宫内膜癌))、子宫颈癌(例如宫颈癌、肿瘤前宫颈发育不良)、卵巢癌症(例如卵巢癌、浆液囊腺癌、粘液囊腺癌，子宫内膜样瘤、细胞母细胞瘤、透明细胞癌，未分类癌、颗粒-泡膜细胞瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)，外阴(例如鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)，阴道(例如透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤)、胚胎性横纹肌肉瘤和输卵管(例如癌)、前列腺癌、肝细胞癌，鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、髓质甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状腺未分化癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)和皮肤癌。

[0062] MM的设计合成和表征

[0063] 抗原物质选择

[0064] 许多自身抗原在对维持生命至关重要的组织中普遍表达，而某些自身抗原，包括降钙素、甲状腺球蛋白、前列腺特异性抗原和黑素瘤分化抗原等，可以治疗性地靶向作用于器官中产生的表达这些抗原的癌症。例如，甲状腺髓样癌表达降钙素，而乳头状甲状腺癌表达甲状腺球蛋白。黑素瘤表达酪氨酸酶、gp100和MART-1。前列腺癌表达前列腺特异性抗原。MM的抗原物质可修饰为含有与组织限制性抗原具有大于95％序列同源性的多肽。另外，携带非同义突变的肿瘤细胞在遗传上与宿主不同。在这些肿瘤中，DNA突变可导致天然宿主序列的单个氨基酸发生改变，从而产生肿瘤特异性抗原。引发针对表达这种非自身抗原的细胞的免疫应答在治疗上是有益的。MM的抗原物质可修饰为包含此类肿瘤特异性抗原。对于每一种MM而言，抗原物质由8至35个氨基酸的多肽组成，与肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原具有大于95％的序列同源性。

[0065] 选择独特的非同源核心序列

[0066] 为了避免使用具有高潜力的核心序列由于脱靶序列同源性而触发自身免疫，随后在候选多肽抗原时应用了理想化的过滤步骤。所述过滤可以如下进行。使用计算工具，比如NIH的基本局部比对搜索工具(BLAST)，首先将候选肽核心序列与整个人类基因组进行交叉参照。具体而言，分别针对整个基因组筛选包含每种候选肽的9聚体(连续的9个氨基酸片段)。排除任何共有7个或更多个氨基酸(＞77％序列同源性)的9聚体多肽。值得注意的是，保守氨基酸置换，例如异亮氨酸(I)置换亮氨酸(V)在所采用的筛选算法中被评分为0.5，而对于完全匹配的氨基酸评分为1.0。

[0067] MM的组合和合成

[0068] MM由多个复杂元件组成，包括：

[0069] 1)肿瘤特异性抗原物质或肿瘤相关抗原物质，即对应于至少一种靶向肿瘤抗原的肽序列，如所选抗原物质部分中所述。通常将抗原物质溶解在合适的缓冲液中，如PBS、含0.1至2％乙酸的PBS、和/或HEPES。

[0070] 2)含有精氨酸、组氨酸和赖氨酸残基的新型肽连接序列(RRHRKRR)(SEQ.ID NO.4)，其在氨基末端、羧基末端或两个末端与抗原物质共价偶联。关键的是，基于BLAST分析，新的连接序列不与人基因组中任何已知序列重叠。最接近的匹配是锌指蛋白646，其具有86％的序列同源性。抗原物质和连接序列一起形成合成的肽。

[0071] 3)免疫原性的硫代磷酸化DNA序列，其通过连接序列和硫代磷酸酯骨架之间的离子相互作用稳定地与合成的肽偶联。表1中提供了所用的DNA序列。此类免疫原性DNA序列作为独立试剂的应用先前已获得Isis制药公司的专利保护，所述专利于1996年9月11日提交申请，专利号为6,727,230，专利名称为“由硫代磷酸化寡聚核苷酸类似物引起的免疫刺激”。以下为用于实验的DNA序列：DNA4(5′-TCGTCGGTTTCGGCGCGCGCCG-3′)和DNA10(5′-TTCGGCGCGCGCGCGCGCGCGCCGTT-3′)。

[0072] 4)新型RNA序列，称为RNA248，其通过连接序列和RNA的硫代磷酸酯骨架之间的离子相互作用稳定地与合成的肽偶联，RNA248具有以下序列：5′-guuggugguugugugagcgu-3′，并包括在表1中。

[0073] 5)任选地，脂肽如Pam(2)CSK4(S-(2,3-二棕榈酸-丙基)半胱氨酸-丝氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸)或Pam(3)CSK4(N-棕榈酰-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸-丝氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸)，可以在氨基末端与合成的肽共价结合。例如，一种具有N-末端连接序列的实例性肽和SVYDFFVWL抗原物质合成为Pam(2)CSKKKKRRHRKRRSVYDFFVWL。另一种具有C-末端连接序列的实例性肽合成为Pam(2)CSKKKKSVYDFFVWLRRHRKRR。

[0074] 图1和图2图示了若干实施方案的通用图例。图1显示了在氨基末端连接有Pam(2)CSK4脂肽的MM，而图2显示了在氨基末端没有脂肽的MM。

[0075] 表1：免疫刺激性DNA和RNA分子

[0076] SEQ.ID NO. 名称序列1 RNA248 5′-guuggugguugugugagcgu-3′
2 DNA4 5′-TCGTCGGTTTCGGCGCGCGCCG-3′
3 DNA10 5′-TTCGGCGCGCGCGCGCGCGCGCCGTT-3′

[0077] 表2：实验所用的肽序列

[0078]

[0079]

[0080] 合成MM的通用方法

[0081] 尽管可以采用本领域技术人员熟知的各种合成方法，但为了显示一种可以合成MM的方法，对下述合成方案进行了概述。该实例性MM含有作为抗原物质的人降钙素的部分多肽序列。

[0082] 实施例1

[0083] 在溶液中制备微生物模拟物

[0084] 通过将合成肽原液和刺激性RNA和DNA序列原液混合，可以容易制备MM。在一个实施方案中，RNA248和DNA4分别以2mg/mL的浓度溶于PBS，形成澄清溶液。然后将RNA248和DNA4溶液(各1mL)等体积混合，形成浓度为1mg/mL、体积为2mL的RNA248和DNA4的澄清溶液。该溶液称为“RNA248/DNA4”。接下来，将合成肽例如含有(LSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAI)降钙素核心序列的SEQ.ID NO.4，以2mg/mL的浓度溶于PBS，制成体积为2mL的澄清溶液。然后将合成肽溶液以100μL的增量缓慢滴加到RNA248/DNA4溶液中。以这种方式，可以容易地控制合成肽的总体积，因此可以控制肽与RNA248/DNA4的比例。随着加入的肽增多，最初澄清的溶液逐渐变得浑浊。在其他实施方案中，可以将RNA248/DNA4缓慢滴加到合成肽溶液中。最初澄清的溶液在混合时变得越来越不透明，这一观察结果启发后续实验以表征MM复合物，其是在混合时自发形成的。如下所述，确定复合物非常稳定，并且通过改变RNA248/DNA4与肽的比例可以容易地改变它们的尺寸。

[0085] 实施例2

[0086] MM复合物的尺寸可调性

[0087] 为本领域技术人员熟知的是，颗粒尺寸和表面电荷都会对细胞摄取产生深远影响。例如，实验表明，当颗粒显示正表面电荷时，颗粒的细胞摄取大大增强，并且实验表明树突状细胞优先摄取直径低于500nm的颗粒，而带有负电荷的颗粒直径低于100nm时可以为树突状细胞选择性内化。值得注意的是，大多数微生物(细菌和病毒)的大小范围为50nm至10μm，因此可以工程设计具有这些尺寸的颗粒并能够容易定制表面电荷，可有利于刺激免疫应答。重要的是，通过简单改变RNA248/DNA4与合成多肽的比例，可以容易地调节MM的尺寸和电荷。

[0088] 作为表征混合比对MM颗粒尺寸的影响的简单方法，将RNA248/DNA4原液和肽(SEQ ID NO.4)的原液以4∶1、2∶1、1∶1和1∶2的比例混合，剧烈涡旋振荡。然后取10μL各溶液液滴，置于显微镜载玻片上并使其干燥。图3、图4、图5和图6分别显示了各干燥液滴的40倍放大图像。在RNA248/DNA4高浓度(4∶1，图3)下，形成大而清晰可见的颗粒，其中值直径为～10μm。随着肽的量增加，MM颗粒的直径减小，当以1∶1的比例混合时，MM颗粒的直径减小并形成相对单分散的～2μm的圆形颗粒。随着肽浓度增加，颗粒尺寸减小到不能再通过显微镜分辨的程度。

[0089] 为了表征该尺寸范围内的MM颗粒，使用马尔文动态光散射粒度分析仪表征溶液。这种粒度测量方法也是有利的，因为它可以测量溶液中的MM。对不同浓度进行实验，并提供了RNA248/DNA4：肽比例为1∶2(图7)和2∶1(图8)的混合溶液的代表性结果。在1∶2比例下，发现存在两类MM，平均尺寸为150nm和1000nm。本发明人注意到这些MM合宜地具有病毒如HIV(150nm)和小细菌如大肠杆菌(1000nm)的特征。尽管是全合成制备，但MM尺寸可调性的独特性质，使得MM可以更忠实地再现真实的微生物感染。

[0090] 为了进一步评估MM对于不同肽制剂的尺寸可调性，将MEL2(SEQ.ID NO.5)和MEL4(SEQ.ID NO.6)与不同浓度的RNA248混合。图17和18提供了结果。使用Malvem粒度分析仪测量平均粒径。

[0091] 通常，对于每个多肽/RNA248/DNA4组合，必须根据经验测定MM的直径作为浓度函数。然而，在测量的浓度范围内，随着肽浓度的增加，平均粒径有持续减小的趋势。图17演示了通过改变RNA248与MEL2(SVYDFFVWLRRHRKRR)的比例可以调节MM的平均直径。RNA248和MEL2最初以1mg/mL的原液浓度混合，然后将MEL2以100μL的增量滴加到1mL RNA248中，以产生规定比例的溶液。随着MEL2浓度的增加，平均粒径减小。图18演示了通过改变RNA248与MEL4(PAM(2)CSKKKKSVYDFFVWLRRHRKRR)的比例可以调节MM的平均直径。最初以1mg/mL的原液浓度将RNA248和MEL4混合，然后将MEL4以100μL的增量滴加到1mL的RNA248中以产生规定比例的溶液。随着MEL4浓度的增加，平均粒径从大约4μm减小到～700nm。

[0092] 实施例3

[0093] MM复合物稳定性表征

[0094] 已知免疫刺激颗粒和抗原物质的复合对免疫原性非常重要。本领域技术人员已知这能对细胞运输具有深远的影响。复合作用一定程度上解释了为什么破坏组织的局部病毒或细菌感染通常不会引起自身免疫疾病。在由细菌感染引起的炎症情况下，垂死细胞释放抗原，并且存在大量免疫刺激性细菌基序，其可以被活化的树突细胞同时摄入。然而，自身抗原和细菌“危险信号”同时呈递通常不会产生自身免疫疾病。

[0095] 实际上，最近的研究表明，当抗原物质与免疫刺激分子复合时，树突细胞对抗原物质的应答更强。最近发现的银屑病病因是一个很好的实例。当皮肤细胞死亡时，可能由于感染，阳离子抗菌自身蛋白LL37与DNA复合，而DNA通常被DNA酶快速降解。肽与免疫刺激DNA的复合物能够触发自身免疫疾病。因此，已知抗原物质与免疫刺激基序的复合物对于触发针对自身抗原的免疫应答是至关重要的，并且这种免疫复合物可以克服中枢和外周耐受机制。

[0096] 如前所述，观察到MM容易在溶液中形成复合物，并且MM复合物的尺寸可以容易地调整。鉴于抗原物质与免疫刺激分子形成稳定复合物的重要性，使用凝胶电泳表征MM的稳定性。将CAL2(SEQ ID NO.4)与DNA4/RNA248以不同比例混合制备MM。如图9所示，在肽与DNA4/RNA248的比例超过2∶1时，没有游离DNA4/RNA248可见，表明所有DNA4/RNA48保持与肽结合，即使在20V/cm的电场中亦是如此。在足够的肽浓度下游离DNA4/RNA248消失表明形成了稳定的复合物。此外，随着肽浓度的增加，每个条带的强度降低。认为存在连接序列RRHRKRR对于稳定复合物而言至关重要。另外，在室温下放置2周后测试MM溶液，得到的结果几乎相同。

[0097] MM子元件的获得

[0098] 如肽合成小节中所概述，可以容易地制造合成肽。使用标准Fmoc化学很容易实现结合。就本发明目的而言，从单一商业供应商(Lifetein，希尔斯伯勒，新泽西)采购肽。肽以冻干形式(保存于2mL冷冻瓶中，在非反应性氩气下包装)运送至本发明人，并在PBS或PBS+1％乙酸中重新配制成不同浓度的原液，浓度范围从0.025mg/mL至2mg/mL。

[0099] 如核苷酸合成小节中所述，可以容易地制备刺激性DNA和RNA序列。冻干的DNA和RNA序列分别购自AlphaDNA(蒙特利尔，加拿大)和Trilink生物技术(圣地亚哥，加利福尼亚州)。在合成之前，在PBS中重新配制成不同浓度的原液用于实验，浓度范围从0.025mg/mL至2mg/mL。

[0100] 多肽合成

[0101] 用于所述公开免疫原性组合物的多肽可以通过任何本领域可用的方法制备，使用本领域技术人员熟悉的固相多肽合成技术的应用和优选方法制备，包括Fmoc化学、或从重组原核或真核生物来源纯化多肽。作为合成较长肽的起始材料，Pam(2)CSK4和Pam3CSK4均可从多个商业供应商(例如Torcris Bioscience、Lifetein和英维捷基)获得，其中Pam(2)CSK4或Pam3CSK4位于氨基末端。

[0102] 用于所公开免疫原性组合物的肽可以例如通过本领域已知的许多手动或自动合成方法中的任何一种化学合成来制备。另外，形成全部或部分异-双功能配体的多肽可合成产生。例如，使用Applied Biosystems Model 43 IA肽合成仪以及使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基末端保护，偶联二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐/羟基苯并三唑(HBTU/HOBT，并使用对羟甲基苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)或使用用于羧基末端酸的Sasrin树脂或用于于羧基末端酰胺的Rink酰胺树脂，可以以0.25毫摩尔(mmole)的规模进行固相多肽合成(SPPS)。按照Atherton等人在SolidPhase Peptide Synthesis，IRL Press：Oxford，1989中所述的Fmoc衍生化，通过在三氟乙酸中三苯甲基化和三苯基甲醇，可以从适当的前体氨基酸制备Fmoc衍生的氨基酸。

[0103] 合成RNA和DNA核苷酸和RNA或DNA编码的抗原

[0104] 编码免疫刺激性RNA、DNA或免疫原性多肽的核酸序列可以通过任何合适的方法制备，所述方法包括例如克隆合适的序列或通过以下方法直接化学合成：如Narang等的磷酸三酯法，Meth.Enzymol.68：90-99，1979；Brown等的磷酸二酯法，Meth.Enzymol.68：109-151，1979；Beaucage等的二乙基亚磷酰胺法，Tetra.Lett.22：1859-1862，1981；Beaucage和Caruthers描述的固相亚磷酰胺三酯法，Tetra，Letts.22(20)：1859-1862，1981；例如，使用如Needham-VanDevanter等在Nucl.Acids Res.12：6159-6168，1984中所述的自动合成仪；
和美国专利第4,458,066号的固体支持方法。化学合成产生单链寡核苷酸。这可以通过与互补序列杂交或通过单链作为模板使用DNA聚合酶聚合将单链寡核苷酸转化为双链DNA。

[0105] MM的应用

[0106] 本发明公开的MM可用于在人体中刺激或引发特异性免疫应答。在一些实施方案中，免疫原性应答是保护性的或提供针对癌症的保护性免疫。本发明公开的免疫原性组合物包括一种或多种分离多肽，比如多种，当给予受试者时，引发对肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的免疫应答。

[0107] 免疫制剂

[0108] 本发明所公开的MM免疫原性组合物可包含在药物组合物中(包括治疗和预防制剂)，并且可以与一种或多种药物可接受的载体组合。此类药物组合物可通过多种给药方式给药于受试者，包括通过肌内、皮下、静脉内、心房内、关节内、腹膜内、非经肠途径口服、直肠、鼻内、肺内或透皮给药，或局部给药到其他表面。

[0109] 为配制药物组合物，可将MM与各种药物可接受的添加剂以及用于分散所述免疫原性组合物的基底或载体组合。所需的添加剂包括但不限于pH控制剂，如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、檬酸等。此外，也可包括局部麻醉剂(例如苯甲醇)、等渗剂(例如氯化钠、甘露醇、山梨糖醇)、吸附抑制剂(例如吐温80)、助溶剂(例如环糊精及其衍生物)、稳定剂(例如血清白蛋白)和还原剂(例如谷胱甘肽)。

[0110] 当组合物是液体时，以0.9％(w/v)生理盐水溶液的张力作为单位进行测量，通常调节制剂的张力值至该张力下给药部位不会诱导发生实质的、不可逆的组织损伤。一般而言，将溶液的张力调节至约0.3至约3.0的值，如约0.5至约2.0，或约0.8至约1.7。

[0111] MM免疫原性组合物可以分散在基底或载体中，其可以包括具有分散免疫原性组合物的能力的亲水性化合物，以及包括任何所需的添加剂。本公开的MM可选择性包含药学上可接受的载体以接近生理条件所需的物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯和油酸三乙醇胺。对于固体组合物，可以使用常规的无毒的药物可接受载体，其包括例如药物级的甘露醇、山梨糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

[0112] 也可将施用MM的药物组合物配制成溶液、微乳液或适合高浓度活性成分的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用如卵磷脂包衣，通过在可分散制剂的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇和山梨糖醇、或氯化钠，是可取的。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现免疫原性组合物的延长吸收。

[0113] 在某些实施方案中，MM免疫原性组合物可以以定时释放制剂形式给药，例如在包含缓释聚合物的组合物中。这些组合物可以使用防止快速释放的载体制备，例如控释载体如聚合物、微囊化递送系统或生物粘附凝胶。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶，可以实现本公开的各种免疫原性组合物的延长递送。当需要控释制剂时，适合本公开使用的控释粘合剂包括任何对活性成分呈惰性并且能够掺入免疫原性组合物和/或其他生物活性成分之中的生物相容性控释材料。许多此类制剂的制备方法为本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978)。其它有用的制剂包括控释微囊(美国专利第4,652,441号和第4,917,893号)、用于制备微胶囊和其它制剂的乳酸-乙醇酸共聚物(美国专利号第4,677,191号和第4,728,721号)和用于水溶性多肽的持续释放组合物(美国专利第4,675,189号)。

[0114] 除化学依赖性限时释放制剂外，免疫原性组合物的剂量和因此树突细胞遇到的抗原量可通过给药方案和剂量大小控制。例如，为模拟急性病毒感染，可以每天或每小时给与免疫原性组合物，从小剂量开始，在数小时或数天的过程中以线性或指数方式增加剂量直至达到可耐受的最大剂量。

[0115] 本发明的药物组合物在制造、储存和使用条件下通常是无菌和稳定的。可通过将所需量的免疫原性组合物掺入适当的溶剂中，根据需要与本文列举的一种或多种成分组合，然后过滤灭菌来制备无菌溶液。一般而言，将免疫原性组合物和/或其他生物活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和本文列举的那些所需的其他成分。在无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其获得的免疫原性的粉末组合物含有来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等，可以预防微生物作用。

[0116] 治疗方法

[0117] 本发明公开的MM可用于产生或引发免疫应答、治疗患有癌症的受试者和降低肿瘤生长速率的方法，如下所述。

[0118] 在若干实施方案中，所述方法包括向受试者给予一种或多种有效量——如免疫有效剂量的所公开的MM以产生免疫应答。所述方法可包括选择需要治疗的受试者，如患有、疑似患有或易患癌症的受试者，所述癌症例如实体瘤。还公开了用于治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法。此类方法包括选择患有或疑似患有癌症的受试者，并向受试者给予治疗有效量的所公开的MM免疫原性组合物，从而治疗受试者。

[0119] 免疫应答是免疫系统细胞(如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核白细胞)对刺激的反应。免疫应答可包括机体中参与宿主防御反应的任何细胞。免疫应答包括但不限于适应性免疫应答或炎症。

[0120] 在实例性应用中，将免疫原性组合物足量给予患有疾病如癌症(例如甲状腺髓样癌)的受试者，以对表达抗原的细胞(所述细胞为免疫原性组合物所靶向)产生免疫应答。给药后产生了足够的免疫应答，减缓此类细胞的增殖或抑制其生长、或减少肿瘤的体征或症状。对此用途的有效量取决于疾病的严重程度、患者健康状况、以及患者免疫系统强弱。在一个实施例中，治疗有效的MM量，提供了主观症状缓解，或由临床医生或其他合格观察者记录的客观可识别的改善。

[0121] 预使用本发明组合物和方法治疗的典型受试者包括人类患者。为了鉴别患者进行治疗，可接受的方法可用于诊断或分期疑似疾病，如医学成像(CT、MRI、超声、PET和/或X射线)、活组织检查、组织学和/或血清肿瘤生物标志物测量。这些和其他常规方法允许临床医生选择需要使用本发明方法和药物组合物治疗的患者。根据这些方法和原理，可以根据本发明教导给药MM免疫原性组合物，可以作为独立的预防或治疗程序，或作为其他治疗的后续治疗、辅助治疗或联合治疗方案，包括手术、免疫疗法、激素治疗等等。

[0122] 所述免疫原性组合物可用于联合治疗方案或组合制剂。作为实例，本发明所述的免疫原性组合物可与结合PD-1的免疫检查点抑制抗体或与结合CTLA-4的免疫检查点抑制抗体同时或顺序给药，PD-1抑制抗体如纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)，CTLA-4抑制抗体如伊匹单抗(ipililumab)。

[0123] 给予本发明的免疫原性组合物可用于预防或治疗目的。当预防性给药时，在任何症状之前使用所述免疫原性组合物。预防性给予免疫原性组合物用于预防或改善疾病的任何进展。当治疗性给药时，免疫原性组合物在疾病症状发作时(或之后不久)给药。为预防和治疗目的，可通过以下方式给予受试者所述免疫原性组合物：单次注射递送、在延长的时间段内通过连续递送(例如连续透皮粘膜或静脉内递送)、或在重复的给药方案中(例如每小时每日或每周重复给药方案)指数增加的剂量，以模拟急性病毒感染。延长的预防或治疗方案中可重复给药治疗有效剂量的MM。

[0124] 在此背景下有效剂量的确定通常基于人体临床试验之前的动物模型研究，并且由优化的临床结果指导给药方案。在这方面，合适的模型包括例如鼠、大鼠、猪、猫、非人灵长类动物和本领域已知的其他可接受的动物模型受试者。

[0125] 在给予本发明MM免疫原性组合物(例如通过注射剂、气雾剂、口服、局部或其他途径)后，受试者的免疫系统通常通过分泌细胞因子如IFN-α、IL-12，TNF-α或者通过诱导树突细胞激活初始肿瘤特异性T细胞对免疫原性组合产生应答。这类活化的T细胞可以迅速增殖。

[0126] 通过单次或多次给药(包括，例如，每天多次给药)、每天或每周给药，可以获得免疫有效剂量。对于每个具体的受试者，可以根据个体需要以及依据所述免疫原性组合物给药人员或监督所述免疫原性组合物给药的人员的专业判断来评估和调整特定剂量方案。在其他实例中，T细胞的细胞免疫应答可以通过酶联免疫斑点(ELISPOT)或四聚体染色或肿瘤标志物测量或医学成像来列举。对个体而言，决定是否加强接种和/或是否改变所述组合物的给药剂量，可以至少部分基于T细胞活化实验。

[0127] 临床主治医生可以改变剂量以维持所需的浓度。可以基于递送模式选择更高或更低的浓度。也可以根据给药制剂的释放速率调整剂量。

[0128] 也设想了试剂盒。在一个实施方案中，这些试剂盒包括容器或制剂，其含有药师通过简单混合或成分滴定从冻干产品中产生MM的材料。在一个实例中，将该组分配制在药物制剂中以递送至受试者。所述MM任选地包含在散装分配容器或单元或多单元剂型中。可以提供可选的分配装置。包装材料任选地包括标签或说明书，以标明包装在其中的药物制剂是何治疗目的和/或是何治疗方式。

[0129] 保守变异MM组合物进行个性化癌症治疗

[0130] 在不同患者中由相同细胞类型产生的肿瘤通常展现出高度不同的分子特征，涉及潜在的突变和基因表达，其决定了肿瘤表型。在较小程度上，同一患者体内的肿瘤可表现出这种多样性。使用本领域技术人员熟悉的已建立的方法，如全外显子组测序、mRNA分析或免疫组织化学染色，可以可靠地确定患者肿瘤样本的独特基因组和蛋白质组表达谱。在这种情况下，可以配制MM溶液，以包括具有各种多肽的MM。通过设计，这种方法将靶向于肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，同时使患者免于任何因为接种针对患者肿瘤中不存在的抗原而产生的潜在的副作用。

[0131] MM的递送、剂量和给药方案

[0132] MM可在患者多个身体部位通过结内、真皮内或肌内注射给药。MM的总剂量可以变化。一般而言，对于每种MM而言，剂量应该在100μg至50mg的范围内，其中定制的剂量基于耐受性和剂量相关的免疫应答。具体而言，为了模拟急性病毒感染，可以同时应用肌内和真皮内给药方案，其中每天给药治疗，并且每次给药剂量是前一天的两倍，使得剂量值呈指数增长，直至达到最大耐受剂量点。真皮内给药用于向引流淋巴结提供稳定的MM剂量，而肌内给药由于增加灌注，可用于模拟由MM模拟的快速升高的感染。

[0133] 模拟急性病毒感染已被证明是保护性免疫的有效方法。作为一个最佳实例，YF-17D黄热病疫苗是一种活的减毒病毒，通常可以提供针对受黄热病的终身保护。YF-17D忠实地复制了真正的急性病毒感染并诱导多功能记忆CD8+T细胞应答。分析表明，疫苗接种后大约7天病毒载量达到峰值，并且在初次注射后～14天就无法检测到，而T细胞应答在数量上有所增加，在第30天达到峰值。此外，分析显示T细胞应答随着病毒载量(抗原刺激)的增加而增加，直至达到约103个病毒拷贝/mL的饱和点。因此，MM可优选用于给药方案，其忠实地复制了急性病毒感染，类似于YF-17D感染。这样的给药方案将确保抗原刺激随着活化T细胞数量增加而增加，进一步引发有效的免疫应答而不会在引发过程中过早地浪费抗原刺激。

[0134] 实施方案的应用和变异

[0135] 尽管本发明已列举和描述了某些实施方案，但为所属领域普通技术人员了解的是，经计算以实现相同目的的各种替代和/或等效实施方案或实施例可替代所展示和描述的实施方案而不背离本范围。本领域技术人员将容易理解，实施方案可以以各种各样的方式实现。本申请旨在涵盖本文所讨论的实施方案的任何改变或变化。因此，显而易见的是，实施方案仅为权利要求及其等同物所限制。

[0136] 实施例4

[0137] MM和包含MM的分子亚单元的体外免疫原性研究

[0138] 进行一系列体外实验以表征MM及其子元件的免疫刺激性质。将人外周血单核细胞(PBMC)暴露于含有SEQ.ID NO.4及其单个分子子元件的MM 24小时。作为参照，将PBMC单独暴露于PolylC。此后，测量诱导PBMC分泌的下列细胞因子：白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)，白介素-15(IL-15)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素-α(IFN-α)和干扰素-γ(IFN-γ)。实验如下进行。由人类志愿者提供150mL血液，并在静脉穿刺后立即通过Ficoll-Paque梯度离心分离PBMC。将PBMC在37℃/5％CO2下在96孔板中培养24小时，每孔
200μL培养基中具有300,000个PBMC，培养基含有49％RPMI-1640/49％PBS/1％L-谷氨酰胺/
1％青霉素-链霉素以及表3中所列组分(浓度为25μg/mL)。重复三次测定所有细胞因子。

[0139] 表3：用于体外研究的MM和分子元件

[0140]标签说明
PolylC 多聚肌苷酸：多聚胞苷酸
CAL2 RRHRKRRLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAI
RNA248 5′-guuggugguugugugagcgu-3′
DNA4 5′-TCGTCGGTTTCGGCGCGCGCCG-3′
DNA10 5′-TTCGGCGCGCGCGCGCGCGCGCCGTT-3′
MM1 CAL2+DNA4+RNA248
MM2 Pam(2)CSKKKK RRHRKRRLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAI+DNA4

[0141] 24小时后，3000g离心分离各孔的上清液，然后立即使用购自Genway Biotech公司(圣地亚哥，加拿大)和Origene公司(罗克维尔，马里兰)的ELISA试剂盒测量细胞因子。根据ELISA试剂盒说明书，每次读数使用100μL上清液。结果提供在图10-图16中，其中提供了每个测量的平均值。(在任何情况下，标准偏差都不超过30％。)

[0142] MM增强和协同的免疫原性

[0143] 该数据集揭示MM1和MM2具有高度免疫原性，诱导高水平分泌IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、FN-α和IFN-γ。值得注意的是，在所有测试的元件中，只有MM2能够诱导分泌IL-15。重要的是，所述MM能够比PolylC更高水平诱导分泌IL-12和IFN-α。必须注意的是，RNA248、DNA4和DNA10本身诱导分泌的细胞因子很少，但当在氨基末端与含有连接序列(RRHRKRR)的CAL2肽(RRHRKRRLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAI)复合时，分泌的细胞因子显著增加。因此，通过与多个免疫刺激基序复合，MM以协同方式诱导增强分泌多种细胞因子。实际上，MM的免疫原性远大于其部分的总和。作为单个元件，RNA248和CAL2对细胞因子分泌的增强作用非常小，其接近或低于检测限。此外，DNA4虽然在IFN-α诱导方面具有一定的免疫原性，但不诱导分泌大量IL-15的L-12。然而，当在MM复合物中组合时，所述细胞因子信号具有高度免疫原性，MM1诱导六种细胞因子的高水平分泌，而MM2诱导所有七种细胞因子的可测量分泌。

[0144] 如MM稳定性小节中所讨论的，MM形成了稳定的复合物。因此，这些数据意味着PBMC可以摄取和加工载有抗原物质的MM。由MM诱导的细胞因子在协调针对入侵病原体和肿瘤细胞的宿主免疫应答中发挥关键和多方面的作用。现在简要讨论它们在抗肿瘤免疫背景下的功能。

[0145] 所测细胞因子背景

[0146] IL-6通过允许树突状细胞(DC)克服调节性T细胞(Treg)介导的抑制作用，在活化细胞毒性淋巴细胞(CTL)的增殖中发挥关键作用。IL-10最近被发现通过刺激免疫细胞分泌IFNγ、IL-18、IL-7、GM-CSF和IL-4，起到免疫增强作用，而先前其被认为抑制宿主免疫应答。实际上，通过PD-1+和LAG-3+门控流式细胞术测量，用PEG化的IL-10治疗的患者活化循环CTL的数量有所增加。IL-12增强NK细胞的细胞毒性，表现出抗血管生成作用，并通过增强活化树突细胞和诱导分泌TNF-α和INF-γ，促进初始T细胞分化。TNF-α通过上调颗粒蛋白酶B抑制剂PI-9保护DC免于细胞溶解，从而增强短期适应性免疫应答。上调PI-9使得相同的DC进行多轮T细胞以相同的表位序列分化而不是被最近已分化的CTL所溶解。INF-α是一种多效细胞因子，其最佳特征在于增强抗病毒免疫应答。已知其可增强多种免疫亚群(包括DC、CTL、NK细胞和巨噬细胞)的活性。它可以诱导白介素-15分泌，已知白介素-15在增强T细胞功能亲合力和记忆T细胞形成中起关键作用。最后，IFN-γ在增强抗肿瘤免疫中起着几个关键作用。IFN-γ由辅助T细胞分泌，以帮助极化细胞(Th1)而不是体液(Th2)应答，并上调I类MHC表达，从而增加抗原呈递并因此增加同源T细胞的肿瘤细胞识别。

[0147] 这些实验确定了合成MM复合物的免疫原性效力，其旨在模拟载有肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的微生物引起的感染。

[0148] 实施例5

[0149] MM在B16小鼠黑色素瘤模型中的体内活性

[0150] 使用充分表征的鼠B16黑素瘤模型，进行体内研究以评估MM的功效。B16细胞表达组织限制性黑素瘤分化抗原Trp2。将Trp2表位SVYDFFVWL(SEQ.ID NO.8)嵌入抗原物质，通过使用具有Trp2表位的多肽，设计并合成MM以引发针对Trp2的免疫应答。该实验的目的在于确定MM对肿瘤生长的影响。该研究如下进行。

[0151] 将2mg/mL的RNA248和DNA4的PBS溶液以1∶1混合，获得1mg/mL RNA248/DNA4溶液，来制备RNA248/DNA4佐剂溶液。实验使用两种不同的MM实施方案。第一种使用MEL2(SEQ.ID NO.5)作为抗原物质，而第二种使用MEL4(SEQ.ID NO.6)作为抗原物质。为了合成MM，将MEL2或MEL4稀释在PBS中，原液浓度为1mg/mL。对于MEL2 MM，将MEL2以100μL的增量滴加到等体积的RNA248/DNA4佐剂中。对于MEL4 MM，将MEL4以100μL的增量滴加到等体积的RNA248/DNA4佐剂中。

[0152] 一共20只C57BL/6小鼠用于体内研究。将小鼠分成4组，每组n＝5，分组如下：

[0153] 1号组：PBS对照

[0154] 2号组：仅RNA248/DNA4佐剂

[0155] 3号组：MEL2 MM(RNA248/DNA4)+MEL2

[0156] 4号组：MEL4 MM(RNA248/DNA4)+MEL4

[0157] 在第4天，给所有小鼠右后肋侧接种105个B16黑素瘤细胞，开始培养肿瘤。根据下表4提供的递增剂量方案，在第0天接种肿瘤后整4天开始治疗。对于每次治疗，使用33号针头给小鼠注射定量的的PBS(对照)、仅佐剂、MEL2MM或MEL4MM。

[0158] 表4：剂量体积和方案

[0159]天剂量体积(μL)
0 10
1 20
2 30
3 40
4 60
5 60
6 70
7 80
8 90
9 100
10 200

[0160] 对于注射，在颈背皮内注射和左后肋侧肌内注射之间等量分配总剂量体积。植入后约9天肿瘤变得可测量，随后每周测量肿瘤3次。使用卡尺测量长度和宽度并应用以下公式来评估肿瘤体积：体积＝0.5×长度×宽度×宽度。MM对B16肿瘤生长的影响在图19中得到证实，其中每组的平均肿瘤体积相对于研究日期作图。与对照组相比，两个MM治疗组均观察到显着的肿瘤生长抑制，其中MEL4 MM具有最有效的肿瘤生长抑制(相对于对照，在第12天为71％)。在仅有佐剂的治疗组中只观察到微弱的肿瘤生长抑制。数据证明MM在模型中抑制体内肿瘤生长，其中抗原物质含有组织限制性抗原，即Trp2。预期通过将MM与对PD-1、PD-L1和/或CTLA-4具有活性的免疫检查点抑制剂组合，可能实现更强的生长抑制或肿瘤消退。这些体内研究证明，MM单一疗法显示出有效的肿瘤生长抑制作用。

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