技术领域
[0001] 本
发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时检测四水合辅羧酶中两种杂质含量的高效液相分析方法。
背景技术
[0002] 四水合辅羧酶为维生素类药，在体内参与糖代谢中丙
酮酸和a-酮
戊二酸的
氧化脱羧反应，是糖类代谢所必需，临床上常用于脚气病或Wernicke脑病的
治疗，亦可用于辅羧酶四水合物缺乏引起的周围神经炎、消化不良等的
辅助治疗，目前也用作复方维生素制剂产品注射用多种维生素(12)的其中一种
原料药。四水合辅羧酶杂质X(甲酰胺基嘧啶)及四水合辅羧酶杂质A(硫胺素一
磷酸酯)为四水合辅羧酶的降解产物，其结构式分别为：
[0003]
[0004] 四水合辅羧酶杂质X
[0005]
[0006] 四水合辅羧酶杂质A
[0007] 在国内外药典中并未收载四水合辅羧酶的标准，在国家标准(YBH03552014)四水合辅羧酶有关物质检查中，有四水合辅羧酶杂质A的检测，但是适用于原料的检验，不适合于含有四水合辅羧酶的复方制剂产品如注射用多种维生素(12)中四水合辅羧酶杂质A的检验，专属性不符合规定，且文献中检测四水合辅羧酶杂质A的方法为衍生法，检测器为
荧光检测器，操作繁琐，且样品处理方法并不适用。四水辅羧酶杂质X为四水辅羧酶的降解产物，常存在于含四水辅羧酶的制剂中，针对四水辅羧酶及含四水辅羧酶制剂的有关物质检测中，并没有对四水合辅羧酶杂质X及其含量检测的描述，也没有同时检测四水合辅羧酶杂质X和杂质A的方法。发明内容：
[0008] 为解决上述问题，本发明提供了同时检测出四水合辅羧酶杂质X(甲酰胺基嘧啶)和/或四水合辅羧酶杂质A含量的方法，适用于检测四水合辅羧酶原料以及含有四水合辅羧酶原料的维生素制剂产品。本
申请的技术方案如下：
[0009] 一种检测四水合辅羧酶杂质X和/或四水合辅羧酶杂质A含量的分析方法，该方法采用高效液相色谱仪测定，其色谱条件为：
[0010] 色谱柱：十八烷基
硅烷键合硅胶色谱柱；
[0011] 流动相A：含辛烷磺酸钠或效能类似磺酸钠离子对的
磷酸盐冲溶液；
[0012] 流动相B：甲醇、乙腈、流动相A-甲醇或流动相A-乙腈中的一种；
[0013] 柱温：30-50℃；
[0014] 流速：0.8-1.2ml/min；
[0016] 进样量：20μl；
[0017] 流动相A、B按梯度程序进行。
[0018] 其中，优选的色谱柱为Thermo BDS HYPERSIL C18柱，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱；
[0019] 优选的，流动相A为0.01mol/L-0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液，辛烷磺酸钠的浓度为1g/L-4g/L，流动相A用磷酸调节pH值为2.0-5.0，流动相A中的离子对
试剂可以是与辛烷磺酸钠作用类似的其他离子对试剂如庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠等磺酸钠离子对试剂，磷酸盐可以为磷酸二氢
钾、磷酸二氢钠、
磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等。
[0020] 优选的，流动相B中，流动相A与甲醇或乙腈的比例为20～40：80～60；
[0021] 优选的流速为1.0ml/min
[0022] 优选的柱温为40℃；
[0023] 优选的检测波长为245nm；
[0024] 进样梯度洗脱程序为：
[0025]
[0026] 该方法可用于检测四水合辅羧酶原料或含有四水合辅羧酶原料的制剂如注射用维生素制剂中四水合辅羧酶杂质X和/或四水合辅羧酶杂质A含量，从而进行原料或制剂中四水合辅羧酶杂质X和/或四水合辅羧酶杂质A含量的
质量控制。
[0027] 本发明产生的有益效果：
[0028] 1)本发明首次同时检测出四水辅羧酶杂质X和四水合辅羧酶杂质A。
[0029] 2)本发明通过使用高效液相色谱仪的技术，提供了一种检测四水合辅羧酶中四水合辅羧酶杂质X和/或四水合辅羧酶杂质A含量的方法，耗材易得、准确度、灵敏度高。
[0030] 3)在样品中加入已知量的四水合辅羧酶杂质X对照品，四水合辅羧酶杂质A对照品，测得的回收率分别100.1％、99.82％，方法准确度良好。
附图说明：
[0031] 图1是
实施例2中检测待测样品的色谱图具体实施方式：
[0032] 实施例1回收率的测定
[0033] 步骤(1)取杂质X对照品和四水合辅羧酶杂质A对照品各适量，精密称定，加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml中约含杂质X和四水合辅羧酶杂质A均为0.3mg/ml的溶液，摇匀；
[0034] 步骤(2)取步骤(1)溶液1ml，置50ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合溶液；
[0035] 步骤(3)取注射用多种维生素(12)约750mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0036] 步骤(4)取注射用多种维生素(12)约750mg，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入步骤(1)中的溶液适量，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为回收率溶液；
[0037] 步骤(5)精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法，以峰面积计算供试品中杂质X、四水合辅羧酶杂质A的含量，测得四水合辅羧酶杂质X，四水合辅羧酶杂质A的回收率分别100.02％、99.8％，方法准确度良好。
[0038] 实施例2注射用多种维生素(12)中杂质X和/或四水合辅羧酶杂质A含量的测定[0039] 步骤1、溶液的配制
[0040] 对照品溶液的配制：取杂质X对照品和四水合辅羧酶杂质A对照品各适量，精密称定，加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml中约含杂质X和四水合辅羧酶杂质A均为6μg/ml的溶液，摇匀；
[0041] 供试品溶液的配制：取注射用多种维生素(12)约750mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。注射用多种维生素(12)的
处方组成参考
专利CN107898805A。
[0042] 步骤2、液相色谱条件为：
[0043] 色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18柱，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱；
[0044] 流动相A：辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L，用磷酸调节pH值至2.0-5.0，辛烷磺酸钠的浓度为1g/L-4g/L，还可以为庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠等作用类似的磺酸钠离子对试剂；
[0045] 流动相B：流动相B：甲醇、乙腈、流动相A-甲醇或流动相A-乙腈中的任一种；
[0046] 当流动相B为流动相A-甲醇或流动相A-乙腈时，流动相A与甲醇或乙腈的比例为20～40：80～60；
[0047] 流速：0.8-1.2ml/min；
[0048] 柱温：35-45℃；
[0049] 检测波长：240-270nm；
[0050] 进样量：20μl；
[0051] 流动相A、B按梯度程序进行。
[0052]
[0053] 精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，见
说明书附图1。按外标法，以峰面积计算，供试品溶液中四水合辅羧酶杂质X的含量占四水辅羧酶的0.13％，四水合辅羧酶杂质A的含量为1.7％。
[0054] 实施例3四水合辅羧酶原料中杂质X和/或杂质A含量的测定
[0055] 步骤1、溶液的配制
[0056] 对照品溶液的配制：取杂质X对照品和四水合辅羧酶杂质A对照品各适量，精密称定，加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml中约含杂质X和四水合辅羧酶杂质A均为6μg/ml的溶液，摇匀；
[0057] 供试品溶液的配制：取四水合辅羧酶原料适量，精密称定，置适宜量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含四水合辅羧酶0.12mg的溶液，即得。
[0058] 步骤2、液相色谱条件为：
[0059] 色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18柱，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱；
[0060] 流动相A：辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L，用磷酸调节pH值至2.0-5.0，辛烷磺酸钠的浓度为1g/L-4g/L，还可以为庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠等作用类似的磺酸钠离子对试剂；
[0061] 流动相B：流动相B：甲醇、乙腈、流动相A-甲醇或流动相A-乙腈中的任一种；
[0062] 当流动相B为流动相A-甲醇或流动相A-乙腈时，流动相A与甲醇或乙腈的比例为20～40：80～60；
[0063] 流速：0.8-1.2ml/min；
[0064] 柱温：35-45℃；
[0065] 检测波长：240-270nm；
[0066] 进样量：20μl；
[0067] 流动相A、B按梯度程序进行。
[0068]
[0069]
[0070] 精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法，以峰面积计算，供试品溶液中四水合辅羧酶杂质X的含量为0.01％，四水合辅羧酶杂质A的含量为0.2％。
[0071] 实施例4注射用多种维生素(12)中杂质X含量的测定
[0072] 步骤1、溶液的配制
[0073] 对照品溶液的配制：取杂质X对照品各适量，精密称定，加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml中约含杂质X为6μg/ml的溶液，摇匀；
[0074] 供试品溶液的配制：取注射用多种维生素(12)约750mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。注射用多种维生素(12)的处方组成参考专利CN107898805A。
[0075] 步骤2、液相色谱条件为：
[0076] 色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18柱，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱；
[0077] 流动相A：辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L，用磷酸调节pH值至2.0-5.0，辛烷磺酸钠的浓度为1g/L-4g/L，还可以为庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠等作用类似的磺酸钠离子对试剂；
[0078] 流动相B：流动相B：甲醇、乙腈、流动相A-甲醇或流动相A-乙腈中的任一种；
[0079] 当流动相B为流动相A-甲醇或流动相A-乙腈时，流动相A与甲醇或乙腈的比例为20～40：80～60；
[0080] 流速：0.8-1.2ml/min；
[0081] 柱温：35-45℃；
[0082] 检测波长：240-270nm；
[0083] 进样量：20μl；
[0084] 流动相A、B按梯度程序进行。
[0085]
[0086]
[0087] 精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法，以峰面积计算，供试品溶液中四水合辅羧酶杂质X的含量占四水辅羧酶的0.2％。
