一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法和用途
阅读：0发布：2022-11-23
专利汇可以提供一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种线粒体靶向 次氯酸 比率型双 光子 荧光 探针及其制备方法和用途，其中线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针，是以以咔唑为母体，其结构式如下：本发明荧光探针应用于 水 溶液中HClO检测时，选择性高，响应速度快，探针荧光比率(I525nm/I465nm)与HClO的浓度之间有很好的线性关系， 检测限 低至35nM。此外，该荧光探针分子还具有优良的双光子吸收性能。细胞毒性测试表明该探针对于细胞几乎没有什么毒 副作用 。双光子共聚焦荧光显微成像实验表明该探针具有很好的线粒体 定位 能 力 和细胞透膜性，适用于细胞线粒体内HClO的双光子荧光成像和定量检测。，下面是一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针，是以以咔唑为母体，其特征在于其结构式如下：
2.一种权利要求1所述的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：化合物1的合成
在丙酮溶液中加入氢氧化钾、碘化钾和1,4-二溴丁烷并在60℃下加热1小时，随后缓慢加入3,6-二碘咔唑，继续加热回流反应；反应结束后冷却并旋干，水洗后得到粗产物，通过柱色谱法提纯，得到中间体1；
步骤2：化合物2的合成
在氮气保护的条件下，将化合物1、4-乙炔基苯甲醛、双三苯基膦二氯化钯、碘化亚铜和三乙胺溶解于四氢呋喃中，在30℃下进行反应；反应结束后冷却并旋干，得到粗产物，通过柱色谱法提纯，得到中间体2；
步骤3：化合物3的合成
在氮气保护的条件下，向乙腈中加入化合物2，80℃下反应1小时，再加入三苯基膦，继续加热反应；反应结束后冷却并旋干，得到粗产物，通过柱色谱法提纯，得到中间体3；
步骤4：目标产物MCL的合成
在氮气保护的条件下，将化合物3、甲磺酸和2-巯基乙醇溶解在二氯甲烷中，在25℃下进行反应；反应结束后冷却并旋干，得到粗产物，通过柱色谱法提纯，得到白色固体MCL。
3.一种权利要求1所述的双光子荧光探针的用途，其特征在于：
在定量检测细胞中线粒体内的HClO时作为检测试剂使用。
一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法
和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法和用途，以实现双光子成像定量检测细胞线粒体内的HClO，具有双光子吸收性能优良，细胞毒性低，透膜性和生物相容性好，选择性和光稳定性高等优点。
背景技术
[0002] 近来，活性氧物质由于其与体内多种生物过程的关联而引起了医学研究人员越来越多的关注。作为高活性氧物种，内源性HClO主要是通过体内髓过氧化物酶(MPO)催化的过氧化氢和氯离子之间的反应产生。内源性HClO由于其强氧化能力而成为生物体内的一把双刃剑。正常生理水平的HClO可有效抑制体内微生物和病原体并调节细胞凋亡。然而，过量HClO的产生则导致细胞和组织损伤，并可能与某些疾病如炎症性疾病或癌症有关。在体液中，次氯酸和次氯酸根阴离子在微摩尔浓度的水平上处于平衡，当身体处于疾病状态时，其可能增加至毫摩尔浓度。因此，体内HClO水平的实时监测对于健康科学的研究具有重要意义。
[0003] 线粒体不仅为人体生命活动提供能量，还参与多种复杂的生理过程。它的异常与癌症、糖尿病、阿尔兹海默病等疾病相关。作为细胞内氧的主要消费者，线粒体是细胞内活性氧物种(ROS)的主要来源。HClO作为细胞内活性氧的一种，在线粒体中维持适当的浓度对保证细胞内多种功能的正常是十分重要的。因此在亚细胞水平，尤其是在线粒体中监测次氯酸是特别有意义和价值的。靶向线粒体类荧光探针主要是基于线粒体带有负的膜电位，进而利用本身带有正电荷的荧光团或者在荧光团中引入三苯基膦或季铵盐等带正电荷的基团来定位线粒体。
[0004] 荧光探针法因其具有选择性高，灵敏度高，实时监测等优点而被经常用作有效的生物分析工具。以单一荧光强度作为响应信号的荧光探针对环境因素和仪器参数较为敏感，采用两种荧光强度比的比率型探针因具有内部校正能力而更加适合于定量分析。目前，许多可用于体内HClO成像的比率型荧光探针已被成功开发出来，但其中大多数是在单光子激发下实现体内成像的。对于生物成像而言，短波长激发会导致样品的光损伤，浅穿透和来自内在生物分子的自发荧光等问题，而双光子成像的应用则极大地弥补了这些缺陷。因而双光子荧光探针已经作为科研工作者研究的一个重要课题。
[0005] 咔唑类化合物因具有较强的给电子能力、大的共轭体系、良好的刚性平面、稳定的光学性能以及易于化学修饰引入官能团而被经常应用为荧光探针的母体。作为一种经典的荧光团，以咔唑为母体的单光子荧光探针已经被很多文献所报道，但以其设计的双光子荧光探针则相对少见。
发明内容
[0006] 本发明旨在提供一种线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种合适的荧光探针结构，具有双光子吸收性能优良，细胞毒性低，透膜性和生物相容性好，选择性和光稳定性高等优点，以实现水溶液和细胞线粒体内HClO的定量检测和在线粒体中的双光子荧光成像。
[0007] 本发明线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针，是以以咔唑为母体，简记为MCL，其结构式如下：
[0008]
[0009] 本发明线粒体靶向次氯酸比率型双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0010] 步骤1：化合物1的合成
[0011] 在丙酮溶液(200mL)中加入氢氧化钾(2.0g，35.8mmol)、碘化钾(0.4g，2.39mmol)和1,4-二溴丁烷(7.73g，35.8mmol)并在60℃下加热1小时，随后缓慢加入3,6-二碘咔唑(10g，23.9mmol)，继续加热回流12小时；反应结束后冷却并旋干，水洗后得到粗产物，通过柱色谱法(石油醚：二氯甲烷＝10：1作为洗脱剂)提纯，得到中间体1，6.8g，产率为51.4％。
[0012] 步骤2：化合物2的合成
[0013] 在氮气保护的条件下，将化合物1(2g，3.6mmol)、4-乙炔基苯甲醛(1.4g，10.8mmol)、双三苯基膦二氯化钯(0.0102g，0.014mmol)、碘化亚铜(0.0054g，0.028mmol)和三乙胺(7mL)溶解于四氢呋喃中(10mL)，在30℃下反应12小时；反应结束后冷却并旋干，得到粗产物，通过柱色谱法(石油醚：二氯甲烷＝4：1作为洗脱剂)提纯，得到中间体2，1.3g，产率为64.5％。
[0014] 步骤3：化合物3的合成
[0015] 在氮气保护的条件下，向乙腈(10mL)中加入化合物2(1g，1.8mmol)，80℃下反应1小时，再加入三苯基膦(2.8g，10.8mmol)，继续加热反应36小时；反应结束后冷却并旋干，得到粗产物，通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝40：1作为洗脱剂)提纯，得到中间体3，0.83g，产率为56％。
[0016] 步骤4：目标产物MCL的合成
[0017] 在氮气保护的条件下，将化合物3(0.83g，1.0112mmol)、甲磺酸(20μL)和2-巯基乙醇(0.237g，3.0334mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)中，在25℃下反应12小时；反应结束后冷却并旋干，得到粗产物，通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝40：1作为洗脱剂)提纯，得到白色固体MCL，0.34g，产率为36％。
[0018] 本发明双光子荧光探针MCL的合成过程如下：
[0019]
[0020] 本发明双光子荧光探针的用途，在定量检测细胞中线粒体内的HClO时作为检测试剂使用，检测方法如下：
[0021] 将本发明荧光探针MCL溶于DMSO中制取2mM的母液，配得5mL，取15μL该母液于含3mL pH＝7.4的PBS缓冲溶液的样品管中，以配制10μM的检测液。测试其加入不同当量HClO后的紫外吸收光谱数据。检测试剂分别在308nm和340nm处有吸收峰，随着HClO的当量的增加，MCL位于308nm和340nm处的吸收峰逐渐降低，而在380nm处的吸收逐渐升高，当HClO达到
5倍当量后，吸收曲线不再变化。随着HClO(0-60μM)的不断加入，可以观察到荧光最大发射峰由465nm逐渐红移至525nm处。当HClO达到5倍当量后，荧光曲线不再变化，说明达到了饱和当量。将不同当量的HClO分别加入10μM检测试剂后，荧光比值(I525nm/I465nm)可在数秒内达到最大值。将0-10μM浓度范围的HClO分别加入到10μM检测试剂时，荧光比率(I525nm/I465nm)与HClO的浓度之间有很好的线性关系(R＝3δ/k)，检测限低至35nM。将10倍当量的其它分析底物分别加入到10μM检测试剂中作用20min后，检测370-650nm范围内的荧光光谱变化，可以看出探针MCL仅对HClO显示明显的荧光变化，表示具有专一性响应。在不同pH值的缓冲溶液中对10μM检测试剂及其对HClO响应的荧光光谱进行调查，此实验结果表明探针MCL及其响应HClO的荧光比率(I525nm/I465nm)在pH＝6～9范围内对pH值不敏感，适用于弱碱性的线粒体内HClO检测。此外，将本探针分子与线粒体红色商染进行了线粒体的共定位成像与线粒体内HClO的双光子共聚焦成像。
5倍当量后，吸收曲线不再变化。随着HClO(0-60μM)的不断加入，可以观察到荧光最大发射峰由465nm逐渐红移至525nm处。当HClO达到5倍当量后，荧光曲线不再变化，说明达到了饱和当量。将不同当量的HClO分别加入10μM检测试剂后，荧光比值(I525nm/I465nm)可在数秒内达到最大值。将0-10μM浓度范围的HClO分别加入到10μM检测试剂时，荧光比率(I525nm/I465nm)与HClO的浓度之间有很好的线性关系(R＝3δ/k)，检测限低至35nM。将10倍当量的其它分析底物分别加入到10μM检测试剂中作用20min后，检测370-650nm范围内的荧光光谱变化，可以看出探针MCL仅对HClO显示明显的荧光变化，表示具有专一性响应。在不同pH值的缓冲溶液中对10μM检测试剂及其对HClO响应的荧光光谱进行调查，此实验结果表明探针MCL及其响应HClO的荧光比率(I525nm/I465nm)在pH＝6～9范围内对pH值不敏感，适用于弱碱性的线粒体内HClO检测。此外，将本探针分子与线粒体红色商染进行了线粒体的共定位成像与线粒体内HClO的双光子共聚焦成像。
[0022] 本发明双光子荧光探针结构简单，易于合成。探针对HClO的响应快速灵敏，并表现出专一性响应。当加入HClO后，会将探针结构中的两个缩醛响应位点氧化成两个醛基(图1)，反应前后电子云密度分布发生变化，荧光和紫外吸收性质也随之改变。双光子共聚焦荧光显微成像实验表明该探针对HeLa细胞渗透性好，可以有效定位细胞中的线粒体(定位系数为0.93)，适用于细胞线粒体内HClO的双光子荧光成像。
附图说明
附图说明
[0023] 图1是本发明荧光探针分子MCL与HClO反应机理图。
[0024] 图2是10μM探针中加入HClO(0-60μM)的(a)紫外吸收光谱图；(b)荧光发射光谱图。
[0025] 图3是10μM探针中加入HClO(10μM、20μM、50μM)的荧光发射峰强度比值(I525nm/I465nm)与时间的关系图。
[0026] 图4是10μM探针中加入HClO(0-10μM)后的荧光发射峰强度比值(I525nm/I465nm)与浓度的线性关系图。
[0027] 图5是10μM探针中加入10倍当量的其它分析底物的荧光选择性谱图。
[0028] 图6是10μM探针中加入HClO(50μM)前后的荧光发射峰强度比值(I525nm/I465nm)与pH关系图。
[0029] 图7是探针MCL加入HClO前后的有效双光子吸收截面图，插图为相对双光子荧光强度(Iout)与输入功率(Iin)的对数关系图。
[0030] 图8是在不同浓度(0μM、10μM、20μM、30μM)的探针分子的作用下的HeLa细胞存活率图。
[0031] 图9是10μM探针和1μM MitoTracker red同时共染HeLa细胞线粒体定位验证共聚焦荧光成像图。
[0032] 图10是在HeLa细胞中加入不同浓度的外源性HClO(0-40μM)的双光子共聚焦细胞成像图，探针浓度为10μM，蓝色通道荧光发射收集范围为420-470nm，绿色通道荧光发射收集范围为500-540nm，激发波长为740nm。
具体实施方式
[0033] 下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0034] 实施例1：化合物1的合成
[0035] 在丙酮溶液(200mL)中加入氢氧化钾(2.0g，35.8mmol)，碘化钾(0.4g，2.39mmol)和1,4-二溴丁烷(7.73g，35.8mmol)并在60℃下加热1小时。缓慢加入3,6-二碘咔唑(10g，23.9mmol)，继续加热回流12小时。冷却后旋干，水洗后得到粗产物。通过柱色谱法(石油醚：
二氯甲烷＝10：1作为洗脱剂)提纯，得到中间体1，6.8g，产率为51.4％。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ8.34(d,J＝1.5Hz,2H),7.74(d,J＝1.6Hz,1H),7.71(d,J＝1.6Hz,1H),7.19(s,1H),7.17(s,1H),4.29(t,J＝7.0Hz,2H),3.37(t,J＝6.4Hz,2H),2.06–1.98(m,2H),
1.86(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ139.38,134.69,129.48,124.08,110.76,81.93,
42.37,32.82,30.02,27.44.
二氯甲烷＝10：1作为洗脱剂)提纯，得到中间体1，6.8g，产率为51.4％。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ8.34(d,J＝1.5Hz,2H),7.74(d,J＝1.6Hz,1H),7.71(d,J＝1.6Hz,1H),7.19(s,1H),7.17(s,1H),4.29(t,J＝7.0Hz,2H),3.37(t,J＝6.4Hz,2H),2.06–1.98(m,2H),
1.86(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ139.38,134.69,129.48,124.08,110.76,81.93,
42.37,32.82,30.02,27.44.
[0036] 实施例2：化合物2的合成
[0037] 在氮气保护的条件下，将化合物1(2g，3.6mmol)，4-乙炔基苯甲醛(1.4g，10.8mmol)，双三苯基膦二氯化钯(0.0102g，0.014mmol)，碘化亚铜(0.0054g，0.028mmol)和三乙胺(7mL)溶解于四氢呋喃中(10mL)，在30℃下反应12小时。冷却后旋干，得到粗产物。通过柱色谱法(石油醚：二氯甲烷＝4：1作为洗脱剂)提纯，得到中间体2，1.3g，产率为64.5％。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ10.04(s,2H),8.33(s,2H),7.89(t,J＝7.4Hz,4H),7.71(m,6H),
7.42(d,J＝8.5Hz,2H),4.38(m,2H),3.42(t,J＝6.3Hz,1H),3.19(t,J＝6.6Hz,1H),2.15–
2.01(m,2H),1.92(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ191.47,140.67,135.13,133.12,
131.92,130.18,130.14,129.67,129.59,124.63,122.62,113.56,109.14,94.83,87.58,
32.84,30.74,27.59,5.54.
7.42(d,J＝8.5Hz,2H),4.38(m,2H),3.42(t,J＝6.3Hz,1H),3.19(t,J＝6.6Hz,1H),2.15–
2.01(m,2H),1.92(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ191.47,140.67,135.13,133.12,
131.92,130.18,130.14,129.67,129.59,124.63,122.62,113.56,109.14,94.83,87.58,
32.84,30.74,27.59,5.54.
[0038] 实施例3：化合物3的合成
[0039] 在氮气保护的条件下，在乙腈(10mL)中加入化合物2(1g，1.8mmol)，80℃下反应1小时，再加入三苯基膦(2.8g，10.8mmol)，继续加热36小时。冷却后旋干，得到粗产物。通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝40：1作为洗脱剂)提纯，得到中间体3，0.83g，产率为56％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.05(s,2H),8.53(s,2H),7.98(d,J＝8.0Hz,4H),7.87(m,3H),7.79(d,J＝8.0Hz,4H),7.76–7.68(m,16H),4.51(t,J＝6.9Hz,2H),3.62(t,J＝
15.1Hz,2H),2.00–1.93(m,2H),1.62(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ191.43,140.73,
135.13,135.08,135.05,133.60,133.50,132.15,132.05,131.88,130.50,130.37,130.20,
130.08,129.67,128.57,128.45,124.24,122.31,118.10,117.24,113.34,110.05,94.88,
87.59,42.55,29.19,22.66,20.15.
15.1Hz,2H),2.00–1.93(m,2H),1.62(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ191.43,140.73,
135.13,135.08,135.05,133.60,133.50,132.15,132.05,131.88,130.50,130.37,130.20,
130.08,129.67,128.57,128.45,124.24,122.31,118.10,117.24,113.34,110.05,94.88,
87.59,42.55,29.19,22.66,20.15.
[0040] 实施例4：目标产物MCL的合成
[0041] 在氮气保护的条件下，将化合物3(0.83g，1.0112mmol)，甲磺酸(20μL)，2-巯基乙醇(0.237g，3.0334mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)中，在25℃下反应12小时。冷却后旋干，得到粗产物。通过柱色谱法(二氯甲烷：甲醇＝40：1作为洗脱剂)提纯，得到白色固体MCL，0.34g，产率为36％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.43(s,2H),7.84(m,3H),7.67(m,14H),
7.62–7.59(m,2H),7.54(d,J＝8.2Hz,4H),7.46(d,J＝8.2Hz,4H),6.09(s,2H),4.51–4.43(m,4H),3.87(m,2H),3.58(t,J＝14.6Hz,2H),3.20(m,4H),1.97–1.88(m,2H),1.58(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ140.13,139.74,134.86,133.48,131.13,130.17,129.59,
126.91,124.27,122.85,121.80,118.69,117.84,112.85,110.21,91.14,87.52,85.55,
71.76,41.69,33.53,20.10,19.57.
7.62–7.59(m,2H),7.54(d,J＝8.2Hz,4H),7.46(d,J＝8.2Hz,4H),6.09(s,2H),4.51–4.43(m,4H),3.87(m,2H),3.58(t,J＝14.6Hz,2H),3.20(m,4H),1.97–1.88(m,2H),1.58(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ140.13,139.74,134.86,133.48,131.13,130.17,129.59,
126.91,124.27,122.85,121.80,118.69,117.84,112.85,110.21,91.14,87.52,85.55,
71.76,41.69,33.53,20.10,19.57.
[0042] 实施例5：荧光探针分子的光谱测试
[0043] 将本发明荧光探针MCL溶于DMSO中制取2mM的母液，配得5mL，取15μL该母液于含3mL pH＝7.4的PBS缓冲溶液的样品管中，以配制10μM的检测液。测试其在含不同当量HClO下的紫外吸收光谱数据。检测试剂分别在308nm和340nm处有吸收峰，随着HClO的当量的增加，MCL位于308nm和340nm处的吸收峰逐渐降低，而在380nm处的吸收逐渐升高，当HClO达到
5倍当量后，吸收曲线不再变化(图2a)。随着HClO(0-60μM)的不断加入，可以观察到荧光最大发射峰由465nm逐渐红移至525nm处。当HClO达到5倍当量后，荧光曲线不再变化，说明达到了饱和当量(图2b)。将不同当量的HClO分别加入10μM检测试剂后，荧光比值(I525nm/I465nm)可在数秒内达到最大值(图3)。将0-10μM浓度范围的HClO分别加入到10μM检测试剂时，荧光比率(I525nm/I465nm)与HClO的浓度之间有很好的线性关系(R＝3δ/k)，检测限低至
35nM(图4)。将10倍当量的其它分析底物分别加入到10μM检测试剂中作用20min后，检测
370-650nm范围内的荧光光谱变化，可以看出探针MCL仅对HClO显示明显的荧光变化，表示具有专一性响应(图5)。在不同pH值的缓冲溶液中对10μM检测试剂及其对HClO响应的荧光光谱进行调查，此实验结果表明探针MCL及其响应HClO的荧光比率(I525nm/I465nm)在pH＝6～
9范围内对pH值不敏感(图6)，适用于弱碱性的线粒体内HClO检测。
5倍当量后，吸收曲线不再变化(图2a)。随着HClO(0-60μM)的不断加入，可以观察到荧光最大发射峰由465nm逐渐红移至525nm处。当HClO达到5倍当量后，荧光曲线不再变化，说明达到了饱和当量(图2b)。将不同当量的HClO分别加入10μM检测试剂后，荧光比值(I525nm/I465nm)可在数秒内达到最大值(图3)。将0-10μM浓度范围的HClO分别加入到10μM检测试剂时，荧光比率(I525nm/I465nm)与HClO的浓度之间有很好的线性关系(R＝3δ/k)，检测限低至
35nM(图4)。将10倍当量的其它分析底物分别加入到10μM检测试剂中作用20min后，检测
370-650nm范围内的荧光光谱变化，可以看出探针MCL仅对HClO显示明显的荧光变化，表示具有专一性响应(图5)。在不同pH值的缓冲溶液中对10μM检测试剂及其对HClO响应的荧光光谱进行调查，此实验结果表明探针MCL及其响应HClO的荧光比率(I525nm/I465nm)在pH＝6～
9范围内对pH值不敏感(图6)，适用于弱碱性的线粒体内HClO检测。
[0044] 实施例6：荧光探针分子的双光子性能测试
[0045] 利用双光子诱导荧光测量技术，我们测量了探针MCL及其响应HClO后的双光子吸收性能。探针MCL在720nm处呈现最大有效双光子吸收作用截面值，为50GM。加入5倍当量的HClO后，反应产物在760nm下呈现最大有效双光子吸收作用截面值，为60GM(图7)。改变入射激发光的能量，输入功率(Iin＝0.3～0.8mW)与相对荧光输出能量(Iout)成对数关系，斜率分别为1.97和1.99，符合双光子性质的规律(图7内插图)。该实验证明探针MCL具有双光子吸收性质，可应用于细胞内HClO检测的双光子荧光成像。
[0046] 实施例7：细胞培养和细胞毒性测试
[0048] 细胞毒性：按照文献报道，通过MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)试验来测试细胞毒性。在测试之前先把HeLa细胞在96-孔板里培养24小时，在加入探针之前先换入新鲜的DMEM，再分别加入不同浓度的探针MCL(0,10,20和30μM)，处理后的细胞在5％二氧化碳含量，37℃条件下培养24小时。随后，再向细胞中加入5mg/mL MTT(40μL/well),继续培养4小时(37℃,5％CO2)。吸取培养液于DMSO(150μL/孔)中，记录570nm处的吸光度。根据细胞存活度的公式：细胞存活率％＝OD570(样品)/OD570(对照组)×100，可算得细胞存活率(图8)。测试结果显示MCL的生物毒性较小，适合进行细胞成像。
[0049] 实施例8：线粒体定位测试
[0050] HeLa细胞由DEME(invitrogen)培养液培养，成像前一天，HeLa细胞放于激光共聚焦皿中，再向HeLa细胞中加入10μM的MCL并置于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时，用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次后，再往培养皿中加入1μM商品化线粒体染色剂MitoTracker red(MTR)溶液并继续孵育0.5小时，之后用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次后，进行双光子荧光共聚焦成像。设置探针分子MCL为蓝色通道(λem＝420-470nm,λex＝740nm)；设置商品化线粒体染色剂MitoTracker red(MTR)为红色通道(λem＝580-600nm，λex＝579nm)。结果表明二者的荧光图像重叠良好，并且MCL与MTR的Pearson共定位系数计算为0.93，说明MCL可以很好地靶向活细胞中的线粒体(图9)。
[0051] 实施例9：细胞内HClO双光子荧光成像
[0052] 用探针培养5组HeLa细胞30分钟，然后分别用不同浓度的HClO(0,5,10,20和40μM)培养30分钟后进行双光子成像。设置蓝色通道(λem＝420-470nm)和绿色通道(λem＝500-540nm)进行成像和观察(图10)。在空白对照组中，可以观察到蓝色通道和绿色通道都显示出显著的荧光，而蓝色荧光强于绿色荧光，这两种荧光可归因于探针MCL本身。同时，也可以清楚地观察到细胞内丝状结构的明亮荧光，这是线粒体的典型形态。随着HClO浓度的增加，蓝色荧光与绿色荧光的强度逐渐下降，而蓝色荧光下降得更快，可观察到HClO浓度的增加导致伪彩色图的变化。这些结果清楚地表明了探针MCL能够通过双光子成像技术定量监测活细胞线粒体内HClO水平及其波动。
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