蒽醌类化合物、制备方法及应用
阅读：758发布：2020-05-08
专利汇可以提供蒽醌类化合物、制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种蒽醌类化合物、制备方法及应用，属于化合物领域。该蒽醌类化合物具有抗 植物 病原细菌活性，作为 杀菌剂 应用可用来 预防 和 治疗 植物病原细菌引起的植物病害。该蒽醌类化合物提取自海洋 真菌 Fusarium equiseti GLY27，所述海洋真菌Fusarium equiseti GLY27的保藏号是CGMCC 14348。该蒽醌类化合物用于预防和治疗由植物病原细菌引起的植物病害，其中所述植物病原细菌为丁香假单胞杆菌P.syringae、燕麦食酸菌A.avenae、胡萝卜软腐欧文氏菌E.carotovora。，下面是蒽醌类化合物、制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.蒽醌类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在菌种培养基中进行对海洋真菌Fusarium equiseti GLY27培养，转入发酵培养基中进行发酵；
将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡后再用甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，过滤，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩、干燥后得粗提物；
将粗提物进行层析、洗脱、浓缩后获得式(I)所述化合物；
其中，R基团选自酮基或羟基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌种培养基为马铃薯葡萄糖平板培养基，配比为：马铃薯5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、琼脂18-20g/L，其余为去离子水；在菌种培养基中28℃培养5-7天。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为大米固体培养基，
500mL锥形瓶中加入大米40g，水30mL，接种真菌后，28℃发酵培养30-40天。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡2次，随后用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡2次。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述粗提物进行层析、洗脱、浓缩的步骤包括：
将粗提物进行减压硅胶柱层析，固定相为100-200目正相硅胶，流动相为10％乙酸乙酯-石油醚混合溶剂，再用100％乙酸乙酯洗脱，将100％乙酸乙酯洗脱液浓缩；
浓缩后的洗脱液再进行ODS反相硅胶柱层析，流动相为30％、40％、50％、60％、70％、
80％甲醇水溶液，将50％甲醇水溶液的洗脱液浓缩后进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，流动相为50％二氯甲烷-甲醇溶液，浓缩后即得式(I)化合物。
6.根据权利要求1-5任一项所述的蒽醌类化合物的制备方法制备得到的蒽醌类化合物在预防和治疗由植物病原细菌引起的植物病害中的应用，其特征在于，所述植物病原细菌为丁香假单胞杆菌P.syringae、燕麦食酸菌A.avenae、胡萝卜软腐欧文氏菌E.carotovora。
蒽醌类化合物、制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及化合物领域，尤其涉及一种蒽醌类化合物、制备方法及应用。
背景技术
[0002] 植物病害严重危害农业生产，每年造成巨大的经济损失。据联合国粮农组织(FAO)统计，每年农作物因遭受病害造成的减产损失平均为总产量的10％～15％。其中，植物细菌病害带来的问题尤为严重，随着农用硫酸链霉素的停用，极为缺乏有效的防治药剂，而铜制剂等防治效果一般，且属于化学农药，易造成环境污染和食品安全问题，同时还会造成病原菌抗药性的出现。因此研发新型环境友好型高效低毒生物农药用来防治植物细菌病害成为迫在眉睫的课题。
[0003] 海洋真菌由于能够产生结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物而引起了人们的关注。自2007年以来，每年从海洋真菌中获得的新化合物数目在100个以上，仅2015年，就报道了400多个新的海洋真菌次级代谢产物。这些化合物当中很多都具有诸如抗菌、抗炎、抗癌、酶抑制等显著地生物活性。
[0004] 然而目前对于海洋真菌次级代谢产物的活性研究大多集中于人类医学方面，对于其在农业方面的应用很少，特别是在防治植物病原细菌方面，文献调研发现，目前并没有对于海洋真菌次级代谢产物防治植物细菌病害的报道。因此从海洋真菌中获得具有抗植物病原细菌活性的化合物具有十分广阔的发展前景。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种蒽醌类化合物、制备方法及应用，该蒽醌类化合物自海洋真菌Fusarium equiseti GLY27中分离得到，具有抗植物病原细菌活性，作为杀菌剂应用可用来预防和治疗植物病原细菌引起的植物病害。
[0006] 本发明一方面提供了一种蒽醌类化合物，其结构式如式(I)所示，
[0007]
[0008] 所述式(I)结构中R基团选自酮基或羟基。
[0009] 该蒽醌类化合物提取自海洋真菌Fusarium equiseti GLY27，所述海洋真菌Fusarium equiseti GLY27已在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号是CGMCC 14348。
[0010] 本发明另一方面提供了上述蒽醌类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0012] 将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡后再用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，过滤，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩、干燥后得粗提物；
[0013] 将粗提物进行层析、洗脱、浓缩后获得式(I)所述化合物。
[0015] 作为优选技术方案，所述马铃薯葡萄糖平板培养基作为优选技术方案，所述发酵培养基为大米固体培养基，500mL锥形瓶中加入大米40g，水30mL，接种真菌后，28℃发酵培养30-40天。
[0016] 作为优选技术方案，将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡2次，随后用甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡2次。
[0017] 作为优选技术方案，所述粗提物进行层析、洗脱、浓缩的步骤包括：
[0019] 浓缩后的洗脱液再进行ODS反相硅胶柱层析，流动相为30％、40％、50％、60％、70％、80％甲醇水溶液，将50％甲醇水溶液的洗脱液浓缩后进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，流动相为50％二氯甲烷-甲醇溶液，浓缩后即得式(I)化合物。
[0020] 流动相为30％-80％甲醇水溶液，30-80％甲醇洗脱液浓缩后进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，流动相为50％二氯甲烷-甲醇溶液，浓缩后即得式(I)化合物。
[0021] 本发明的再一方面提供了上述蒽醌类化合物的应用，所述蒽醌类化合物用于预防和治疗由植物病原细菌引起的植物病害。
[0022] 作为优选技术方案，所述植物病原细菌为丁香假单胞杆菌P.syringae、燕麦食酸菌A.avenae、胡萝卜软腐欧文氏菌E.carotovora。
[0023] 本发明的又一方面提供了一种植物病原细菌杀菌剂，其有效成分为上述蒽醌类化合物，还包括溶剂或助剂。
[0024] 作为优选技术方案，所述植物病原细菌杀菌剂为所述蒽醌类化合物溶解于二甲基亚砜后，再配制成为水溶液，蒽醌类化合物的浓度≥3.91μg/mL，二甲基亚砜终浓度≤1％。
[0025] 与现有技术相比，本发明所具有的优势及有益效果在于：
[0026] 1、本发明首次发现了海洋真菌Fusarium equiseti GLY27提取的化合物的抗植物病原细菌活性，杀菌活性高、效果好，低浓度下可发挥优异的杀菌性能，并首次确定了其结构中手性碳的绝对构型；
[0027] 2、本发明的蒽醌类化合物，可作为农用杀菌剂主要成分用来预防和治疗植物病原细菌引起的病害，并且对由丁香假单胞杆菌P.syringae、燕麦食酸菌A.avenae、胡萝卜软腐欧文氏菌E.carotovora引起的植物细菌病害防治效果显著；
[0029] 图1为本发明实施例所提供的蒽醌类化合物A的1H NMR谱图；
[0030] 图2为本发明实施例所提供的蒽醌类化合物A的13C NMR谱图；
[0031] 图3为本发明实施例所提供的蒽醌类化合物A的HRESIMS谱图；
[0032] 图4为本发明实施例所提供的蒽醌类化合物B的1H NMR谱图；
[0033] 图5为本发明实施例所提供的蒽醌类化合物B的13C NMR谱图；
[0034] 图6为本发明实施例所提供的蒽醌类化合物B的HRESIMS谱图；
[0035] 图7为本发明实施例所提供的蒽醌类化合物B的ECD谱图。
具体实施方式
[0036] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037] 本发明的一实施例提供了一种蒽醌类化合物，其结构式如式(I)所示，
[0038]
[0039] 所述式(I)结构中R基团选自酮基或羟基。
[0040] 该蒽醌类化合物提取自海洋真菌Fusarium equiseti GLY27，所述海洋真菌Fusarium equiseti GLY27的保藏号是CGMCC 14348。该海洋真菌为木贼镰刀菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2017年7月3日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0041] 本发明的另一实施例提供了蒽醌类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0042] 在菌种培养基中进行对海洋真菌Fusarium equiseti GLY27培养，转入发酵培养基中进行发酵；
[0043] 将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡后再用甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，过滤，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩、干燥后得粗提物；
[0044] 将粗提物进行层析、洗脱、浓缩后获得式(I)所述化合物。
[0045] 本实施例中，海洋真菌经过菌种活化和发酵扩大培养后能够产生代谢产物，利于提取物的制备，发酵后的发酵产物经过乙酸乙酯浸泡，再经过甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡，能够充分提取其中的次级代谢产物。乙酸乙酯的萃取能够保证提取物活性的基础上进行浓缩和提纯。层析、洗脱、浓缩能够获得纯化的化合物。
[0046] 在一优选的实施例中，所述菌种培养基为马铃薯葡萄糖平板培养基，在菌种培养基中28℃培养5-7天；其中，马铃薯葡萄糖平板培养基配比为：马铃薯5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、琼脂18-20g/L，其余为去离子水。本实施例中，可以理解的是，菌种的培养温度可以在28℃左右，培养的时间可以根据培养的情况进行略微调整。培养基中马铃薯和葡萄糖的配比是针对Fusarium equiseti GLY27进行了优化和选择的，能够有效的促进Fusarium equiseti GLY27的生长。
[0047] 在一优选的实施例中，所述发酵培养基为大米固体培养基，500mL锥形瓶中加入大米40g，水30mL，接种真菌后，28℃发酵培养30-40天。本实施例中，可以理解的是，菌种的发酵温度可以在28℃左右，具体发酵的时间可以根据发酵的情况进行缩短或延长。发酵培养基中大米的浓度是针对Fusarium equiseti进行了优化和选择的，能够有效的促进Fusarium equiseti的菌丝生长和次生代谢产物的产生。
[0048] 在一优选的实施例中，将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡2次，随后用甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡2次。本实施例中，浸泡2次能够充分提取，可以理解的是，浸泡多次也可以充分提取，但是比较费时。
[0049] 在一优选的实施例中，为获得纯化的蒽醌类化合物，层析、洗脱、浓缩的具体步骤包括：
[0050] 将粗提物进行减压硅胶柱层析，固定相为100-200目正相硅胶，流动相为10％乙酸乙酯-石油醚混合溶剂，再用100％乙酸乙酯洗脱，将100％乙酸乙酯洗脱液浓缩；
[0051] 浓缩后的洗脱液再进行ODS反相硅胶柱层析，流动相为30％、40％、50％、60％、70％、80％甲醇水溶液，将50％甲醇水溶液的洗脱液浓缩后进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，流动相为50％二氯甲烷-甲醇溶液，浓缩后即得式(I)化合物。本实施例的上述步骤可以充分提取和纯化蒽醌类化合物，同时保证蒽醌类化合物的活性，但是可以理解的是，本领域其它的纯化化合物的方法和具体参数也可用于上述化合物的纯化过程。
[0052] 本发明的再一实施例为上述蒽醌类化合物的应用，上述蒽醌类化合物用于预防和治疗由植物病原细菌引起的植物病害。本实施例中，上述蒽醌类化合物对于植物病原细菌引起的植物细菌病害疗效显著。其中，针对丁香假单胞杆菌P.syringae、燕麦食酸菌A.avenae、胡萝卜软腐欧文氏菌E.carotovora引起的植物病害防治疗效特别显著。具体的，本发明的上述蒽醌类化合物可主要用来预防和治疗由丁香假单胞杆菌P.syringae引起的角斑病，燕麦食酸菌A.avenae引起的果斑病，胡萝卜软腐欧文氏菌E.carotovora引起的软腐病。
[0053] 本发明的又一实施例提供了一种植物病原细菌杀菌剂，其有效成分为上述蒽醌类化合物，还包括溶剂或助剂。本实施例中，以上述蒽醌类化合物为有效成分，可配合其他的溶剂或助剂配制成为具有优异杀菌效果的杀菌剂。其中溶剂可以为能够有效溶解上述蒽醌类化合物的任意溶剂，助剂包括能够促进该蒽醌类化合物发挥杀菌作用的有效助剂以及在具体施用杀菌剂过程中促进施用效果的有效助剂，另外，本领域常见的杀菌剂配合助剂也可用于本发明的植物病原杀菌剂中，例如表面活性剂、分散剂、润湿剂、增稠剂、消泡剂、填料等。
[0054] 在一优选的实施例中，所述蒽醌类化合物溶解于二甲基亚砜后，再配制成为水溶液，蒽醌类化合物的浓度≥3.91μg/mL，二甲基亚砜终浓度≤1％。本实施例中，所述植物病原细菌杀菌剂杀菌的最低浓度为3.91μg/mL，具体应用过程中可以根据病原细菌引起的病害程度以及实施方式具体选择合适的浓度。
[0055] 为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的蒽醌类化合物、制备方法及应用，以下将结合具体实施例进行说明。
[0056] 实施例1海洋真菌Fusarium equiseti GLY27的培养和发酵
[0057] 海洋真菌Fusarium equiseti GLY27的菌种培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，含有马铃薯6g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，其余为水，使用时制成平板培养基，菌株在28℃下培养5-7天；
[0058] (2)海洋真菌Fusarium equiseti GLY27的发酵培养采用大米固体培养基，每500mL锥形瓶中加入大米40g，水30mL，发酵3瓶，真菌菌株于28℃下培养30-40天。
[0059] 实施例2蒽醌类化合物的制备
[0060] 将所得发酵物用乙酸乙酯浸泡2遍，再用甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，过滤，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩、干燥后得粗提物；
[0061] 将粗提物进行减压硅胶柱层析，固定相为100-200目正相硅胶，流动相为10％乙酸乙酯-石油醚混合溶剂洗脱，然后用100％乙酸乙酯洗脱，将100％乙酸乙酯洗脱液浓缩后，再进行ODS(48-63μm)反相硅胶柱层析，流动相为30％、40％、50％、60％、70％、80％甲醇水溶液，50％甲醇洗脱液浓缩后，进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，流动相为50％二氯甲烷-甲醇溶液，根据TLC分别浓缩后，获得两种橘黄色的固体a 4.4mg,b 2.2mg。
[0062] 通过质谱、核磁、旋光和圆二色谱的方法确定了化合物A和B的结构，图谱，参见图1-图7，所得化合物A和B的波谱数据为：
[0063] A：
[0064] orange powder；1H NMR(500MHz,DMSO,δ,ppm):13.04(1H,s,1-OH),8.42(1H,s,H-8),7.51(1H,s,H-5),7.10(1H,d,J＝2.0Hz,H-4),6.59(1H,J＝2.0Hz,H-2),2.67(3H,s,H-
12).13C NMR(125MHz,DMSO,δ,ppm):200.1(C,C-11),184.6(C,C-9),181.8(C,C-10),165.4(C,C-6),164.7(C,C-3),164.6(C,C-1),136.9(C,C-4b),135.1(C,C-4a),130.5(CH,C-8),
128.0(C,C-7),122.2(C,C-8a),116.5(CH,C-5),109.4(C,C-8b),108.0(CH,C-2),107.9(CH,C-4),30.3(CH3,C-12).HRESIMS m/z 297.0399(calcd for C16H9O6,297.0394)。
12).13C NMR(125MHz,DMSO,δ,ppm):200.1(C,C-11),184.6(C,C-9),181.8(C,C-10),165.4(C,C-6),164.7(C,C-3),164.6(C,C-1),136.9(C,C-4b),135.1(C,C-4a),130.5(CH,C-8),
128.0(C,C-7),122.2(C,C-8a),116.5(CH,C-5),109.4(C,C-8b),108.0(CH,C-2),107.9(CH,C-4),30.3(CH3,C-12).HRESIMS m/z 297.0399(calcd for C16H9O6,297.0394)。
[0065] B:
[0066] orange powder；[α]20D-22.6°(c 0.10,MeOH)；ECD(1.11mM,MeOH)λmax(Δε)203(Δε-0.43),224(Δε-0.04),239(Δε-0.15),260(Δε-0.04),268nm(Δε-0.05),288nm(Δε+0.002),308(-0.08)；1H NMR(500MHz,DMSO,δ,ppm):13.04(1H,s,1-OH),8.27(1H,s,H-8),
7.49(1H,s,H-5),7.09(d,J＝2.0Hz,H-4),6.56(1H,J＝2.0Hz,H-2),5.01(1H,q,J＝6.5Hz,H-11),1.32(3H,d,J＝6.5Hz,H-12)；13C NMR(125MHz,DMSO,δ,ppm):185.7(C,C-9),182.0(C,C-10),164.9(C,C-3),164.5(C,C-1),159.4(C,C-6),141.0(C,C-7),135.1(C,C-4a),
133.3(C,C-4b),125.1(CH,C-8),124.6(C,C-8a),112.2(CH,C-5),109.0(C,C-8b),108.1(CH,C-4),107.7(CH,C-2),62.9(CH,C-11),23.8(CH3,C-12).HRESIMS m/z 299.0563(calcd for C16H9O6,299.0561)。
7.49(1H,s,H-5),7.09(d,J＝2.0Hz,H-4),6.56(1H,J＝2.0Hz,H-2),5.01(1H,q,J＝6.5Hz,H-11),1.32(3H,d,J＝6.5Hz,H-12)；13C NMR(125MHz,DMSO,δ,ppm):185.7(C,C-9),182.0(C,C-10),164.9(C,C-3),164.5(C,C-1),159.4(C,C-6),141.0(C,C-7),135.1(C,C-4a),
133.3(C,C-4b),125.1(CH,C-8),124.6(C,C-8a),112.2(CH,C-5),109.0(C,C-8b),108.1(CH,C-4),107.7(CH,C-2),62.9(CH,C-11),23.8(CH3,C-12).HRESIMS m/z 299.0563(calcd for C16H9O6,299.0561)。
[0067] 通过上述数据确定化合物a和b的结构分别为：
[0068] A 7-acetyl-1,3,6-trihydroxyanthracene-9,10-dione
[0069]
[0070] B(S)-1,3,6-trihydroxy-7-(1-hydroxyethyl)anthracene-9,10-dione
[0071]
[0072] 实施例3蒽醌类化合物抗菌活性测定
[0073] 测试对6株植物病原细菌：丁香假单胞杆菌P.syringae、燕麦食酸菌A.avenae、稻生黄单胞菌Xanthomonas oryzae、胡萝卜软腐欧文氏菌E.carotovora、密执安棍状杆菌C.michiganensis和青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum的抗菌活性。
[0074] 上述6株植物病原细菌经LB培养基120rpm/min震荡培养24h。取细菌培养液制备菌悬液，调整菌液浓至2-5×105cfu/mL，待测化合物1.0mg用50μL DMSO溶解，加950μL无菌水，配制成1.0mg/mL的母液；在96孔板每列第1-8孔中分别加入50μL无菌水，再往第1孔中加入50μL母液混匀，采用二倍稀释法将1-8孔梯度稀释，后补入50μL菌液，使待测化合物浓度为
250，125，62.5，31.3，15.6，7.85，3.93，1.97μg/mL，37℃培养24h，以最后一个澄清的孔中化合物浓度为最小抑菌浓度，或通过酶标仪630nm下测量吸光度来测量抑菌率，确定能够有效抑菌的最低浓度，结果如下表1。
250，125，62.5，31.3，15.6，7.85，3.93，1.97μg/mL，37℃培养24h，以最后一个澄清的孔中化合物浓度为最小抑菌浓度，或通过酶标仪630nm下测量吸光度来测量抑菌率，确定能够有效抑菌的最低浓度，结果如下表1。
[0075] 表1本发明的式(I)化合物对细菌的抑制活性
[0076]
[0077] 通过表1可以看出，本发明的化合物对丁香假单胞杆菌P.syringae、燕麦食酸菌A.avenae和胡萝卜软腐欧文氏菌E.carotovora具有显著的抗菌活性。因此，上述试验充分说明本发明的蒽醌类化合物对于上述细菌抗菌活性优异，相比现有的抗细菌药剂，低浓度下能够取得显著的抗菌效果。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于片烟烟包的检测系统、检测方法和制烟设备 | 2020-05-08 | 800 |
| 非燃烧式抽吸器的电源单元、主体单元及非燃烧式抽吸器 | 2020-05-08 | 476 |
| 气溶胶生成装置及其主体单元、非燃烧式吸取器 | 2020-05-08 | 335 |
| 非燃烧式抽吸器的电源单元以及非燃烧式抽吸器 | 2020-05-08 | 825 |
| 一种使用THT的烟梗烘烤加工方法 | 2020-05-08 | 294 |
| 非燃烧式抽吸器的电源单元、主体单元及非燃烧式抽吸器 | 2020-05-08 | 204 |
| 烟弹、雾化单元以及非燃烧式吸取器 | 2020-05-08 | 773 |
| 非燃烧式吸取器的电源单元、雾化单元以及非燃烧式吸取器 | 2020-05-08 | 68 |
| 聚乳酸基香味缓释材料、复合薄片及其制备和在加热不燃烧烟草制品中的应用 | 2020-05-08 | 1 |
| 聚合物基香味缓释复合薄片及其制备和在加热不燃烧烟草制品中的应用 | 2020-05-11 | 854 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈